Tcnicas de Gram de bacterias

Daniel Castillo, Linda Luz Florez, Dirols Lopez, Jorge Isaac Maldonado
Universidad del Atlntico
2016-1

Resumen
En esta informe podemos leer los pasos que se realiz en el laboratorio por el grupo de
microbiologa #2 como pudimos identificar y visualizar las bacterias obtenidas a partir de
un cultivo bacteriano en una caja Petri atreves de la metodologa de tensin de gram y
despus observadas al microscopio.
OBJETIVOS

Christian

1.

desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza

Adquirir destreza en la tcnica de

Diferenciar

con

base

en

la

aplicacin de esta tcnica las bacterias

Gram positivas de las Gram negativas.
3.

(1853-1938),

que

tanto para poder referirse a la morfologa

coloracin Gram
2.

Gram

Conocer los diferentes campos de

celular bacteriana, como para poder

realizar una primera aproximacin a la
diferenciacin bacteriana, considerndose
bacterias grampositivas a las que se
visualizan de color morado, y bacterias

aplicacin de esta tcnica

gram negativas a las que se visualizan de

4.

color rosa, rojo o grosella.

Aplicar la tcnica con diferentes

reactivos observando los resultados y

Un microorganismo gram positivo debe

diferencias.

presentar una pared celular sana. El

Introduccin

mismo microorganismo, si sufre dao de

la pared por una u otra causa, se vuelve
gram negativo. Esto indica la importancia

La tincin de Gram o coloracin de Gram

de la pared para la retencin o el escape

es un tipo de tincin diferencial empleado

del colorante. Una posible teora del

en bacteriologa para la visualizacin de

mecanismo de tincin es la siguiente:

bacterias, sobre todo en muestras clnicas.

Debe su nombre al bacterilogo dans

El

colorante

bsico

entra

al

En la zona isoelctrica caracterstica de

microorganismo, donde forma con el

cada especie es muy escasa la tendencia a

yodo una laca insoluble en agua. El

retener cualquier colorante.

alcohol o la acetona empleados para

Parece estar bien demostrado que las

aclarar, deshidrata las paredes de los

protenas de las bacterias no son simples,

microorganismos gram positivos, tratados

sino ms bien una dbil combinacin de

con mordiente, y forma una barrera que la

sustancias protenicas con otras lipoideas

laca no puede atravesar. En las clulas

o grasas.

gram negativas, los lpidos de la pared

(ms abundantes que en las clulas gram
positivas)

se

disuelven

por

este

tratamiento, lo que permite el escape del

complejo de cristal violeta con yodo.
Algunos autores objetan esta teora, pero
es indudable la importancia general de la
pared celular.

La

materia

grasa

extrada

de

los

microorganismos gram positivos difiere

de la obtenida de los microorganismos
gram negativos, en que la primera
contiene una proporcin mucho mayor de
cidos no saturados que muestren gran
afinidad por los agentes oxidantes. Todos
los mordientes (como el yodo) empleados

Los microorganismos gram positivos

en la coloracin gram son oxidantes; su

pueden

efecto, en general, consiste en dar a la

hacerse

gram

negativos

al

aumentar la acidez.

sustancia oxidada un carcter ms cido.

Los microorganismos gram negativos

Esto

pueden

microorganismo

hacerse

gram

positivos

al

aumenta

la

afinidad

por

los

de

un

colorantes

aumentar la alcalinidad.

bsicos.

Los microorganismos de reaccin positiva

El cambio de respuesta a la coloracin de

a los colorantes cidos pueden hacerse

Gram con el tiempo es propio, sobre todo,

gram

de los microorganismos dbilmente gram

negativos

por

aumentar

la

alcalinidad.

positivos cultivados en los medios que

Los microorganismos de reaccin positiva

contengan

a los colorantes bsicos pueden hacerse

fermentar, y cuya reaccin se vuelve

gram negativos por aumentar la acidez.

cida en el curso del desarrollo.

sustancias

capaces

de

Bacterias resistentes a la tincin de

aislamientos bacterianos realizados en los

Gram

cultivos. Si se observan mayor nmero de

Las siguientes bacterias de naturaleza

formas bacterianas que las aisladas hay

gram positiva se tien como gram

que reconsiderar los medios de cultivos

negativas:

empleados as como la atmsfera de

incubacin.
A partir de la tincin de Gram pueden

Mycobacterias (estn encapsuladas).

distinguirse varios morfotipos distintos:

Mycoplasmas (no tienen pared).

Los cocos son de forma esfrica. Pueden

Formas L (prdida ocasional de la pared).

aparecer aislados despus de la divisin

Protoplastos y esferoplastos (eliminacin

total

parcial

de

la

pared,

respectivamente).

celular (micrococos), aparecer por pares

(diplococos),

formar

cadenas

(estreptococos), o agruparse de manera

irregular (estafilococos).

Los bacilos poseen forma alargada. En

general suelen agruparse en forma de
cadena (estreptobacilos) o en empalizada.
Utilidades
En el anlisis de muestras clnicas suele

Tambin

pueden

distinguirse

los

ser un estudio fundamental por cumplir

espirales, que se clasifican en espirilos (si

varias funciones:

son de forma rgida) o espiroquetas (si

son blandas y onduladas). Si por el

Identificacin preliminar de la bacteria

causal de una infeccin.
Utilidad

como

control

calidad

del

aislamiento bacteriano. Los morfotipos

bacterianos identificados en la tincin de
Gram se deben de corresponder con

contrario, poseen forma de coma (o

curvados) entonces se los designa vibrios.
Fundamentos

de

diferenciacin

de

gram positivo y gram negativo

Los fundamentos de la tcnica se basan
en las diferencias entre las paredes

celulares de las bacterias gram positivas y

material que confiere su rigidez a la pared

gram negativas

celular bacteriana, y las gram positivas lo

poseen en mucha mayor proporcin que

La pared celular de las bacterias gram

las gram negativas.

positivas posee una gruesa capa de

peptidoglicano, adems de dos clases de

La diferencia que se observa en la

cidos teitoicos: anclado en la cara interna

resistencia a la decoloracin se debe a que

de la pared celular y unido a la membrana

la membrana externa de las bacterias

plasmtica,

cido

gram negativas es soluble en solventes

lipoteicoico, y ms en la superficie, el

orgnicos, como por ejemplo la mezcla de

cido teicoico que est anclado solamente

alcohol/acetona.

en el peptidoglicano (tambin conocido

peptidoglucano que posee es demasiado

como murena).

delgada como para poder retener el

se

encuentra

el

La

capa

de

complejo de cristal violeta/yodo que se

Por

el

contrario,

la

capa

de

peptidoglucano de las bacterias gram

negativas es delgada, y se encuentra unida
a una segunda membrana plasmtica
exterior (de composicin distinta a la
interna) por medio de lipoprotenas. Tiene
una capa delgada de peptidoglicano unida
a

una

membrana

exterior

por

lipoprotenas. La membrana exterior est

hecha

de

protena,

fosfolpido

lipopolisacrido.

Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se

tien diferencialmente debido a estas
diferencias constitutivas de su pared. La
clave es el peptidoglicano, ya que es el

form previamente, y por lo tanto este

complejo se escapa, perdindose la
coloracin azul-violcea. Por el contrario,
las bacterias gram positivas, al poseer una
pared celular ms resistente y con mayor
proporcin de peptidoglicanos, no son
susceptibles a la accin del solvente
orgnico,

sino

que

este

acta

deshidratando los poros, cerrndolos, lo

que impide que pueda escaparse el
complejo

cristal

violeta/yodo,

manteniendo la coloracin azul-violeta.

Factores que alteran la tincin de

Gram
Edad de la bacteria.

Errores del operador.

iniciamos la tincin agregamos el Agregar

Uso de antibiticos

azul violeta y esperamos un minuto, a

A pesar de la gran utilidad de la tincin de

Gram, este mtodo debe ser valorado con
precaucin, ya que la reaccin puede
variar segn la edad de las clulas
(cultivos

viejos

positivas

pueden

de

bacterias

perder

capas

gram
de

peptidoglicanos y teirse como gram

negativos) y la tcnica empleada (al
decolorar por un tiempo muy prolongado
se puede correr el riesgo que bacterias

continuacin, enjuagamos la muestra con

agua, posteriormente se agreg lugol, se
esper un minuto y se enjuago, al cabo
rato agregamos el alcohol acetona y
esperamos de 20 a 30 segundos en ese
momento se da la decoloracin de las
GRAM (-) , enjuagamos la muestra con
agua y por ultimo agregamos la fucsina,
por ltimo se procedi a observar las
muestras en el microscopio.

gram positivas se tian como gram

negativas). Por esta situacin, junto a la

Resultados y anlisis de resultados

muestra deben teirse controles con

bacterias gram positivas (por ejemplo
Staphylococcus aureus) y gram negativas
(por ejemplo, Escherichia coli).
Metodologa:
Iniciamos la tincin tomando una
muestra de bacterias ya presentes en el
laboratorio, primero tomamos la muestra
y con el asa ya esterilizado realizamos un
frotis usando una solucin salina en el

Imagen 1. Vista 100x de muestra

porta

preparada con tincin de gram

objetos,

despus

esperamos

aproximadamente 15 min despus ya

secada la muestra realizamos la fijacin
tomamos el porta objetos, se pas
rpidamente por el mechero hasta que se
fijara la muestra. Despus dada la fijacin

En la imagen 1 se muestra que se

lograron colorear algunas colonias de
bacterias, dado a su coloracin rosa, se
deduce que eran bacterias gram negativas

las que se lograron teir y gracias a la

Se logr comprobar que la tincin de

tincin se lograron diferenciar colonias de

gram es un mtodo de tincin adecuado

coccos, estafiloccos, de manera separada

para diferenciar bacterias y conocer su

esparcidas por toda la muestra.

identidad, las muestras obtenidas fue

gram

negativas

dado

su

color

caracterstico violeta, de esta forma se

logr identificar de manera prctica las
morfologas de las muestras desconocidas
preparadas, en la primera se lograron
notar colonias de estafilococos y en la
muestra 2, clonias de estretobacilos y
algunos

vibrios

vistos

de

manera

diferencial.
Imagen 2. Muestra 100x preparada con
BIBLIOGRAFIA

tincin de gram
Se

encontr

una

muestra

bastante

1.

Brock, (2016). Biologia de los

microorganismos (12 ed., Vol., pp.
1-28). Mexico, mexico: Pearson
eduacation.

2.

Bergey, David H.; Holt, John G.;

Krieg, Noel R.; Sneath, Peter H.
A. (1994): Bergey's manual of
determinative
bacteriology.
Lippincott Williams & Wilkins,
novena edicin, 1994. ISBN 0683-00603-7.

colorada de color violeta, se deduce de

una que las bacterias que se encontraron
son

gram

bacteriana

negativas,

la

morfologa

que se puede notar que gran

parte de la muestra son bacilos en

diferentes

formas

colonias

como

estreptobacilos y di bacilos en la muestra,

se pueden notar algunos vibrios en la
muestra, se deduce por la curvatura
caracterstica de ellos en forma inclinada.

Conclusiones.