5tesis. Crecimiento de H Pluviales y Prod Astaxantina PDF

Evaluacin del crecimiento y
produccin de astaxantina por

Haematococcus pluvialis en un
fotobiorreactor tipo airlift.
Daniel Mauricio Ramrez Landnez, Ing. Qco.
Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ingeniera, Departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental
Bogot, Colombia
2013
Evaluacin del crecimiento y

produccin de astaxantina por
Haematococcus pluvialis en un
fotobiorreactor tipo airlift.
Daniel Mauricio Ramrez Landnez
Tesis de investigacin presentada como requisito parcial para optar al ttulo de:
Magister en Ingeniera Qumica
Director:
Ph. D. M. Sc. Ing. Qco. Rubn Daro Godoy Silva
Codirector:
Dr . M.Sc. Bilogo Luis Carlos Montenegro Ruiz
Lnea de Investigacin:
Procesos Bioqumicos - Cultivo de microalgas
Grupo de Investigacin:
Grupo de investigacin en procesos Qumicos y Bioqumicos
Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ingeniera, Departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental
Bogot, Colombia
2013
A mi esposa por haber estado en los

momentos difciles y apoyarme cuando ms
lo necesitaba. A mi padre que ya parti y a mi
madre por todos los esfuerzos por traerme
hasta aqu.
Agradecimientos
Quiero iniciar agradeciendo a los profesores Rubn Daro Godoy y Luis Carlos
Montenegro por su direccin y por permitirme ser parte de esta experiencia llena de
aprendizajes y buenos momentos.
Agradezco a la Direccin de investigacin de la sede Bogot de la Universidad Nacional

de Colombia por su apoyo econmico para el desarrollo de la investigacin, al
Departamento de Ingeniera qumica por facilitar los recursos fsicos y humanos, as
como al Laboratorio de cultivo de microalgas del departamento de Biologa por ser mi
escuela y facilitarme el desarrollo de mi tesis.
Un agradecimiento a todas las personas que directa o indirectamente me apoyaron y

guiaron para alcanzar las metas que haba establecido, especialmente a mis compaeros
y amigos Luis Miguel Serrano, Liliana Ardila, Marisol Herrera, Ana Isabel Ramos y Fredy
Gmez.
Al personal del Ingenio Providencia S.A. por su comprensin durante la ltima fase del
proyecto.
Resumen y Abstract
IX
Resumen
Haematococcus pluvialis ha ganado gran inters comercial por su capacidad de
acumular altos niveles de astaxantina comparado con otras fuentes. El principal
problema para su escalamiento industrial es su elevado costo de produccin comparado
con la astaxantina sinttica. Actualmente las investigaciones han sido encaminadas a
optimizar las variables del proceso de crecimiento de la microalga y la acumulacin de
este metabolito, evaluando parmetros como la intensidad de luz, diferentes medios de
cultivo, el efecto del nitrgeno, fsforo, minerales, temperatura, entre otros. Adems se
ha propuesto el uso de diferentes fotobiorreactores, para reducir el estrs hidrodinmico,
as como los procesos posteriores de separacin y purificacin. En el presente
investigacin se presenta una revisin de diferentes trabajos, evaluando el potencial que
tiene Haematococcus pluvialis para la produccin industrial de astaxantina.
En la primera fase de la investigacin se estudi el efecto de cinco medios de cultivo en

el crecimiento de una cepa nativa de la microalga Haematococcus pluvialis, encontrando
que no existe diferencia significativa entre los medios evaluados, mostrando velocidades
de crecimiento de 0,463 - 0,536 das-1, con una densidad celular mxima de 4,02 - 4,16 x
105 cel/mL. Al someter las clulas en fase estacionaria a estrs, se encontr que una
concentracin de sal superior al 0,025 % es letal para la microalga y no genera
acumulacin de astaxantina, mientras que las clulas sometidas a irradiaciones inferiores
a 55500 Lux no fueron inhibidas, logrando una acumulacin de 32,99 Pg/mL y una
productividad de 1,434 mg L-1da-1. Por ultimo se encontr que al concentrar primero las
clulas en fase estacionaria y luego someterlas a estrs por irradiacin se consigue una
acumulacin 59,23 Pg/mL y una productividad de 3,484 mg L-1da-1, mostrando gran
potencial para la produccin industrial de astaxantina a partir de esta microalga nativa.
En la segunda fase se evalu el efecto del porcentaje de dixido de carbono en la

aireacin, de la intensidad de luz y de la concentracin de nitrgeno y de fsforo, en la
Evaluacin del crecimiento y produccin de astaxantina por Haematococcus pluvialis

en un fotobiorreactor tipo airlift.
velocidad especfica de crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis

utilizando la metodologa de superficie de respuesta y ajustando los parmetros a un
polinomio de segundo orden. Se encontr una velocidad mxima de crecimiento para los
lmites evaluados de 0.825 das -1, utilizando 0.51% de CO2, 3,28x10-3 M de nitrgeno
(NaNO3), 2,58x10-3 M de fsforo (K2HPO4 y KH2PO4) y 11000 Lux de iluminancia, como
parmetros de cultivo. De estos parmetros la intensidad de luz y la concentracin de
fsforo tuvieron un efecto positivo en el crecimiento de la microalga, mientras que el %
CO2 presento un efecto negativo; la concentracin de nitrgeno no tuvo efecto
significativo en la velocidad especfica de crecimiento.
Por ltimo se dise y construy un fotobioreactor tipo airlift para el crecimiento de la

microalga nativa Haematococcus pluvialis. Se realiz una caracterizacin hidrodinmica
encontrando tiempos de mezclado de 130 a 240 s, retenciones de gas inferiores al 6 %
del volumen del reactor, y coeficientes de transferencia de masa para el oxigeno y el
dixido de carbono de 9,8 y 8,6 h-1 respectivamente. Se encontr una velocidad mxima
de crecimiento de 0.597 das -1, utilizando las condiciones ptimas encontradas en las
fases anteriores de la investigacin.
Palabras
clave:
Haematococcus
pluvialis,
fotobioreactores,
astaxantina,
estrs
hidrodinmico, velocidad especfica de crecimiento, medios de cultivo, irradiacin,

salinidad.
Abstract
Haematococcus pluvialis has gained great commercial interest for their ability to
accumulate high levels of astaxanthin with respect to other sources. The high production
cost compared to synthetic astaxanthin is the main problem for industrial scaling.
Currently, research has been focused to optimizing the process variables for microalga
growth and metabolite accumulation, evaluating parameters as irradiance, culture media,
nitrogen, phosphorus, minerals, temperature, etc. They have also proposed the use of
different photobioreactors for hydrodynamic stress reduction as well as the subsequent
separation processes and purification. This investigation presents a review of various
researches, evaluating the potential of Haematococcus pluvialis for industrial astaxanthin
production.
Contenido
XI
In the first part of the investigation, five different culture media were effect in the native
microalgae Haematococcus pluvialis was studied finding no significant differences
between evaluated media, showing growing rates of 0,463 - 0,536 days-1 with a maximum
cellular density of 4,02 - 4,16 x 105 cel/mL. When stationary phase cells are stressed, a
more than 0,025 % salt concentration is lethal for the microalgae and does not produce
astaxanthin accumulation, while the cells under less than 55500 Lux irradiation were not
inhibited, achieving a 32,99 Pg/mL accumulation and a 1,434 mg L-1day-1 production.
Finally, to concentrate the stationary cells first and later to stress them by irradiation is
suggested, to get a 59,23 Pg/mL accumulation and a 3,484 mg L-1day-1production,
showing a big potential for the industrial astaxanthin production from this native
microalgae.
In the second part, the effect of carbon dioxide concentration in the aeration, the nitrogen
and phosphorus concentration and the light intensity, in the specific growth rate of native
microalgae Haematococcus pluvialis were evaluated through a response surface
methodology, adjusting the parameters to a second order polynomial. The maximum
growth rate, for evaluated limits, was 0.825 days-1, using 0.51% of CO2, 3,28x10-3 M of
nitrogen (NaNO3), 2,58x10-3 M of Phosphorus (K2HPO4 and KH2PO4) and 11000 Lux of
luminance, as culture parameters. Light intensity and phosphorus concentration had a
positive effect in the specific growth rate of the microalgae while the carbon dioxide
percentage had a negative effect; the nitrogen concentration had no significant effect in
the specific growth rate.
An airlift photobioreactor was designed and built growing the native microalgae
Haematococcus pluvialis. A hydrodynamic characterization of the bioreactor was
developed, finding a mixing time of 130 and 240 s, gas retention of less than 6%, oxygen
mass transfer coefficient of 9,8 h-1 and carbon dioxide one of 8,6 h-1. The specific growth
rate for aeration of 0,5 vvm was 0.597 day -1, using the same conditions found in the last
stage of this research.
Keywords: Haematococcus pluvialis, photobioreactors, specific growth rate, astaxanthin,

hydrodynamic stress, culture media, irradiation, salinity, microalgae.
Contenido
XIII
Contenido
Pg.
Resumen ................................................................................................................................... IX
Lista de figuras........................................................................................................................ XVI
Lista de tablas ....................................................................................................................... XVIII
Lista de Smbolos y abreviaturas ...............................................................................................XX
Introduccin ............................................................................................................................... 1
Objetivos .................................................................................................................................... 1
1.
Una revisin de la microalga Haematococcus pluvialis como fuente de Astaxantina natural.2

Resumen...................................................................................................................... 2
Abstract ........................................................................................................................ 2
1.1
Introduccin....................................................................................................... 3
1.2
Astaxantina ....................................................................................................... 4
1.2.1
Aplicaciones ........................................................................................... 5
1.2.2
Fuentes .................................................................................................. 6
1.3
Haematococcus pluvialis ................................................................................... 7
1.4
Condiciones de crecimiento ............................................................................ 10
1.4.1
Medios de cultivo .................................................................................. 10
1.4.2
Iluminancia, CO2, temperatura y sales en el medio de cultivo ............. 11
1.4.3
Factores hidrodinmicos y de diseo ................................................... 13
1.5
Mtodos de separacin y purificacin ............................................................. 14
1.6
Fotobiorreactores ............................................................................................ 15
1.6.1
Sistemas abiertos ................................................................................. 15
1.6.2
Sistemas cerrados ................................................................................ 16
1.7
Mercado de Haematococcus pluvialis ............................................................. 18
1.7.1
Produccin de astaxantina a nivel industrial ........................................ 19
2. Efecto de las condiciones de cultivo en el crecimiento y acumulacin de astaxantina en una

cepa nativa de Haematococcus pluvialis ................................................................................... 21
Resumen.................................................................................................................... 21
Abstract ...................................................................................................................... 21
2.1
Introduccin..................................................................................................... 22
2.2
Materiales y mtodos ...................................................................................... 23
2.2.1
Microorganismo y condiciones de cultivo ............................................. 23
XIV
Evaluacin del crecimiento y produccin de astaxantina por Haematococcus

pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
2.2.2
Evaluacin de medios de cultivo ........................................................... 24
2.2.3
Evaluacin de estrs por intensidad lumnica ....................................... 24
2.2.4
Evaluacin de estrs por alta salinidad en el medio de cultivo ............. 25
2.2.5
Evaluacin de estrs por concentracin celular .................................... 25
2.2.6
Medicin de variables ........................................................................... 26
2.2.7
Ajuste cinticas de crecimiento ............................................................. 28
2.3
Resultados y discusin .................................................................................... 29
2.3.1
Efecto del medio de cultivo ................................................................... 29
2.3.2
Efecto de la intensidad de luz y concentracin de sal en la acumulacin
de astaxantina. .................................................................................................... 32
2.3.3
Efecto de la concentracin celular y la elevada iluminacin en la
acumulacin de astaxantina. ............................................................................... 36
3. Optimizacin de las condiciones de cultivo en el crecimiento de la microalga nativa
Haematococcus pluvialis ........................................................................................................... 41
Resumen .................................................................................................................... 41
Abstract....................................................................................................................... 41
3.1
Introduccin ..................................................................................................... 42
3.2
Materiales y mtodos ....................................................................................... 43
3.2.1
Microorganismos y condiciones de cultivo ............................................ 43
3.2.2
Diseo experimental y anlisis de datos ............................................... 45
3.2.3
Medicin del crecimiento ....................................................................... 47
3.2.4
Ajuste de cinticas de crecimiento ........................................................ 47
3.3
4. Diseo, montaje y evaluacin de un fotobiorreactor para el crecimiento de la microalga
nativa Haematococcus pluvialis ................................................................................................ 57
Resumen .................................................................................................................... 57
Abstract....................................................................................................................... 57
4.1
Introduccin ..................................................................................................... 58
4.2
Materiales y mtodos ....................................................................................... 59
4.2.1
Microorganismos y condiciones de cultivo ............................................ 59
4.2.2
Descripcin del fotobioreactor airlift ...................................................... 61
4.2.3
Caracterizacin hidrodinmica .............................................................. 63
4.2.4
Tiempo de Mezclado ............................................................................. 64
4.2.5
Retencin de gas .................................................................................. 64
4.2.6
Velocidad del gas en la zona de ascenso ............................................. 64
4.2.7
Velocidad del lquido en la seccin de descenso .................................. 65
4.2.8
Coeficiente volumtrico global de transferencia de masa ..................... 65
4.2.9
Medicin del crecimiento ....................................................................... 66
4.2.10 Ajuste de cinticas de crecimiento ........................................................ 66
4.3
4.3.1
Tiempo de Mezclado ............................................................................. 66
4.3.2
Retencin del gas ................................................................................. 68
4.3.3
Velocidad de descenso del lquido ........................................................ 68
4.3.4
Coeficientes globales de transferencia de masa .................................. 69
4.3.5
Evaluacin del crecimiento de la microalga .......................................... 71
5.
Conclusiones y recomendaciones ...................................................................................... 75

5.1
Conclusiones ................................................................................................... 75
Contenido
5.2
XV
Recomendaciones .......................................................................................... 76
A.
Anexo: Composicin de los medios de cultivo empleados ................................................. 77
B.
Anexo: Superficies de respuesta ........................................................................................ 79
C.
Anexo: Planos de diseo fotobioreactor tipo airlift ........................................................... 81
D.
Anexo: Curvas de aireacin y desgasificacin- Oxgeno disuelto ...................................... 119
Bibliografa ............................................................................................................................. 123
Contenido
XVI
Lista de figuras
Pg.
Figura 1-1: Estructura molecular de la Astaxantina (Snchez & Flores, 1999).................. 5
Figura 1-2: Fases de crecimiento de Haematococcus pluvialis (Hagen et al., 2002) ........ 8
Figura 1-3: Ruta de sntesis de astaxantina en la microalga Haematococcus pluvialis
(Zhu et al., 2009)................................................................................................................. 9
Figura 2-1 Esquema del montaje de trabajo para evaluar estrs por concentracin celular
.......................................................................................................................................... 28
Figura 2-2: Curvas de crecimiento de la microalga Haematococcus pluvialis en los
medios de cultivo BBM (), BG11 (), OHM (), F1 (), BBM: BG11 (1:1) () ................. 30
Figura 2-3 Velocidad especfica de crecimiento para los medios de cultivo evaluados.
Barra error: desviacin estndar. ...................................................................................... 31
Figura 2-4 Efecto de la salinidad del medio de cultivo en la acumulacin de astaxantina
en H. pluvialis .................................................................................................................... 33
Figura 2-5: Efecto de la intensidad de luz en la acumulacin de astaxantina en H.
pluvialis ............................................................................................................................. 34
Figura 2-6: Efecto de la salinidad del medio de cultivo en la produccin de biomasa ..... 35
Figura 2-7 Efecto de la intensidad lumnica en la produccin de biomasa ...................... 36
Figura 2-8: Seguimiento fotogrfico al estrs por concentracin y elevada iluminancia en
la acumulacin de astaxantina en H. pluvialis. ................................................................. 37
Figura 2-9: Efecto de la concentracin celular y la intensidad de luz en la acumulacin de
astaxantina Pg/mL............................................................................................................. 38
Figura 3-1: Fotografa biorreactores utilizados en la experimentacin ............................ 44
Figura 3-2: Sistema de iluminacin por LEDs ................................................................. 44
Figura 3-3: Sistema de control de temperatura ............................................................... 45
Figura 3-4: Esquema de mezclado de aire y dixido de carbono .................................... 46
Figura 3-5: Diagrama de Pareto estandarizado para el efecto de los parmetros
ajustados sobre la velocidad especfica de crecimiento. .................................................. 52
Figura 3-6: Efecto de los parmetros sobre la velocidad especfica de crecimiento ....... 53
Figura 3-7: Superficie de respuesta para la velocidad especfica de crecimiento, 3,28 mM
NaNO3 y 2,58 mM de K2HPO4 y KH2PO4 .......................................................................... 53
Figura 4-1: Iluminacin con cintas LED tipo SMD del fotobiorreactor tipo airlift .............. 60
Figura 4-2: Esquema de mezclado de aire y dixido de carbono, control de flujo de aire y
nitrgeno ........................................................................................................................... 61
Figura 4-3 Fotobiorreactor tipo airlift para el cultivo de microalgas.................................. 63
Contenido
XVII
Figura 4-4 Respuesta ante impulsos cidos del electrodo de pH .................................... 67

Figura 4-5 Tiempos de mezclado en funcin del flujo de aireacin ................................. 67
Figura 4-6 Retencin de gas en funcin del flujo de aireacin ......................................... 68
Figura 4-7 Velocidad de descenso del medio lquido ....................................................... 69
Figura 4-8 Perfil de concentracin de Oxgeno disuelto para una flujo de 0,25 vvm ....... 69
Figura 4-9 Linealizacin de los perfiles de concentracin para el oxgeno disuelto para un
flujo de aireacin de 0,25 vvm .......................................................................................... 70
Figura 4-9 Coeficientes globales de transferencia de masa en funcin del flujo de
aireacin............................................................................................................................ 71
Figura 4-11 Curva de crecimiento de la microalga H. pluvialis en un fotobioreactor tipo
airlift................................................................................................................................... 73
Figura B-1: Superficie de respuesta para la velocidad especfica de crecimiento, 1% CO2
y 8500 Lux......................................................................................................................... 79
y 1,72 mM de K2HPO4 y KH2PO4 ..................................................................................... 79
Figura B-3: Superficie de respuesta para la velocidad especfica de crecimiento, 2,94
mM NaNO3 y 8500 Lux ...................................................................................................... 80
XVIII

Lista de tablas
Pg.
Tabla 1-1: Principales aplicaciones de la astaxantina .................................................... 5
Tabla 1-2: Densidad celular y velocidad especfica de crecimiento para diferentes
medios de cultivo autotrficos ........................................................................................... 10
Tabla 1-3: Comparacin de las propiedades de diferentes sistemas para el cultivo de
microalgas a gran escala (Borowitzka, 1999). .................................................................. 17
Tabla 1-4: Informacin industrial de produccin de astaxantina natural (Domnguez et
al. (2006); Rosenberg et al. (2008)). ................................................................................. 20
Tabla 2-1: Parmetros de estrs para acumulacin de astaxantina en la microalga
H. pluvialis......................................................................................................................... 26
Tabla 2-2: Comparacin de la concentracin celular mxima obtenida por diferentes
autores. ............................................................................................................................. 29
Tabla 2-3 Matriz de coeficientes del modelo logstico ajustado para los diferentes medios
de cultivo segn la Ecuacin 2.1. Desviacin estndar (DE) y coeficiente de
determinacin R2, Xmax y X0 en ClulasmL-1 y en da-1 .............................................. 31
Tabla 2-4 Anlisis de varianza (ANOVA) del efecto del medio de cultivo en la velocidad
especfica de crecimiento de la microlaga Haematococcus pluvialis............................... 32
Tabla 2-5 Anlisis de varianza (ANOVA) del efecto del medio de cultivo en la produccin
de biomasa de la microlaga Haematococcus pluvialis ..................................................... 32
Tabla 2-4: Tasa de aumento en la acumulacin de astaxantina ...................................... 39
Tabla 3-1: Niveles e intervalos de variacin de los parmetros ....................................... 46
Tabla 3-2: Diseo de experimentos rotacional para optimizar la velocidad especfica de
crecimiento de H. pluvialis ................................................................................................ 48
Tabla 3-3: Anlisis de varianza (ANOVA) para los parmetros ajustados ....................... 51
Tabla A-1: Composicin de los medios de cultivo empleados, cantidades para 1 L ....... 78
Contenido
XIX
Contenido
XX
Lista de Smbolos y abreviaturas

Smbolos con letras latinas
Smbolo
A
a
C
D
E
f
KLa
I
L
M
m
n
Pbio
Q
r
t
T
U
V
X
Trmino
rea
Coeficientes de ajuste polinomio de segundo
grado
Concentracin de oxgeno disuelto
Difusividad
Energa
frecuencia
Coeficiente global de transferencia de masa
Irradiancia
Longitud
Molaridad
Masa
Cantidad de materia
Productividad de biomasa
Caudal del gas
Radio
Tiempo
Temperatura
Velocidad del gas
Volumen
Densidad celular
Unidad SI
Definicin
m2

Kg/m3
Ec. 4.3
DF
mL2t-2
t-1
Ec. 4.4
EA-1t-1
DF
DF
DF
DF
mA-1t-1
DF
DF
DF
DF
M t-1

Ec. 2.1
J
Hz
t-1
Lux
m
Mol L-1
kg
mol
kgm-2s-1
L h-1
m
s
K
m/s
m3
N clulasm3
X0
Densidad celular inicial
Xmax
Densidad celular mxima
N clulas
m-3
N clulas
m-3
Ec. 2.1
Ec. 2.1
Smbolos con letras griegas

Smbolo
H
Trmino
Longitud de onda
Velocidad especfica de crecimiento
media
Error
Unidad SI
m
s-1
Definicin
DF
Ec. 2.1
Ec. 3.1
Contenido
XXI

Subndices
Subndice
bio
Max
0
L
O2
CO2
Trmino
Biomasa
Mximo
Valor inicial
Medio lquido
Oxgeno
Dixido de carbono

Superndices
Superndice Trmino
n
Exponente, potencia
*
saturacin

Abreviaturas
Abreviatura Trmino
DE
EE
HL
LO
n
p-valor
t
vvm
LED
Cel
Desviacin Estndar
Error estndar
Horas de luz diarias
Ciclo de luz oscuridad
Nmero de repeticiones
Valor probabilstico
Estadstico t de Student
Volumen de gas por volumen de lquido por minuto
Diodo de emisin de luz
Clulas
Introduccin
Las microalgas son microrganismos fotosintticos que tiene un alto valor industrial debido
a su gran aplicabilidad, ya que son tiles en la produccin de biodiesel, el tratamiento de
aguas residuales y la produccin de protena para la alimentacin animal y humana,
entre otras. Adems de las aplicaciones anteriores, estos microrganismos, presentan
como caracterstica especial la capacidad de acumular metabolitos de inters
biotecnolgico como los cidos grasos poli-insaturados de cadena larga y los
carotenoides (Cardozo et al., 2007).
El carotenoide de mayor importancia a nivel industrial es el E-caroteno, el cual es
producido utilizando la microalga marina unicelular Dunaliella salina (Prieto et al., 2011).
Desde entonces, se han desarrollado diversas investigaciones en torno a carotenoides
derivados del E-caroteno, que presentan mejores propiedades antioxidantes como la
astaxantina.
La microalga Haematococcus pluvialis es uno de los mejores productores del carotenoide

rojo astaxantina, ya que tiene la capacidad de acumular ms del 3% en peso seco de
pigmento (Hagen et al., 2001); sin embargo, esta microalga presenta una baja
productividad de astaxantina, debido a factores como un lento crecimiento, baja
concentracin celular y alta susceptibilidad a daos hidrodinmicos.
La produccin de este metabolito secundario est fuertemente relacionada con los

cambios morfolgicos producidos en la microalga desde un estado vegetativo verde en el
que se da el crecimiento, hasta un estado rojo de alta acumulacin de astaxantina. Estos
cambios son inducidos por diversos factores como la deficiencia de nutrientes (nitrato,
fosfato, sulfato), la intensidad lumnica, la salinidad del medio y las altas temperaturas,
entre otros (Tripathi et al., 2002).
Introduccin
La separacin y purificacin de este carotenoide tambin son de gran importancia para

su utilizacin industrial. Se han propuesto mtodos de extraccin con solventes orgnicos
como el diclorometano, la acetona y el hexano, entre otros, pero algunos de ellos pueden
ser txicos, lo que restringe su uso para aplicaciones comerciales en alimentos y
productos farmacuticos (Krichnavaruk et al., 2008). Esto hace necesario plantear otros
mtodos de separacin, que no alteren las propiedades fsico-qumicas del producto.
La astaxantina es ampliamente utilizada en la acuicultura como aditivo para la

pigmentacin de salmn, trucha, camarn, algunos peces ornamentales y muchos
crustceos (Lorenz & Cysewski, 2000). Estudios recientes sealan otras propiedades de
la astaxantina con potencial aplicacin en las industrias farmacutica y cosmtica tales
como su elevada actividad antioxidante, excelentes propiedades como agente
fotoprotector (luz UV), propiedades para la salud ocular, de la piel, del corazn y a nivel
celular y otros usos potenciales como anti-inflamatorio, anti-cancergeno, desintoxicante,
en enfermedades neurodegenerativas y en la respuesta inmune (Guerin et al., 2003).
Las industrias anteriormente mencionadas han encontrado numerosas ventajas en la

utilizacin de astaxantina natural frente a la sinttica en sus aplicaciones, lo que ha
generado un aumento en la demanda de este producto natural e impulsado el uso de
microorganismos capaces de sintetizar astaxantina. Por este motivo, es necesario
realizar
diferentes
investigaciones
encaminadas
utilizar
la
cepa
nativa
de
Haematococcus pluvialis para la produccin del pigmento a nivel industrial.
Kaewpintong et al. (2007) evaluaron el efecto de diferentes medios de cultivo y la adicin

de vitamina B12 en la produccin de biomasa, identificando el medio F1 con una
concentracin de vitamina B12 de 12 mg/L, como el que genera la mxima densidad
celular de 8,4 x 104 Cel mL-1. Tambin evaluaron la concentracin de CO2 en el aire
burbujeado, y encontraron que al aplicar una concentracin del 1% en volumen en el aire
se optimiza el crecimiento para el medio de cultivo, obteniendo una densidad celular de
79,5 4 x 104 Cel mL-1 y una velocidad especifica de crecimiento de 0,45 d -1.
Sin embargo, los medios de cultivo no son el nico factor determinante en el diseo de
este tipo procesos; otros autores proponen el estudio de los efectos hidrodinmicos
evaluando los efectos del flujo de aire en el dao celular. La velocidad superficial del gas
Introduccin
en el dispersor (variando el flujo de aire) y en la velocidad de entrada de gas (para

diferentes aspersores) de un fotobioreactor tipo airlift de pared plana, sobre el
crecimiento de H. pluvialis, fue evaluado por Vega-Estrada et al. (2005), encontrando que
los daos celulares por efectos hidrodinmicos son reducidos cuando el biorreactor es
operado con una velocidad superficial y de entrada de 12 mm/s y 22.8 m/s
respectivamente. Los autores calcularon el coeficiente volumtrico de transferencia de
masa para el fotobioreactor, y encontraron que es de 10 h-1 y 32 h-1 para una velocidad
superficial de 6 y 24 mm/s respectivamente.
Adems de los factores ya mencionados, es importante definir el mtodo de separacin y

purificacin ms adecuado. Krichnavaruk et al. (2008) proponen la extraccin con dixido
de carbono supercrtico como mtodo de separacin de astaxantina en Haematococcus
pluvialis, evaluando los aceites de soya y de oliva como co-solventes, con un flujo
constante de 3 mL/min de CO2 a 70 C y 40 MPa. La utilizacin de 10% de aceite de
soya incrementa la eficiencia de separacin a 36,6%, mejorando en un 30% la eficiencia,
comparada con el uso de CO2 sin co-solvente; en cambio el uso de 10% de aceite de
oliva incrementa la eficiencia separacin a un 51,03%.
El aporte que este trabajo busc hacer al rea de investigacin en el cultivo de

microalgas estuvo centrado en la produccin de carotenoides respondiendo a la siguiente
pregunta de investigacin: Cules son las condiciones ptimas de crecimiento y
produccin de astaxantina en la microalga Haematococcus pluvialis en un fotobioreactor
tipo airlift?
Objetivos
Objetivo general
Determinar las condiciones ptimas de crecimiento y produccin de astaxantina en la
microalga Haematococcus pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift a nivel de laboratorio.
Objetivos especficos
1. Estandarizar las condiciones de cultivo de la microalga Haematococcus pluvialis

para optimizar la acumulacin de astaxantina en la clula a nivel laboratorio (100
mL).
2. Evaluar el efecto de la concentracin celular y alta intensidad lumnica en la

acumulacin de astaxantina en la microalga nativa de Haematococcus pluvialis
3. Disear y construir un fotobiorreactor tipo airlift a nivel laboratorio (1 L).
4. Evaluar el crecimiento y la acumulacin de astaxantina en la microalga

Haematococcus pluvialis en el fotobiorreactor tipo airlift a nivel laboratorio (1 L).
1. Una
revisin
de
la
microalga
Haematococcus pluvialis como fuente de
Astaxantina natural.
Resumen
La astaxantina es un pigmento carotenoide de color rojizo, soluble en lpidos y con una
potente actividad antioxidante, que se usa como suplemento en dietas animales para
impartir coloracin y en la alimentacin humana como antioxidante. El inters comercial
en Haematococcus pluvialis radica en su capacidad de acumular altos niveles de
astaxantina natural comparada con otras fuentes. El principal problema para su
escalamiento industrial es su elevado costo de produccin comparado con el de la
astaxantina sinttica. Para intentar resolver estos problemas, muchas investigaciones
han buscado optimizar algunas de las variables ms importantes del proceso de
crecimiento de la microalga y la acumulacin del carotenoide, incluyendo la intensidad de
luz, diferentes medios de cultivo, el efecto del nitrgeno, fsforo, minerales y la
temperatura, entre otros. Adems se ha propuesto el uso de diferentes fotobiorreactores
para reducir el estrs hidrodinmico, as como diferentes procesos posteriores de
separacin y purificacin de la astaxantina. En el presente capitulo se har una revisin
de la literatura cientfica relacionada con el potencial de Haematococcus pluvialis para la
produccin industrial de astaxantina.
Palabras claves: Haematococcus pluvialis, fotobiorreactores, astaxantina, estrs

hidrodinmico.
Abstract
Astaxanthin is a lipid-soluble, reddish carotenoid pigment with a potent antioxidant
activity. It is used as food supplement for both animal feed to impart coloration and human
food as antioxidant. The commercial interest in Haematococcus pluvialis lies on its ability
Captulo 1 Una revisin de la microalga Haematococcus pluvialis como fuente
de Astaxantina natural.
to accumulate high levels of natural astaxanthin compared to other sources. The high
production cost compared to synthetic astaxanthin is the main problem for industrial
scaling-up. In an attempt to solve this problem, research has been focused to optimize
some of the most important process variables for microalga growth and carotenoid
accumulation, including irradiance, culture media, nitrogen, phosphorus, minerals and
temperature, among others. It also has been proposed the use of different
photobioreactors for hydrodynamic stress reduction as well as different separation and
purification processes. This chapter reviews scientific reports related to the potential of
Haematococcus pluvialis for industrial production of natural astaxanthin.
Keywords: Haematococcus pluvialis, photobioreactors, astaxanthin, hydrodynamic

stress.
1.1 Introduccin
Las microalgas son microrganismos fotosintticos con enorme potencial en la produccin
de biodiesel, el tratamiento de aguas residuales y la produccin de protena para la
alimentacin animal y humana, entre otros. Estos microorganismos, presentan como
caracterstica especial la capacidad de acumular metabolitos de inters biotecnolgico
como los cidos grasos poli-insaturados de cadena larga y los carotenoides (Cardozo et
al., 2007).
El carotenoide de mayor importancia a nivel industrial es el E-caroteno, el cual es
producido utilizando la microalga marina unicelular Dunaliella salina (Prieto et al., 2011).
Desde entonces, se han desarrollado diversas investigaciones en torno a carotenoides
derivados del E-caroteno, que presentan mejores propiedades antioxidantes como la
astaxantina. Por ejemplo (OConnor & OBrien, 1998) muestran en su investigacin que
se requiere utilizar una cantidad menor de astaxantina (0,01 mM) frente a la utilizacin de
E caroteno (1 mM) o lutena (1mM), para reducir el estrs oxidativo, sometiendo ratas a
exposicin de luz UVA por 4 horas.

La astaxantina es un carotenoide rojo liposoluble de gran capacidad antioxidante, es

ampliamente utilizado en la acuicultura como aditivo para la pigmentacin de salmn,
trucha, camarn, algunos peces ornamentales y muchos crustceos (Lorenz & Cysewski,
2000). Adems, las industrias farmacutica y cosmtica han realizado estudios, que
detacan su elevada actividad antioxidante, excelentes propiedades como agente
fotoprotector (luz UV), propiedades para la salud ocular, de la piel, del corazn y a nivel
celular y otros usos potenciales como anti-inflamatorio, anti-cancergeno, desintoxicante,
en enfermedades neurodegenerativas y en la respuesta inmune (Guerin et al., 2003).
Las industrias anteriormente mencionadas han encontrado numerosas ventajas en la

utilizacin de astaxantina natural frente a la sinttica en sus aplicaciones, lo que ha
generado un aumento en la demanda de este producto natural e impulsado el uso de
microorganismos capaces de sintetizar astaxantina (Lorenz & Cysewski, 2000)Por este
motivo, es necesario realizar diferentes investigaciones encaminadas a mejorar la
produccin del pigmento aprovechando cepas nativas de microalgas que permita
incrementar la rentabilidad del proceso
La microalga Haematococcus pluvialis es uno de los mejores productores del carotenoide

rojo astaxantina, ya que tiene la capacidad de acumular ms del 3% en peso seco de
pigmento (Hagen et al., 2001); sin embargo, esta microalga puede presentar baja
productividad de astaxantina dificultando su uso comercial, si no se optimizan las
condiciones de cultivo, debido a factores como un lento crecimiento, baja concentracin
celular y alta susceptibilidad a daos hidrodinmicos. El presente documento hace una
revisin sobre el potencial que tiene la microalga Haematococcus pluvialis para la
produccin de astaxantina, abarcando temas como las condiciones de cultivo, mtodos
de estrs celular, cultivo en fotobiorreactores y diferentes mtodos de extraccin.
1.2 Astaxantina
La astaxantina (3,3'dihidroxi4,4'dicetoEEcaroteno) se distingue por tener una
cadena polinica de once dobles enlaces conjugados, responsables del intenso color rojo
brillante del cromforo. Presenta un anillo cclico en cada extremo de la molcula, un
grupo funcional hidroxlico en cada uno de los carbones 4 y 4' (Figura 1-1). La existencia
de dichos radicales oxigenados en los extremos lo caracteriza entre los carotenoides
como un oxicarotenoide o xantofila (Snchez & Flores, 1999).
Figura 1-1: Estructura molecular de la Astaxantina (Snchez & Flores, 1999)
1.2.1
Aplicaciones
Los pigmentos carotenoides son de gran importancia para diferentes sectores, entre los
que se destacan la acuicultura, la ornitologa y la industria farmacutica, desempeando
funciones vitales en la fisiologa y la salud de diferentes especies biolgicas. En la Tabla
1-1 se muestra un resumen de las principales aplicaciones de la astaxantina.
Tabla 1-1:
Sector
Acuicultura
Ornitologa
Farmacutica
Principales aplicaciones de la astaxantina

Aplicacin
Funcin
Pigmentacin
Salmn y Trucha
Etapas del crecimiento
Peces
Marinos- Pigmentacin
Besugo
Peces
Pigmentacin
ornamentales
Cultivos
de Pigmentacin
camarn
Gallinas
Color yema de los
huevos
Pollos
Pigmentacin
Radicales libres
Antioxidante
Peroxidacin
Antioxidante
Salud humana
Anti-cancergeno
Piel, ADN y retinas Foto-protector
Fuente
(Domnguez
et
al., 2005; Lawlor
& O'Brien, 1995;
Lorenz
&
Cysewski, 2000)
(Inborr, 1998)
(Barros et al.,
2001; Guerin et
al., 2003; Kamath
et
al.,
2008;
Mortensen et al.,
1997;
Naguib,
2000; Pashkow et
al., 2008)

1.2.2 Fuentes
Sinttica
Actualmente las ms importantes empresas que producen y comercializan la astaxantina

sinttica son DSM (DSM Carophyll Pink 10% CWS) (Mayer & Muller, 1981) y BASF
The Chemical Company (BASF Lucantin Pink) (Wolfgang et al., 1997).
Mayer & Muller (1981) describen un proceso de produccin patentado para la produccin
de astaxantina a partir de compuestos como 3-acetoxi-4-oxo-E-ionona o 3-hidroxi-4-oxoE-ionona, los cuales son disueltos en solventes derivados del petrleo (tetrahidrofurano,
etilenglicol, metanol, etc.) y enfriados a temperaturas que van desde -5 C hasta 75 C,
terminando con un proceso de extraccin y cristalizacin utilizando ter y hexano.
Wolfgang et al. (1997) en su invencin muestran un proceso de produccin de

astaxantina a partir de la reaccin de una sal de trifenilfosfonium con un dialdehido de 10
carbonos. La reaccin se da en etanol o metanol a una temperatura entre 40 C hasta 60
C, finalizando con la adicin de agua para la precipitacin de la astaxantina.
Natural
En la naturaleza, la astaxantina es producida por el plancton y algunos tipos de algas, los

cuales son ingeridos por diversas especies acuticas, incluyendo a los crustceos, entre
los que se encuentran los langostinos, que almacenan el pigmento en su cubierta, dando
lugar a su color rojizo externo. A su vez, los crustceos son ingeridos por los peces
(como el salmn o la trucha) o por las aves (flamingos, ibis rojo) (Cohen, 1999).
Industrialmente solo se han utilizado algunos crustceos, algas y levaduras para la

produccin de este carotenoide. Los crustceos se han utilizado para la pigmentacin de
salmn, pero no solo contienen una baja concentracin de astaxantina, sino que adems
contiene una alto nivel de cenizas, quitina y humedad lo que ocasiona problemas
tcnicos en la formulacin de las dietas (Domnguez, 2003).
Phaffia rhodozyma es una levadura que gracias a su capacidad de sintetizar astaxantina,

ha sido considerada como un desarrollo comercial interesante para la industria de los
carotenos. Esta levadura puede crecer en fermentadores con una alta densidad celular (>
50 g/L). La principal limitacin que presenta P. rhodozyma es la pequea acumulacin de
astaxantina que se encuentra en su pared celular, por lo cual la industria est utilizando
clulas genticamente modificadas capaces de producir mas de 10 mg/g de astaxantina
(Fang & Wang, 2002; Johnson, 2003).
Si se analiza la productividad del pigmento se ha observado para H. pluvialis valores
entre 290 Pg g-1 da-1 y 471 Pg g-1 da-1 y para P. rhodozyma valores entre 170 Pg g-1 da-1
y 370 Pg g-1 da-1, dependiendo de las condiciones de crecimiento, mostrando una
ventaja comercial de la microalga sobre la levadura (Domnguez-Bocanegra et al., 2007).
1.3 Haematococcus pluvialis

Haematococcus pluvialis es alga unicelular de agua dulce, con un tamao celular entre 8
y 50 Pm, que se caracteriza por presentar dos flagelos con los que se desplaza.
Usualmente se encuentra en las regiones templadas alrededor del mundo, con una
coloracin rojiza, debido a la produccin de astaxantina como medio de proteccin frente
a los rayos ultravioletas provenientes del sol, pero sus esporas pueden volver al estado
vegetativo verde de la clula despus de un tiempo de inactividad en condiciones
favorables para el crecimiento (Dore & Cysewski, 2003).
H. pluvialis se puede encontrar en diferentes estados o fases de crecimiento a durante su

ciclo de vida; en la primera forma, donde se da el crecimiento, la clula es verde,
presenta flagelos denominndose clula vegetativa; una forma sin flagelos y verde se
denomina palmella, y otra forma roja, en donde se da la acumulacin de astaxantina, se
denomina aplanspora (Figura 1-2), En esta ltima fase se produce la acumulacin de
astaxantina en grandes cantidades, adquiriendo una coloracin rojiza (Domnguez et al.,
2006; Kobayashi et al., 1997). Los cambios de fase en el crecimiento de H. pluvialis estn
caracterizados por la prdida de los flagelos y la formacin de una matriz extracelular
gelatinosa, siendo ms grande y resistente la clula como aplanspora (Hagen et al.,
2002).

Figura 1-2: Fases de crecimiento de Haematococcus pluvialis (Hagen et al., 2002)

A.
B.
C.
1.3.1
Clula vegetativa.
Palmella.
Aplanspora.
Ruta de sntesis de Astaxantina
La fraccin de carotenos en las clulas vegetativas est compuesta principalmente por

lutena (75-80%) y E-caroteno (10-20%). Una vez la clula es estresada y llega a la fase
aplanspora su composicin se transforma prcticamente en el caroteno astaxantina
(Lorenz, 1999). El E- caroteno es convertido en astaxantina por la adicin de grupos
carbonilos en la posicin 4 y 4, y grupos hidroxil en la posicin 3 y 3. Estas reacciones
son catalizadas por E-caroteno cetolasa (4,4- oxigenasa; CRTW, BKT o CRTO) y Ecaroteno hidroxilasa (3,3- oxigenasa; BCH o CRTZ), respectivamente. La presencia de
echinenona y cantaxantina en los microorganismos muestra que es prioritaria la
formacin de los grupos carbonilos frente a la hidroxilacin. La formacin de estos grupos
es catalizada por E-caroteno cetolasa (BKT) con el intermediario mono cetocarotenoide
(echinenona), mientras que la formacin de grupos hidroxlicos esta catalizada por una
hidrolasa para formar la astaxantina (Figura 1-3) (Zhu et al., 2009).

Figura 1-3: Ruta de sntesis de astaxantina en la microalga Haematococcus pluvialis

(Zhu et al., 2009)
10

1.4 Condiciones de crecimiento

1.4.1
Medios de cultivo
Se han reportado diferentes medios de cultivo para el crecimiento autotrfico de H.

pluvialis entre los que se destacan los medios OHM (Fbregas et al., 2001), F1
(Issarapayup et al., 2009) y Basal (Vega-Estrada et al., 2005) por su alta productividad.
Kaewpintong et al. (2007) han realizado diversos estudios, en los que se hace una
comparacin entre los medios F1 y Basal, con otros medios utilizados en la literatura por
diferentes autores como los medios M1, M6, Hong Kong, BG-11 y una mezcla de
Basal:BG-11 (1:1) (la composicin de cada uno de estos medios se muestra en el Anexo
A); estos autores han encontrado una alta dependencia del crecimiento de H. pluvialis
con relacin al medio de cultivo utilizado, reportando un bajo crecimiento en los medios
M1 y M6, y una alta densidad celular en el medio F1. El medio de cultivo Hong-Kong
muestra resultados muy similares a los medios de cultivo BG11 y Basal:BG11 (Tabla
1-2).
Medio de Cultivo
M1
Basal
F1
BG-11
Hong Kong
M6
Basal:BG-11
OHM
Z8
Medio de Cultivo
M1
Basal
F1
BG-11
Hong Kong
M6
Basal:BG-11
OHM
Z8
Tabla 1-2:
(Kaewpintong
et al., 2007)
0,5 x 104
0,9 x 104
5,5 x 104
3,5 x 104
3,1 x 104
0,5 x 104
3,3 x 104
Densidad celular mxima Cel/mL

(Fbregas et (Tripathi et al.,
(Issarapayup
al., 2001)
2002)
et al., 2009)
1,5 105
1,8 105
6,25 x 105
0.8 105
Velocidad especifica de crecimiento mxima d-1
(Kaewpintong (Fbregas et (Tripathi et al,
(Issarapayup
et al, 2007).
al 2001)
1999).
et al, 2009).
0,010
0,032
--0,200
0,225
0,130
0,110
0,010
0,125
0,130
---
Densidad celular y velocidad especfica de crecimiento para diferentes
medios de cultivo autotrficos
11
Fbregas et al. (2001) han reportado una alta densidad celular con un medio de cultivo
ptimo para el crecimiento de Haematococcus pluvialis (OHM), de 6,25 x 105 cel/mL. Por
otro lado Tripathi et al. (1999), desarrollan un estudio con los medios de cultivo Basal y
Z8, encontrando una mayor densidad celular en el medio basal. Issarapayup tambin
realiza un estudio con el medio F1, encontrando una alta velocidad especfica de
crecimiento (Issarapayup et al., 2009) (Tabla 1-2). Todos los autores utilizaron
condiciones de cultivo diferentes, en algunos casos en biorreactores y en otros los
medios de cultivo son optimizados para una cepa especfica, lo que dificulta encontrar
una correlacin entre los medios de cultivo y el crecimiento de la microalga.
1.4.2
Iluminancia, CO2, temperatura y sales en el medio de

cultivo
La intensidad lumnica es uno de los factores ms importantes tanto en el crecimiento de

la clula como en la acumulacin de astaxantina. Se ha encontrado que se pueden
obtener gran cantidad de biomasa y una alta tasa de supervivencia de las clulas de
Haematococcus al usar bajas intensidades de luz (< 37 Pmol/m2s) (Cohen, 1999). Harker
y colaboradores, han encontrado altas tasas de crecimiento cuando se usa una
intensidad de luz de 2 y de 37 Pmol/m2s, e inhibicin del crecimiento a 89 Pmol/m2s
(Harker et al., 1996); al igual que Harker, Katsuda et al. (2004) muestran un alta densidad
celular al usar 8 Pmol/m2s para diferentes fuentes de luz (LEDs y lmparas
fluorescentes).
Por otro lado Choi et al. (2003) han encontrado un 15% ms de crecimiento a 90
Pmol/m2s comparado con la exposicin a 40 y 140Pmol/m2s. Zhang et al. (2009)
muestran velocidades de crecimiento incluso por encima de los 100 Pmol/m2s, en ambos
casos se hace un aumento progresivo de la intensidad lumnica, obteniendo crecimiento
celular y acumulacin de astaxantina en el mismo proceso. Estos resultados demuestran
que la intensidad de luz est directamente relacionada con la cepa, mostrando en
algunas investigaciones inhibicin de crecimiento y en otras altas velocidades de
crecimiento a elevadas intensidades de luz con diferentes fuentes de irradiacin.
12

Cuando H. pluvialis es cultivada en medios con limitaciones de nitrgeno, el crecimiento

del alga se ve restringido y la sntesis de astaxantina es estimulada. Se tienen efectos
similares cuando el alga es sometida a altas concentraciones de hierro, bajas
concentraciones de fosfatos y a medios salinos. Harker et al. (1996), han observado que
se obtiene el mximo crecimiento de la microalga cuando sta es sometida a una
concentracin de inicial en el medio de cultivo de nitrgeno (NaNO3) de 3 mM, de fosfato
(K2HPO4 y KH2PO4) de 3,4 mM y 18 PM de hierro (FeSO4.7H20), mientras que se obtiene
la mxima acumulacin de astaxantina en ausencia total de nitrgeno, una concentracin
de fosfato de 0,85 mM y 72 PM de hierro.
Garca-Malea et al. (2005), evalan la produccin de clulas vegetativas de H. pluvialis

determinando el efecto de la irradiacin y la deficiencia de nutrientes en cultivos
discontinuos. Los cultivos no fueron fotoinhibidos hasta una irradiacin mxima de 2500
Pmol/m2s, y se observ una velocidad especfica de crecimiento de 0,57 d-1 con una
concentracin de nitrgeno en el medio de 10 mM de nitrato. Solo se observ
acumulacin de astaxantina cuando la deficiencia de nitrgeno lleg a 0,2 mM.
Sarada et al. (2002b) encontraron que concentraciones por encima del 1% w/v de NaCl
son letales para el crecimiento de la microalga, mientras que una concentracin de 0,5%
favorece la acumulacin de astaxantina. En el mismo estudio se muestra la mxima
densidad celular a un pH de 7, mientras que no se observa crecimiento a pH de 5 y muy
baja densidad celular a pH de 9.
Kaewpintong et al. (2007) evalan la concentracin de CO2, como fuente de carbono

encontrando que al aplicar una concentracin del 1% en volumen en el aire se optimiza el
crecimiento de H. pluvialis. Algunos autores como Jeon et al. (2006) y Hata et al. (2001),
proponen el uso de medios de cultivo hetertrofos, utilizando acetato de sodio como
fuente de carbono; mostrando que la concentracin ptima para el crecimiento de la
microalga es de 38 mM y 30 mM de acetato respectivamente, e inhibicin del crecimiento
a altas concentraciones (>50 mM).
13
1.4.3
Factores hidrodinmicos y de diseo
Las condiciones de cultivo no son el nico factor determinante en el diseo de este tipo
procesos; otros autores proponen el estudio de los efectos hidrodinmicos, evaluando los
efectos del flujo de aire en el dao celular. La velocidad superficial del gas en el dispersor
y en la entrada de un fotobioreactor tipo airlift de pared plana, sobre el crecimiento de H.
pluvialis fue evaluado por Vega y colaboradores (Vega-Estrada et al., 2005), encontrando
que los daos celulares por efectos hidrodinmicos son reducidos cuando el biorreactor
es operado con una velocidad superficial y de entrada de 12 mm/s y 22,8 m/s
respectivamente. Los autores calcularon el coeficiente volumtrico de transferencia de
masa para el fotobiorreactor, y encontraron que es de 10 h-1 y 32 h-1 para una velocidad
superficial de 6 y 24 mm/s respectivamente.
Kaewpintong et al. (2007) muestran que la aireacin es un parmetro crucial en el

crecimiento apropiado de H. pluvialis en los bioreactores airlift, pero es preferible la
utilizacin de bajos niveles de aireacin para reducir el estrs hidrodinmico. La
velocidad superficial del aire que mostr mejores resultados fue 0,4 cm/s y el menor
dimetro del dispersor tiene una influencia positiva en el crecimiento de la clula. Las
condiciones que presentaron el mejor crecimiento fueron el 1% de CO 2 y 20 Pmol/m2s,
respectivamente.
Harker et al. (1996) estudiaron la produccin de astaxantina en Haematococcus pluvialis

en un reactor airlift de 30 L. Los autores desarrollaron el cultivo en dos etapas en
discontinuo, en donde la primera fase se cultiva con las condiciones constantes de luz,
nitrgeno y fosfato, que proporcionan el mximo crecimiento celular, y en la segunda
fase, se toman las clulas en estado estacionario y se adiciona NaCl para generar estrs
y acumular astaxantina, produciendo el 2,7 % en peso de este carotenoide con mas del
95% de la astaxantina esterificada.
Otros autores han investigado el efecto del crecimiento de H. pluvialis en diferentes

biorreactores, Garca-Malea Lpez et al. (2006) compararon un fotobioreactor tubular con
una columna de burbujeo, encontrando una mayor concentracin de biomasa y mayor
productividad global de biomasa en los fermentadores tubulares (7,0 g/L y 0,41 g/l da
14

respectivamente), que los encontrados en la columna de burbujeo (1,4 g/L y 0,06 g/Lda).
Adems la acumulacin de astaxantina solo fue observada en los fotobioreactores
tubulares cuando la deficiencia de nitrgeno estaba por debajo de los 5,0 mM. De igual
manera Ranjbar et al. (2008a) encontraron mayor rendimiento al utilizar un fotobioreactor
tipo airlift comparado con una columna de burbujeo, alcanzando 4,8 g/L y 4,4 g/L de
biomasa respectivamente.
Adems se ha intentado que el crecimiento de las clulas vegetativas vaya acompaado

de la acumulacin de astaxantina, utilizando un nico birreactor, por ejemplo Suh et al.
(2006) disean un fotobioreactor con dos regiones, en la que la regin exterior recibe la
intensidad de luz de forma directa y una superficie interior absorbe solo la luz restante de
la primera regin. De esta manera se optimiza la irradiacin y se permite que los cultivos
por lotes (exterior e interior) del reactor presenten crecimiento y acumulacin de
astaxantina simultneamente, obteniendo una concentracin celular de 4,0 x 10 5 Cel /mL
en el interior y 5,79% en peso seco de astaxantina.
1.5 Mtodos de separacin y purificacin

La astaxantina es insoluble en soluciones acuosas, pero soluble en diclorometano (30
g/L), en cloroformo (10 g/L), acetona (0.2 g/L), dimetilsulfxido (0.5 g/L) y otros solventes
polares. Es sensible a la luz, a la temperatura, a los cidos, al oxgeno, a la presencia de
lcalis y en condiciones de saponificacin sufre una conversin a astaceno (MelndezMartnez et al., 2007). Las operaciones de separacin por extraccin con solventes
orgnicos no pueden emplearse ya que los residuos no son permitidos en aplicaciones
alimenticias.
El mtodo propuesto para la separacin de la astaxantina en la mayora de las

investigaciones es la separacin por fluidos supercrticos utilizando dixido de carbono,
ya que es una metodologa ampliamente utilizada con elevados rendimientos de
extraccin de cafena, metabolitos de diferentes plantas algas y microalgas (Herrero et
al., 2006; Moreno et al., 2007; Mustafa & Turner, 2011; Ordez et al., 2006; Reverchon
& De Marco, 2006), pero su aplicacin puede ser costosa a nivel industrial siendo
rentable solo para productos de alto valor agregado.
15
Krichnavaruk et al. (2008) proponen la extraccin con dixido de carbono supercrtico,

evaluando los aceites de soya y de oliva como co-solventes, con un flujo constante de
3mL/min de CO2 a 70 C y 40 MPa. La utilizacin de 10% de aceite de soya incrementa
la eficiencia de separacin a 36,6%, mejorando en un 30% la eficiencia, comparada con
el uso de CO2 sin co-solvente; similarmente, el uso de 10% de aceite de oliva incrementa
la eficiencia a un 51,03%.
Los resultados de Valderrama et al. (2003) para la extraccin de astaxantina con fluidos
supercrticos muestran que el rompimiento de la pared celular tiene un efecto importante
en la eficiencia de separacin y la adicin de etanol como co-solvente tiene un efecto
poco significativo, alcanzando un rendimiento en la extraccin del 1,7 % en masa.
Lim et al. (2002) realizan una investigacin sobre la extraccin de astaxantina en la

levadura Phaffia rhodozyma mediante la extraccin por fluidos supercrticos, mediante el
rompimiento de la pared celular y el secado de las clulas, evaluando los efectos de la
presin (100-500 bar), la temperatura (40-80 C), velocidad superficial de CO2 (0,27-0,54
cm/min) y el uso de etanol como co-solvente (1-15%) determinando que la eficiencia de
separacin fue del 90% a 40 C y 500 bar. Sun & Temelli (2006) encontraron que el
rendimiento de la separacin de carotenoides en la zanahoria se duplica mediante la
utilizacin de aceite de canola como co-solvente frente al uso de CO2 puro.
1.6 Fotobiorreactores
1.6.1
Sistemas abiertos
Aunque la gran mayora de los cultivos industriales en el mundo estn enfocados a el uso
de fotobioreactores cerrados, gran cantidad de sistemas estn usando fotobioreactores
abiertos gracias a su gran economa; los sistemas cerrados son muy costosos y la
mayora de ellos son muy difciles de escalar (Tabla 1-3). Entre los
sistemas ms
utilizados para estos cultivos se encuentran los grandes estanques de poca profundidad,
tanques, estanques rectangulares y estanques tipo raceway.
16

El principal problema con este tipo de sistemas es la baja productividad comparada con
la esperada tericamente, adems de una alta dificultad para controlar las condiciones
del cultivo. Los estanques profundos se deben disear para asegurar una adecuada
iluminacin en las clulas y la necesidad de mantener un nivel adecuado de agua para
mezclar y evitar los cambios de composicin en el medio por evaporacin. La
profundidad recomendada para los estanques tipo raceway est comprendida entre 20 y
30 cm, y un rea de cultivo muy grande (250 ha). En este tipo de sistemas los
rendimientos que se obtienen gracias a estas dificultades estn entre 0,1 y 0,5 g/L
(Borowitzka, 1999)
1.6.2
Sistemas cerrados
A pesar del xito de los sistemas abiertos, los futuros avances para el cultivo en masa de
las microalgas van a requerir del uso de sistemas cerrados, para evitar el crecimiento de
contaminantes como metales pesados y otros microorganismos, sin embargo los altos
costos no han permitido su utilizacin. Las algas pueden ser cultivadas en sistemas
fotoautotrficos, mixotrficos o heterotrficos. Los cultivos heterotrficos usan como
fuente de carbono acetatos o glucosa, pero los costos de produccin son muy altos y los
productos no tienen las mismas caractersticas que los cultivos fotoautotrficos. A pesar
de estos inconvenientes, estos cultivos pueden alcanzar una densidad celular de 20 a
100 g/L (Borowitzka, 1999).
Los reactores cerrados presentan grandes ventajas, como una mayor esterilidad del
cultivo, una alta eficiencia en la utilizacin de la luz, control de temperatura, y la
posibilidad de utilizar la luz del da. Lo que significa que diferentes especies pueden ser
cultivadas libres de contaminantes, el reactor pueden ser operado a diferentes
condiciones climticas y la facilidad para controlar las condiciones de cultico dan un
producto final de mejor calidad y composicin. Esto resulta una mayor produccin celular
y una menor utilizacin de la tierra, pero se deben hacer estudios para reducir el costo de
fabricacin de estos reactores para hacerlos econmicamente competitivos (Borowitzka,
1999).
17
Comercialmente se tiene una serie de fotobioreactores cerrados, entre los que se

encuentra los fotobioreactores de pared plana, los fotobioreactores tubulares, de columna
vertical y con iluminacin interna (Ugwu et al., 2008). Diferentes autores han demostrado
la factibilidad econmica en la utilizacin de fotoboreactores para el cultivo de microalgas
como Chlorococum littorale y Chaetoceros calcitrans (Krichnavaruk et al., 2005;
Krichnavaruk et al., 2007; Sato et al., 2006), as como para el cultivo de Haematococcus
pluvialis, con productividades de 0,06 g L
Lpez et al., 2006) y 0,052 g L
-1
-1
da-1 en una columna de 55 L (Garca-Malea
da-1 en un reactor exterior de 25000 L (Olaizola, 2000).
As mismo Garca-Malea et al. (2006) logran aumentar la productividad de biomasa a

0,68 g L
-1
da-1 utilizando un reactor tubular externo operado en forma continua y
Boussiba (2000) una productividad de 0,6-0,7 g L
-1
da-1 utilizando un panel alveolar
vertical.
Tipo de
reactor
Mezclado
Utilizacin
de la Luz
Control de
temperatura
Transferencia
del gas
estrs
hidrodinmico
control
de
especies
esterilidad
Escalado
Estanques
muy
pobre
pobre
ninguno
pobre
muy bajo
difcil
ninguna
muy difcil
Tanques
pobre
muy pobre
ninguno
pobre
muy bajo
difcil
ninguna
muy difcil
Estanques
circulares
razonable
Aceptable
ninguno
pobre
Bajo
difcil
ninguna
muy difcil
estanques
raceway
Aceptable
Aceptable
ninguno
pobre
Bajo
difcil
ninguna
muy difcil
Tanque de
mezclado
la mayor
parte
uniforme
Aceptable
Excelente
medio
Alto
fcil
fcil
difcil
reactores
airlift
Uniforme
bueno
Excelente
alto
Bajo
fcil
fcil
difcil
Reactores
planos
Uniforme
excelente
Excelente
alto
Medio
fcil
factible
difcil
Reactores
tubulares
(tipo
serpentn)
Uniforme
excelente
Excelente
medio
Medio
fcil
factible
fcil
Tabla 1-3:
Comparacin de las propiedades de diferentes sistemas para el cultivo de
microalgas a gran escala (Borowitzka, 1999).
18

1.7 Mercado de Haematococcus pluvialis

El mayor consumo de astaxantina en la actualidad es como fuente de pigmentacin en
acuicultura, especialmente en salmn y trucha. La astaxantina es comercializada con un
costo de US$2000 a US$2500/Kg, con un mercado mundial anual estimado de US$200
millones. Sin embargo, el 95% de este mercado consume astaxantina sinttica
desplazando la produccin de astaxantina natural (Li et al., 2011; Lorenz & Cysewski,
2000).
Actualmente la astaxantina natural no es competitiva comercialmente, ya que se requiere

alcanzar un costo de produccin de biomasa y de separacin y purificacin de la
astaxantina menor a US$30/Kg de biomasa (considerando un 3% de acumulacin de
astaxantina en Haematococcus) para competir con los costos de produccin de
astaxantina sinttica que son de US$1000/Kg de astaxantina. Bajo estas condiciones, la
astaxantina natural solo ser rentable como complemento alimenticio, si la tecnologa de
produccin es optimizada, o si los consumidores de salmn y trucha son concientes de
los beneficios de usar productos naturales y estn dispuestos a pagar un valor ms alto
por este tipo de productos, tal como sucedi en los mercados de la vitamina E y el Ecaroteno (Olaizola, 2003).
Desde 1990 se estableci la gran capacidad antioxidante de la astaxantina, lo que abre

una oportunidad en el mercado de los productos nutracuticos para consumo humanos.
El precio en el mercado de la astaxantina grado nutracutico es de US$100000/Kg, el
cual justifica los altos costos de produccin de astaxantina natural. Actualmente este
mercado es de unos pocos millones de dlares al ao, pero ha tenido un rpido
crecimiento (Olaizola, 2003).
Li et al. (2011) muestran en su investigacin que un proyecto de produccin de

astaxantina natural tiene rentabilidad frente a la astaxantina sinttica, ya que los costos
de produccin de biomasa y astaxantina pueden llegar a ser de US$22/kg y US$882/kg
respectivamente, mientras que la produccin sinttica se estima en un valor de
US$1000/Kg y para otras industrias con produccin natural en un valor de US$3000/Kg.
Estos bajos costos de produccin son posibles dado que se estima una elevada
19
velocidad de crecimiento, la utilizacin de fotobiorreactores tipo raceway abiertos y bajos

costos salariales, ubicando la planta en China.
1.7.1
Produccin de astaxantina a nivel industrial
Actualmente diferentes empresas tienen produccin de astaxantina a partir de H. pluvialis

a nivel industrial, entre ellas se destaca Cyanotech y Parry Nutraceuticals por la
utilizacin de tanques de agua a cielo abierto. Otras empresas como Mera
Pharmaceuticals prefieren el uso de fotobioreactores tubulares interiores para la
produccin de clulas verdes y exteriores para el estrs de las microalgas. De igual
manera la empresa Algatech, aprovechando las fuertes intensidades de luz solar que se
producen en el desierto de Israel para inducir la sntesis del pigmento. Recientemente,
Yamaha Motor inici la produccin de astaxantina de Haematococcus pluvialis utilizando
un sistema interior cerrado con fotobioreactores planos, aprovechando los gases
producidos por sus fbricas como fuente de CO2 reduciendo as tambin sus emisiones a
la atmsfera y obteniendo un producto de alto valor. Toda la biomasa algal producida es
destinada prcticamente al consumo humano como suplemento diettico o producto
cosmtico (Tabla 1-4) (Domnguez et al., 2006).
20

Empresa
Ubicacin
Cyanotech
1997-Presente
Kailua Kong
Hawi
Tipo de
fotobiorreactor
Tanques
Sistema
AbiertoExterior
x
x
x
x
Parry
Nutraceuticals
2003-Presente
Conaiyur
India
Tanque
AbiertosExterior
Mera
Pharmaceuticals
2003-Presente
Kailua Kong
Hawi,
fotobioreactores
tubulares
CerradosArtificialExterior
Alga
technologies
LTDA
1998-Presente
Kibbutz
Ketura
Israel
fotobioreactores
tubulares
CerradosExterior
Tanques de
mezclado
CerradoExterior
fotobioreactores
planos
CerradoArtificial
Fuji
1997-2011
BioReal
(Swedden)
1994-Presente
Aplicacin
Mawi
Hawi
Sweden
Suecia
x
x
x
x
x
x
x
x
Yamaha Motor
2006-2010
Tabla 1-4:
Japn
Acuicultura
Consumo
humano
Ind. cosmtica
Consumo
humano
Ind. cosmtica
Consumo
humano
Ind. cosmtica
Consumo
humano
Ind. cosmtica
Producto
NatuRose
BioAstin
Parrys
natural
Astaxanthin
Astanatural
Zanthin
Astafactor
Astapure
Consumo
humano
Ind. cosmtica
Astaxin
Astareal
Consumo
humano
Ind. cosmtica
Astivo
Puresta
Informacin industrial de produccin de astaxantina natural (Domnguez et
al. (2006); Rosenberg et al. (2008)).
2. Efecto de las condiciones de cultivo en el

crecimiento y acumulacin de astaxantina
en una cepa nativa de Haematococcus
pluvialis
Resumen
Se estudi el efecto de cinco medios de cultivo (BBM, BG11, OHM, F1 BBM:BG11 (1:1))
en el crecimiento de una cepa nativa de la microalga Haematococcus pluvialis,
encontrndose que no existe diferencia significativa entre los medios evaluados ( = 5%),
mostrando velocidades de crecimiento de 0,463 - 0,536 das-1, con una densidad celular
mxima de 4,02 - 4,16 x 105 cel/mL. Al someter clulas en fase estacionaria a estrs
salino, se encontr que una concentracin de NaCl superior al 0,025 % es letal para la
microalga y no genera acumulacin de astaxantina, mientras que clulas en fase
estacionaria sometidas a irradiaciones inferiores a 55500 Lux no fueron inhibidas,
logrando una acumulacin de 32,99 Pg/mL y una productividad de 1,434 mg L-1da-1 de
astaxantina. Por ltimo se concentr primero las clulas en fase estacionaria y luego se
sometieron a estrs por irradiacin, consiguiendo una acumulacin 59,23 Pg/mL y una
productividad de 3,484 mg L-1da-1 de astaxantina, mostrando gran potencial para la
produccin industrial de astaxantina a partir de esta microalga nativa.
Palabras claves: Haematococcus pluvialis, astaxantina, medios de cultivo, irradiacin,

salinidad.
Abstract
The five culture media effect in the native microalgae Haematococcus pluvialis was
studied finding no significant differences between evaluated media ( = 5%), showing
growing rates of 0,463 - 0,536 days-1 with a maximum cellular density of 4,02 - 4,16 x 105
22

cel/ml. When stationary phase cells are stressed, a more than 0,025 % salt concentration
is lethal for the microalgae and does not produce astaxanthin accumulation, while the
cells under less than 55500 Lux irradiation were not inhibited, achieving a 32,99 Pg/mL
accumulation and a 1,434 mg L-1day-1 production. Finally, to concentrate the stationary
cells first and later to stress them by irradiation is suggested, to get a 59,23 Pg/mL
accumulation and a 3,484 mg L-1day-1 astaxanthin production, showing a big potential for
the industrial astaxanthin production from this native microalgae.
Keywords: Haematococcus pluvialis, astaxanthin, culture media, irradiation, salinity.
2.1 Introduccin
En la bsqueda de metabolitos de alto valor industrial, se han destacado las microalgas
por su alta aplicabilidad, ya que son tiles en la produccin de biodiesel, el tratamiento de
aguas residuales y la produccin de protena para la alimentacin animal y humana,
entre otras. Adems, estos microrganismos, presentan como caracterstica especial la
capacidad de acumular metabolitos de inters biotecnolgico como los cidos grasos
poli-insaturados de cadena larga y los carotenoides (Cardozo et al., 2007).
La microalga Haematococcus pluvialis es uno de los mejores productores naturales del

carotenoide rojo astaxantina, ya que tiene la capacidad de acumular ms del 3% en peso
seco del pigmento (Hagen et al., 2001); sin embargo, esta microalga puede presentar
baja productividad de astaxantina dificultando su uso comercial, si no se optimizan las
condiciones de cultivo, debido a factores como un lento crecimiento, baja concentracin
celular y alta susceptibilidad a daos hidrodinmicos.
La astaxantina es ampliamente utilizada en la acuicultura como aditivo para la

pigmentacin de salmn, trucha, camarn, algunos peces ornamentales y muchos
crustceos (Lorenz & Cysewski, 2000). Adems, la industria farmacutica y la industria
cosmtica han realizado avances importantes en sus estudios, los cuales han mostrado
su elevada actividad antioxidante, excelentes propiedades como agente fotoprotector (luz
UV), propiedades para la salud ocular, de la piel, del corazn y a nivel celular y otros
Captulo 2 Efecto de las condiciones de cultivo en el crecimiento y

acumulacin de astaxantina en una cepa nativa de Haematococcus pluvialis
23
usos
en
potenciales
como
anti-inflamatorio,
anti-cancergeno,
desintoxicante,
enfermedades neurodegenerativas y en la respuesta inmune (Guerin et al., 2003).
La produccin de este metabolito secundario est fuertemente relacionada con los

cambios morfolgicos producidos en la microalga desde un estado vegetativo verde en el
que se da el crecimiento, hasta un estado rojo de alta acumulacin de astaxantina. Estos
cambios son inducidos por diversos factores como la deficiencia de nutrientes (nitrato,
fosfato, sulfato), la intensidad lumnica, la salinidad del medio y las altas temperaturas,
entre otros (Tripathi et al., 2002).
El objetivo del presente capitulo fue la evaluacin de cinco medios de cultivo para el
crecimiento de Haematococcus pluvialis, as como el efecto de la irradiacin y la alta
concentracin de NaCl en la produccin de astaxantina en la clula. Adems se
muestran los resultados de la aplicacin de un mtodo innovador, utilizando la
deshidratacin de la clula y posterior irradiacin, para una mayor acumulacin de
astaxantina, reduciendo costos de produccin.
2.2 Materiales y mtodos

2.2.1
Microorganismo y condiciones de cultivo
La microalga H. pluvialis (LAUN 029) fue suministrada por el Laboratorio de microalgas

del Departamento de Biologa de la Universidad Nacional de Colombia. La microalga fue
mantenida en medio lquido BBM estndar (Anexo A) (Andersen, 2005) esterilizado en
autoclave a 121C durante 30 minutos. La temperatura del cultivo fue mantenida en 24
2 C. Se utilizaron lmparas fluorescentes Sylvania Daylight F48T12/D de 39W como
fuente de iluminacin artificial con iluminancia de 2500 50 Lux, fotoperiodo de 18 horas
de luz y 6 de oscuridad (18:6 LO), aireacin de 0,5 vvm empleando aire atmosfrico
filtrado con una membrana de 0,22 m. El mantenimiento se realiz en botellas de vidrio
de paredes planas de 4,5 cm de espesor y capacidad de 330 mL con volumen de cultivo
de 200 mL. Se realiz resiembra semanalmente empleando inculo del 10% v/v.
24

2.2.2
Evaluacin de medios de cultivo
Para evaluar el efecto del crecimiento de Haematococcus, se investig 5 de los medios

de cultivo (BBM, BG11, OHM, F1, BBM: BG11 (1:1) -Anexo A), que han sido reportados
en la literatura con mayor tasa especfica de crecimiento. Todos los medios de cultivo se
llevaron a cabo simultneamente por triplicado, utilizando un inculo inicial del 4x104
Cel/mL en botellas de vidrio de 330 mL con un volumen de cultivo de 200 mL, para un
total de 15 ensayos. El crecimiento se determin por conteo celular diario empleando la
cmara Neubauer. Los parmetros de cultivo fueron los mismos que los descritos en el
numeral 2.2, excepto que el fotoperiodo fue 12:12 (Horas de luz: horas de oscuridad)
2.2.3
Evaluacin de estrs por intensidad lumnica
Para evaluar el efecto del estrs lumnico sobre la acumulacin de astaxantina, se

sometieron las clulas en fase estacionaria a elevadas intensidades de luz. Para ello se
tom un inculo y se cultiv en 1L de medio BBM en un recipiente cilndrico de vidrio de
1,5 L de capacidad por un periodo de 8 das hasta alcanzar la fase estacionara,
manteniendo los mismos parmetros de cultivo descritos en el numeral 2.2.2. Una vez el
cultivo alcanz la fase estacionaria se dividi en botellas de vidrio de 330 mL con un
volumen de cultivo de 200 mL y se someti el cultivo a tres diferentes intensidades
lumnicas (18500, 37000, 55500 ( 50 Lux)) por triplicado, utilizando un montaje de LEDs
tipo SMD P96WN2-12-001 blancos con un regulador de potencia que permiti variar la
intensidad lumnica. La variable de respuesta fue la cantidad de astaxantina, medida en
porcentaje peso/volumen. Los parmetros de cultivo permanecieron constantes
(Temperatura de cultivo: 24 2C- fuente lumnica: LEDs blancos- fotoperiodo: 12:12aireacin: 0,5 vvm- 0,033% CO2 concentracin atmosfrica). Como control negativo se
realiz un blanco, tomando 200 mL del cultivo en fase estacionara en botellas de 330
mL, y se someti a una intensidad de luz de 2500 Lux y 0% de NaCl, realizando el
experimento por tambin triplicado.

2.2.4
25
Evaluacin de estrs por alta salinidad en el medio de

cultivo
Para evaluar el efecto de la salinidad sobre la acumulacin de astaxantina se sometieron

clulas en fase estacionaria a diferentes concentraciones de sal. Para ello se tom un
inculo y se cultiv en 1L de medio BBM en un recipiente cilndrico de vidrio de 1,5 L de
capacidad por un periodo de 8 das hasta alcanzar la fase estacionara, manteniendo los
mismos parmetros de cultivo descritos en el numeral 2.2.2. Una vez el cultivo alcanz la
fase estacionaria se dividi en botellas de vidrio de 330 mL con un volumen de cultivo de
200 mL y se someti el cultivo a tres diferentes concentraciones de NaCl (0.025, 0.100,
0.250 %) por triplicado, ajustando la concentracin de sal por medio de la adicin de una
cantidad apropiada de una solucin acuosa de 100 g NaCl L-1, esterilizada en autoclave a
121C durante 30 minutos. Se seleccion 0.250 % como la concentracin mxima para
los experimentos, basados en estudios exploratorios realizados en donde se encontr
que para concentraciones superiores de sal, no se presenta crecimiento de la microalga y
se observa muerte por rompimiento de la membrana celular. La variable de respuesta fue
la cantidad de astaxantina, medida en porcentaje peso/volumen. Los parmetros de
cultivo fueron descritos en el numeral 2.2.2. Como control negativo se realiz un cultivo
tomando 200 mL de la muestra en fase estacionara en botellas de 330 mL, los cuales
fueron sometidos a una intensidad de luz de 2500 Lux y 0% de NaCl, realizando el
experimento tambin por triplicado.
2.2.5
Evaluacin de estrs por concentracin celular
Para evaluar el efecto del estrs por concentracin celular sobre la acumulacin de
astaxantina se sometieron las clulas en fase estacionaria a estrs, concentrndolas y
sometindolas a irradiacin de luz. Para ello se tom un inculo y se cultiv en 1L de
medio BBM en un recipiente cilndrico de vidrio de 1,5 L de capacidad por un periodo de
8 das hasta alcanzar la fase estacionara, manteniendo los mismos parmetros de
cultivo descritos en el numeral 2.2.2. Una vez alcanz la fase estacionaria se centrifug
la muestra a 2000 rpm en centrifuga Hettich Zentrifugen ROTOFIX 32 de 14 cm de radio
(2500g) durante 30 min, retirando el sobrenadante de tal manera que el volumen final
del precipitado fue el 10 % del inicial. El volumen final de concentrado se agit utilizando
un Vortex a 2000 rpm por 30 s.
26

La solucin concentrada se dividi en 6 cajas de Petri de vidrio de 5 cm de dimetro, 3

cajas con un volumen de 5 mL y 3 cajas con 2,5 mL, de tal manera que se tuviera dos
diferentes alturas del medio en los experimentos (1,3 y 2,5 mm, ver Figura 2-1). Las cajas
de Petri se dividieron en 3 grupos, de dos alturas diferentes cada grupo, y fueron
sometidas a diferentes condiciones. En la primera se utiliz un montaje de LEDs tipo
SMD P96WN2-12-001 blancos con una intensidad lumnica de 11000 50 lux; en la
segunda se utilizaron lmparas fluorescentes marca Sylvania Daylight F48T12/D de 39W
con una intensidad lumnica de 5000 50 lux, En ambos casos la iluminacin se realiz
por la parte inferior de las cajas de Petri para obtener la mayor rea de iluminancia. El
tercer grupo no se ilumin para tomarlo como control (Tabla 2-1). Todas las cajas de
Petri se taparon para evitar la contaminacin y se mantuvieron a 25 C en una
incubadora En todos los casos se realiz seguimiento fotogrfico y a los 9 das se
determin la concentracin de astaxantina.
Tabla 2-1: Parmetros de estrs para acumulacin de astaxantina en la microalga H.

pluvialis
# Cel/mL cultivo inicial
5,0E+05
Intensidad lumnica lmparas Fluorescentes

Intensidad lumnica LEDs
5000 Lux
11000 Lux
Volumen experimento mL
2,5
5
2.2.6
# Clulas
1,3E+07
2,5E+07
# Clulas/ mm2
6366,2
12732,4
Espesor de irradiacin mm
1,3
2,5
Medicin de variables
Medicin del crecimiento
El crecimiento fue monitoreado tanto por conteo celular, como por peso seco. El conteo
se realiz utilizando una cmara de Neubauer. El peso seco se determin al final de los
cultivos tomando 50 mL de muestra y centrifugndola a 3000 rpm en una centrifuga
Hettich Zentrifugen ROTOFIX 32 de 14 cm de radio (2500g) durante 20 min,
resuspendiendo el precipitado en agua destilada, agitndola con Vortex a 2000 rpm por

27
30 s, y centrifugando de nuevo las muestras a 2500 g por 20 min. El precipitado se sec

a 60C hasta obtener peso constante.
Medicin de Astaxantina
Se realiz la extraccin de los carotenos utilizando metanol como solvente y analizando

las muestras en un espectrofotmetro Thermo Scientific Genesys 20, empleando celda
de absorbancia plstica de 2 mL de capacidad y trayectoria de luz de 1 cm. Se tom una
muestra de 1 mL de medio de cultivo, y se centrifug a 7000 rpm por 5 min utilizando una
centrfuga para EPPENDORF modelo 5415C de 7,3 cm de radio (4000xg), realizando
conteo celular en simultneo. Se retir el sobrenadante utilizando una micro-pipeta y se
le adicion al precipitado 1 mL de metanol y 0,4 g de partculas de slica (silica gel 60
200-500 Merck, KGaA, Darmstadt, Alemania EM-7733-1); se realiz el rompimiento
celular agitando la muestra con un Vortex a 2000 rpm por 10 min (Ranjbar et al., 2008b).
Las muestras fueron centrifugadas a 7000 rpm por 5 min, retirando el sobrenadante y
repitiendo el procedimiento hasta que no se observ color rojo en la extraccin. Se
mezclaron los sobrenadantes y se determin la absorbancia a 477 nm, utilizando un
coeficiente msico de extincin, A 1% de 2306,6 mL g-1 cm-1 por el mtodo de Davies
(1976), descrito por Tripathi et al. (2002) y Aquasearch-Inc. (1999), manteniendo las
muestras en completa oscuridad.
28

Figura 2-1 Esquema del montaje de trabajo para evaluar estrs por concentracin celular
Control de variables
Para medir la intensidad de la luz se utiliz un medidor de luz marca VWR Scientific
21800-014 y el fotoperiodo se fij empleando una temporizador digital marca Steren. Se
construy una cabina con control de temperatura, y se utilizaron membranas de 0,22 Pm
para esterilizar el aire.
2.2.7
Ajuste cinticas de crecimiento
A cada cultivo se le ajust el modelo de crecimiento logstico descrito en la Ecuacin 2.1
(Ecuacin 2.1)
En la Ecuacin 2.1, X es la densidad celular (clulasmL-1), X0 y Xmax son las densidades

celulares inicial y mxima, respectivamente (clulasmL-1), es la velocidad especfica de
crecimiento aparente (da-1) y t es el tiempo de cultivo (da). Para el ajuste se emple el
software TableCurve 2D (Systat Software Inc., San Jose, California, USA).

29
2.3 Resultados y discusin

2.3.1
Efecto del medio de cultivo
En las curvas de crecimiento de la microalga H. pluvialis (Figura 2-2) se puede observar

que la fase exponencial en todos los medios de cultivo fue de 8 das con 1 da de fase de
adaptacin; el medio de cultivo con la mayor velocidad especfica de crecimiento es el
medio OHM (0,536 das-1), con una densidad celular mxima de 4,16 x 105 cel/mL,
mientras que el medio BG11 solo alcanz una velocidad especifica de crecimiento de
0,463 y una densidad celular de 4,02 x 10 5 cel/mL, con aumento de produccin de
biomasa entre 11 y 19 veces la poblacin inicial (Figura 2-3,Tabla 2-3).
Las densidades celulares obtenidas se encuentran acordes con las reportadas por
Fbregas et al. (2001) para el medio de cultivo OHM y de Issarapayup et al. (2009) para
el medio F1, ya que la investigacin de Kaewpintong et al. (2007) muestran
concentraciones celulares mximas de inferiores a las reportadas por la presente
investigacin (Tabla 2-2).
Concentracin celular mxima Cel mL-1
Medio
Fbregas
et
(2001)
OHM
al.
Issarapayup et al.
Kaewpintong et al.
(2009)
(2007)
3,9 105
6,25 x 10
1,8 105
F1
Presente trabajo
5,5 x 104
3,5 105
M1
0,5 x 104
Basal
0,9 x 104
4,5 105
BG-11
3,5 x 104
3,5 105
2,7 105
Basal: BG11 (1:1)

Hong Kong
3,1 x 104
M6
0,5 x 104
Tabla 2-2: Comparacin de la concentracin celular mxima obtenida por diferentes

autores.
30
Densidad Celular
#Cel mL-1
1,0E+05
1,0E+04
0,0
2,0
4,0
6,0
Tiempo [das]
8,0
10,0
12,0
Figura 2-2: Curvas de crecimiento de la microalga Haematococcus pluvialis en los

medios de cultivo BBM (), BG11 (), OHM (), F1 (), BBM: BG11 (1:1) ()
Para la velocidad especfica de crecimiento, se encontr que estn por encima de las
reportadas por otros autores entre 2,5 y 50 veces, ya que mientras los valores
encontrados en la presente investigacin se encuentran entre 0,470 y 0,530 das-1 (Figura
2-3 y Tabla 2-3), la investigacin de Fbregas et al. (2001) para el medio de cultivo OHM
reporta 0,130 das-1, la investigacin de Issarapayup et al. (2009) reporta 0,225 das-1
para el medio F1, y la investigacin de Kaewpintong et al. (2007) muestran velocidades
especificas de crecimiento de 0,010- 0,032- 0,200 -0,130- 0,110- 0,010- 0,125 das-1 para
los medios de cultivo M1, Basal, F1, BG-11, Hong Kong, M6, respectivamente. Estos
valores muestran que la cepa nativa de Haematococcus pluvialis tiene un gran potencial
para la produccin de biomasa y su utilizacin industrial.
Velocidad especfica de crecimiento

[das-1]

31
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
BBM
BG11
BBM + BG11
OHM
F1
Medio de cultivo
Figura 2-3 Velocidad especfica de crecimiento para los medios de cultivo evaluados.
Barra error: desviacin estndar.
Medio de cultivo
BBM
BG11
BG11+BBM (1:1)
OHM
F1
Xo
2,57E+04
2,68E+04
2,70E+04
2,14E+04
2,68E+04
DEXo
1,04E+03
2,25E+03
3,93E+03
8,63E+02
4,18E+03
Xmax
4,88E+05
4,02E+05
3,01E+05
4,16E+05
3,80E+05
DE Xmax
P
DE P
R2
Xmax/Xo
4,47E+04
4,73E+04
1,89E+04
4,81E+04
2,18E+04
0,511
0,463
0,517
0,536
0,509
0,0071
0,0274
0,0654
0,0164
0,0939
97,9%
93,1%
95,8%
94,3%
96,3%
1,90E+01
1,50E+01
1,11E+01
1,94E+01
1,42E+01
Tabla 2-3 Matriz de coeficientes del modelo logstico ajustado para los diferentes medios
de cultivo segn la Ecuacin 2.1. Desviacin estndar (DE) y coeficiente de
determinacin R2, Xmax y X0 en ClulasmL-1 y en da-1
Se realiz un anlisis de varianza (ANOVA) de un factor (velocidad especfica de

crecimiento) para los 5 tratamientos (medios de cultivo) y 3 rplicas de cada tratamiento,
encontrando que para una confianza del 95% no existe diferencia estadstica entre los
diferentes medios de cultivo evaluados Tabla 2-4). Adicionalmente se realiz un anlisis
de varianza (ANOVA) de un factor (Produccin de biomasa) para los mismos
tratamientos anteriormente mencionados, encontrando diferencia significativa entre los
medios de cultivo evaluados para una confianza del 95% (Tabla 2-5), se puede observar
que el medio de cultivo con la menor productividad de biomasa es el medio BG11:BBM
(1:1) y que los medios de cultivo de mayor rendimiento son el BBM y el OHM. El medio
de cultivo BBM se seleccion para las siguientes etapas de experimentacin ya que es
32

un medio estndar y autotrfico, a diferencia del medio OHM que requiere del uso de
citrato de hierro; adems no se requiere el uso de vitaminas facilitando su aplicacin
industrial.
ANLISIS DE VARIANZA
Origen de las
variaciones
Medios de
cultivo
Error
Total
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de
los cuadrados
0,00604
0,02834
4
10
0,001509
0,002834
0,03438
14
Probabilidad
Valor crtico
para F
0,5326
0,71505
3,4780
Tabla 2-4 Anlisis de varianza (ANOVA) del efecto del medio de cultivo en la velocidad
especfica de crecimiento de la microlaga Haematococcus pluvialis
ANLISIS DE VARIANZA
Origen de
las
variaciones
Medios de
cultivo
Error
Total
Suma de
cuadrados
Grados de Promedio de
libertad
los cuadrados
139,787
44,610
4
10
184,397
14
34,946
4,461
Probabilidad
Valor crtico
para F
7,8337
0,003969
3,47804
Tabla 2-5 Anlisis de varianza (ANOVA) del efecto del medio de cultivo en la produccin
de biomasa de la microlaga Haematococcus pluvialis
2.3.2
Efecto de la intensidad de luz y concentracin de sal en la

acumulacin de astaxantina.
En la (Figura 2-4) se puede observar los resultados de la medicin de astaxantina en

funcin de la concentracin de sal, para tres diferentes niveles (0,25 1,00 2,50 g L-1),
en donde se puede observar que a concentraciones superiores a 0,250 % se presenta
inhibicin del crecimiento, y una reduccin en la acumulacin de astaxantina de 6 a 1,2
Pg/mL. Para las concentraciones de 0,025 y 0,100 % se observa un pequeo aumento de
la concentracin de astaxantina, pasando de valores iniciales de 4,5 y 5 Pg/mL a 5 y 6,5
Pg/mL, respectivamente, representando un aumento del 1,1 %.

33
A diferencia de investigaciones como la de Sarada et al. (2002b), donde han encontrado

que para concentraciones por encima del 1% w/v de NaCl son letales para el crecimiento
de la microalga, y que concentraciones de 0,5% favorece la acumulacin de astaxantina
(10 y 12 Pg/mL de astaxantina respectivamente), se pudo concluir que para la cepa
nativa de Haematococcus pluvialis no tiene efecto en la acumulacin de astaxantina las
concentraciones de sal por encima de 0,025 %.
La alta iluminacin mostr resultados diferentes a los obtenidos por la salinidad en el

medio, ya que se pudo evidenciar una relacin directa entre la intensidad de luz y la
acumulacin de astaxantina (Figura 2-5). Se consigui acumular en las clulas 34 Pg/mL
al cabo de 15 das, siendo mayor 5,8 veces al control.
Efecto de la salinidad en el medio

9
Astaxantina mg/mL
8
7
6
0 g/L
5
4
0,25 g/L
1,00 g/L
2,50 g/L
1
0
0
10
Tiempo (das)
15
20
Figura 2-4 Efecto de la salinidad del medio de cultivo en la acumulacin de astaxantina

en H. pluvialis
34

Efecto de la intensidad de luz
35
Astaxantina mg/mL
30
25
20
2500 Lux
15
18500 Lux
10
37000 Lux
55500Lux
5
0
0
10
15
Tiempo (das)
20
Figura 2-5: Efecto de la intensidad de luz en la acumulacin de astaxantina en H.

pluvialis
La intensidad lumnica ha sido ampliamente estudiada, se ha encontrado que se pueden

obtener gran cantidad de biomasa y una alta tasa de supervivencia de las clulas al usar
intensidades de luz por debajo de 37 Pmol/m2s (60000 Lux) (Cohen, 1999) y para Harker
et al. (1996) se obtienen altas tasas de crecimiento cuando se usa una intensidad de luz
de 2 y de 37 Pmol/m2s (3300 a 60000 Lux), e inhibicin del crecimiento a 89 Pmol/m2s
(140000 Lux), en ambos casos, as como para otras investigaciones en las que no se
obtienen inhibicin por debajo de los 90 y 100 Pmol/m2s (140000 180000 Lux) (Choi et
al., 2003; Zhang et al., 2009). Garca-Malea et al. (2005) han encontrado que la
acumulacin de astaxantina esta relacionado en mayor medida con la deficiencia de
nutrientes comparada con las elevadas irradiaciones de luz, encontrando que para una
iluminancia de 2500 Pmol/m2s y duplicando los nutrientes del medio BBM logran obtener
3 g/L de biomasa y utilizando la misma irradiacin 2500 Pmol/m2s, pero con la tercera
parte de los nutrientes del medio BBM obtienen 15 Pg/mL de astaxantina. Por otro lado
Kang et al. (2006) han obtenido hasta 83,9 Pg/mL utilizando en los cultivos en fase
estacionaria 5 % de CO2 en la aireacin y 200 Pmol/m2s (360000 Lux). Los resultados
obtenidos se ajustan a los esperados, ya que no se present inhibicin por debajo de los
55500 Lux y se logr obtener 34 Pg/mL de astaxantina, mostrando gran potencial para la

35
produccin industrial de este carotenoide a partir de la microalga nativa Haematococcus

pluvialis.
En las Figura 2-6 y Figura 2-7 se muestra el efecto de la salinidad y la intensidad de luz
en la produccin de biomasa, en la primera se puede observar claramente la inhibicin
por salinidad a una concentracin de 0,25 %, adems hay una reduccin de la poblacin
a concentraciones de 0,025 y 0,100 % comparadas con el control. En la Figura 2-7 se
puede observar el caso contrario, ya que la biomasa aumenta proporcionalmente al
aumento de la intensidad de luz, esto debido a que un mayor nmero de clulas fueron
estresadas pasando de la fase vegetativa a la fase Aplanspora donde se da el
crecimiento, presentando mayor tamao celular y peso. Para los resultados obtenidos,
las mejores condiciones para el estrs de la microalga son a una intensidad de luz mayor
a 55500 Lux y 0% de concentracin de sal, obteniendo 0,774 g/L de biomasa y 32,98
Pg/mL
de astaxantina, siendo estos valores superiores a los reportados por otros
autores.
Efecto de la salinidad
0,40
g de Biomasa /L
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
0
0,5
1,5
2,5
Concentracin de NaCl g/L
Figura 2-6: Efecto de la salinidad del medio de cultivo en la produccin de biomasa
36

Efecto de la Intensidad Lumnica

0,80
g de Biomasa/ L
0,70
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
Intensidad Lumnica Lux
Figura 2-7 Efecto de la intensidad lumnica en la produccin de biomasa
2.3.3
Efecto de la concentracin celular y la elevada

iluminacin en la acumulacin de astaxantina.
En la Figura 2-8 se muestra el seguimiento fotogrfico de la microalga Haematococcus

pluvialis al ser sometidas a estrs por concentracin y alta iluminacin; en ellas se puede
observar que en las muestras sometidas a una fuente lumnica presencia de astaxantina,
mientras que las muestras que se mantuvieron en la oscuridad no lo hicieron. Tambin
se puede destacar que los experimentos con 2,5 mL fueron estresados con mayor
rapidez comparadas con las muestras de 5 mL, esto quiere decir que el nmero de
clulas/ unidad de rea es un parmetro fundamental en el diseo.

37
Figura 2-8: Seguimiento fotogrfico al estrs por concentracin y elevada iluminancia en

la acumulacin de astaxantina en H. pluvialis.
Utilizando la metodologa propuesta se logr obtener una acumulacin de astaxantina de
59,2 Pg/mL, siendo superior a los obtenidos en los mtodos convencionales de estrs
evaluados en la presente investigacin as como en otras (Figura 2-9). El estrs con luz
fluorescente presento mayor acumulacin que la iluminacin con LEDs, as mismo, a
38

pesar de que las muestras con 2,5 mL presentaron rpida acumulacin de astaxantina, el
experimento con luz fluorescente y 5 mL de volumen present la mayor acumulacin. Las
muestras sin iluminacin alcanzaron valores similares a los iniciales de escasamente 3,9
y 4,0 Pg/mL.
70
Astaxantina Pg/mL
60
50
40
Acumulacin
de astaxantina
30
Valor inicial
20
10
0
Figura 2-9: Efecto de la concentracin celular y la intensidad de luz en la acumulacin de

astaxantina Pg/mL.
En la Tabla 2-6 se hace la comparacin de los diferentes mtodos de estrs para la

acumulacin de astaxantina en H. pluvialis probados en el presente trabajo, en ella se
puede observar que al concentrar las clulas y someterlas a elevada intensidad de luz se
puede aumentar entre 10 y 13 veces la concentracin de astaxantina en las clulas,
siendo superior a los resultados obtenidos para los mtodos convencionales, en donde
se encontr un aumento mximo de 6,5 veces. La productividad de astaxantina medida
por el tiempo total del cultivo y de estrs, mostr valores entre 2,8 y 3,5 mg L-1da-1,
duplicando la productividad de los mtodos convencionales en donde se encontraron
valores entre 0,05 y 1,4 mg L-1da-1, de igual manera este procedimiento mostr
productividades superiores a las reportadas por otras investigaciones, por ejemplo Kang
et al. (2006) reporta valores entre 1,65 y 3,23 mg L-1da-1, utilizando en los cultivos en
fase estacionaria 5 % de CO2 en la aireacin y 200 Pmol/m2s (360000 Lux), Garca-Malea
et al. (2005) logran una productividad de 1,6 mg L-1da-1 utilizando una alta irradiacin de

39
2500 PE/m2s en las clulas, Fbregas et al. (2001) han reportado una productividad de
3,2 mg L-1da-1 utilizando un cultivo por lote alimentado, con presencia de acetato e
irradiacin continua.
Experimento
Valor
inicial
Astaxantina Pg/mL
Tasa de
Valor final
aumento
Productividad
mg/L-da
LED's 2,5 mL
4,43
54,46
12,28
3,204
LED's 5 mL
4,43
47,50
10,71
2,794
Fluorescentes 2,5 mL
4,43
56,27
12,69
3,310
Fluorescentes 5 mL
4,43
59,23
13,36
3,484
Sin iluminacin 2,5 mL
4,43
4,03
0,91
0,237
Sin iluminacin 5 mL
4,43
3,90
0,88
0,229
4,44
6,50
1,47
0,025 % NaCl
0,283
5,10
5,77
1,13
0,100 % NaCl
0,251
6,10
1,19
0,20
0,250 % NaCl
0,052
18500 Lux
4,44
11,09
2,50
0,482
37000 Lux
6,10
19,58
3,21
0,851
55500 Lux
5,10
32,99
6,46
1,434
Tabla 2-6: Tasa de aumento en la acumulacin de astaxantina
El mtodo que consiste en concentrar las clulas y someterlas a estrs por alta
irradiacin gener gran acumulacin de astaxantina, elevadas tasas de aumento en la
concentracin del caroteno y productividades superiores, comparadas con los mtodos
tradicionales de estrs; Adicionalmente al utilizar esta metodologa en el escalamiento del
proceso se obtendr un ahorro de energa en el transporte, ya que solo ser necesario el
10% del flujo comparado con otras metodologas, reduciendo la capacidad y los costos
de los equipos, as como la utilizacin de sistemas de aireacin o burbujeo, tampoco se
requiere de un mtodo de separacin costosa, ya que las clulas rojas tienen tamaos
promedio de 25 a 50 Pm que facilitan su precipitacin o el uso de telas filtrantes.
Finalmente se puede decir que en la microalga nativa de Haematococcus pluvialis no se

presenta ninguna diferencia significativa entre los medios de cultivo evaluados, por lo
cual se recomienda el uso del medio de cultivo BBM por ser un medio autotrfico
estndar. De igual manera se recomienda concentrar las clulas en fase estacionaria y
someterlas a estrs por elevada irradiacin, ya que al modificar la salinidad del medio las
40

clulas son inhibidas y la alta irradiacin del sistema burbujeado alcanza apenas la mitad
de la acumulacin y la productividad de astaxantina.
3. Optimizacin de las condiciones de cultivo

en el crecimiento de la microalga nativa
Haematococcus pluvialis
Resumen
Se evalu el efecto del porcentaje de dixido de carbono en la aireacin, la intensidad de
luz, la concentracin de nitrgeno y de fsforo, en la velocidad especfica de crecimiento
de la microalga nativa Haematococcus pluvialis utilizando la metodologa de superficie de
respuesta, ajustando los parmetros a un polinomio de segundo orden. Se encontr una
velocidad mxima de crecimiento para los lmites evaluados de 0.825 das -1, utilizando
0.51% de CO2, 3,28x10-3 M de nitrgeno (NaNO3), 2,58x10-3 M de fsforo (K2HPO4 y
KH2PO4) y 11000 Lux de iluminancia, como parmetros de cultivo. De estos parmetros
la intensidad de luz y la concentracin de fsforo tuvieron un efecto positivo en el
crecimiento de la microalga, mientras que el % CO2 present un efecto negativo; la
concentracin de nitrgeno no tuvo efecto significativo en la velocidad especfica de
crecimiento
Palabras claves: Haematococcus pluvialis, velocidad especfica de crecimiento, CO2,

nitrgeno, fsforo, intensidad lumnica.
Abstract
The effect of carbon dioxide percentage in the aeration, the nitrogen and phosphorus
concentration and the light intensity, on the specific growth rate of a native strain of the
microalgae Haematococcus pluvialis were evaluated through a response surface
methodology; the effect of the variable was fitted to a second order polynomial. The
maximum growth rate, within evaluated limits, was 0.825 days-1, at 0.51% of CO2,
3,28x10-3 M of nitrogen (NaNO3), 2,58x10-3 M of Phosphorus (K2HPO4 y KH2PO4) and
42

11000 Lux of luminance. The light intensity and the phosphorus concentration had a
positive effect in the microalgae growth while the carbon dioxide percentage had a
negative effect; the nitrogen concentration had no significant effect in the specific growth
rate.
Keywords: Haematococcus pluvialis, specific growth rate, CO2, Nitrogen, Phosphorus,

light intensity.
3.1 Introduccin
Las microalgas son microorganismos fotosintticos que tiene un alto valor industrial; la
microalga Haematococcus pluvialis es uno de los mejores productores de astaxantina, ya
que tiene la capacidad de acumular ms del 3% en peso del pigmento (Hagen et al.,
2001); sin embargo, esta microalga puede presentar baja productividad de astaxantina si
no son optimizados los parmetros de cultivo, dificultando su uso comercial, debido a
factores como un lento crecimiento, baja concentracin celular y alta susceptibilidad a
daos hidrodinmicos, comparada con la microalga unicelular Chlorococcum sp.: sta
ltima microalga presenta, sin embargo, una muy baja acumulacin de astaxantina
(Zhang & Lee, 1997).
La intensidad lumnica es uno de los factores ms importantes tanto en el crecimiento de

la clula como en la acumulacin de astaxantina, en diversas investigaciones se han
encontrado valores de inhibicin y estrs para la microalga, as como irradiancia que
presenta ptimo en la acumulacin de biomasa (Cohen, 1999; Choi et al., 2003; Harker
et al., 1996; Katsuda et al., 2004). De igual manera cuando H. pluvialis es cultivada en
medios con limitaciones de nitrgeno, el crecimiento del alga se ve restringido y la
sntesis de astaxantina es estimulada. Se tienen efectos similares cuando el alga es
sometida a altas concentraciones de hierro, bajas concentraciones de fosfatos y a
medios salinos (Garca-Malea et al., 2005; Harker et al., 1996).
Otro parmetro fundamental en el crecimiento de la microalga es la fuente de carbono;

diferentes autores han propuesto el uso de CO2 en la aireacin, encontrando ptimos
cercanos al 1 % (Kaewpintong et al., 2007), as mismo se han evaluado medios de cultivo
Captulo 3 Optimizacin de las condiciones de cultivo en el crecimiento de la

microalga nativa Haematococcus pluvialis
43
hetertrofos utilizando acetato de sodio (Hata et al., 2001; Jeon et al., 2006). La gran
dependencia del crecimiento de H. pluvialis de diferentes parmetros ha motivado la
presente investigacin, en la que se evaluaron la fuente de nitrgeno y de fsforo, as
como la irradiacin y la concentracin de CO2 en la velocidad especfica de crecimiento,
encontrando el optimo de estas variables.

3.2.1
Microorganismos y condiciones de cultivo

autoclave a 121C durante 30 minutos. La temperatura del cultivo fue de 24 2 C,
utilizando lmparas fluorescentes Sylvania Daylight F48T12/D 39W como fuente de
iluminacin artificial con iluminancia de 2500 50 Lux1, fotoperiodo de 18 h horas de luz
y 6 de oscuridad (18:6 LO), aireacin de 0,5 vvm empleando aire atmosfrico filtrado a
0,22 m. El mantenimiento se realiz en botellas de vidrio planas de 4,5 cm de espesor y
capacidad de 330 mL con volumen de cultivo de 200 mL, se realiz resiembra
semanalmente empleando inculo del 10% v/v.
Todos los experimentos fueron realizados en biorreactores de vidrio con capacidad para
100 mL con volumen de cultivo de 80 mL 0,5 mL, se construyeron con botellas de tapa
roscada, la cual se perfor y se le acopl un tapn de silicona tipo RTV con tres
mangueras de silicona para permitir en ingreso y la salida de aire, as como un puerto
toma muestra que permite mantener la esterilidad del sistema (Figura 3-1). Se utiliz el
medio lquido BBM (Anexo A) (Andersen, 2005) con diferentes concentraciones de
nitrgeno (NaNO3) y fsforo (K2HPO4 y KH2PO4). Se ajust el inculo para una
concentracin inicial de 4,0 x 104 Cel/mL en todos los cultivos y se aplicaron diferentes
concentraciones de CO2 en la aireacin, as como diferentes intensidades de luz. En
todos los casos se us 0,5 vvm de aireacin, temperatura de 25 0,5 C, fotoperiodo de
12 horas de luz y 12 horas e oscuridad (12:12 LO) y la iluminacin se realiz por la parte
inferior de las botellas, por tener mayor rea de aplicacin (Figura 3-2). Para ello se
44

construy un sistema cerrado con control de temperatura y fotoperiodo (Figura 3-3),

utilizando un montaje de LEDs blancos con un regulador de potencia que permiti variar
la intensidad lumnica, la cual se midi empleando un luxmetros marca VWR Scientific
21800-014 y el fotoperiodo se fij empleando una temporizador digital marca Steren.
Figura 3-1: Fotografa biorreactores utilizados en la experimentacin
Figura 3-2: Sistema de iluminacin por LEDs

45
Figura 3-3: Sistema de control de temperatura

Para la mezcla de los gases de aireacin se construy un mezclador compuesto por un
manmetro y un regulador de presin para cada una de los gases, as como rotmetros
marca AALBORG Instruments 112-02 de 0 a 150 mm para CO2 y Dwyer Instruments VFB
de 4 L para aire (Figura 3-4). El suministro de CO2 se realiz con un cilindro de gas grado
industrial, fijando la presin de salida igual que la del aire en 8 psig, la mezcla se
humidific para evitar la evaporacin del medio de cultivo. Adicionalmente se construy
un distribuidor de aire para garantizar la correcta aplicacin a cada biorreactor,
verificando su flujo con un rotmetro marca AALBORG Instruments 112-02 de 0 a 150
mm.
3.2.2
Diseo experimental y anlisis de datos
Se emple un diseo de experimentos de segundo orden ortogonal (Lazic, 2006),

evaluando cuatro variables con cinco niveles en cada variable, realizando 6 rplicas al
punto central. Las variables independientes seleccionadas fueron la concentracin de
nitrgeno X1 (NaNO3), la concentracin de fsforo X2 (K2HPO4 y KH2PO4), el porcentaje
de CO2 en la aireacin X3 y la intensidad de luz X4. Los niveles y los intervalos de
variacin de los parmetros se muestran en la Tabla 3-1; La decodificacin y los niveles
evaluados de cada variable se muestran en la Tabla 3-2.
46

Nmero
Descripcin
Nmero
Descripcin
Entrada de aire
Manmetro para aire
Entrada de CO2
Regulador de presin para aire
Salida de mezcla
10
Rotmetro para CO2
Cilindro de CO2
11
Rotmetro para aire
Humidificador de aire
12
Distribuidor de aire
Manmetro para CO2
13
Mangueras con filtros de 0,22 Pm
Regulador de presin para CO2
Figura 3-4: Esquema de mezclado de aire y dixido de carbono
Niveles de Variacin
Factores
Intervalos de variacin
-2
-1
'X
X1 - Nitrgeno (M)
0,00E+00
1,47E-03
2,94E-03
4,41E-03
5,88E-03
1,47E-03
X2 - Fsforo (M)
0,00E+00
8,61E-04
1,72E-03
2,58E-03
3,44E-03
8,61E-04
X3 - CO2 %
0,000%
0,500%
1,000%
1,500%
2,000%
5,00E-03
X4 - Lux
3500
6000
8500
11000
13500,00
2500
Tabla 3-1: Niveles e intervalos de variacin de los parmetros

47
Las ecuaciones que relacionan las variables reales con las codificadas son:
Nitrgeno:
Fsforo:
CO2:
Intensidad de Luz:
La respuesta fue la velocidad especfica de crecimiento de la microalga (Y), ajustando los

datos a un polinomio de segundo orden (Ecuacin 3.1) (Sarada et al., 2002a), utilizando
el software Statgraphics Centurion XV (StatPoint Technologies, Warrenton, VA, USA)
con una significancia del 5%.
(Ecuacin 3.1)
Donde n representa el nmero de variables, i, j son subndices de las variables y los

coeficientes de ajuste del polinomio estn representados por a.
3.2.3
El crecimiento fue monitoreado por conteo celular diario hasta alcanzar la fase
estacionaria (8 das), utilizando una cmara de Neubauer.
3.2.4
Ajuste de cinticas de crecimiento
(Ecuacin 3.2)
En la Ecuacin 3.2, X es la densidad celular (clulasmL-1), X0 y Xmax son las densidades

celulares inicial y mxima respectivamente (clulasmL-1), es la velocidad especfica de
48

Exp. #
X1 - Nitrgeno (M)
X2 - Fsforo (M)
X3 - CO2 %
X4 Lux
Nivel
Valor
Nivel
Valor
Nivel
Valor
Nivel
Valor
4,41E-03
-1
8,61E-04
-1
0,500%
-1
6000
2,94E-03
1,72E-03
1,000%
8500
-1
1,47E-03
2,58E-03
1,500%
11000
2,94E-03
3,44E-03
1,000%
8500
-1
1,47E-03
2,58E-03
-1
0,500%
11000
4,41E-03
-1
8,61E-04
1,500%
-1
6000
-1
1,47E-03
-1
8,61E-04
-1
0,500%
11000
2,94E-03
1,72E-03
1,000%
8500
-1
1,47E-03
2,58E-03
1,500%
-1
6000
10
2,94E-03
1,72E-03
1,000%
8500
11
4,41E-03
2,58E-03
1,500%
11000
12
2,94E-03
1,72E-03
1,000%
8500
13
2,94E-03
1,72E-03
1,000%
8500
14
2,94E-03
-2
0,00E+00
1,000%
8500
15
4,41E-03
-1
8,61E-04
-1
0,500%
11000
16
2,94E-03
1,72E-03
-2
0,000%
8500
17
4,41E-03
2,58E-03
1,500%
-1
6000
18
4,41E-03
2,58E-03
-1
0,500%
11000
19
-1
1,47E-03
2,58E-03
-1
0,500%
-1
6000
20
2,94E-03
1,72E-03
2,000%
8500
21
2,94E-03
1,72E-03
1,000%
8500
22
-1
1,47E-03
-1
8,61E-04
1,500%
11000
23
4,41E-03
-1
8,61E-04
1,500%
11000
24
-2
0,00E+00
1,72E-03
1,000%
8500
25
5,88E-03
1,72E-03
1,000%
8500
26
-1
1,47E-03
-1
8,61E-04
-1
0,500%
-1
6000
27
4,41E-03
2,58E-03
-1
0,500%
-1
6000
28
2,94E-03
1,72E-03
1,000%
-2
3500
29
2,94E-03
1,72E-03
1,000%
13500
30
-1
1,47E-03
-1
8,61E-04
1,500%
-1
6000
31
2,94E-03
1,72E-03
1,000%
8500
Tabla 3-2: Diseo de experimentos rotacional para optimizar la velocidad especfica de

crecimiento de H. pluvialis

49

En la Tabla 3-3 se muestran los resultados del ajuste de los parmetros evaluados en
una matriz de varianza (ANOVA), donde se puede ver que el polinomio de segundo
orden describe el 93,5% de la variacin de los datos experimentales de velocidad
especifica de crecimiento lo que se consider satisfactorio. La velocidad especfica de
crecimiento queda ajustada por la Ecuacin 3.3, la cual se encuentra descrita por
variables codificadas en el intervalo (-2, 2). En la Figura 3-5 se muestra el diagrama de
Pareto para los parmetros evaluados, mostrando que el nitrgeno, al igual que las
interacciones Fsforo CO2, Nitrgeno Intensidad lumnica, Nitrgeno Fsforo,
Nitrgeno CO2 y Fsforo intensidad lumnica, no tienen efecto significativo en la
velocidad especfica de crecimiento con una confianza del 95%.

(Ecuacin 3.3)
El parmetro que present mayor efecto en la velocidad especfica de crecimiento fue el
porcentaje de CO2 en el aire de burbujeo, mostrando un efecto negativo o inhibitorio en el
crecimiento de la microalga nativa. Este resultado difiere con el encontrado por Sarada et
al. (2002a), ya que ellos encontraron un efecto positivo de esta variable y un ptimo de
aplicacin en 1,54 %; de igual manera en la investigacin de Kaewpintong et al. (2007)
se muestra un ptimo de crecimiento al utilizar 1% de CO2. Las microalgas son
microrganismos capaces de tolerar elevadas concentraciones de CO2, presentando
ptimos de produccin de biomasa a niveles muy inferiores a los mximos tolerables, por
ejemplo especies tolerantes como Euglena gracilis puede crecer al ser sometida a
concentraciones entre 5 y 45 % de CO2 con un crecimiento ptimo a una concentracin
de 5 %, comportamiento similar al obtenido en la presente investigacin. Otras
microalgas como Chlorella sp. producen la mxima biomasa al ser sometidas a aireacin
con 10 % de concentracin de CO2 y se ha reportado crecimiento hasta un 40 % de
concentracin (Salih, 2011).
La presencia de oxigeno tambin es importante en la asimilacin del dixido de carbono,

se ha encontrado que a bajas concentraciones de oxigeno disuelto se aumenta la
50

eficiencia fotosinttica en un 14 %, mientras que la saturacin genera un decaimiento en

un 35% de la eficiencia (Salih, 2011). Para la remocin del oxgeno se aireo el medio de
cultivo, lo cual puede llegar a saturarlo y reducir su eficiencia de absorcin de CO2; se
puede utilizar otros gases paa la desorcin del oxgeno generado, pero no solo se
aumentaran los costos de produccin sino que se reduce la disponibilidad mnima de
oxgeno que se requiere para los procesos de fotorespiracin.
The presence of oxygen plays a role in controlling the efficiency of CO2 uptake. Becker
[51] calculated that a concentration of CO2, as low as 106 mol/l (30 ppm) is sufficient to
maintain unlimited photosynthesis of the algae. On the other hand, experiments with
different O2 concentrations in the medium have shown the photosyn-thetic efficiency is
increased by 14% if almost no O2 is present in the medium but is reduced to about 35%
when the medium is saturated with 100% O2. However, an-other study showed that
oxygen concentrations ranging from 10 to 200% of ambient had no significant effects on
daily net carbon gain or total wet biomass production rates in this particular seaweed [40].
Generally speaking, the effects of
El segundo parmetro de mayor influencia en el crecimiento de H. pluvialis es la

intensidad de luz, mostrando un efecto positivo en la velocidad especfica de crecimiento.
Sarada et al. (2002a) han encontrado por el contrario un efecto negativo de esta variable
en la produccin de biomasa, mostrando un valor ptimo a bajas iluminancias; este
parmetro ha mostrado gran diferencia en las diferentes investigaciones, ya que en los
resultados de Cohen (1999), Harker et al. (1996) y Katsuda et al. (2004) se muestra
crecimiento y supervivencia de las clulas hasta niveles de baja irradiacin, entre 2 y de
37 Pmol/m2s, para diferentes fuentes de luz (LEDs y lmparas fluorescentes), mientras
que las investigaciones de Choi et al. (2003) y Zhang et al. (2009) han mostrado ptimos
de crecimiento a irradiaciones de 90 Pmol/m2s y 100 Pmol/m2s respectivamente, en
ambos casos se realiz un aumento progresivo de la intensidad lumnica, obteniendo
crecimiento celular y acumulacin de astaxantina en el mismo proceso.

Coeficiente
Valor
estimado
Media suma
de cuadrados
F-Valor
P-Valor
Constante
ao
0,57339
X1:Nitrgeno
a1
0,03148
0,02379
0,02379
3,33
0,0866
X2:Fsforo
a2
0,03874
0,03601
0,03601
5,05
0,0391
X3:CO2
X4:Intensidad
lumnica
a3
-0,19534
0,91576
0,91576
128,33
0,0000
a4
0,10294
0,25434
0,25434
35,64
0,0000
X12
a11
-0,04425
0,05598
0,05598
7,85
0,0128
X1X2
a12
-0,01745
0,00487
0,00487
0,68
0,4209
X1X3
a13
0,01386
0,00308
0,00308
0,43
0,5208
X1X4
a14
0,01848
0,00546
0,00546
0,77
0,3945
X22
a22
-0,03690
0,03894
0,03894
5,46
0,0328
X2X3
a23
-0,03157
0,01595
0,01595
2,23
0,1544
X2X4
a24
0,01010
0,00163
0,00163
0,23
0,6390
X32
a33
-0,08548
0,20896
0,20896
29,28
0,0001
X3X4
a34
-0,05691
0,05182
0,05182
7,26
0,0159
X42
a44
-0,06203
0,11002
0,11002
15,42
0,0012
Total error
0,11418
16
0,00714
Total (corr.)
1,75514
30
Fuente de variacin
Suma de Grados de
cuadrados
libertad
51
R2 = 93,495 %
Tabla 3-3: Anlisis de varianza (ANOVA) para los parmetros ajustados
52

Figura 3-5: Diagrama de Pareto estandarizado para el efecto de los parmetros

ajustados sobre la velocidad especfica de crecimiento.
La concentracin de nitrgeno (NaNO3) y la concentracin de fsforo (K2HPO4 y KH2PO4)

mostraron un efecto positivo en el crecimiento de Haematococcus pluvialis, pero el
nitrgeno no present diferencia significativa en la velocidad especifica de crecimiento.
Estos parmetros son de gran importancia en la acumulacin de astaxantina en las
clulas, dado que las bajas concentraciones en el medio de cultivo genera estrs y bajas
tasas de crecimiento, pero autores como Harker et al. (1996) han observado que se
obtiene el mximo crecimiento de la microalga cuando sta es sometida a una
concentracin de nitrgeno (NaNO3) de 3 mM y de fsforo (K2HPO4 y KH2PO4) de 3,4
mM, mientras que se obtiene la mxima acumulacin de astaxantina en ausencia total de
nitrgeno, una concentracin de fosfato de 0,85 mM y 72 PM de hierro. Garca-Malea et
al. (2005) alcanzaron una velocidad especfica de crecimiento de 0,57 d-1 con una
concentracin de nitrgeno en el medio de 10 mM de nitrato y acumulacin de
astaxantina cuando la deficiencia de nitrgeno lleg a 0,2 mM.
Todos los efectos cuadrticos mostraron un efecto negativo en el crecimiento de la

microalga, as como la interaccin entre la fuente de nitrgeno y la fuente de fsforo,
siendo todos los efectos significativos con 95 % de confianza. En las Figura 3-6, Figura
3-7 y el Anexo B se puede ver con mayor facilidad estos efectos en las superficies de
respuesta.

53
Figura 3-6: Efecto de los parmetros sobre la velocidad especfica de crecimiento
Figura 3-7: Superficie de respuesta para la velocidad especfica de crecimiento, 3,28 mM

NaNO3 y 2,58 mM de K2HPO4 y KH2PO4
Para el anlisis el ptimo de la concentracin de nitrgeno se tom la derivada de la

54


(Ecuacin 3.3 con respecto a
X1 manteniendo las otras variables constantes, llegando a la siguiente ecuacin:
Igualando a 0 la
(Ecuacin 3.4)
(Ecuacin
3.4 y despejando X1 se puede calcular el ptimo de la concentracin de nitrgeno como:

(Ecuacin 3.5)
Remplazando los parmetros de la ecuacin y siguiendo el mismo procedimiento para la

concentracin de fsforo, el porcentaje de CO2 en la aireacin y la iluminancia se llega a
las siguientes expresiones:

Las concentraciones de nitrgeno y fsforo ptimas se encuentran, de acuerdo a estas
relaciones, cuando se tienen los ms altos valores de CO2 en la aireacin y de
irradiacin, pero estas variables son inversamente proporcionales, es decir que el ptimo
de la concentracin de nitrgeno es cuando se tiene la menor concentracin de fsforo y
viceversa. Utilizando X2=-1, X3=1 y X4=1, el valor de la concentracin de nitrgeno que
optimiza la velocidad de crecimiento es 0,919 (4,3 mM), y para el fsforo (X1=-1, X3=1 y
X4=1) es 1,278 (2,82 mM) (fuera del rango de investigacin), estos valores estn de
acuerdo a los encontrados por Harker et al. (1996) en donde obtiene el mximo
crecimiento de la microalga cuando es sometida a una concentracin de nitrgeno
(NaNO3) de 3 mM y de fsforo (K2HPO4 y KH2PO4) de 3,4 mM, adems en la
investigacin de Garca-Malea et al. (2005) alcanzaron la mxima velocidad especfica de
crecimiento con una concentracin de nitrgeno de 10 mM.
Tanto para el porcentaje de CO2 en la aireacin y la irradiacin de luz, los valores

ptimos se encuentran cuando se tiene la ms alta concentracin de nitrgeno y la ms
baja concentracin de fsforo, pero el porcentaje de CO2 en la aireacin tiene su ptimo
a elevadas irradiaciones, mientras que la irradiacin lo presenta a bajos porcentajes de

55
CO2 en la aireacin. Utilizando X1=-1, X2=1 y X4=1, el valor del porcentaje de CO2 que
optimiza la velocidad de crecimiento es -0,544 (0,728%), y para el fsforo (X1=-1, X2=1 y
X3=1) es 1,519 (12300 Lux) (por fuera del intervalo evaluado). Este resultado difiere al
encontrado por Sarada et al. (2002a), 1,54 %; pero es similar al reportado por
Kaewpintong et al. (2007) quienes muestran un ptimo de crecimiento al utilizar 1% de
CO2 en la aireacin. El valor ptimo de la irradiacin es similar a los publicados por
Cohen (1999), Harker et al. (1996) y Katsuda et al. (2004) donde muestran crecimiento y
supervivencia de las clulas hasta niveles de irradiacin entre 2 y de 37 Pmol/m2s (3600
y 66000 Lux)
Estos resultados sugieren que el experimento puede reevaluarse en intervalos ms

amplios para la concentracin de fsforo as como para la irradiacin, ya que estos
parmetros se encuentran por fuera del intervalo evaluado.
En el proceso de optimizacin se encontr que la mxima velocidad especfica de

crecimiento predicha, para los lmites evaluados entre el intervalo de confianza, fue de
0,825 das -1, con los siguientes valores de los parmetros evaluados: Dixido de carbono
0,51%, nitrgeno (NaNO3) 3,28x10-3 M, fsforo (K2HPO4 y KH2PO4) 2,58x10-3 M,
Intensidad de luz 11000 Lux, superando los valores encontrados en el captulo 2 de 0,52
das -1 en la comparacin de diferentes medios de cultivo. Adems, este valor es superior
a los reportados en investigaciones como la de Fbregas et al. (2001) con una velocidad
especfica de crecimiento de 0.13 das-1 utilizando el medio de cultivo OHM, la
investigacin de Kaewpintong et al. (2007) donde reportan valores de 0,20 das
-1
para el
medio de cultivo F1 o el reporte de Issarapayup et al. (2009) en el que se muestran

velocidades de crecimiento de 0,225 das -1 para el medio F1.
Las elevadas velocidades de crecimiento predichas por el modelo en la presente

investigacin, sumadas a los elevados porcentajes de acumulacin de astaxantina
obtenidos por el mtodo de concentracin e irradiacin de luz descritos en el captulo 2,
muestran el potencial que tiene la cepa nativa de Haematococcus pluvialis para producir
este caroteno a nivel industrial utilizando una metodologa de dos pasos para el
crecimiento y el estrs de la microalga.
56

4. Diseo, montaje y evaluacin de un

fotobiorreactor para el crecimiento de la
Resumen
Se dise y construy un fotobioreactor tipo airlift para el crecimiento de una cepa nativa
de la microalga Haematococcus pluvialis. Se realiz una caracterizacin hidrodinmica
reactor encontrando tiempos de mezclado de 130 a 240 s, retenciones de gas inferiores
al 6 % del volumen del reactor, y coeficientes de transferencia de masa para el oxgeno y
el dixido de carbono de 9,8 y 8,6 h-1 respectivamente. Se encontr una velocidad
mxima de crecimiento, para una aireacin de 0,05 vvm, de 0,597 das-1, utilizando las
condiciones ptimas encontradas anteriormente: Dixido de carbono 0,51%, nitrgeno
(NaNO3) 3,28x10-3 M, fsforo (K2HPO4 y KH2PO4) 2,58x10-3 M, Intensidad de luz 11000
Lux.
Palabras claves: Haematococcus pluvialis, velocidad especfica de crecimiento,

retencin de gas, tiempos de mezclado, coeficientes globales de transferencia de masa.
Abstract
An airlift photobioreactor was designed, built and used for growing a native strain of the
microalgae Haematococcus pluvialis. A hydrodynamic characterization of the bioreactor
was performed, finding a range of mixing times between 130 and 240 s, gas retention of
less than 6% of the reactor volume, oxygen mass transfer coefficient of 9,8 h-1 and carbon
dioxide mass transfer coefficient of 8,6 h-1. The specific growth rate of the algae for
aeration of 0,5 vvm was 0.597 day -1, using the same conditions for the last experiment:
carbon dioxide 0,51%, nitrogen (NaNO3) 3,28x10-3 M, phosphor (K2HPO4 y KH2PO4)
2,58x10-3 M, irradiance 11000 Lux.
58

Keywords: Haematococcus pluvialis, specific growth rate, gas hold up, mixing time,
mass transfer coefficient.
4.1 Introduccin
Las microalgas son microorganismos fotosintticos que tiene un alto valor industrial; la
microalga Haematococcus pluvialis es uno de los mejores productores de astaxantina, ya
que tiene la capacidad de acumular ms del 3% en peso del pigmento (Hagen et al.,
2001); sin embargo, esta microalga presenta una baja productividad de astaxantina que
impiden su uso comercial, debido a factores como un lento crecimiento, baja
concentracin celular y alta susceptibilidad a daos hidrodinmicos, comparada con la
microalga unicelular Chlorococcum sp.: sta ltima microalga presenta, sin embargo, una
muy baja acumulacin de astaxantina (Zhang & Lee, 1997).
La astaxantina ha adquirido gran inters industrial, ya que ha sido ampliamente utilizada

en la acuicultura como aditivo para la pigmentacin de salmn, trucha, camarn, algunos
peces ornamentales y muchos crustceos (Lorenz & Cysewski, 2000), as como en la
industria farmacutica y la industria cosmtica han realizado avances importantes en sus
estudios, mostrando su elevada actividad antioxidante, excelentes propiedades como
agente fotoprotector (luz UV), propiedades para la salud ocular, de la piel, del corazn y a
nivel celular y otros usos potenciales como anti-inflamatorio, anti-cancergeno,
desintoxicante, en enfermedades neurodegenerativas y en la respuesta inmune (Guerin
et al., 2003).
Para clulas de bajo crecimiento y alta sensibilidad como H. pluvialis, es recomendado el

uso de biorreactores agitados neumticamente frente a los reactores agitados
mecnicamente, gracias a la simplicidad de su diseo y al bajo estrs hidrodinmico
(Kaewpintong et al., 2007). Ejemplos de estos reactores neumticos son las columnas de
burbujeo y los reactores airlift, los cuales han sido usados en numerosas aplicaciones en
procesos biotecnolgicos.
Capitulo 4 Diseo, montaje y evaluacin de un fotobiorreactor para el
59
crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis
Se han reportado daos celulares en la microalga, como prdida de los flagelos y muerte
celular a elevados flujos de aireacin, por ejemplo Vega-Estrada et al. (2005) muestran el
efecto de la velocidad superficial del gas a la salida del dispersor (utilizando diferentes
tipos de aspersores) y la velocidad de entrada de gas (medida en funcin del flujo
volumtrico de entrada), sobre el crecimiento de H. pluvialis, en un fotobioreactor tipo
airlift de pared plana, encontrando que los daos celulares por efectos hidrodinmicos
son reducidos cuando el biorreactor es operado con una velocidad superficial y de
entrada de gas de 12 mm/s and 22.8 m/s respectivamente. Los autores calcularon el
coeficiente volumtrico de transferencia de masa para el fotobioreactor, y encontraron
que es de 10 h-1 y 32 h-1 para velocidades superficiales de 6 y 24 mm/s respectivamente.
En el presente trabajo de investigacin se muestra la caracterizacin hidrodinmica de un

fotobioreactor tipo airlift, el cual fue diseado y construido para el cultivo vegetativo de la
microalga nativa de Haematococcus pluvialis. Se presenta los coeficientes de
transferencia de masa para el oxgeno y el dixido de carbono para diferentes flujos de
aireacin, medida en vvm, en cultivos por lotes.

4.2.1
Microorganismos y condiciones de cultivo

autoclave a 121C durante 30 minutos. La temperatura del cultivo fue de 24 2 C,
utilizando lmparas fluorescentes Sylvania Daylight F48T12/D 39W como fuente de
iluminacin artificial con iluminancia de 2500 50 Lux, fotoperiodo de 18 h horas de luz y
6 de oscuridad (18:6 LO), aireacin de 0,5 vvm empleando aire atmosfrico filtrado con
membranas de 0,22 m. El mantenimiento se realiz en botellas de vidrio planas de 4,5
cm de espesor y capacidad de 330 mL con volumen de cultivo de 200 mL; se realiz
resiembra semanalmente empleando inculo del 10% v/v.
60

Los inculos fueron realizados en botellas de vidrio con capacidad para 330 mL con
volumen de cultivo de 200 mL 0,5 mL, utilizando el medio lquido BBM (Anexo A)
(Andersen, 2005) modificado de acuerdo con los valores ptimos de crecimiento
obtenidos en el captulo 3 nitrgeno (NaNO3) 3,28x10-3 M y fsforo (K2HPO4 y KH2PO4)
2,58x10-3 M). Se ajust el inculo para una concentracin inicial de 4,0 x 10 4 Cel/mL, y se
realizaron dos curvas de crecimiento por conteo diario a 0,5 vvm y 1 vvm; en los cultivos
se aplic 0,51 % de CO2 en la aireacin y una intensidad de luz de 11000 Lux. Se fij la
temperatura de 25 0,5 C, fotoperiodo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad
(12:12 LO). Para la iluminacin se utilizaron 5 cintas de LEDs de referencia SMD3528 de
luz blanca rodeando la pared externa del biorreactor, conectados a un regulador de
potencia que permiti variar la intensidad lumnica, la cual se midi empleando un
luxmetro marca VWR Scientific 21800-014 y el fotoperiodo se fij empleando una
temporizador digital marca Steren ver figura 4-1.
Figura 4-1: Iluminacin con cintas LED tipo SMD del fotobiorreactor tipo airlift
Para la mezcla de los gases de aireacin se construy un mezclador compuesto por un

manmetro y un regulador de presin para cada una de los gases, as como rotmetros
marca AALBORG Instruments 112-02 de 0 a 150 mm para CO2 y Dwyer Instruments VFB
de 4 L para aire (Figura 4-2). El suministro de CO2 se realiz con un cilindro de gas grado
industrial, fijando su presin igual que la del aire en 5 psi; la mezcla se humidific para
evitar la evaporacin del medio de cultivo. Se instal en la entrada de aire una vlvula de
conexin rpida para realizar el cambio entre aire y nitrgeno segn su necesidad. Para
la inyeccin de nitrgeno se utiliz un cilindro de nitrgeno grado industrial.
61
4.2.2
Descripcin del fotobioreactor airlift
Se construy un fotobioreactor de 1,8 L de capacidad con un volumen de 1,5 L tiles de

trabajo, en vidrio borosilicato para permitir la entrada de luz (1). El vidrio cilndrico se
construy con una expansin del dimetro en la parte superior para reducir la velocidad
del medio de cultivo en la zona de desgasificacin. El reactor cuenta con puertos para
sensores de oxgeno disuelto (2) y pH (3), as como un puerto para entrada de
termocupla (4), regulando la temperatura por medio del ingreso de agua a 25 0,5 C a
travs de un intercambiador de calor interno (5).
Nmero
Descripcin
Nmero
Descripcin
Entrada de aire
Manmetro para aire- nitrgeno
Entrada de CO2
Regulador de presin para aire nitrgeno
Salida de mezcla
10
Rotmetro para CO2
Cilindro de CO2
11
Rotmetro para aire
Humidificador de aire
12
Cilindro de Nitrgeno
Manmetro para CO2
Regulador de presin para CO2
Figura 4-2: Esquema de mezclado de aire y dixido de carbono, control de flujo de aire y
nitrgeno
62

Se incorpor un muestreador en la parte baja de la zona de descenso del reactor, para

obtener muestras representativas (6). De igual manera se instal un tubo de ingreso de la
aireacin (7), con un agujero distribuidor de 1,97 mm2 de rea (8); el sistema permite
intercambiar diferentes tipos de distribuidores de gas para permitir su evaluacin. Para el
control de pH se cuenta con un puerto de inyeccin de tres entradas para el ingreso de
cido y base cuyo flujo se regula (9), mediante un controlador de pH conectado a 2
bomba peristlticas. Por ltimo se construy un intercambiador de calor para condensar
el agua evaporada o arrastrada por el aire de salida del reactor (10) el cual es refrigerado
por agua fra (Figura 4-3).
El tubo central se construy en vidrio borosilicato (11), y se asegur a la tapa por medio
de un tubo roscado que permite modificar la altura de trabajo de la zona de ascenso (12),
permitiendo variar el rea de flujo de lquido en la parte superior e inferior del reactor; el
rea de flujo de la zona de ascenso es de 2,03 x10-3 m2 y la relacin de reas
transversales de la zonas de ascenso y descenso es de 0,187. El rea de iluminacin
para un volumen de trabajo de 1,5 L es de 556 cm 2. Todas las partes del reactor se
construyeron en acero inoxidable 316 y se utiliz el software Solid Edge v18 (Siemens
PLM Software) para la realizacin de los planos de diseo, los cuales son presentados
en el Anexo C.
63
Figura 4-3 Fotobiorreactor tipo airlift para el cultivo de microalgas
4.2.3
Caracterizacin hidrodinmica
Para la caracterizacin hidrodinmica se evaluaron los parmetros tiempo de mezclado,

retencin del gas, velocidad del gas en la zona de ascenso, velocidad del lquido en la
64

zona de descenso y el coeficiente global de transferencia de masa tanto para el oxgeno

como para el CO2 disueltos. Se evaluaron 4 distintos flujos de aireacin, medidos en
funcin de la relacin de aire de entrada y el volumen del reactor (0.25, 0.5, 0.75 y 1 vvm)
4.2.4
Tiempo de Mezclado
El tiempo de mezclado se determin usando la tcnica del trazador cido (Cristi, 1989):
se inyectaron 0,3 mL de una solucin de cido sulfrico 6N en la parte central de la zona
de ascenso del fotobioreactor. La seal de pH se registr con un electrodo de pH marca
Mettler Toledo, modelo InPro 3253/225/Pt1000, en la parte inferior de la zona de
descenso, a una altura de 3 cm sobre la base del reactor. Se determin el tiempo de
mezclado como el tiempo necesario para alcanzar el 99% de la concentracin final de la
solucin, utilizando agua destilada y manteniendo la temperatura en 25 0.5 C.
4.2.5
Retencin de gas
La retencin de gas (G ) fue determinada por la tcnica de expansin de volumen (Chisti

& Moo-Young, 1987) descrita por (Daz, 2008), se determin a partir de la diferencia
entre los niveles de lquido no gaseado y gaseado:

(Ecuacin 4.1)
Donde h representa la altura del lquido y los subndices G y L representan al lquido

gaseado y no gaseado respectivamente. Para ello se tomaron videos donde se
obtuvieron entre 5 y 8 repeticiones de las medidas.
4.2.6
Velocidad del gas en la zona de ascenso
La velocidad del gas en la zona de ascenso se calcul con el rea transversal de flujo y
el caudal de aire alimentado de acuerdo con la siguiente ecuacin:

(Ecuacin 4.2)
Donde UGR es la velocidad del gas a la entrada, en m/s, QG es el caudal de gas a la

entrada del dispersor, en m3/s y AR es el rea transversal del tubo de ascenso o zona de
ascenso (2,03 x10-3 m2).
65
4.2.7
Velocidad del lquido en la seccin de descenso
La velocidad de descenso del medio de cultivo se determin mediante la tcnica visual

del trazador slido, determinando la longitud y tiempo de un polmero de igual densidad
al agua en la zona de descenso (Daz, 2008). Se determino el tiempo necesario para que
la partcula esfrica de 1 mm de dimetro cruce dos lmites establecidos, este
procedimiento se repiti 10 veces.
4.2.8
Coeficiente volumtrico global de transferencia de masa
El coeficiente volumtrico global de transferencia de masa (k La) se evalu por la tcnica

dinmica de desgasificacin (Cristi, 1989). Se utiliz el medio lquido BBM y se aire por
2 horas hasta alcanzar la concentracin mxima de oxgeno, se cerr el ingreso de aire y
se permiti la entrada de nitrgeno para desairear el sistema hasta una concentracin de
oxigeno baja (Aproximadamente 50%); luego, se permiti 1 minuto para desalojar todas
las burbujas de nitrgeno restantes y se reinici el burbujeo con aire a un caudal
determinado por las vvm evaluadas, hasta alcanzar de nuevo alta concentracin de
oxgeno disuelto. Se hizo seguimiento a la concentracin de oxgeno disuelto en ppm
cada 15 segundos, hasta alcanzar el equilibrio, utilizando un sensor multi-parmetro
HI9828 marca HANNA instruments, ubicado en la zona de descenso a la mitad de la
altura del biorreactor. Para todos los experimentos la temperatura se fij en 25 0.5 C.
La velocidad de transferencia de oxgeno est relacionada con el coeficiente global de

transferencia de masa kLaL, por medio del siguiente balance de oxgeno en la fase
lquida:
(Ecuacin 4.3)
Donde CL y C* son la concentracin instantnea y de saturacin de oxgeno disuelto

respectivamente. Suponiendo estado estacionario y que el coeficiente global de
transferencia de masa es invariante con el tiempo se puede integrar la ecuacin:

(Ecuacin 4.4)
66

Se calcula el aprovechamiento fraccional del equilibrio (E), y se grafica el Ln(1-E) vs el

tiempo, donde la pendiente es el coeficiente global de transferencia de masa; CLO es la
concentracin inicial de oxgeno disuelto en el instante donde reinicia la aireacin.
El coeficiente global de transferencia de masa para el dixido de carbono se calcul por

medio de la correlacin de la difusividad de las dos fases, de acuerdo a la teora de la
penetracin (Talbot et al., 1990), utilizando la siguiente ecuacin:

(Ecuacin 4.5)
Utilizando las correlaciones de Wilke y Chang para el agua destilada a 25 C el factor

[DCO2/DO2]0,5 es 0,884 (Treybal, 1987).
4.2.9
El crecimiento fue determinado por conteo celular diario hasta alcanzar la fase
estacionaria (8 das), utilizando una cmara de Neubauer.
4.2.10 Ajuste de cinticas de crecimiento

(Ecuacin 4.6)
En la Ecuacin 4.6 X es la densidad celular (clulasmL-1), X0 y Xmax son las densidades

celulares inicial y mxima respectivamente (clulasmL-1), es la Velocidad especfica de

4.3.1
Tiempo de Mezclado
Los tiempos de mezclado obtenidos se encuentran entre 100 y 250 s, valores que se
encuentran entre los rangos reportados en otras investigaciones. Daz (2008) muestra
tiempos de mezclado entre 100 y 420 s, para flujos entre 10,8 y 60 L/min, en un
67
biorreactor tipo airlift de 20 L para medios de cultivo con viscosidad similar a la del agua.
Se observ una disminucin en los tiempos de mezclado a medida que aumenta el flujo
de aireacin, ajustndose a un modelo exponencial con un 97,9 %.
7,00
6,50
6,00
pH
5,50
0,25 vvm
5,00
0,75 vvm
4,50
4,00
0,5 vvm
3,50
1 vvm
3,00
2,50
200
400
600
800
1000
Tiempo (s)
Figura 4-4 Respuesta ante impulsos cidos del electrodo de pH
Tiempo de Mezclado (s)
300
250
200
150
y = 292,16e-0,51x
R = 0,979
100
50
0
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
1,50
1,75
Caudal de gas (L/min)
Figura 4-5 Tiempos de mezclado en funcin del flujo de aireacin
68

4.3.2 Retencin del gas

Se observ un aumento progresivo de la retencin del gas a medida que aumenta el flujo
de aireacin al reactor; el mximo valor obtenido no supera el 6 % del volumen del
reactor (1,590 L/min), siendo este volumen inferior al volumen total del equipo (1,8 L),
evitando problemas de arrastre del medio de cultivo en la corriente de salida de la
aireacin. Este parmetro es de gran importancia ya que describe el volumen de gas que
es capaz de retener el medio de cultivo, permitiendo la transferencia de materia entre las
fases. Los resultados se muestran en la Figura 4-6.
4.3.3 Velocidad de descenso del lquido

Se observ aumento progresivo de la velocidad de descenso en funcin de la velocidad
de flujo de gas en la zona de ascenso, esto se debe a que la velocidad de circulacin del
lquido depende de la diferencia en la retencin de gas entre la seccin de ascenso y de
descenso, el tiempo de mezclado y el rea interfacial, principalmente (Daz, 2008). Se
ajustaron los datos a una ecuacin potencial, que describe con un 99,64 %, los datos
experimentales; este modelo muestra que al incrementar la velocidad del gas en la zona
de ascenso se obtiene un incremento en la velocidad de descenso del lquido, ya que se
reduce la densidad en la zona de ascenso (oxgeno disuelto), impulsando as el lquido
desairado en la zona de descenso.
Retencin del gas
0,07
0,06
y = 0,0024x + 0,0224
R = 0,9919
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
Velocidad de aireacin (mm/s)
Figura 4-6 Retencin de gas en funcin del flujo de aireacin
69
Velocidad de decenso del liquido

(m/s)
0,25
y = 1,7071x0,4636
R = 0,9964
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
0,000
0,005
0,010
0,015
Velocidad del gas en la zona de ascenso m/s
Figura 4-7 Velocidad de descenso del medio lquido
4.3.4 Coeficientes globales de transferencia de masa

La Figura 4-8 muestra la curva de desgasificacin y gasificacin de la concentracin de
oxgeno disuelto para un flujo de 0,25 vvm (las otras curvas se pueden ver en el Anexo
D). Los datos obtenidos se linealizaron por medio de la Ecuacin 4,4 y se calcul la
pendiente para cada uno de los flujos, obteniendo en todos los casos un ajuste superior
al 98 % (Figura 4-9 Anexo D).
Oxigeno disuelto %
100
90
80
70
60
50
40
0
500
1000
1500
Tiempo (s)
Figura 4-8 Perfil de concentracin de Oxgeno disuelto para una flujo de 0,25 vvm
70

1,2
y = 0,00114x - 0,37982
R = 0,98704
-Ln(1-E)
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Tiempo (s)
Figura 4-9 Linealizacin de los perfiles de concentracin para el oxgeno disuelto para un
flujo de aireacin de 0,25 vvm
Los coeficientes globales de transferencia de masa obtenidos para el oxgeno estn entre
el rango de 4 y 10 h-1, valores similares a los obtenidos por otras investigaciones. VegaEstrada et al. (2005) muestran en su trabajo que para velocidades de aireacin de 5 y 25
mm/s de gas, se obtienen coeficientes globales de transferencia de oxgeno de 10 y 32 h1
, mientras que (Daz, 2008) muestra coeficientes globales mayores utilizando flujos de 9
a 42 L/min en un biorreactor de 20 L, con valores de 25 y 100 h-1 respectivamente. Estas

grandes diferencias son causadas principalmente por el uso de diferentes difusores de
aire, lo que permite que el tamao de las burbujas tengan mayor rea de transferencia.
Los coeficientes de transferencia de CO2 fueron menores en todos los experimentos
comparados a los del oxgeno, dado que la difusivad del dixido de carbono es menor
que la del oxigeno en agua a 25 C
.
71
12
10
kLa (h-1)
8
6
Oxgeno
CO2
4
2
0
0
10
12
14
Velocidad de gas (mm/min)
Figura 4-10 Coeficientes globales de transferencia de masa en funcin del flujo de

aireacin
4.3.5 Evaluacin del crecimiento de la microalga

En la Figura 4-11 se muestran las curvas de crecimiento de la cepa nativa de
Haematococcus pluvialis a dos flujos de aireacin, 0.5 y 1 vvm. Se pudo observar lento
crecimiento para el flujo de 1 vvm. Autores como Krichnavaruk et al. (2005) reportan
para Chaetoceros calcitrans reduccin en el crecimiento para velocidades de aireacin
superiores a 40 mm/s y Vega-Estrada et al. (2005) han encontrado inhibicin para la
microalga Haematococcus pluvialis para velocidades de gas en la zona de ascenso
superiores a 12 mm/s, la misma velocidad evaluada en el presente trabajo (1 vvm).
La velocidad especifica de crecimiento de la microalga fue de 0,597 das-1, siendo inferior
al ptimo encontrado en el captulo 3 de 0,825 das -1, utilizando las mismas condiciones
de cultivo, medio BBM, concentracin de nitrgeno (NaNO3) 3,28x10-3 M, concentracin
de fsforo (K2HPO4 y KH2PO4) 2,58x10-3 M, porcentaje de dixido de carbono en la
aireacin 0,51%, Intensidad de luz 11000 Lux, temperatura 25 0,5 C y fotoperiodo de
12 horas de luz y 12 horas e oscuridad (12:12 LO). Esto puede explicarse porque la
72

disponibilidad de luz en el reactor es menor que la disponible en los ensayos a nivel de

laboratorio, en los biorrectores a de 100 mL la distancia promedio que debi pasar la luz
fue de 5 cm, mientras que en reactor airlift la distancia promedio fue de 12 cm, adems
las clulas que se encuentran en la zona de ascenso no tienen la misma intensidad que
las clulas en la zona de descenso, ya que se encuentran ms cerca de la fuente de luz y
el tubo central del reactor genera una resistencia adicional al paso de luz. Otro efecto
importante fue la presin atmosfrica, los experimentos a nivel de laboratorio se
realizaron a una presin atmosfrica de 560 mmHg y los experimentos en el reactor airlift
se realizaron a una presin atmosfrica de 670 mmHg, lo que representa una mayor
solubilidad del oxigeno y del dixido de carbono. Al aumentar la concentracin de
oxigeno disuelto se promueven las reacciones de fotorespiracin reduciendo la
produccin de biomasa, adems al aumentar la concentracin de dixido de carbono se
producir un efecto inhibitorio del crecimiento de acuerdo a los resultados encontrados
en el capitulo 2 de la presente investigacin.
Vega-Estrada et al. (2005) reportan 5 x104 y 1,1 x 106 Cel mL-1 como la concentracin
inicial y mxima obtenida, para un flujo de 0,5 vvm y fotoperiodo de 12 horas de luz y 12
de oscuridad en un periodo de 18 das, obteniendo una productividad de 5,8 Cel mL-1da-1
superando la productividad de 2,41 Cel mL-1da-1 encontrada en el presente trabajo (
# Cel/ mL
Figura 4-11).
2,0E+05
1,8E+05
1,6E+05
1,4E+05
1,2E+05
1,0E+05
8,0E+04
6,0E+04
4,0E+04
2,0E+04
0,0E+00
0,5 vvm
1 vvm
Tiempo (das)
10
73
Figura 4-11 Curva de crecimiento de la microalga H. pluvialis en un fotobioreactor tipo

airlift
5. Conclusiones y recomendaciones
5.1 Conclusiones
La microalga nativa de H. pluvialis no present diferencia significativa en el crecimiento
cuando es sometida a diferentes medios de cultivo (BBM, BG11, OHM, F1 y BBM:BG11),
por lo cual se recomienda utilizar el medio BBM por ser de mayor facilidad y economa
siendo un medio de cultivo estndar. Cuando las clulas se sometieron estrs por
salinidad en el medio no se present acumulacin significativa de astaxantina y se
observo muerte celular a una concentracin de 2,5 g/L; por el contrario al utilizar altas
intensidades de luz, las clulas fueron capaces de acumular 32,99 Pm/mL de
astaxantina.
Sin embargo si las clulas son concentradas e iluminadas por altas irradiaciones se
puede lograr una acumulacin de 59,23 Pm/mL de astaxantina, evitando airear 15 das
ms el medio de cultivo como se realiza en los otros mtodos de estrs celular, siendo la
opcin ms rentable y llamativa para su implementacin industrial.
Al evaluar los efectos del nitrgeno y de fsforo en el medio de cultivo, se encontr un

efecto positivo en el crecimiento, al igual que al aumentar la intensidad de luz. Caso
contrario sucedi con la concentracin de CO2 que produjo efectos inhibitorios sobre el
crecimiento, dado que su valor ptimo se encuentra en el lmite inferior evaluado por la
presente investigacin. Se encontr las condiciones ptimas de cultivo de dixido de
carbono 0.51%, nitrgeno (NaNO3) 3,28x10-3 M, fsforo (K2HPO4 y KH2PO4) 2,58x10-3 M,
Intensidad de luz 11000 Lux.
Las elevadas velocidades de crecimiento obtenidas en la presente investigacin,

sumadas a los elevados porcentajes de acumulacin de astaxantina obtenidos por el
mtodo de concentracin e irradiacin de luz, muestran el potencial que tiene la cepa
76

nativa de Haematococcus pluvialis para producir este caroteno a nivel industrial utilizando
una metodologa de dos pasos para el crecimiento y el estrs de la microalga.
El fotobiorreactor que se dise y construy presenta una retencin del gas para los
flujos evaluados menor al 6% del volumen total del reactor permitiendo un volumen de
trabajo de 1.5 litros. Los coeficientes de transferencia de masa para el oxgeno y para el
dixido de carbono se encontraron dentro de los valores utilizados en otros biorreactores
permitiendo la disponibilidad de dixido de carbono en el medio de cultivo.
Se encontr que los altos flujos de aireacin generan bajo crecimiento de la microalga (1
vvm), mientras que al utilizar flujos intermedios la velocidad especfica de crecimiento es
de 0.597 das -1, que a pesar de ser inferior al ptimo encontrado a nivel de laboratorio,
es superior al encontrado en otras investigaciones.
5.2 Recomendaciones
Se recomienda evaluar diferentes tipos de distribuidores de aire en el biorreactor tipo
airlift, as como diferentes flujos de aireacin (vvm) para encontrar la velocidad de
crecimiento ptima en el reactor.
Se recomienda adems, evaluar diferentes intensidades de luz y encontrar una funcin

de transferencia de luz dado que el dimetro del reactor puede generar gradientes de
crecimiento.
Otro factor importante a evaluar en investigaciones futuras es la extraccin de

astaxantina de la clula; se recomienda el uso de fluidos supercrticos.
Evaluar a nivel de laboratorio el punto ptimo encontrado por la regresin estadstica

sobre las condiciones de crecimiento, as como su evaluacin en el biorreactor por lote
alimentado y el crecimiento y la acumulacin de Astaxantina como variables simultneas
en el reactor airlift
CaCl2 2H2O
KNO3
NaNO3
Na2HPO4
NaH2PO4
H3PO4
K2HPO4
KH2PO4
NaCl
KOH
H2SO4
C6H5FeO7 5H2O
FeSO4 7H2O
MgSO4 7H2O
ZnSO4
CuSO4 5H2O
Na2MoO4 2H2O
CoCl2 2H2O
H3BO3
Cr2O3
SeO2
EDTA-Na 2H2O
Na2CO3
Especie qumica
18.6 g
20.9 mg
61.6 mg
0.72 mg
0.62 mg
0.07 mg
0.05 mg
195 mg
0.12 mg
M1
(Kaewpintong
et al, 2007)
183.8 mg
0.5 g
49.34 mg
10.948 mg
4.976 mg
4 mg
8.827 Pg
1.572 g
75 mg
175 mg
2.513 g
30.85 mg
0.99 mg
BBM
(Kaewpintong
et al, 2007).
25 mg
10 mg
1 mg
0.02 g
2.86 mg
0.079 mg
0.39 mg
0.008 mg
0.08 mg
0.0078 mg
0.05 mg
0.036 mg
75 mg
40 mg
1.5 g
BG-11
(Kaewpintong
et al, 2007).
36 mg
16.41 mg
2.21 mg
0.03 g
F1
(Kaewpintong
et al, 2007).
9.78 mg
0.41 g
6.7 mg
8.3 mg
24.6 mg
0.014 mg
0.012 mg
0.001 mg
0.0005 mg
0.003 mg
30 mg
35.5 mg
Hong Kong
(Kaewpintong
et al, 2007).
73 mg
0.3 g
0.372 g
0.417 g
1.231 g
71.89 mg
62.42 mg
7.26 mg
4.67 mg
1.5 g
1.778 g
12.37 mg
M6
(Kaewpintong
et al, 2007).
3.676 g
0.075 mg
0.005 mg
0.012 mg
0.12 mg
0.246 g
2.62 mg
0.03 g
OHM
(Fbregas et
al 2001)
0.11 g
0.41 g
0.003 g
0.021 g
0.024 g
0.031 g
Z8
(Tripathi et al,
1999).
A. Anexo: Composicin de los medios de cultivo

empleados
NH4Fe(C6H5O7)
MnCl2 4H2O
ZnSO4 7H2O
Co(NO3)2 6H2O
MnSO4 H2O
Ca(NO3)2 4H2O
CoCl2 6H2O
FeCl3
Biotina
Tiamina
Vitamina B12
78
15 mg
0.389 mg
0,5-20 Pg
0.66 mg
0.006 g
1.81 mg
0.222 mg
0.049 mg
0,5-20 Pg
0.001 mg
0,5-20 Pg
84.51 mg
25 Pg
17.5 Pg
15 Pg
0.011 mg
0.98 mg
Tabla A-1: Composicin de los medios de cultivo empleados, cantidades para 1 L
0,5-20 Pg
0.72 mg
1.445 mg
0.016 g
0.059 g
Evaluacin del crecimiento y produccin de astaxantina por Haematococcus pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
B.
Anexo: Superficies de respuesta

y 8500 Lux

y 1,72 mM de K2HPO4 y KH2PO4
80

Figura B-3: Superficie de respuesta para la velocidad especfica de crecimiento, 2,94

mM NaNO3 y 8500 Lux
C. Anexo: Planos de diseo

fotobioreactor tipo airlift
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Nombre
Fecha
Dibujado
DANIEL RAMREZ Marzo-2010
EDS-PLM SOLUTIONS
Comprobado DANIEL RAMREZ Junio 2010
Reactor airlift
Aprobado 1 RUBEN GODOY Sept. 2010 Ttulo
Aprobado 2
Salvo indicacin contraria
A4 Plano
cotas en pulgadas
Archivo: reactor airlift.dft
ngulos en grados
tolerancias 1/64 y 1
Escala
Peso
Aprobado
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
O 1/4
Descripcin
Fecha
Aprobado
O 1/8
#10-32 UNF
Conexin para manguera
1 1/2
Soldadura aireador 2
1/8
1/4
9 7/8
90
1 1/8
#10-32 UNF
Interna
3/8
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Aireador 1
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
Archivo: Aireador 1.dft
ngulos en grados
Escala
Peso
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
3/8-24 UNF
Fecha
Aprobado
1/4
1/2
1/8
3/4
1/32 X 45
CORTE A-A
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Aireador 2 (realizar 2 piezas)
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
ngulos en grados
Escala
Peso
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
A
#10-32 UNF
1/4
3/8
Fecha
Aprobado
#10-32 UNF
Interna
3/8
7/8
15/16
Descripcin
90
1/8
#10-32 UNF
Externa
CORTE A-A
1 5/16
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Aireador 3
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en milmetros
ngulos en grados
Escala
Peso
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
1/4
1/16
1/8
#10-32 UNF
3/8
A
CORTE A-A
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Aireador 3
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en milmetros
ngulos en grados
Escala
Peso
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
3/4-16 UNF
1/32 X 45
1-12 UNF
1/16
1/16
O1
O 7/8
B
1
1/2
13/16
1/16
Grafilado
CORTE A-A
1/32
1/16
DETALLE B
1 3/16 3/4
1/4
3/16
3/16
3/4
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Ajuste 2-1 ( 2 piezas)
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
Archivo: Ajuste 2-1.dft
ngulos en grados
Escala
Peso
Hoja 1 de 1
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
9/16
1/8
1 3/16 1-12 UNF
1/32 X 45v
CORTE A-A
3/4
1/32 X 45
Grafilado
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Ajuste 2-2 (3 piezas)
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
ngulos en grados
Escala
Peso
Hoja 1 de 1
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
1/8
Aprobado
5/16
1/16
1/8
7/8 13/16
Fecha
1/8
1/2
CORTE A-A A
7/8
3/4
1/32 X 45
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Ajuste 2-3 (2 piezas)
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
ngulos en grados
Escala
Peso
Hoja 1 de 1
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
1/4-28 UNF
1/4
4 1/16
3 13/16
O 1/8
1/4
5/8
O 1/8
1/4
5/8
CORTE A-A
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Cierre central 2
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
Archivo: cierre central 2.dft
ngulos en grados
Escala
Peso
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
1/32
1/16
DETALLE B
B
1/4
1/8
1 1/4-12 UNF
1/4-28 UNF
Interna
1 5/8
1 7/8
1/4
CORTE A-A
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Cierre central 1
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
Archivo: cierre central.dft
ngulos en grados
Escala
Peso
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
1/8
Descripcin
Fecha
Aprobado
1/16
Control de pH 2
Control de pH
1 1/2
5/8
Soldadura pieza
control de pH y 3
piezas de control
de pH 2
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Control de pH 2
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
Archivo: Control pH 2.dft
ngulos en grados
Escala
Peso
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
1/16
1/32
Grafilado
DETALLE A
3/16
1/32
A
3/16
1 1/4
Grafilado
3/4-16 UNF
O 1/8
Los 3 agujeros
van soldados a la
pieza control de pH 2
O1
O 7/8
120
O 7/16
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Control de pH
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
Archivo: Control pH.dft
ngulos en grados
Escala
Peso
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
11/16
5/8
Descripcin
Fecha
Aprobado
Soldadura Pieza
Enfriamiento 1-3
1/32
O 11/16
1/32
8
Soldadura Enfriamiento 1-1
TAPA FONDO ENFRIAMIENTO
Soldadura Tapa fondo enfriamiento

Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Pieza Enfriamiento 1-1
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
Archivo: Enfriaminto 1-1.dft
ngulos en grados
Escala
Peso
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
Grafilado
1/32
1/16
Soldadura Pieza
Enfriamiento 1-5
DETALLE A
A
3/4-16 UNF
1 1/4
3/4
O 1/4
3/4-16 UNF
1
5/32
Soldadura Pieza
Enfriamiento 1-1
3/16
1/4
7/16
Nombre
Fecha
EDS-PLM SOLUTIONS
Enfriamiento 1-3
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
ngulos en grados
Escala
Peso
Soldadura Pieza Dibujado

Enfriamiento 1-4
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado

1
45
Soldadura Pieza
Enfriamiento 1-3
8 7/16
8 1/16
1/4
3/16
DETALLE A
1/4
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Enfriamiento 1-4
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
ngulos en grados
Escala
Peso
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
Soldadura Pieza
Enfriamiento 1-3 45
1/32
11/16
1/4
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
ngulos en grados
tolerancias 0,5 y 1
Escala
Peso
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
5/16
Soldadura Pieza
Enfriamiento 1-1
Soldadura Pieza
Enfriamiento 1-5
Soldadura Pieza
Enfriamiento 1-4
Soldadura Tapa fondo enfriamiento
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Soldaduras piezas Enfriamiento
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
Archivo: Enfriaminto Soldadura.dft
ngulos en grados
Escala
Peso
SOLID EDGE
Rev
Ajuste 2-2
Intercambiador 4
oring 11/16 in
Intercambiador 3
Intercambiador 1
Intercambiador 2
Ajuste 2-2
Ajuste 2-3
Ajuste 2
oring 7/8 in
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
Soldadura
aireador 2
1/8
1/4
9 1/2
8
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Inoculacin
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
Archivo: Inoculacin.dft
ngulos en grados
Escala
Peso
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
3 11/16
7/16
Descripcin
Fecha
Aprobado
3/4
1 1/8
5/8
5/16
1/16
1/16
1/2
15/16
1/32 X 45
5 3/16
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Intercambiador 1
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
Archivo: Intercambiador 1.dft
ngulos en grados
Escala
Peso
Hoja 1 de 1
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
Soldadura Intercambiador 1
5/16
3/8
O 1/4 ( X 2)
Soldadura Intercambiador 1
15/16
3 5/8
Soldadura Pieza 2
Intercambiador 2
Soldadura Pieza 2
Intercambiador 2
Soldadura Pieza
Intercambiador 2
PIEZA 2

1
1/4
3/16
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Intercambiador 2
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
ngulos en grados
Escala
Peso
Hoja 1 de 1
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
#12-28 UNF
Descripcin
Fecha
Aprobado
1/16
3/8
3/8
3/8
3/8
3/8
1/4 9/16
3/8
5/32 X 45
3/8
3/8
3/8
1/4
3 3/8
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Intercambiador 3
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
ngulos en grados
Escala
Peso
Hoja 1 de 1
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
1 5/8
#12-28 UNF
Descripcin
Fecha
Aprobado
1/16
1/32
1 1/8
1/4
DETALLE B
1/8
A CORTE A-A A
#12-28 UNF
O 7/8
O 11/16
O 1/8
O 13/16
1/16
O 5/8
O 1/4
13/16 5/8
3/8
1
3/16
1/4 7/8
Soldadura Pieza 2
Intercambiador 4
1/32
Pieza 2
Soldadura Pieza
Intercambiador 4
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Intercambiador 4
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
ngulos en grados
Escala
Peso
Hoja 1 de 1
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
Nombre
DANIEL
Fecha
Dibujado
Comprobado
Aprobado 1
Aprobado 2
cotas en pulgadas
ngulos en grados
Fecha
Aprobado
SOLID EDGE
Ttulo
EDS-PLM SOLUTIONS
Intercambiador conjunto
A4 Plano
Archivo: Intercambiador conjunto.dft

Escala
Peso
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
1/32
1/8
1/32 X 45
Superficie
grafilada
1/4
1/32 X 45
1/4
1/16
DETALLE B
3/4-16 UNF
1/4
3/4-16 UNF
1/8
B
1 12 mm
7/8
1/32 X 45
CORTE A-A
1 3/16
3/4-16 UNF
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Sensor de pH
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
Archivo: Sensor pH.dft
ngulos en grados
Escala
Peso
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
Aprobado
3/8
3/16
3/32
15
15
Fecha
15
15
O6
60
R 2 7/16
R 2 17/32
R 2 3/4
R 3 5/16
O 1/4 ( X4)
CORTE A-A
1/32 X 45
1/32 X 45
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Aprobado 1 RUBEN GODOY Sept. 2010 Ttulo Soporte inferior (2 piezas en aluminio)
Aprobado 2
Rev
A4 Plano
cotas en pulgadas
Archivo: Soporte inf.dft
ngulos en grados
Escala
Peso
Hoja 1 de 2
SOLID EDGE
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Aprobado 1 RUBEN GODOY Sept. 2010 Ttulo Soporte inferior (2 piezas en aluminio)
Aprobado 2
Rev
A4 Plano
cotas en pulgadas
Archivo: Soporte inf.dft
ngulos en grados
Escala
Peso
Hoja 2 de 2
SOLID EDGE
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Soporte Inferior
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
Archivo: Soporte inf2.dft
ngulos en grados
Escala
Peso
Hoja 1 de 1
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
O 7 3/8
R4
O 1/4 ( X4)
60
R 3 13/32
R 3 3/32
R3
10
10
10
3/16
3/32
3/32
3/8
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Soporte superior (2 piezas en Aluminio)
Aprobado 2
Rev
A4 Plano
cotas en milmetros
Archivo: soporte sup.dft
ngulos en grados
Escala
Peso
Hoja 1 de 2
SOLID EDGE
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Soporte superior (2 piezas en Aluminio)
Aprobado 2
Rev
A4 Plano
cotas en milmetros
Archivo: soporte sup.dft
ngulos en grados
Escala
Peso
Hoja 2 de 2
SOLID EDGE
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
O 6 5/8
O6
O 4 3/4
O5
6 5/8
60
O 1/4 ( X 6)
1/8
3/16
3/32
CORTE A-A
DETALLE B
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Tapa inferior
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
Archivo: Tapa inferior.dft
ngulos en grados
Escala
Peso
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
Soldadura tornillos
1/4 unc x 3/4
* Los agujeros de 1/4 van soldados a tornillos

de 1/4 unc de 3/4 de longitud
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en milmetros
Archivo: Tapa superior 2.dft
ngulos en grados
tolerancias 0,5 y 1
Escala
Peso
Hoja 1 de 1
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
3/4-16 UNF
Descripcin
Fecha
Aprobado
O8
O 7 3/8
O6
( X 5)
O 3/8 ( X 4)
45
1 1/4-12 UNF
O 3 5/8
30
1/8
45
60
*
O 1/4 ( X 8)
1/8
3/16
CORTE A-A
3/32
* Los agujeros de 1/4 van soldados a tornillos

de 1/4 unc de 3/4 de longitud
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Tapa superior
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
Archivo: Tapa superior(nueva).dft
ngulos en grados
Escala
Peso
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
O 3/8
3/8-24 UNF
1/16
1/8
7/16
Soldadura pieza 2
soldadura Termopozo
Pieza 3
O 3/4
O 3/8
3/8
8
5/16
1/8
1/16
soldadura pieza 3
Termopozo
1/16 X 45
Pieza 2
soldadura Termopozo
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Termopozo
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
Archivo: termopozo.dft
ngulos en grados
Escala
Peso
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
3/8-24 UNF
1/32 X 45
3/4
1/2
1/8
CORTE A-A
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Tornillo (realizar 2 piezas)
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
Archivo: tornillo.dft
ngulos en grados
Escala
Peso
SOLID EDGE
Rev
Revisiones
Rev
Descripcin
Fecha
Aprobado
6 13/16
13/16
8 13/16
5 5/8
3/16
5 15/32
4 1/2
4 7/8
Nombre
Fecha
Dibujado
EDS-PLM SOLUTIONS
Reactor en vidrio
Aprobado 2
A4 Plano
cotas en pulgadas
Archivo: vidrio.dft
ngulos en grados
Escala
Peso
Hoja 1 de 1
SOLID EDGE
Rev
D. Anexo: Curvas de aireacin y

desgasificacin- Oxgeno disuelto
Oxigeno disuelto %
100
90
80
70
60
50
40
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Tiempo (s)
Figura D-1: Perfil de concentracin de Oxgeno disuelto para un flujo de 0,25 vvm
100
Oxigeno disuelto %
90
80
70
60
50
40
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Tiempo (s)
Figura D-2 Perfil de concentracin de Oxgeno disuelto para un flujo de 0,5 vvm
120

Oxigeno disuelto %
100
90
80
70
60
50
40
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Tiempo (s)
Figura D-3 Perfil de concentracin de Oxgeno disuelto para un flujo de 0,75 vvm
100
Oxigeno disuelto %
90
80
70
60
50
40
200
400
600
800
1000
1200
Tiempo (s)
Figura D-4 Perfil de concentracin de Oxgeno disuelto para un flujo de 1 vvm
Anexo D Curvas de aireacin y desgasificacin- Oxgeno disuelto
121
1,2
y = 0,00114x - 0,37982
R = 0,98704
1,0
-Ln(1-E)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Tiempo (s)
Figura D-5 Linealizacin de los perfiles de concentracin para el oxgeno disuelto para
un flujo de aireacin de 0,25 vvm
1,4
y = 0,00149x - 0,45233
R = 0,99364
1,2
Ln(1-E)
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Tiempo (s)
un flujo de aireacin de 0,5 vvm
122

1,0
y = 0,00197x - 0,89235
R = 0,98660
0,9
0,8
Ln(1-E)
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
200
400
600
800
1000
Tiempo (s)
Figura D-7 Linealizacin de los perfiles de concentracin para el oxgeno disuelto

para un flujo de aireacin de 0,75 vvm
2,5
y = 0,00272x - 0,94030
R = 0,99224
Ln(1-E)
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Tiempo (s)
un flujo de aireacin de 1 vvm
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Evaluacin del crecimiento y

produccin de astaxantina por

Daniel Mauricio Ramrez Landnez, Ing. Qco.

Universidad Nacional de Colombia

Evaluacin del crecimiento y

Daniel Mauricio Ramrez Landnez

Universidad Nacional de Colombia

A mi esposa por haber estado en los

Agradezco a la Direccin de investigacin de la sede Bogot de la Universidad Nacional

Un agradecimiento a todas las personas que directa o indirectamente me apoyaron y

En la primera fase de la investigacin se estudi el efecto de cinco medios de cultivo en

En la segunda fase se evalu el efecto del porcentaje de dixido de carbono en la

Evaluacin del crecimiento y produccin de astaxantina por Haematococcus pluvialis

velocidad especfica de crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis

Por ltimo se dise y construy un fotobioreactor tipo airlift para el crecimiento de la

hidrodinmico, velocidad especfica de crecimiento, medios de cultivo, irradiacin,

Keywords: Haematococcus pluvialis, photobioreactors, specific growth rate, astaxanthin,

Una revisin de la microalga Haematococcus pluvialis como fuente de Astaxantina natural.2

2. Efecto de las condiciones de cultivo en el crecimiento y acumulacin de astaxantina en una

Evaluacin del crecimiento y produccin de astaxantina por Haematococcus

Conclusiones y recomendaciones ...................................................................................... 75

Anexo: Composicin de los medios de cultivo empleados ................................................. 77

Anexo: Superficies de respuesta ........................................................................................ 79

Anexo: Planos de diseo fotobioreactor tipo airlift ........................................................... 81

Anexo: Curvas de aireacin y desgasificacin- Oxgeno disuelto ...................................... 119

Bibliografa ............................................................................................................................. 123

Figura 4-4 Respuesta ante impulsos cidos del electrodo de pH .................................... 67

Evaluacin del crecimiento y produccin de astaxantina por Haematococcus

Lista de Smbolos y abreviaturas

Densidad celular inicial

Densidad celular mxima

Smbolos con letras griegas

La microalga Haematococcus pluvialis es uno de los mejores productores del carotenoide

La produccin de este metabolito secundario est fuertemente relacionada con los

La separacin y purificacin de este carotenoide tambin son de gran importancia para

La astaxantina es ampliamente utilizada en la acuicultura como aditivo para la

Las industrias anteriormente mencionadas han encontrado numerosas ventajas en la

Haematococcus pluvialis para la produccin del pigmento a nivel industrial.

Kaewpintong et al. (2007) evaluaron el efecto de diferentes medios de cultivo y la adicin

en el dispersor (variando el flujo de aire) y en la velocidad de entrada de gas (para

Adems de los factores ya mencionados, es importante definir el mtodo de separacin y

El aporte que este trabajo busc hacer al rea de investigacin en el cultivo de

1. Estandarizar las condiciones de cultivo de la microalga Haematococcus pluvialis

2. Evaluar el efecto de la concentracin celular y alta intensidad lumnica en la

3. Disear y construir un fotobiorreactor tipo airlift a nivel laboratorio (1 L).

4. Evaluar el crecimiento y la acumulacin de astaxantina en la microalga

Palabras claves: Haematococcus pluvialis, fotobiorreactores, astaxantina, estrs

Captulo 1 Una revisin de la microalga Haematococcus pluvialis como fuente

Keywords: Haematococcus pluvialis, photobioreactors, astaxanthin, hydrodynamic

Evaluacin del crecimiento y produccin de astaxantina por Haematococcus

La astaxantina es un carotenoide rojo liposoluble de gran capacidad antioxidante, es

Las industrias anteriormente mencionadas han encontrado numerosas ventajas en la

La microalga Haematococcus pluvialis es uno de los mejores productores del carotenoide

Captulo 1 Una revisin de la microalga Haematococcus pluvialis como fuente

Figura 1-1: Estructura molecular de la Astaxantina (Snchez & Flores, 1999)

Principales aplicaciones de la astaxantina

Evaluacin del crecimiento y produccin de astaxantina por Haematococcus

Actualmente las ms importantes empresas que producen y comercializan la astaxantina

Wolfgang et al. (1997) en su invencin muestran un proceso de produccin de

En la naturaleza, la astaxantina es producida por el plancton y algunos tipos de algas, los

Industrialmente solo se han utilizado algunos crustceos, algas y levaduras para la

Captulo 1 Una revisin de la microalga Haematococcus pluvialis como fuente

Phaffia rhodozyma es una levadura que gracias a su capacidad de sintetizar astaxantina,