Para qu romper clulas?

Para obtener productos que se encuentran en

el interior de las clulas.
La tcnica de RC seleccionada
determina el tamao de los
desechos y la influencia que
tendrn en las operaciones que
se utilicen para su separacin.

Ejemplos de productos
intracelulares

cidos nucleicos

Enzimas

Tanasa

Invertasa
Proteasas

DNA polimerasa

Pigmentos

B-coeritrina (BPE), colorante rosa

Polmeros intracelulares

AnBbiBcos

Rompimiento celular

Separacin,
tratamiento de
cuerpos de inclusin
Purificacin alta
resolucin
refinamiento
Refinamiento

sobrenadante

Separacin de clulas

Concentracin

Sin clulas

Con
clulas

Clulas inmovilizadas o
Clulas retenidas

protenas
intracelulares

Caldo de
fermentacin

La recuperacin ptima de productos intracelulares

requiere del conocimiento de la estructura de las
capas externas que protegen a las clulas.

Paredes microbianas:

MECANISMOS DE RUPTURA
CELULAR
La seleccin de una tcnica depende de las
caractersBcas del producto:
u

Resistencia a:

Medios alcalinos

Solventes

Detergentes

Enzimas

Temperatura

Esfuerzo de corte

La tcnica uBlizada
determinar el tamao
de los desechos que se
producirn

Los mtodos de ruptura celular en la

industria pueden ser divididos en:
Mtodos qumicos
Mtodos Qsicos
Mtodos biolgicos

ROMPIMIENTO
CELULAR
RUPTURA DE CLULAS
DE MICROORGANISMOS
Mtodos Fsicos
Ultrasonido
Mtodo
Lquido

Prensas Gaulin/
Manton
Prensa de French
Molinos
Molino Dyno
Molino coloidal

Mtodo
Slido

Congelacin,
descongelacin

Molino de bolas
Prensas
Prensa X
Prensa Hughes

Mtodos Qumicos

Mtodos Biolgicos

Liolizacin

Enzimas que
digieren la pared
celular

Tratamiento
con cidos
Detergentes
Extraccin con
acetona/tolueno
Cambio en la
presin osmRca

Fagos
Agentes que
inhiben la pared
celular

Mtodos qumicos:
Choque osmBco
Permeabilizacin
Disolucin lipdica (tolueno 10% de la biomasa)
DigesBn enzimBca (enzimas que atacan la
pared celular)
Tratamiento alcalino
Detergentes
Liolizacin

Los mtodos no-mecnicos son fciles de

escalar, si uno necesita tratar 10 veces ms
materia orgnica basta con adicionar 10
veces ms reacBvo qumico o enzimBco

Rompimiento celular por mtodos qumicos.

TCNICAS

PRINCIPIO

ESTRS EN EL
PRODUCTO

COSTO

Solubilizacin

Detergentes solubilizan la
membrana

Suave

Moderado/
Caro

Choque osmtico

Ruptura osmtica de la
membrana

Suave

Barato

Ruptura
de glbulos rojos

Disolucin lipdica

Solventes orgnicos actan

sobre
la pared celular
desestabilizndola

Barato

Rompimiento de
levaduras con
tolueno

Digestin
enzimtica

Rompimiento por la digestin

de
la pared celular

Suave

Caro

Micrococcus
lysodeikticus
tratado con
lisozima

Fuerte

Barato

Tratamiento
alcalino
Permeabilizacin
enzimatica

La saponificacin de los
lpidos solubiliza la
membrana
Permeabilizan la membrana
ocasionando
la ruptura de la clula

Moderado

Suave

Caro

EJEMPLO

Tratamiento de M.
lysodeikticus
con lisozima

Mtodos mecnicos:
Mtodos a pequea escala:
Ultrasonicacin
Molido con abrasivos
Homogeneizadores
Mtodos a gran escala:
Homogeneizadores a alta presin
Molinos de perlas

Rompimiento celular por mtodos mecnicos

TCNICAS

PRINCIPIO

ESTRS
SOBRE EL
PRODUCTO

Homogeneizador
de cuchillos

Las clulas son

rotas en un mezclador

Moderado

Las clulas son forzadas

Homogeneizador a pasar a travs de un
pequeo orificio,
alta
produciendo su ruptura
presin
por el esfuerzo de
corte

Molienda

Las clulas son rotas

por medio de una
molienda con abrasivos

Molino de perlas

Las clulas son

trituradas con perlas de
acero o vidrio

Ultrasonificacin

Las clulas son

quebradas en una
cavidad ultrasnica

COSTO

EJEMPLO

Moderado

Rompimiento de tejidos y
clulas animales.

Fuerte

Moderado

Tratamiento a gran
escala
de suspensin
de clulas.

Moderado

Barato

Fuerte

Fuerte

Barato

Rompimiento a gran escala

para suspensiones de clulas y
clulas de plantas

Caro

Rompimiento de suspensiones
de clulas a lo menos en
pequea escala

Mtodos biolgicos:
Enzimas
Fagos
Agentes inhibidores de pared celular
Estos mtodos no son muy empleados
debido a que son muy costosos.

Animales
Micelio
Bacterias Gram +
Bacterias Gram
Levaduras
Esporas

Dicultad para rompimiento de diferentes Bpos de clulas.

7 = Fcil de romper 1 = Difcil de romper

Que hay que tomar en cuenta para la

seleccin de un mtodo de ruptura celular

Naturaleza del producto intracelular

Escala de la operacin
Velocidad
Estabilidad del producto
Pureza del producto
Costo del mtodo

CHOQUE OSMTICO
Las clulas se colocan en un volumen de agua
frecuentemente 2 veces mayor que el volumen de
clulas.
Las clulas se expanden, por un simple ujo osmBco
que se produce debido a que las clulas conBenen
solutos, ocasionando que el agua entre al interior.
Debido a esta expansin puede conducir a su lisis o
rompimiento.

El uso de este
mtodo depende de
la resistencia de las
clulas.

Ley de van`t Hoff

Toluenizacin:
Ruptura a altas concentraciones, , se trabaja a
bajas temperaturas, clulas inacBvas
metablicamente.
Permeabilizacin a bajas concentraciones,
clulas metablicamente acBvas comienzan a
destruirse.

DigesRn enzimRca
Consiste en el empleo de enzimas que atacan a la
pared celular hidrolizndola.
Permeabilizando la membrana para liberar
compuestos intracelulares al medio o rompiendo
completamente la clula.

DigesRn enzimRca
A pH< 5 las clulas no se rompen an cuando la
pared haya sido destruida por digesBn.
Los costos son muy altos
No hay recuperacin de las enzimas empleadas
Mayor suscepBbilidad a Gram +
Ejemplos
Gram(+): lisozima
Gram(-): lisozima + AEDT
Levaduras: 1,3-glucanasa,
1,6-glucanasa manasa, quiBnasa

Permeabilizacin con detergentes

Los detergentes Benen una zona hidroQlica y otra
hidrofbica, por esta razn pueden interactuar tanto
con el agua como con los lpidos. Su habilidad se basa
en la solubilizacin de los lpidos de la pared celular
Los detergentes ms uBlizados son de tres Bpos:
Detergente aninico
Detergente caBnico
Detergente no-inico

Ejemplos Detergentes aninicos :

Dodecil Sulfato de Sodio (SDS)

Sulfonato de Sodio
Tauroclorato de Sodio
Colato de sodio

Ejemplos Detergentes caBnicos:

Bromuro de CaBltrimeBl Amonio (CTAB)
Ejemplos Detergente no-inicos
Triton X-100
Tween
Spam

Permeabilizacin con detergentes

A bajas concentraciones no se produce
degradacin de lpidos.
A alta concentracin se produce una degradacin
que resulta lineal a la concentracin de detergente,
junto a esta variable tambin se altera la tensin
supercial de la solucin.

Permeabilizacin con detergentes

Procedimiento:

1. Se coloca un determinado volumen de

detergente concentrado por un volumen de
clulas. Generalmente la mitad de volumen de
detergente
que de volumen de clulas.
2. El detergente rompe la membrana celular.
3. La suspensin resultante se centrifuga para
remover los fragmentos de clulas y se pasa por
etapas de extraccin para aislar el producto.

Permeabilizacin con detergentes

Tratamiento de las clulas con soluciones alcalinas
(KOH, NaOH, pH 11.5-12.5; 20-30 min)
Ventajas:
Simple y barato
Aplicacin a gran escala
Desventajas:
Tratamiento fuerte, los lpidos son converBdos en
detergentes
No selecBvo
Aplica nicamente si las enzimas a aislar son
estables a pH alcalino

Ultrasonicacin
Frecuencias >20 KHz produciendo vibraciones
que provocan el fenmeno de cavitacin.
Se producen zonas de baja presin en el
lquido
El lquido se transforma en gas formndose
pequeas burbujas
Las burbujas colapsan debido a los cambios
de presin.
Se producen fuertes esfuerzos de corte en el
lquido que rompen las clulas.

Ultrasonicacin
Desventajas:
Produccin de radicales libres
Destruccin del producto por las ondas
Destruccin del producto por la
temperatura
Elevados requerimientos de energa
Altos costos

Homogeneizacin
Homogeneizadores: el material biolgico
se somete a una fuerte presin
hidrostBca (500 atm) y la presin se
libera bruscamente que el lquido salga
por una vlvula.

 La idea es generar altos esfuerzos de corte

que produzcan la rupturas. Estos se pueden
obtener por:
1. mbolos
2. Cuchillas
3. Pistones

Congelacin-descongelacin
Formar y deshacer los cristales de hielo
Ventajas:
Muy simple de realizar
Se realiza a bajas temperaturas
Desventajas:
Tiempos largos
Algunos microorganismos son resistentes
Sensibilidad de las enzimas a congelacin/
descongelacin

Molino de perlas
Operacin intermitente: El rompimiento celular
con perlas agitadas a altas velocidades sigue una
cinBca de primer orden.
El balance de masa liberada puede ser expresado
mediante la ecuacin:

Ejemplo 1:
Obtencin y puricacin de la enzima monxido de
carbono deshidrogenasa, a parBr de extractos celulares
de la bacteria Oligotropha carboxidovorans, cepa OM5.
Las bacterias con lisozima se colocaron en un bao mara
durante 12 horas a 40C. Posteriormente, se complet el
rompimiento celular por sonicacin en un equipo
Branson Sonifer (VWR Company), con la siguientes
indicaciones:
Output control: 7, Duty cycle: 60, Time: 10 minutos

Posteriormente se solubiliz con el detergente Tritn

X-100 debido a que la enzima que se desea obtener
estaba ligada a la membrana.
La metodologa uBlizada consisB en agregar a cada
600mL de extracto celular despus de la sonicacion,
200mL de Tritn X-100; se dej homogenizar la solucin.
Se dej actuar por una hora y se centrifug a 10000 rpm
durante 45 min en una centrifuga refrigerada.
Se tom el sobrenadante y el detergente remanente fue
reBrado mediante dilisis.

Ejemplo 2: Ruptura celular de Saccharomyces

cerevisiae por medio de mtodos qumicos.
Se basan en el uso de solventes orgnicos y
detergentes para acelerar los procesos de autlisis
de S. cerevisiae. El sistema se basa en la autlisis
celular por medio de una plasmlisis originada por
tratamiento de las clulas con solventes orgnicos.

Para seguir la liberacin del contenido

intracelular miden la canBdad de la proteasa
vacuolar carboxipepBdasa. Y liberada por la
clula, requiriendo el proceso un no control
del pH alrededor de 8. Entre los solventes
orgnicos destacan los alcoholes de cadena
entre 6 y 9 carbonos de longitud.

Los detergentes con mejores resultados son el

Tritn X-100 y N-laurilsarcosina.
Ventajas a nivel industrial:
No requiere aparatos especiales
Restos celulares fciles de separar por centrifuga
Costo de los productos inductores bajo.
Desventajas:
Dicultad para eliminar compuestos qumicos
Riesgo de desnaturalizacin
Largos Bempos para lograr la autlisis 20-30h.
Aumentan el riesgo de las protenas de inters por
la proteasas presentes.

Ejemplo 3: Ruptura celular de S. cerevisiae por

medio de enzimas lBcos combinado con el uso
de estabilizadores osmBcos.
Con estos tratamientos se ha logrado la liberacin
selecBva de enzimas y protenas localizados en
diferentes comparBmientos celulares. El complejo
empleado procede de Oerskowia xanthinoly;ca. Se
trata de una mezcla de enzimas lBcos con
acBvidades en beta-1,3-gluconasa, proteasa,
beta-1,6-glucanasa, mananasa y quiBnasa.

Todas actan en forma sinrgica en la

degradacin de la pared celular, la acBvidad
mananasa que degrada la capa externa de
manano de la pared y la beta-1,3-glucanasa para
la degradacin de la capa interna de glucano.
La produccion de estas enzimas obtenida en un
fermentados de 2000 litros es suciente para
lisar un fermentador de 100,000 litros de S.
cerevisiae.