Medios ptimos para el microorganismo streptomyces

Medio mnimo: S04(NH4>2.05%, P04HK2 0,05%, SO4Mg.7H20 0,02%, SO4Ee.7H20

0,001%, pH 7,2.Tras esterilizar, se aade Manitol estril hasta 0,5%.
Para medio slido, se aadi agar hasta 2,2%.
R2YE o RS: Sacarosa 10,3%, S04K2 0,025%, Cl2Mg.6H20 1,012%, glucosa 1%,
casaminocidos) 0,01%, extracto de levadura 0,5% tampn TES 0,573%, elementos
traza 0,2%. Ajustar a pH 7,3, aadir agar hasta 2,2% y esterilizar.
DNA: DNE, glucosa 0,5%, agar 1.5%. Esterilizar y aadir (N0 3)2Ca hasta 0,8mM y
SO4Mg hasta 1mM.
SNA: DNB con agar al 0,6%.
YEME: Extracto de levadura 0,3%, extracto de malta 0,3%, bactopeptona 0,5%,
glucosa 1% y Sacarosa 10,3%. Esterilizar y completar con Cl 2Ng.6H20 hasta 5mM.
Para la preparacin de protoplastos aadir, adems, glicina hasta 0,5%.

Medio de cultivo Y Seleccin

Se parte de un cultivo de 25m1 de YEME crecido a 30OC durante 48 horas. Tras recoger
el micelio por filtracin se lava con sacarosa al 10%. Posteriormente se re suspende
con el tampn de lisis alcalina con lisozima (2-4 mg/ml), incubando a 37 oC durante 40
minutos. Estas clulas se lisan en presencia de SDS con una concentracin final de 1%.
Se extraen con fenol: cloroformo neutro (50:50 con un OH-quinolena al 0.1% y
neutralizando con Tris-HCl 50mM pH8. Las extracciones se suceden hasta que no se
observan interface. Posteriormente se precipita con 2,2 volmenes de etanol al 100% y
1/10 volumen de AcNO3 3M. Despus de dos lavadas con etanol 75%, se disuelve en TE
con una concentracin de RNAsa de 50ug /ml, incubndose a 37 oC durante 60 minutos
para digerir el RNA. La fase acuosa se vuelve a extraer con fenol: cloroformo neutro y
se precipita con etanol 100% disolviendo finalmente en TE. La concentracin de las
soluciones de DNA se determina por la medida de la densidad ptica a 260 nm en
cubetas de cuarzo de 1 mm y considerando que 1 unidad de D.O. se corresponde con
una concentracin de DNA de 50ug/ml. La pureza de la preparacin se estima midiendo
en las mismas condiciones pero a 280 nm y determinando la relacin DO 260/280,
siendo valores aceptables entre 1,65 y 1,85.

En el caso de Streptomyces las clulas se re suspenden en 5ml del tampn de lisis;

este tampn contiene, adems, lisozima (2-4 mg/ml). Se incuban a 37 oC durante unos
30 minutos, para digerir la pared celular. Posteriormente se lisan las clulas aadiendo
3 ml de solucin de lisis alcalina previamente calentada a 60oC, e incubando 10
minutos a 70oC en el caso de plsmidos pequeos de Streptomyces. Si los plsmidos
de streptomyces son de gran tamao, es necesario un tratamiento ms suave, que
consiste en una incubacin a 50oC hasta que se observa una lisis total, generalmente
unos 30 minutos.

A los lisados se aaden 4ml de una solucin de AcOK 3M pH6 para precipitar los restos
de protenas, DNA cromosmico desnaturalizado, etc. Posteriormente se extrae con un
volumen de fenol: cloroformo neutro y la fase acuosa se precipita con 1 volumen de
isopropanol sin aadir sales, ya que la concentracin salina es alta por el proceso
anterior. Despus de dos lavados Con etanol 75% se disuelve en TE con RNAsa a una
concentracin de 50ug /ml. Se incuba a 37oC durante 30 minutos y se vuelven a repetir
los ciclos de extraccin con fenol: cloroformo y precipitacin, disolvindose al final en
70ul de TE.

La conservacin de las cepas de Streptomyces se realiza en forma de suspensin de

esporas (o de micelio en el caso de mutantes que no esporulan) en glicerol al 20% y se
guardan a 200C.
La seleccin de cepas bacterianas se realiza aadiendo a los medios de cultivo
diferentes antibiticos en las condiciones que seala la siguiente tabla: (unidades en
ul/ml)

Aislamiento Y Obtencin de Cultivo Puro

Para el aislamiento se diluye la muestra en agua destilada estril a las concentraciones
de 1 en 1.000, 1 en 10.000 y 1 en 100.000. De estas diluciones se pusieron 1 c. c. por
placa Petri y se adicion despus en cada placa 10 c. c. de agar-albmina de huevo
previamente fundida y enfriada despus hasta unos 42- 44o C, se mezcl bien por ligero
movimiento de rotacin de las placas, se dejaron estas enfriar para que solidificaran el
medio y despus se pusieron las placas en la estufa a 28o. por cada dilucin se
sembraron tres placas.
A los pocos das de incubacin aparecieron en las placas pequeas colonias mates de
color blanquecino algo grisceo.
Resembrar de estas colonias en placas de agar-glucosa-esparraguina para obtener un
cultivo puro y de las placas se resembro a tubos con agar-glucosa-esparraguina en los
que los Streptomyces esporulan bien y que es el medio que corrientemente se emplea
para conservar cultivos de Streptomyces