PRACTICA N2: COLORACION GRAM

1. OBJETIVO:

Comprender los pasos necesarios para realizar la tincin de Gram.

Observar la coloracin Gram de la levadura fresca y de yogurt.
Reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos.

2. MATERIALES Y REACTIVOS:

Porta objetos
Asa de col
Mechero de Bunsen
Cristal violeta
Lugol
Alcohol de 96
Safranina
Aceite de cedro
Levadura
Yogurt

3. FUNDAMENTO TEORICO:
TINSION GRAM

Definicin:
La tincin de Gram es usada para clasificar bacterias
sobre la base de sus formas, tamaos, morfologas
celulares y reaccin Gram (color). A nivel del
laboratorio es til como test para un rpido
diagnstico presuntivo de agentes infecciosos, tanto
muestras como en cultivos en crecimiento, y
adicionalmente sirve para valorar la calidad de la
muestra clnica. Las bacterias se tien Gram positivas
(+), Gram negativas () o no se tien debido a sus
diferencias en la composicin de su pared y
arquitectura celular.

en

Tipos:
Tincin Gram positiva: Las bacterias Gram positivas tienen una gruesa capa de
pptidoglucano y gran cantidad de cidos teicicos que no son afectados por la
decoloracin con alcohol y/o acetona, reteniendo el colorante inicial acomplejado con iodo
y visualizndose en distintos grados de tonos desde el violeta al azul claro, dependiendo
de si la naturaleza de su pared celular est intacta o daada (por tratamientos antibiticos,
edad celular).

Tincin Gram Negativa: Tienen en su pared celular una delgada capa de pptidoglucano
ligada a una membrana externa por molculas de lipo-polisacridos. Esta membrana
externa es daada por el alcohol y/o acetona de la decoloracin, permitiendo que el primer
colorante acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el contra colorante
.

Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas diferencias
constitutivas de su pared.
La clave es el pptidoglucano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared
celular bacteriana, y las Grampositivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las
Gram negativas.La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a
que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como
por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona.
La capa de pptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el
complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se
escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las Grampositivas,
al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin pptidoglucano, no son

susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros
cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y
manteniendo la coloracin azul-violcea.

Mecanismo :

Productos que se
utilizan

Reaccin y coloracin de las bacterias

GRAM (+)

GRAM (-)

Cristal violeta

Clulas color violeta

Clulas color violeta

Lugol
(Solucin iodada)

Se forma el complejo CV-I. Las

clulas continan teidas de

Se forma el complejo CV-I.

Las
clulas
continan
teidas de color violeta.

color violeta.

Alcohol

Safranina

Se deshidratan las paredes

celulares. Se contraen los
poros.
Disminuye
la
permeabilidad. El complejo CV-I
no sale de las clulas que
continan teidas de color
violeta.

Eliminacin por extraccin

de grasas de las paredes
celulares.
Aumenta
la
porosidad. El complejo CV-I
se separa de la clula.

Clulas no decoloradas; quedan

teidas de color violeta.

Clulas decoloradas;
tien de color rosado

4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

se

 Flamear el asa de col y el portaobjetos para esterilizarlo. Luego con el asa de col llevar una
pequea cantidad de la muestra (Levadura y Yogurt) hacia el portaobjetos esparcindolo en
el centro de este.

Luego
realizar el frotis el cual puede ser al medio ambiente o con el mechero de
Bunsen.
Agregar el cristal violeta por encima del frotis y retirar el exceso con agua destilada.

Despus de 1 minuto se procede a agregar el Lugol (fijador), esperar 1 minuto hasta que la
muestra se torne un color negruzco y agregar el alcohol.

 Luego de 30 segundos agregar la safranina y 30 segundos despus enjaguar con agua

destilada y secar el frotis.

Agregar el aceite de cedro con ayuda de una pipeta y observar al microscopio con el
objetivo de inmersin.

5. RESULTADOS:

MUESTR
DE

LEVADURA
TINCION GRAM POSITIVA

MUESTRA DE YOGURT
TINCION GRAM NEGATIVA

6. CONCLUSIONES:
Observamos la coloracin Gram de levadura fresca, la cual es una bacteria Gram positiva y el
yogurt contiene bacterias Gram negativa.
7. BIBLIOGRAFIA:

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm

http://www.a14.san.gva.es/laboratorio/Web/gram.htm

http://www.ecologia.unam.mx/laboratorios/evolucionmolecular/documentos/Clase
Procariontes/Alejandra/Pr%C3%A1ctica%203%20Tinci%C3%B3n%20de
%20Gram.pdf