BIOPROCESOS

CENTRIFUGACION
La centrifugacin es uno de los mtodos de separacin de mezclas que puede usarse cuando la
sedimentacin es muy lenta; para acelerar esta operacin la mezcla se coloca en un recipiente que se
hace girar a gran velocidad; por accin de la fuerza centrfuga los componentes ms pesados se
sedimentan ms rpidamente y los livianos quedan como sobrenadante. Luego la operacin que se
sigue es la decantacin.

Otra definicin: Es un procedimiento que se utiliza cuando se quiere acelerar la

sedimentacin.
Las centrfugas son instrumentos que permiten
someter a las muestras a intensas fuerzas que
producen la sedimentacin en poco tiempo de las
partculas que tienen una densida mayor que la del
medio que las rodea. En general se diferencian en
funcin de los mrgenes de aceleracin a que
someten a las muestras en : centrfugas (de pocas g
a aprox. 3000 g), super-centrfugas (o centrfugas
de alta velocidad, rango de 2000 g a 20000 g) y
ultracentrfugas (de 15000 g a 600000 g). En las
centrfugas se suele controlar la temperatura de la
cmara para evitar sobrecalentamiento de las
muestras debido a la friccin. En las ultracentrfugas, la velocidad extrema (ms de 100000 rpm),
hace que sea necesario hacer un intenso vacio en la cmara de la centrfuga para evitar el
calentamiento de rotor y muestra.
A travs de este procedimiento se separan materiales de diferente densidad aplicando una fuerza
superior a la de la gravedad.
En bioprocesados suele utilizarse para:
- separar clulas del caldo de fermentacin
- eliminar desechos celulares
- recoger precipitados
- preparar medios de filtracin
En general, requiere un equipamiento ms costoso que para filtracin, pero es un procedimiento
ms efectivo en aquellos casos en los cuales se tienen partculas ms pequeas.

FUNDAMENTOS
Para que se de la centrifugacin debe existir un fuerte campo impulsor, el cual fuerza a las
molculas a desplazarse a travs del medio en que se encuentren con una aceleracin mayor a la
gravedad. Esta aceleracin se denomina aceleracin centrfuga.

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Aceleracin Centrfuga.- es la aceleracin que adquieren los cuerpo por efecto de una fuerza
centrfuga. La fuerza centrfuga es una fuerza inercial (ficticia) que resulta de la inercia de los
cuerpos al moverse entorno a su eje, ya que estos tienden a seguir una trayectoria lineal o tangencial
a la curva que describen, por lo cual junto con la fuerza centrpeda (hacia el centro) aparentemente
mantienen
a
la
partcula
en
el
movimiento
circular.

La fuerza centrfuga
matemticamente de

se expresa
la siguiente manera:

por lo

cual
entonces la aceleracin centrfuga es igual a:

Por lo cual la aceleracin centrfuga puede ser tantas veces la gravedad que tambin es una
aceleracin, y de esta manera se puede facilitar y agilizar los procesos de sedimentacin por
gravedad en la que se basa la centrifugacin. En otras palabras se imprime una fuerza gravitatoria
mas alta que la de la tierra, para provocar que las partculas mas densas se depositen en el fondo de
una medio y las partculas menos densas que el medio se agrupen en la parte superior. Tambin hay
que sealar que la aceleracin centrfuga segn la ecuacin deducida depende de la velocidad
angular, es decir que el nmero de revoluciones durante la centrifugacin acelera el proceso.

PARTES DE UNA CENTRIFUGA

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En una centrfuga el elemento determinante es el rotor, dispositivo que gira y en el que se colocan
los tubos. Existen varios tipos :

Los parmetros a tener presentes en cualquier centrifugacin, que determinarn las

condiciones son:

Volumen de solucin a centrifugar, que determinar el tipo de tubos y rotores a emplear.

Naturaleza qumica de la solucin, que determinar la naturaleza del tubo a emplear

Diferencial de densidad entre la partcula a sedimentar y la densidad del medio en el

que se encuentra. En general cuanto mayor sea esa diferencia antes (menor tiempo y menor
fuerza de aceleracin) sedimentar. Cuando el diferencial es muy pequeo se pueden
aplicar centrifugaciones de cientos de miles de g durante horas.

Todo rotor tiene unas propiedades que determinan las condiciones en que se podr centrifugar la
muestra. Son especialmente importantes el ngulo de giro, el radio mnimo, medio y mximo, y la
velocidad mxima de giro. La relacin entre la velocidad de giro, medida en revoluciones por
minuto (rpm) y la fuerza de aceleracin (fuerza centrfuga relativa, RCF :relative centrifuge force) a
que se somete la muestra (g) se recoge en la expresin siguiente :
RCF = 1.118 * 10-5 * r * (rpm)2
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NOTA: Si usted desea conocer el valor en gravedades de las rpm, se aplica la frmula de fuerza de
centrifugacin relativa:

TIPOS DE CENTRIFUGACIN
En la prctica existen diferentes tipos de centrifugacin, tiles para diferentes tipos de uso, los
principales tipos son:

Centrifugacin Diferencial
La centrifugacin diferencial se basa en la existencia de diferentes partculas en la suspensin que
difieren en su densidad de la del medio. Si se centrifuga en condiciones suaves (poco tiempo, poco
fuerza de aceleracin) sedimentarn las partculas mayores y/o ms densas. Cuando el sobrenadante
de la primera centrifugacin es centrifugado de nuevo en condiciones de ms tiempo y ms fuerza
de aceleracin sedimenta de nuevo las partculas ms densas presentes y as sucesivamente. Se
pueden aplicar condiciones crecientes de severidad en la centrifugacin y obtener una coleccin de
sedimentos que corresponden sucesivamente a fracciones de partculas de diferente tamao y/o
densidad.

Este tipo de centrifugacin

se basa en la separacin de
partculas debido a su
tamao, masa y densidad.
Sin embargo no se puede
separar partculas con poca
diferencia en sus
densidades, ya que las
mismas precipitan juntas.
La fuerza centrfuga es
aplicada a cada partcula de
la muestra la cual ser
sedimentada en un ndice
que es proporcional a la
fuerza centrfuga aplicada.

SEDIMENTACION
La sedimentacin es el transporte de partculas en un campo de fuerza de centrifugacin.
Permite determinar peso molecular, densidad y forma de macromolculas y organelos celulares.

Coeficiente de sedimentacin
Los principios bsicos de la teora de sedimentacin, se originan de la ley de Stokes, la cual
fue creada para medir la sedimentacin de una esfera en un campo gravitacional, para as mostrar
que la velocidad de la esfera alcanza un valor constante y la fuerza neta en esta es igual a la fuerza
de resistencia de este movimiento a travs del lquido.

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Coeficiente de sedimentacin 1 dr S = ----- X -----W2 r dt
W : velocidad del rotor
Dr/dt : ndice de movimiento de dos partculas (cm/s)

Velocidad de sedimentacin
Alternativamente es posible aprovechar esa diferencia
en la velocidad necesaria para sedimentar las partculas
para realizar una centrifugacin en un medio en el que
exista un gradiente de densidad, siendo menor en la parte
superior y mayor en la inferior. Despus de un tiempo las
diferentes poblaciones de partculas se sitan en diferentes
profundidades del tubo. Haciendo un pequeo orificio en el fondo del mismo se pueden recoger
diferentes fracciones que contengan a las distintas poblaciones separadas.
Este es el fundamente de la ultracentrifugacin preparativa, que permite determinar la velocidad de
sedimentacin de una partcula (medida en unidades Svedverg, S).
Los coeficientes de sedimentacin son usualmente expresados en Sveldbergs (S) o 10 -13s. De esta
manera, una partcula cuyo coeficiente de sedimentacin es medido en 10 -12s.= 10x10-13s., es decir
que tiene un valor de 10S.
Una partcula en un campo gravitacional se comporta segn la LEY DE STOKES
d2 ( hP - hL )
V = ____________ x g
18 n
Donde: V = velocidad de sedimentacin
d = dimetro de la partcula
hP = densidad de la partcula
hL = densidad del lquido
n = viscosidad del medio
g = fuerza gravitacional
Se cumple:
- La velocidad de sedimentacin es proporcional al tamao de la partcula
- La velocidad de sedimentacin es proporcional a la diferencia entre la densidad del medio
circundante y la densidad de la partcula
- La velocidad de sedimentacin es 0, cuando la densidad de la partcula e igual a la densidad del
medio circundante
- La velocidad de sedimentacin disminuye al aumentar la viscosidad del medio
- La velocidad de sedimentacin aumenta al aumentar la fuerza del campo centrfugo

El coeficiente de sedimentacin es una constante caractristica de cada organelo o

macromolcula y sus unidades se dan en Svedvergs, tomando el nombre de su descubridor.
El tiempo de centrifugacin hasta la clarificacin de una organela se define por:
K
T (horas) = --S
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Donde: S= coeficiente de sedimentacin de la organela
K= constante del rotor. ( depende del ngulo de inclinacin del tubo de centrifugacin con
respecto al eje de rotacin)

nomograma.

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CENTRIFUGACION EN GRADIENTE DE DENSIDAD
Es un sistema que se suele realizar empleando la ultracentrfuga. Consiste en la separacin de las
partculas en funcin de su densidad de flotacin. La muestra se dispone por encima o se mezcla
con un gradiente de densidad ms pronunciado que el del caso anterior, y que contiene una
concentracin muy elevada de sacarosa o de cloruro de cesio. Al centrifugar cada componente
subcelular se desplazar hacia arriba o hacia abajo hasta que alcance una posicinen la que su
densidad sea igual a la de su entorno (situacin de flotabilidad neutra) y ya no se desplazar ms.
Como consecuencia se producirn una serie de bandas discretas, las ms prximas al fondo del
tubo contendrn las partculas con mayor densidad de flotacin. Este mtodo tambin se conoce
como equilibrio en gradiente de densidad.
Se emplean diferentes sustancias para conseguir los gradientes de densidad, como son sacarosa,
percol, cloruro de cesio, etc. Los gradientes pueden ser autogenerados como es el caso de los
basados en cloruro de cesio en que se forman en el propio proceso de centrifugacin, o preformados
como es el caso de la sacarosa o del percol. En este ltimo caso la preparacin se realiza antes de la
centrifugacin mediante un formador de gradientes, dispositivo que consiste en dos cubetas
conectadas por la base y con agitacin
en las que se colocan las soluciones con los dos
extremos de concentracin. A medida que se va sacando de una de ellas la otra reemplaza el lquido
extraido
y
modifica
linealmente
la
concentracin.
Una alternativa es la centrifugacin en gradiente discontinuo, en la que se crea un gradiente por
etapas en el interior de un tubo al apilar sucesivamente volmenes homogneos de soluciones de
diferente densidad. En las interfases de las diferentes capas se acumularn las partculas que flotan
(son menos densas) en la capa inferior pero que se hunden (son ms densas) en la capa superior.
En la centrifugacin por gradiente de densidad, la separacin de una muestra se logra por
sedimentacin a travs de un gradiente de densidad, esto es, una solucin que incrementa en
densidad desde la parte superior hacia la inferior del tubo de centrifuga. Dos aproximaciones
distintas son posibles usando esta tcnica; centrifugacin zonal y centrifugacin de equilibrio en
gradiente.
La centrifugacin de equilibrio en gradiente separa las partculas con base en sus densidades
diferentes, la muestra puede ser cargada directamente sobre un gradiente de densidad preformado y
la centrifugacin llevada a cabo. Mientras en la centrifugacin zonal la densidad del gradiente no
debe exceder a la de las partculas a separar, en la centrifugacin de equilibrio en gradiente la
condicin fundamental es que la densidad mxima del gradiente final debe siempre exceder a la
densidad
de
las
partculas
(1,
2).
La centrifugacin de equilibrio en gradiente permite que las especies sedimentantes se muevan
por el gradiente hasta que alcanzan un punto donde su densidad y la del gradiente son idnticas, por
lo cual tambin se le llama centrifugacin isopcnica. En este punto no se producir una
sedimentacin posterior debido a que flotan sobre un "colchn" de material que posee una densidad
superior
que
la
suya
propia.
Esta tcnica se emplea para separar partculas similares en tamao pero distintas en densidad.
Puesto que la mayora de las protenas poseen casi la misma densidad, este mtodo no se suele
utilizar para su separacin. Sin embargo, en situaciones donde intervienen diferentes densidades, la
centrifugacin isopcnica es el mtodo adecuado. Esto es cierto para molculas, tales como cidos
nucleicos, as como diferentes organelos celulares (3).

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Diseo especifico de un
gradiente de densidad
Un buen resultado en el aislamiento de unas molculas en particular mediante la centrifugacin
en gradiente de densidad requiere una consideracin cuidadosa de los parmetros del gradiente de
densidad. Estos parmetros incluyen

El material que se emplea para establecer el gradiente. Es un solvente distribudo

con diferentes concentraciones en una columna en donde la parte apical es la
positiva por contener el solvente con mayor densidad.

El fludo del gradiente de densidad consiste de un adecuado soluto de bajo peso

molecular en un solvente en el cual las partculas de las muestras pueden ser
suspendidas.

La fuerza inica

La viscosidad

Las caractersticas osmticas

La pendiente del gradiente

El pH

La presencia de agentes estabilizantes tales como mercaptanos; EDTA, substratos

enzimticos y Magnesio.

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La solucin de una muestra contiene partculas para ser separadas en capas o zonas en una
columna de gradiente de densidad elaborado. Las molculas y organelos son separados de acuerdo a
su masa y forma. Dentro de los materiales que se utilizan estn la sacarosa, la cual permite formar
disoluciones con una densidad de hasta 1.28 g/cm3, el glicerol que puede emplearse a densidades
inferiores a 1.15 g/cm3, el ficoll, la metrizamida con capacidad para generar densidades de hasta
1.45 g/cm3, el cloruro de cesio con un rango de densidades hasta de 1.7 g/cm3, el sufato de cesio, y
el percoll entre otros.
Es importante tener presente que el material que se use sea inerte o al menos no txico para el
material biolgico, las propiedades fisicoqumicas deben conocerse antes de usarse para determinar
la concentraciones precisas del gradiente adems debe facilitar la separacin de la muestra del
material sin prdida de la muestra o su actividad. (1, 3)

Elaboracin
Preparar la solucin stock del gradiente.
Realizar las diferentes diluciones para establecer una escala de densidad y concentracin
consecutiva del gradiente.
Determinacin de la concentracin y volmen de la muestra.
Disposicin del gradiente a partir del que tiene mayor a menor densidad de forma sincrnica.
Disposicin de la muestra.
Consideraciones para elaborar un gradiente de densidad:
Poseer un amplio rango de densidad.
No afectar la actividad biolgica de la muestra.
No hipo o hiperosmtica.
Fcil remocin a partir del producto purificado.

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No sea sensible al rango de luz UV y visible.

Econmico y accesible.
Esterilizable.
No corrosivo, txico e inflamable.

El gradiente ms usado es el de sacarosa ya que es un medio resistente porque es poco viscoso

y polar.
Bsicamente, el ndice de migracin en un medio resistente depende del movimiento de la
partcula en el medio y la fuerza debido a la fuerza centrpeta o de gravedad.

Tipos de gradientes

Gradientes lineales
Son aquellos en los que la densidad aumenta linealmente con el incremento en la distancia
desde el centro de rotacin, pueden ser continuos o discontinuos, estos ltimos se usan para
incrementar la capacidad de un gradiente bien definido o para efectuar una separacin mayor de dos
especies.
Aunque estos tipos pueden emplearse aportando grandes ventajas, deben usarse con cuidado y
discriminacin. Los gradientes discontinuos se forman colocando con cuidado en capas las
disoluciones de densidades distintas en los tubos de centrifuga.
El mtodo ms ampliamente usado para producir gradientes discontinuos es comenzar con la
solucin ms densa y colocarlos en capas de menor densidad sucesivamente, existe la posibilidad de
carga por arriba usando una pipeta, una jeringa o una pipeta Pasteur, teniendo siempre precaucin
en la forma como se coloca y evitando la formacin de aire que cause turbulencia sobre los
gradientes formados. (figura 1)

Figura 1. Formacin de un gradiente discontinuo desde arriba (A) Con pipeta; (B) Con jeringa; (C)
Con pipeta Pasteur. Aunque el mtodo de carga por arriba es probablemente el ms usado, existe
tambin la posibilidad de carga por abajo colocndose soluciones ms densas por debajo de las
menos densas (figura 2).
Figura 2. Formacin de un gradiente discontinuo desde abajo(A-B)Punta de cnula de metal en
jeringa hacia el fondo del tubo; (C) Solucin ms densa colocada lentamente por debajo de las
capas ms livianas; (D) La cnula es retirada contra la pared del tubo.

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Los gradientes continuos pueden ser hechos a partir de
gradientes discontinuos, de tal manera que los limites de forma
entre las capas comienzan a desaparecer en la medida que los
solutos difunden, as las discontinuidades comienzan a
linearizarse y en un tiempo suficiente la densidad se volver
completamente uniforme. (figura 3). Figura 3.Formacin de
un gradiente continuo a partir de un discontinuo por difusin.
(lnea punteada) gradiente escalonado en un tiempo cero; la
difusin progresivamente suaviza el escalonado (azul, verde),
para producir un gradiente lineal (rojo).
Una forma de hacerlo es rotando cuidadosamente el tubo de
una posicin vertical a una horizontal, bajo estas condiciones un gradiente discontinuo se convertir
en continuo en menos de 1 hora (figura 4). Figura 4. Formacin de un gradiente continuo a partir de
un discontinuo por difusin posterior a reorientacin

Gradientes no lineales
No siempre es deseable usar un
gradiente lineal, en algunos casos
para la
resolucin particular de algunas
especies sedimentantes puede ser
deseable un perfil convexo, cncavo,
complejo o en forma de S (figura 5);
los
gradientes convexos son
particularmente tiles para la
resolucin de una muestra que
contenga alta concentracin de
partculas de un amplio rango de densidades o viceversa puede utilizarse uno cncavo. Para generar
este tipo de gradientes es posible utilizar cmaras continuas (figura 6) o mezcladores de gradientes
los cuales permiten la formacin de hasta seis gradientes de una sla vez. (figura 7)
Figura 5. Perfiles de gradientes de densidad no lineales. Gradiente convexo (rojo), gradiente en
forma de S (prpura), gradiente complejo (azul) y gradiente cncavo (verde).

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Figura 6. Cmara doble fabricante de gradientes continuos. El liquido
denso en cmara A se mezcla continuamente con el liquido menos denso
en cmara B. Flujo producido por bomba peristaltica (P) la cual coloca el
liquido cada vez ms denso en el fondo del tubo de centrifuga. La llave
(T) controla el flujo del liquido de A a B . La mezcla en la cmara B se
da con un plancha agitadora (M) y un magneto (SB). Mezclador de

gradientes

Recoleccin de
gradientes

los

Una vez se han

separado una serie de
especies moleculares u
organelos en un gradiente
de
densidad, es importante recuperar los componentes separados. El modo de recoleccin depende del
tipo de tubo usado para el gradiente, la distribucin de las partculas en el gradiente y el objetivo del
fraccionamiento.
Se pueden utilizar jeringas, pipetas Pasteur o bombas peristalticas y se puede hacer por puncin si
el tubo esta construido con policarbonato (figura 8), es posible recolectarlo con desplazamiento
ascendente (figura 9) o con desplazamiento descendente. Figura 8. Descarga del gradiente por
puncin del tubo. El tubo es sujetado entre el disco de sello (SD) sobre el tubo soporte (TS) y el
sujetador superior (TC). Una aguja (HN) avanza hacia el fondo del tubo.
Figura 9. Recoleccin del gradiente por desplazamiento ascendente desde una bureta (B) hacia el
fondo del tubo a travs de una bomba peristaltica (P).
Estos mtodos permiten que los contenidos en los tubos de centrifuga salgan secuencialmente
a una serie de tubos de ensayo. Con los contenidos de tubo de centrifuga distribuidos en una serie
de tubos de ensayo individuales, es posible averiguar la distribucin de los componentes que se
deseen. En el caso de organelos celulares esto se puede hacer mediante la localizacin de las
actividades enzimticas del "marcador" especfico; tambin se puede verificar la morfologa
mediante microscopa electrnica. Los organelos y molculas que carezcan de actividades
enzimticas fcilmente ensayables se localizan bien por su absorcin de luz o marcaje radiactivo (1,
3, 4).
El equipo usado es una ultracentrfuga, la cual posee un motor que sostiene un eje capaz de
soportar latas fuerzas de gravedad (g). Este eje a la vez contiene un rotor para la colocacin de las
columnas o tubos que contienen la muestra; este rotor genera en los tubos de 20000 a 100000 rpm
que pueden ser de 10000 a 100000 fuerzas de gravedad.

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