RECUPERACION DE PRODUCTOS

I. INTRODUCCION:
La comercializacin de nuevos productos conseguidos a travs del empleo
de la biotecnologa, demanda de un coordinado encaje de operaciones
unitarias a fin de ampliar un proceso eficiente
El

objetivo

general

de

este

proceso

es

cambiar

materia

prima

relativamente de bajo costo en productos de mayor importe comercial.

En este sentido la biotecnologa se puede concretar como la coleccin de
procesos industriales que comprenden el uso de sistemas biolgicos.
El punto central de este proceso es el biorreactor. En esta unidad de
operacin se manipulan catalizadores biolgicos (microorganismos, clulas
vegetales animales, enzimas, virus, etc.) para la obtencin de
sustancias, alimentos, agentes teraputicos, etc. de inters.
No obstante, el biorreactor no est aislado, sino que la eficiencia y xito de
la operacin depende de un adecuado upstream processing (procesado
previo) que envuelve desde el diseo del medio de cultivo hasta la
esterilizacin del mismo. Por otro lado, la liberacin del producto final
requiere

una

serie

de

operaciones

referidas

colectivamente

como

downstream processing (SP).

Estas operaciones perciben todos los tratamientos que requiere el cultivo,
una vez consumado, para la obtencin del producto en las condiciones de
pureza y actividad esperadas

RECUPERACIN:

(CONCENTRACION Y PURIFICACION)

La recuperacin del producto, es un trmino agrupado, til para

todas las etapas que se demandan a fin de recuperar o distanciar los
productos tiles de cualquier tipo de proceso industrial.

Se debe diferenciar los conceptos de concentracin y purificacin.

Una etapa de recuperacin cambia la concentracin y/o la pureza de

un metabolito.

En el proceso ideal de recuperacin se perfeccionan ambos

parmetros.

TCNICAS UTILIZADAS EN LA RECUPERACIN DE PRODUCTOS

En tiempos INICIALES de la Microbiologa Industrial las tcnicas

manejadas (extraccin, destilacin, dilisis, cristalizacin, precipitacin,
desecacin) se tomaron concisamente de la Ingeniera Qumica con un
intento prximo para adaptarlas a los materiales biolgicos.

Para

materiales

biolgicos,

haba

que

perfeccionar

procesos

especficos de purificacin ya que los bioproductos son continuamente

compuestos muy lbiles. Sus estructuras activas pueden sobrevivir
solamente

bajo

condiciones

temperatura, fuerza inica, etc.

concretadas

limitadas

de

pH,

No existe una maniobra nica, ideal o universal, ni secuencias de

operaciones

que

puedan

ser

encomendadas;

las

operaciones

individuales unitarias deben ser combinadas de la forma ms ordenada

para cada problema particular.
ETAPAS DE RECUPERACION
A.

Separacin de las partculas

(SEPARACIN DE SLIDOS DEL

LQUIDO)

En muchos casos, es la etapa inicial al final de una fermentacin. Es la

primera etapa en la recuperacin del producto. Se asla la biomasa
celular y los ingredientes insolubles del sobrenadante del cultivo

El producto final anhelado puede ser el propio microorganismo, sin

embargo, en la mayor parte de los procesos a gran escala el producto
deseado es un metabolito que est vigente extra o intracelularmente.
Metabolitos extracelulares: aminocidos, cido ctrico, alcohol,
algunos enzimas (amilasas y proteasas) y la mayor parte de
antibiticos (penicilina, estreptomicina).
Metabolitos intracelulares: cidos nucleicos, vitaminas, enzimas
y ciertos antibiticos (griseofulvina).
Si el metabolito a aislar es intracelular, debe ser librado de las
clulas antes de derivar a las siguientes etapas. Una vez el
metabolito ha sido retirado de las clulas, la seleccin de etapas
adicionales de purificacin depender del producto deseado.
Metabolitos en las clulas y en el filtrado del cultivo:
pocos casos se encuentran (Ej. vitamina B12).

En

Existen

varios

mtodos:

floculacin,

flotacin,

filtracin

centrifugacin.
1.

Floculacin y flotacin

En la floculacin se originan grandes agregados que sedimentan mucho

ms rpidamente ya que la velocidad de precipitacin de una partcula
aumenta con su dimetro (ley de Stokes).

Aplicacin: para clulas aisladas en el rango de tamao de 1 a 10 m

que sedimentan solo muy perezosamente y son difciles de precipitar
incluso con la centrfuga.

En la mayor parte de los casos se agrega un agente floculante, sal

inorgnica, polielectrolitos orgnicos o hidrocoloides minerales.

La floculacin acata tanto del agente floculante empleado como de

otros factores como la naturaleza de las clulas, de los constituyentes
inicos as como su concentracin.

La floculacin puede ocurrir reversiblemente si las cargas sobre la

superficie de la clula pueden neutralizarse por iones de carga
sublevada, e irreversiblemente si se forman, entre las clulas, puentes
de molculas polimricas imputadas.

Se utilizar la flotacin si no se forma un flculo suficientemente espeso,

y es el transcurso reverso a la floculacin.

La flotacin se consigue implantando gas en el lquido. Las pequeas

burbujas de gas adsorben y aferran a las clulas y suben a la capa de
espuma en la parte superior del recipiente donde pueden ser
almacenadas y sacadas del biorreactor.

2.

Filtracin

Algn tipo de proceso de filtracin es lo mas abundante se lleve a cabo

en la primera etapa en el proceso de recuperacin.

Los dos principales tipos de filtros son los filtros en profundidad y filtros
en superficie; en ambos casos la fuerza motriz es la presin, sea
establecida por sobrepresin o por vaco.

Un filtro en profundidad se monta a partir de una matriz filamentosa,

como lana de vidrio o papel de filtro, llevndose a cabo el proceso de
filtracin debido a que las partculas que han de ser depuestas quedan
atrapadas dentro de la matriz. Las partculas que van a ser filtradas son
frecuentemente ms pequeas que los poros del filtro, pero a pesar de
ello son separadas a medida que pasan a travs de los intersticios
retorcidos del filtro.

Los filtros en superficie son membranas en las que el volumen de los

poros es ms pequeo que las partculas que van a ser filtradas.

Las partculas son, por consiguiente, retiradas sobre las superficies de

los filtros.

Los hongos filamentosos se filtran frecuentemente a travs de filtros

profundos. Por su parte, los cultivos bacterianos deben ser filtrados en
superficie. En cualquier caso, la velocidad de filtracin, es decir el
volumen de filtrado que puede ser recogido en un tiempo definitivo,
est influenciada por numerosos factores, como el tamao de los
microorganismos, su morfologa, la viscosidad del fluido, temperatura,
etc.

Uno de los inconvenientes de la filtracin en superficie es la

colmatacin. Debido a que este proceso de filtracin depende
rigurosamente del tamao de los poros y del tamao de las partculas,
a medida que el material celular se amontona sobre el filtro se forma
una capa que reduce la velocidad de filtracin.

Una mejora formidable en el flujo que pasa por el filtro se consigue por
filtracin en contracorriente, en la cual los slidos que no pasen a
travs del filtro son mantenidos en suspensin mediante un flujo
turbulento a travs de la membrana o acordando palas mviles o
mediante un impulsor en el interior del filtro. El filtrado pasa a travs
de la membrana y la biomasa se separa del filtro y se transfiere con el
material que se retiene. Con el mtodo de contracorriente puede
obtenerse un aumento de la velocidad de filtracin de 100 veces en
comparacin con la filtracin esttica.

Dependiendo del volumen de las partculas que sean filtradas se

reconocen tres tipos principales de procesos de filtracin:
Osmosis reversa, para partculas de 0,0001 a 0,001 m

Ultrafiltracin,

para partculas de

0,001 a

Microfiltracin,

para partculas de

0,1 a

0,1 m
10

Las posibilidades de los procesos de ultrafiltracin y smosis reversa se

dan habitualmente en trminos del peso molecular del tamao de
corte. La smosis reversa implica generalmente a sustancias de pesos
moleculares menores de 1.000 daltons y la ultrafiltracin a sustancias
de pesos moleculares mayores de 1.000 daltons. El proceso de
microfiltracin concierne principalmente a la disociacin de clulas o de
fracciones celulares. Se utilizan membranas fabricadas con steres de
celulosa, polivinilfluoruros, policarbonatos, polisulfonas y celulosa.

En los procesos clsicos de purificacin utilizados en la industria de

antibiticos (micelios de hongos y actinomicetos), la biomasa se aleja
del filtrado del cultivo sobre un filtro de tambor rotatorio a vaco que
consiste en un tambor rotatorio en cuya parte exterior se enrolla un
pao y el vaco se origina desde el interior del tambor. Para aumentar
la eficiencia del proceso de filtracin, se utiliza una ayuda filtrante
como tierra de diatomeas. Para mantener la eficiencia de filtracin, se
utiliza una cuchilla automtica para raspar continuamente del filtro la
biomasa junto con una fina capa del material de ayuda de filtracin.

Organizando el tambor en segmentos, la ayuda filtrante puede ser

lavada a medida que gira el tambor. Los filtros de tambor a vaco son
especialmente buenos para suspensiones que contengan una alta
concentracin de slidos (20-60% de volumen de micelio).
3.

Las

Centrifugacin
bacterias

son

normalmente

demasiado

pequeas

para

ser

separadas con filtros sencillos. Su separacin por centrifugacin

tambin es difcil debido a las pequeas diversificas en densidad entre
las partculas y la suspensin.

La centrifugacin no slo se utiliza para retirar partculas slidas de la

fase lquida sino tambin para la separacin de fluido/fluido.

Si bien la ausencia fluido/partcula es de la mayor importancia, la

separacin fluido/fluido tambin es importante como es el caso en la
produccin de penicilina para la separacin del solvente que extrae el
antibitico de la fase acuosa mediante una contracorriente continua en
dos etapas con acetato de amilo o de butilo a 0-3C y pH: 2,5-3,0.

La disociacin eficiente de las clulas por centrifugacin se ve

favorecida por un volumen grande de las partculas, una gran diferencia
entre la densidad de las partculas y el lquido, una baja viscosidad del
lquido, un radio supremo del rotor de la centrfuga y una alta velocidad
angular. Tanto el tamao de las partculas, su densidad as como la
viscosidad del lquido normalmente no se pueden registrar. Adems, el
radio del rotor de la centrfuga no puede extender indefinidamente ya
que el estrs mecnico incrementa con el cuadrado del radio por lo que
los lmites de seguridad se alcanzan fcilmente. Por todo esto y cuando
se atarea con grandes volmenes se debe recurrir a centrfugas de flujo
continuo. En este tipo de centrfugas la disgregacin de partculas es
ms eficiente cuanto ms flemtico sea el flujo de la suspensin a
clarificar ya que se incrementa el tiempo que cada partcula est
expuesta a la fuerza centrfuga.

Algunos tipos de rotores: cmara tubular, recipiente de cmara mltiple

y centrfuga de rotor de discos. Todos los diseos tienen desventajas
individuales a las que deben ser aadidas las generales del coste
(incluyendo el mantenimiento), gasto de energa y (exceptuando las
que incorporan refrigeracin) elevacin de la temperatura.

B.

Desintegracin de los microorganismos (RUPTURA CELULAR)

Etapa en que los microorganismos son divididos por procedimientos
qumicos, fsicos o biolgicos, en los casos que se solicite para la
recuperacin del producto.

La eleccin del mtodo depende principalmente de la naturaleza de las

clulas. No obstante las membranas celulares no ofrecen especial
resistencia a la ruptura, las paredes celulares varan ampliamente a la
rotura.

Las bacterias Gram + y hongos son mucho ms difciles de rasgar que

las bacterias G- debido a la composicin de la pared celular. Incluso
dentro

de

un

mismo

microorganismo

las

clulas

varan

significativamente en sensibilidad a la ruptura dependiendo de su

estado fisiolgico.

La desintegracin no debe destruir el producto de inters. Por ejemplo,

pueden utilizarse cidos para romper muchos microorganismos pero no
pueden ser utilizados si el producto es lbil a los cidos.

1. Mtodos qumicos

Incluyen tratamiento con lcalis o cidos, solventes orgnicos y

detergentes.

La lisis bacteriana con

lcalis puede efectuar a gran escala y bajo

costeo siempre y cuando el producto sea estable a pH: 10,5-12,5. Por

ejemplo, la hormona de crecimiento humano recombinante se libera
cmodamente de Escherichia coli por tratamiento con hidrxido sdico
a pH: 11.

El tratamiento con solventes orgnicos es un tratamiento natural y

barato manejado en el aislamiento de enzimas en levaduras. No
obstante, existe el riesgo que el tratamiento desnaturalice las protenas
por lo que se debe chequear con antelacin.

Los detergentes permeabilizan las clulas bacterianas al solubilizar las

membranas celulares. Asi se originan agujeros por donde salen al
exterior protenas y otras molculas. Sin embargo los detergentes son
caros, desnaturalizan la totalidad de las protenas y a menudo aparecen
como contaminantes en el proceso subsecuente de purificacin.

Para la extraccin de clulas de levadura se utiliza la plasmlisis que se

consigue mediante la suma de una concentracin alta de cloruro
sdico.

2.

Mtodos biolgicos
Se manipula la lisis enzimtica.
Por ejemplo:

La pared celular de las bacterias Gram + se hidroliza con el enzima

lisozima que se aisla de la clara de huevo. La pared celular de las
bacterias Gram - se hidroliza con lisozima y EDTA.

La pared celular de las levaduras se hidroliza con una combinacin

de uno o ms de los enzimas (1,3)-glucanasa, (1,6)-glucanasa,
mananasa y quitinasa.

Los tratamientos enzimticos son muy concretos y las condiciones para

la lisis son blandas.

En la novedad, los costes limitan el uso de los enzimas como agentes

lticos celulares en la industria.

Una variante que se utiliza en levaduras es la autolisis en la cual los

enzimas autolticos endgenos de las levaduras llevan a cabo la
destruccin de su propia pared celular. La adicin de cloruro sdico,
acetato de etilo o cloroformo y la incubacin durante 24h a 45C
aumenta la velocidad del proceso autoltico.

3.- Mtodos fsicos

La descomposicin por ultrasonidos se utiliza ampliamente en el

laboratorio, pero debido a su alto coste no es adecuada para procesos a
escala industrial.

Otro

mtodo

fsico

incluye

repetidos

ciclos

de

congelacin

descongelacin pero en este caso muchas de las clulas subsisten

intactas. Industrialmente los mtodos fsicos ms empleados de
desintegracin celular suponen la accin mecnica.

Los molinos de bolas llevan a cabo la ruptura de las clulas mediante la

accin de bolas de vidrio. Las clulas y las bolas de vidrio se mezclan
juntas y se someten a una alta velocidad de mezclado en una vasija de
reaccin. La ruptura se produce cuando una bola de vidrio fuerza una
clula contra las paredes de la vasija. Con este mtodo se consigue una
velocidad mxima de ruptura de aproximadamente el 80% de las
clulas.

Otro enfoque es el uso de homogeneizadores. En tales artilugios el

material biolgico se coloca bajo una fuerte presin hidrosttica
(alrededor de 500 atmsferas) y la presin se libera rudamente

admitiendo que el lquido salga por una vlvula, lo que ocasiona la lisis
celular.
C. Mtodos de aislamiento (SEPARACIN DE RESTOS CELULARES)

Una vez lisadas las clulas, los restos celulares se retiran por
centrifugacin de gran capacidad a baja velocidad o por filtracin en
membrana.

Al final alcanzamos un lquido libre de clulas que es el que sufre los

tratamientos posteriores para aislamiento y en su caso purificacin del
producto de inters.

D.

Concentracin y Purificacin del producto

1.

Cromatografa

El uso de mtodos cromatogrficos involucran unas de las etapas ms

caras en la recuperacin del producto

Tales mtodos son de especial valor para la purificacin de materiales

biolgicos sensibles y encuentran un amplio uso en la elaboracin de
materiales farmacuticos, reactivos de diagnstico y reactivos para
investigacin.

Los

distintos

mtodos

cromatogrficos

que

existen

segn

su

mecanismo de separacin son: filtracin en gel (peso molecular),

cromatografa de adhesin (interacciones hidrofbicas), cromatografa
de intercambio inico (carga), cromatografa de afinidad (actividad
biolgica) y electroenfoque (punto isoelctrico).
2. Extraccin

Cuando se utiliza a los bioproductos, tiene funcin de apartamiento y

concentracin.

El caldo acuoso de fermentacin que contiene el producto deseado se

mezcla

con

un

solvente

inmiscible

en

el

que

se

disuelva

preferentemente y del que pueda ser ms fcil y especficamente

recuperado.

Una vez se ha concentrado el producto anhelado en la fase solvente

puede ser adicionalmente purificado.

La extraccin con solventes ha sido manejada ampliamente en la

industria de antibiticos (penicilina) manejando solventes (acetato de
amilo o de butilo).

Para la separacin de enzimas en estado activo no pueden ser

utilizados los solventes orgnicos pero s pueden ser utilizados sistemas
acuosos en fase mltiple preparados en una solucin de sales con
polmeros hidroflicos (polietilenglicol-dextrano). En ambas fases el
agua es el componente principal, pero ambas fases no son miscibles
por lo que los enzimas pueden separarse fcilmente sin prdida de
actividad.

3. Precipitacin, Cristalizacin y/o Desecacin: Ultimas etapas:

Cristalizacin y precipitacin

La cristalizacin a baja temperatura es una forma muy suave de

purificacin.

Se utiliza principalmente para la desinfeccin de compuestos de bajo

peso

molecular

(antibiticos).

Por

ejemplo,

la

Penicilina

es

generalmente extrada del caldo de fermentacin con acetato de butilo

y cristalizada por adicin de acetato potsico en solucin etanlica.

Desecacin

Desecado del material biolgico. Es en muchos casos el mtodo final.

Los productos son llevados a una forma firme adecuada para su manejo
y almacenamiento.

La sensibilidad al calor de la mayor parte de los productos biolgicos

representa que los nicos mtodos que pueden ser utilizados son los
que transfieren a la eliminacin de agua con elevacin mnima de la
temperatura.

La termoestabilidad de los productos (enzimas o preparaciones

farmacuticas) en algunos casos, es corregida por la adicin de
azcares u otros estabilizantes inertes.

La liofilizacin es el mtodo de desecacin ms suave debido a que el

agua es sublimada a partir de una masa congelada. Muchos productos
farmacuticos

son

liofilizados

(vacunas,

fracciones

de

plasma,

hormonas y elaboraciones de enzimas, as como ingredientes muy

lbiles y caros para diagnosis). Tambin se liofiliza cultivos microbianos
vivos (cultivos para inoculacin en las industrias lcteas).
E. Rendimiento
Las prdidas en la recuperacin dependen de la sensibilidad de las
sustancias al proceso y del nmero de etapas de purificacin.
El promedio de prdidas atribuidas a la purificacin est en torno al 20%
pero en casos extremos, con ciertos tipos de metabolitos intracelulares,
puede llegar a ser el 90%.
El rendimiento final es solamente un factor, ya que el coste de los
productos qumicos, el equipo y los salarios deben ser considerados en el
clculo global.
Los productos que resultan de los proceso biotecnolgicos pueden ser muy
variados. La variedad estar dada por:

a. La naturaleza qumica del mismo: sustancias simples (alcoholes, cidos

orgnicos);

protenas,

sustancias

con

actividad

teraputica

(antibiticos, hormonas) etc.

b. El volumen de produccin y la concentracin del producto en el caldo
de fermentacin: los aclamados commodities (etanol, cido ctrico,
etc.) se obtienen de a cientos o miles de ton./ao y en altas
concentraciones
teraputicos

de

en

la

fermentacin.

moderna

Mientras

generacin

que

(hormonas,

los

agentes

factores

de

coagulacin, etc.) se originan slo algunos kg/ao y su concentracin

en la produccin es baja. Esto determina la escala de produccin.
c. Los requerimientos de pureza del producto final. Las molculas a ser
utilizadas en salud humana requerirn una pureza final muy diferente a
las enzimas a ser manejadas en los polvos para lavar de un
acidulante para alimentos.
El principal ejemplo son los antibiticos. La concentracin de los mismos
en los caldos fue incrementndose a medida que se conoca ms del
producto, se mejoraba la productividad de las cepas, se desarrollaban
nuevas metodologas de produccin y as fue aumentndose el volumen y
bajando los precios.
Lo mismo puede ocurrir con los agentes
generacin.

teraputicos

de ltima

Por ello hablar de SP (downstream processing) en Biotecnologa no es

referirnos a algo invariable.
Las etapas y metodologas a emplear estn fijadas por todo lo dicho, pero
de cualquier manera se puede trazar un esquema general que sea
aplicable a cualquier proceso.
Estrategias de diseo de procesos de SP
Para todos aquellos productos de la Biotecnologa tradicional hay un gran
conocimiento tecnolgico y de las propiedades bsicas de las molculas a
purificar tanto como del entorno en que se localizan luego de la etapa de
produccin.
No ocurre lo mismo con los productos de ltima generacin ya que, por las
necesidades comerciales para aprovechar la baja competencia, el elevado
precio, y dada la baja escala actual de produccin, la estrategia es llegar
rpido con el producto al mercado con la tecnologa de SP que se posea
(por lo general la desarrollada a escala de laboratorio). Esta estrategia

posibilita

un

buen

posicionamiento

en

el

mercado

que

aprueba,

posteriormente, el desarrollo de nuevas tecnologas de cambio de escala y

SP. Otra vez el ejemplo de este tipo de evolucin son los antibiticos.
Las estrategias de diseo de procesos de SP para los productos conocidos
pueden resumirse en:
1. Estar al tanto las propiedades fsicas y qumicas bsicas del principio
activo y caractersticas del producto final (por ejemplo definir pureza
requerida). El uso determina la pureza. Para agentes teraputicos se
requiere un alto grado de pureza del principio activo. Se tolera un
mximo de 100 ppm de impurezas de 10 pg/dosis, adems de estar
libre de pirgenos.
2. Precisar perfectamente el material de partida. En la Tabla 4 se muestra
un ejemplo de caracterizacin de material de partida para la
purificacin de un producto. Muchas veces la metodologa de SP
condiciona

etapas

de

produccin.

Por

ejemplo,

logran

existir

componentes del medio de cultivo (por lo general subproductos como

agua de hidrolizado de maz, extracto de malta, sueros animales,
albmina otros) que posean sustancias muy similares al producto
final que, por lo tanto, interfieren en la purificacin del mismo. En este
caso se debe excluir ese componente del medio de cultivo.
3. Disear diferentes esquemas tentativos de SP y llevarlos a etapas de
laboratorio y piloto.
Algunas reglas que se siguen para ello son:
a. Elegir en etapas sucesivas procesos basados en diferentes propiedades
fisicoqumicas. Por ejemplo si una primera etapa es cromatografa de
intercambio inico (propiedad: carga) se puede seguir con una
cromatografa de filtracin por geles (propiedad: tamao).
b. Apartar las impurezas que estn en mayor proporcin en las primeras
etapas. Por esta causa la etapa de separacin siempre finaliza en una

concentracin, ya que el agua es por lo general la impureza mayoritaria

(mayor del 90% en cualquier proceso fermentativo).
c. Luego de la concentracin usar en las primeras etapas de purificacin
propiamente dicha un mtodo de alta resolucin (por ejemplo
cromatografa

de

afinidad).

Estos

mtodos

conservan

un

alto

rendimiento aunque no manifiesten la mayor pureza. En cierta medida

lo que se hace es seguir concentrando para reducir la cantidad de
muestra a tratar en las etapas posteriores.
d. Dejar el proceso ms complejo (y por lo general ms caro) para el final.
Se usan estos mtodos cuando tenemos la sustancia a purificar
concentrada y pre-purificada.
Volviendo al diagrama original de SP en la Figura 3 podemos ver algunos
mtodos usados en cada una de esas etapas.
Como

podemos

biotecnolgicos

prestar
depende

atencin,
en

gran

la

economa

medida

de

las

de

los

procesos

operaciones

de

bioseparacin que involucran, de tal manera que la correcta seleccin de

estas operaciones tiene un fuerte impacto en el xito del proceso.