CARACTERIZACIN DE BIOSURFACTANTES PRODUCIDOS POR PSEUDOMONAS

FLUORESCENTES AISLADAS DE EMULSIONES DE PETRLEO PESADO

Resumen
Los biosurfactantes son compuestos producidos por microorganismos y presentan una alta
actividad de superficie y propiedades emulsificantes, adems de tener baja toxicidad y ser
biodegradables. Estas propiedades los hacen tiles en varios procesos biotecnolgicos, entre los
cuales estn su aplicacin en la biorremediacin de ambientes contaminados. En este trabajo se
estudi la produccin de biosurfactantes por cepas pertenecientes al grupo de Pseudomonas
fluorescentes aisladas de muestras de emulsiones de petrleo pesado. Los biosurfactantes
fueron detectados mediante el registro de la disminucin de la tensin superficial de los cultivos y
tambin mediante sus capacidades hemolticas y emulsionantes. Su caracterizacin se realiz
mediante la determinacin de azucares y de protenas, as como tambin mediante
espectroscopia de infrarrojo IRTF y espectroscopia de RMN. Los mejores sustratos para el
crecimiento de las cepas y para la produccin de los biosurfactantes resultaron ser los aceites
vegetales estudiados en este trabajo. Los resultados obtenidos permiten concluir que estos
compuesto son glicolpidos que tienen, entre otras, la caractersticas de formar rpidamente
emulsiones acuosas de petrleo pesado, disminuyen la tensin superficial entre 28,51 y 30,5
dinas/cm y forman emulsiones estables de parafina lquida en agua durante varios meses a
temperatura ambiente. Por medio de los resultados de los anlisis de espectroscopia IRTF y
RMN se establecieron las estructuras qumicas de los biosurfactantes producidos por la cepa de
P. aeruginosa BIOMI E5, los cuales resultaron ser rhamnolpidos.
Introduccin
Los biosurfactantes son molculas producidas por microorganismos y presentan una alta
actividad de superficie y propiedades emulsificantes, generalmente son metabolitos secundarios
excretados por los microorganismos, su principal papel fisiolgico es el de permitir crecer a los
microorganismos en sustratos inmiscibles en agua mediante la reduccin de la tensin superficial
de la interfase (1). Pueden ser clasificados principalmente por su composicin qumica, por
consiguiente la mayor clase de biosurfactantes comprenden a los glicolpidos, lipopptidos y
lipoprotenas, fosfolpidos y cidos grasos, surfactantes polimricos y partculas de surfactantes
(2).
La enorme demanda del mercado de los surfactantes ha provocado un incremento en la
preparacin por sntesis de numerosos surfactantes qumicos, principalmente con aplicacin de
la industria petrolera. Ahora bien, los rpidos avances en la biotecnologa e incremento de la
necesidad del consumidor de proteger el medio ambiente, provee un buen futuro para considerar
seriamente a los surfactantes biolgicos como posibles alternativas para la produccin de stos
(3).
Los biosurfactantes tienen variadas aplicaciones en el mercado, tanto en la produccin de
petrleo, como en la incorporacin en la formulaciones de aceites (4). Entre otras aplicaciones
relacionadas con la industria del petrleo estn los procesos de biorremediacin y dispersin de
derrames petroleros, tanto a nivel del suelo como de las aguas, la remocin y movilizacin de
petrleo pegado en el interior de los tanques y tambin en la recuperacin mejorada de petrleo
(5-7). Un segundo e importante mercado de los biosurfactantes se encuentra en la

polimerizacin y emulsin de pinturas. Tambin se describen otro uso de los surfactantes en la

formulacin de asfaltos, cementos, textiles y manufacturacin de fibras, adicionalmente en
tratamientos de metales, minera, tratamientos de agua y como preservativos de madera (8).
Pueden ser usados en la industria de los alimentos, los cosmticos y como productos de
limpieza. En la agricultura como diluyentes y dispersantes de fertilizantes y pesticidas (3), as
como en el mejoramiento de la penetracin de compuestos activos dentro de las plantas, todas
estas aplicaciones dependen del tipo de funcin que presente el compuesto (9).
En este trabajo se reporta la produccin de biosurfactantes por especies del grupo de
Pseudomonas fluorescentes, tambin se realiza la caracterizacin qumica de esos compuestos.
Materiales y Mtodos
Microorganismos
Se utilizaron 4 cepas aisladas de muestras de emulsiones de crudo pesado venezolano
procedentes del Laboratorio de Biotecnologa de Microorganismo Sixto David Rojo de la
Universidad de Los Andes. Estas fueron identificadas y designadas en trabajos anteriores (10,11)
como: Pseudomonas putida BIOMI E1, P. aeruginosaBIOMI E3, P. putida BIOMI E4 y P.
aeruginosa BIOMI E5. Las bacterias fueron conservadas a 20C en cuas de agar nutritivo.
Preparacin de los inculos
Las bacterias se cultivaron en caldo nutritivo previamente esterilizado por autoclave e incubadas
a 30C durante 24 horas. Para las suspensiones celulares y la produccin de los biosurfactantes
se utiliz el medio mnimo salino de Davis (12) Este medio fue modificado ya que se utiliz
CuCl2 en vez de CuSO4, tampoco agregamos NiCL2 como lo seala el autor. La frmula del
medio por cada litro de agua destilada es la siguiente: fosfato de potasio dibsico 5,23 g/L,
fosfato de potasio monobsico 1,91 g/L, sulfato de magnesio 0,09 g/L y sulfato de amonio 1g/L
as como 1mL/L de solucin de trazas de elementos (Cloruro de cobalto 20 mg/L, cido brico 30
mg/L, sulfato de cinc 10 mg/L, sulfato de cobre 1 mg/L, molibdato de sodio 3 mg/L, sulfato de
hierro 10 mg/Ly sulfato de magnesio 2,6 mg/L). El pH del medio fue ajustado a 7,3. Las clulas
obtenidas, previa centrifugacin a 5.181 x g durante 15 minutos a partir de los caldos nutritivos,
fueron lavadas dos veces con el mismo medio salino, recuperndose en cada caso mediante
centrifugaciones. Estas se dejaron carenciando por un da en 5 mL de medio salino sin fuente de
carbono, constituyendo los inculos para las pruebas posteriores.
Seleccin de las cepas productoras de biosurfactantes y sustratos que inducen su
produccin
Se inocularon los medios con 0,2% v/v de las suspensiones celulares obtenidas anteriormente
en el medio mnimo salino. La fuente de carbono utilizadas incluyen: Glicerol, parafina lquida,
glucosa, melaza, vinaza, sacarosa y aceites vegetales de maz, ajonjol, resino y otras mezclas
comerciales (Coposa), estos sustratos se agregaron a una concentracin de 1% y 10 % v/v. Los
cultivos se incubaron a 30C 2 sujeto a agitacin constante, en un agitador rotatorio a 156
r.p.m. Transcurridos 3 das, los cultivos se centrifugaron a 5.181 x g durante 15 min. Se

determin la tensin superficial de cada sobrenadante con respecto a su control, con la ayuda
del tensimetro de superficie Fisher Modelo 20.
Como controles se dispusieron medios con su respectiva fuente de carbono sin inocular, esto en
el caso de las fuentes de carbono solubles en agua. Para el caso de las fuentes de carbono no
solubles en agua se utiliz como control solamente el medio salino sin inocular, ya que
previamente habamos determinado que la presencia de estos sustratos hidrfobos no influyen
en las medidas. Se registr en todos los casos la aparicin de espuma estable en los cultivos.
Denominamos espuma estable a aquella que permanece luego de la agitacin. Este criterio fue
tomado en cuenta para la seleccin de los productores de biosurfactante.
Otro criterio considerado fue la capacidad hemoltica de cada una de las cepas bacterianas. Para
lo cual se realiz la pruebas clsica de capacidad hemoltica en placas de agar sangre. Las
mismas fueron incubadas a 30 2C durante 2 das; al cabo de este tiempo se verific la
presencia de halos alrededor de las colonias.
Produccin de biosurfactantes a partir de glicerol
Se prepararon cultivos en matraces de 1 L que contenan 300 mL del medio mnimo salino con
glicerol como fuente de carbono a una concentracin del 1% v/v. Se cultivaron durante tres das
a 30C 2 y bajo agitacin constante.
En todos los cultivos la biomasa fue eliminada por centrifugacin, previa esterilizacin, a 30.100
x g durante 15 min, a 4C lo cual permiti eliminar completamente los restos celulares facilitando
la obtencin de biosurfactantes ms puros. Antes de guardar los sobrenadantes bajo congelacin
a 20C, se hizo un registro, de la tensin superficial y la formacin de espuma obtenida
mediante los procedimientos sealados anteriormente.
Extraccin y concentracin de los biosurfactantes
Los biosurfactantes fueron extrados con acetato de etilo, con un volumen de 1,5 del
sobrenadante en un embudo de separacin de 1 L, previa acidificacin del medio hasta un valor
de pH igual a 2 con HCL 1N (12). Luego de la concentracin de las muestras de biosurfactantes
en el rotavapor, un alcuota de cada una fue pesada, debido a su alta viscosidad, para luego ser
disuelto en una solucin de bicarbonato de sodio 0,1M; se ajust la concentracin hasta un valor
del 1% p/v. Otra alcuota fue conservada bajo congelamiento a 20C, para anlisis
espectroscpicos IRTF y posterior elucidacin de la estructura mediante RMN. El control, medio
salino, sin inocular y con glicerol como sustrato, recibi el mismo tratamiento que las muestras.
Deteccin de los biosurfactantes mediante cromatografa de capa fina (TLC)
Se realiz sobre laminas para capa fina preparativas elaboradas con Silicagel 60 F 254 de 0,25
mm de espesor con indicador de fluorescencia (Merck). Las soluciones de los biosurfactantes
con bicarbonato de sodio y las muestras controles provenientes se agregaron con pipetas
pasteur. Se desarrollaron sobre la placa con el sistema de solventes metanol-cloroformo en una
proporcin de 1,3 volmenes de metanol y 7 volmenes de cloroformo. El revelado de las placas
se realiz con luz UV mediante una lmpara mineral Light UV lejano y cercano del tipo UVSL-25,

y posteriormente con una mezcla reveladora conteniendo 70% de cido sulfrico, 20% de cido
actico y 10% agua.
Estudio de la naturaleza qumica de los biosurfactantes
Determinacin cualitativa de azcares
Se determin la presencia de azucares totales en las soluciones de los biosurfactantes con
bicarbonato de sodio. Se hidrolizaron previamente 5 mL de cada una de las soluciones (13), y se
mezclaron con 5 mL de una solucin de cido clorhdrico 2N. La mezcla se mantuvo a una
temperatura de 100C durante 2 horas. Posteriormente la muestra permaneca en reposo
durante 6 horas hasta alcanzar la temperatura ambiente, se agreg seguidamente acetato de
etilo para descartar la mitad hidrofbica del compuesto hidrolizado, y por ltimo se recolect la
fase acuosa de cada muestra (14). A cada muestra acuosa se le determin la presencia de
azcares mediante el mtodo de fenol cido sulfrico. Se midi la absorbancia a 480 nm con
respecto al blanco (15).
Determinacin de protenas
Se agregaron 120 L de muestra de biosurfactantes en tubos de ensayo, se adicion a cada
tubo 3 mL de una solucin de ninhidrina a una concentracin de 0,2 % en etanol, se agitaron por
10 segundos y se dejaron en reposo durante una hora. Se observ la formacin de color
(16). Para esta experiencia se utilizaron tres controles, 2 positivos (soluciones de alanina y
albmina de bovino) y otro negativo (control preparado anteriormente con medio salino sin
inocular).
Anlisis de la estructura qumica de los biosurfactantes
La caracterizacin de los grupos funcionales de los biosurfactantes se realiz por medio de la
tcnica de Espectroscopia de Infrarrojo con Transformadas de Fourier. Para la elucidacin su
estructura se utiliz la tcnica de Espectroscopia de Resonancia Magntica Nuclear, en un
espectrmetro BRUKER Advance DRX 400 MHz.
Estudio de las propiedades de los biosurfactantes ndice de Emulsin
El ndice de emulsin % PE12 se defini como el porcentaje de parafina lquida emulsionada
durante 2 minutos en un agitador Vortex a 30C registrada despus de 12 horas. La emulsin se
realiz en tubos calibrados de 15 mL, se agregaron 6 mL de parafina y 4 mL de las soluciones de
los biosurfactantes con bicarbonato de sodio. Los valores se obtuvieron determinando la
cantidad de parafina no emulsionada en los tubos, con relacin a la cantidad total de parafina
agregada.
Tambin fue determinada la actividad hemoltica de los compuestos a partir de estas soluciones
en placas de agar sangre incubadas a 30C 0,2 durante 1 hora.
Actividad detergente y tensoactiva sobre muestras de crudo pesado

Se determin la capacidad de los biosurfactantes para remover crudo pesado adherido a las
paredes del vidrio y por ende sus propiedades de detergencia. Se agregaron a dos tubos de
ensayo aproximadamente 10 mL de crudo pesado tipo Cerro Negro. A uno se agreg 10 mL de la
solucin de bicarbonato de sodio 0,1M sin biosurfactantes, utilizado como control, y al otro tubo
10 mL de la solucin de biosurfactante disuelto en bicarbonato de sodio a 0,1M, obtenido a partir
de la cepa de P. aeruginosa BIOMI E3. Los tubos fueron agitados en el vortex por 10 segundos y
se dejaron sujeto a reposo por una hora a temperatura ambiente. Se descart el contenido de los
tubos y se observ la capacidad del tenso activo para desprender el crudo adherido en la
superficie del tubo de vidrio.
Anlisis de la estructura qumica de los biosurfactantes IRTF
Se identificaron diferentes grupos funcionales en los espectros de los biosurfactantes crudos
producidos por las cepas de P. aeruginosa BIOMI E3, BIOMI E5 y BIOMI E1, correspondientes a
alcoholes alifticos, alcoholes cidos de grupos carboxlicos y grupos carbonilos, cuyo espectro
de absorcin vara entre 1.650 cm-1 y 1.780 cm-1 No se logr registrar grupos funcional en las
soluciones de la cepa de P. putida BIOMI E4 (Figura 1).

Propiedades de los biosurfactantes

En la Tabla 4 se representan los resultados de la prueba de emulsin. En las muestras
provenientes de la cepaP. putida BIOMI E4 no se observ emulsin; en muestras
correspondientes a P. aeruginosa BIOMI E5 se report un porcentaje de emulsin del 50%,
mientras que para BIOMI E3 el porcentaje fue de 83,13%. En las muestras originadas de P.
putida BIOMI E1 se obtuvo un valor del 16,6%. Adicionalmente, se pudo observar que la
emulsin de la parafina causada por los biosurfactantes de P. aeruginosa BIOMI E5 es similar en
cuanto a la apariencia de la distribucin, a la emulsin causada por el extracto de la cepa BIOMI
E3, a pesar de que el porcentaje de parafina emulsionada para el extracto de la cepa BIOMI E3
es mayor que el de la cepa BIOMI E5. Ya que los resultados arrojados por los anlisis de TLC,
de IRTF y de RMN indican que se tratan de molculas similares, la diferencia sealada
anteriormente podra deberse a que el extracto crudo de la cepa BIOMI E3 estuviese enriquecido
con el biosurfactante. En cuanto a la estabilidad de las emulsiones producidas por las soluciones
de los biosurfactantes de P. aeruginosa BIOMI E5 y BIOMI E3 a temperatura ambiente, su

duracin fue de 4 a 8 meses, mientras que la estabilidad de la emulsin producida por la solucin
del extracto de P. putida BIOMI E1 se mantuvo solo por algunos das. Estas diferencias
presentes en el tipo de emulsin y tiempo de estabilidad podra deberse a los grupos funcionales
detectados por IRTF que alteran el balance hidroflico lipoflico (HLB) del biosurfactante,
originando un comportamiento distinto al observado en las emulsiones producidas por las
soluciones de los biosurfactantes de P. aeruginosa BIOMI E5 y BIOMI E3. Adicionalmente se
determin la presencia de actividad hemoltica en los biosurfactantes de P. putida BIOMI E1, P.
aeruginosaBIOMI E3 y BIOMI E5.

Solubilizacin de crudo pesado

Se determin visualmente la capacidad que tienen el compuesto o mezcla originado por la cepa
de P. aeruginosa BIOMI E3 para permitir la remocin del crudo pesado, dejando las paredes del
tubo de ensayo libre del mismo. Esto demuestra la capacidad detergente de este tipo de
compuesto (22-24). Los dems biosurfactantes no se utilizaron debido a que no se contaba con
suficiente solucin para esta prueba.
Es relevante destacar que los compuestos tenso-activos producidos por las bacterias estudiadas
principalmente correspondiente a P. aeruginosa soportan cambios bruscos de pH y temperatura.
Aspecto que se evidencia desde los cultivos as como en los sucesivos pasos de extraccin,
tanto la temperatura como el pH se han variado drsticamente, desde temperaturas de 121C en
el paso de esterilizacin, hasta temperaturas de 20C durante congelamiento.
Tensin superficial
En cuanto a la tensin superficial, tenemos que para el agua fue de 68,42 dinas/cm. La pequea
disminucin que se observa con respecto al valor estndar puede deberse a la modificacin
implementadas para medir volmenes menores a los requeridos por el aparato y temperatura
operativa. Los resultados de tensin superficial de las soluciones de los biosurfactantes fueron
de 30,86 dinas/cm para la cepa BIOMI E1; 28,51 dinas/cm para la cepa BIOMI E3; 51,03
dinas/cm para la BIOMI E4 y 30,5 dinas/cm para la cepa BIOMI E4. El control present un valor
de 51,03 dinas/cm. Adicionalmente, se puede ver que todos los extractos que presentan cada en
la tensin superficial tienen valores muy aproximados entre s, estos valores no se pueden tomar
como pertenecientes a un solo compuesto ya que se trata de biosurfactantes crudos.
Conclusiones

Se comprob que los microorganismos que conforman los cultivos mixtos utilizados en la
biodegradacin de gasoil y dibenzotiofeno disueltos en parafina en trabajos anteriores (10,11)
forman emulsiones debido a la produccin de biosurfactantes. Esta caracterstica aunada a la
capacidad de las cepas para degradar hidrocarburos las hace potencialmente tiles en procesos
de biorremediacin y tratamiento de contaminantes.
Las cepas P. aeruginosa BIOMI E5 y P. aeruginosa BIOMI E3 producen biosurfactantes en medio
salino con glicerol como fuente de carbono. Adicionalmente, se comprob que son b-hemolticas
a los 2 das de crecimiento. Los sustratos ptimos para la produccin de estos biosurfactantes y
para el crecimiento de los microorganismos en cuestin resultaron ser los aceites vegetales de
maz, ajonjol, resino y otras mezclas comerciales (Coposa). Estos aceites podra ser una
eleccin adecuada a la hora de producir estos compuestos en sustratos econmicos y podemos
pensar que aparte de los biosurfactantes se produciran otros metabolitos provenientes de la
degradacin de los aceites con propiedades tambin tenso activas. Tal vez, por esta razn
encontramos los valores ms bajos de tensin superficial en los sobrenadantes de los cultivos
realizados con estos aceite vegetales.
En cuanto a las cepas de P. putida BIOMI E1 y P. putida BIOMI E4 son a-hemolticas a los 7 das
de incubacin. Se determin que la cepa de P. putida BIOMI E1 mantenida durante este tiempo
en incubacin, produce un compuestos tenso-activo de naturaleza glicolipdica con
caractersticas similares a los biosurfactantes producidos por las cepas de P. aeruginosa BIOMI
E5 y P. aeruginosa BIOMI E3. Pese a que no se realizaron estudios concluyentes al respecto es
interesante el resultado anterior ya que se trata de una especie no patgena que podra utilizarse
en la produccin del biosurfactante.
Los biosurfactantes estudiados poseen la actividad hemoltica registradas en las cepas que los
producen. Se determin que estas sustancias tenso-activas soportan cambios bruscos de
temperatura y de pH, y que adems son eficientes en la formacin de emulsiones de
hidrocarburos tales como parafina lquida y petrleo. Estas fueron estables por ms de 3 meses
y se comprob tambin su eficientes en la remocin (detergencia) de crudo pesado.
Se elucidaron los posibles grupos funcionales presentes en los biosurfactantes por la tcnica de
IR, la cual indic que los compuestos originados por las cepas de P. aeruginosa BIOMI E3 y P.
aeruginosa BIOMI E5 contenan grupos como alcoholes, cidos carboxlicos, carbonilos, grupos
metilos y cadenas de metilenos mayores o iguales a cuatro miembros, adems se sugiri por
medio de esta tcnica que probablemente son sustancias muy similares. Las conclusiones de los
anlisis de Resonancia Magntica Nuclear nos permiten conocer que los biosurfactantes
producidos por las bacterias de P. aeruginosa BIOMI E3 y P. aeruginosa BIOMI E5 son
rhamnolpidos de tipo III y probablemente tambin se encuentre presente el de tipo I.

EVALUACIN DE LA CAPACIDAD DEGRADADORA DE ACEITE POR BACTERIAS

LIPOLTICA EN EL LODO RESIDUAL DE LA EXTRACCIN DE ACEITE DE PALMA
Las lagunas de estabilizacin son sistemas de tratamiento de efluentes que emplean
microorganismos especializados para la depuracin de los residuos. Uno de los problemas de
manejo que presenta este tipo de residuos en las plantas extractoras de aceite de palma es la

alta carga de aceites y grasas residuales (aproximadamente 8.750 mg/.). La remocin de estas
grasas puede realizarse mediante la preparacin de un cultivo biolgico lipoltico, el cual tome las
grasas presentes en el residuo, las metabolice y permita aprovechar los nutrientes, minerales,
carbohidratos y protenas. En este estudio, realizado en la Plantacin Palmar del Oriente
(Villanueva, Casanare), se aislaron cepas nativas con actividad lipoltica de cada una de las
lagunas de estabilizacin 1 A (14,8%); 1 B (24,07%); 2 (27,77%); 3 (12,96%); y 4 (20,37%). De
estas cepas se seleccionaron seis, las cuales presentaron mayor actividad, tres pertenecientes al
gnero Pseudomonas, una al gnero Enterobacter, otra al gnero Bacillus y otra al gnero
Staphylococcus. Con estas cepas se prepar un inoculo y se realizaron pruebas en campo
evaluando la remocin de grasas y aceite a partir de 8 tratamientos diferentes en volmenes de
60 y 2 litros, incluyendo un tratamiento control. Simultneamente se evalu la degradacin del
aceite bajo condiciones controladas en un reactor de 5 litros, el cual se mantuvo en aireacin
constante; a todos estos ensayos se les realizaron mediciones de pH, temperatura y porcentaje
de aceite y grasas (mg/l); con respecto a este ltimo parmetro se analiz el contenido inicial
(tratamiento control) a los 8, 15 y 30 das durante un perodo de un mes. El inoculo mixto de
bacterias logran remover, como mximo, el 40% del aceite en el ensayo con canecas de 60 litros
en un tiempo de 15 das a una temperatura de 33C y pH de 7,0 0,2; y un 20% de remocin de
aceite se obtuvo con el ensayo en un reactor de 5 litros (bajo condiciones controladas)
Evaluacin de la capacidad degradadora de aceite por bacterias lipolticas en el lodo residual de
la extraccin de aceite de palma
Durant e el proceso de extraccin de aceite de palma se realizan varios pasos importante s
que incluyen el descargue de los racimos de frut a fresca , e l desfrutad o y ,
posteriormente , e l procesamiento de los fruto s sueltos.
El prensado de la masa de frut a se realiza por medi o de una prensa de tornill o qu e
funcion a continuamente . Los pasos subsiguientes son el desarenado , la decantacin , la
separacin de slidos residuales, tales com o el agua y el rema nente de aceite .
La descarga de aceite obtenid a se transport a a un secador al vaco, y el aceite seco se
bombea a travs de la unida d de enfriamient o al tanqu e de almacenamient o (Dupjohan n
1994).
En el proceso de extraccin de aceite de palma existen punto s de producci n de aguas
residua les, tales como : aguas lodosas provenientes de la clarificacin, los condensados de
esterilizacin y los efluentes de los hidrociclones.
Todo s esto s efluente s recibe n diferente s tratamientos , de los cuales el ms important e
es en las lagunas de estabilizaci n (Garca et al .
1995). Sin embargo , la falt a de un diseo apro piado , el desconocimient o de los procesos
de degradacin y el complej o manej o de stos, han hecho qu e en la mayora de los casos los
sistemas se saturen rpidament e y no cumpla n con los objetivos deseados. Hace
aproximadament e tres aos se plante la necesida d de mejora r el
tratamient o d e los efluente s co n u n apro vechamient o intern o de l recurso , e s decir
, buscand o disminui r los alto s costo s d e u n tratamient o qu e se viert e al desag e
con su posible reutilizacin .

Los problemas de manejo de este tip o de residuos radican en la elevada temperatura , pH bajo y
alta carga de slidos suspendidos y voltiles, grasas y aceites residuales, siendo su composicin
muy constante , l o cual permitir a u n tratamient o definid o como es la remoci n aerbica
del ma teria l graso presente en estos residuos, despus d e pasar po r u n tratamient o
anaerbic o qu e remueva la materi a orgnica ; esto a parti r de un cultiv o biolgic o lipoltic o
aislado del agua re sidual, el cual tom e las grasas all presentes, las metabolic e y permit a
aprovecha r e l alt o contenid o de materi a nitrogenada , minerales y protena s all
contenida s e n proceso s d e fertilizaci n agrcola.

MATERIALES Y MTODOS
Las muestra s de agua s residuale s para este trabaj o s e obtuviero n d e las laguna s
d e estabilizaci n 1 A, 1 B, 2, 3 y 4 de la plant a extractora de Palmar del Oriente . Las
muestras se transportaro n en frasco s de vidri o y se mantuviero n refrigeradas hasta el
moment o de procesarlas. Posteriorment e se sembraro n en medios de cultiv o no selectivos,
a parti r de los cuales se recuperaro n 55 cepas.
Aislamiento y seleccin de cepas bacterianas
A parti r de las cepas recuperadas en los medios no selectivos, las colonias aisladas
se sembraro n en medios selectivos com o agar King B y agar F Pseudomonas con
el fi n de seleccionar las de inters y observar sus caractersticas morfolgicas y
bioqumicas.
Las bacterias que presentaro n mayor activida d lipoltica en agar tributirin a se
enviaron al Centro de Investigaciones Microbiologicas (CIMIC) de la Universidad de
los Andes, en Bogot , D.C., para su respectiva identificaci n de gner o y especie.
Siembra en agar tributirina
Las cepas aisladas de los medios selectivos se sem braro n adems en agar Tributirin a
para hacer de terminacione s cualitativas y cuantitativa s de las bacterias lipolticas
y as seleccionar las cepas que formara n part e del inoculo . La seleccin se hizo con
base en el halo de liplisis (mayor de 2,5 cm) formad o a 37 C en un tiemp o de 48
- 72 horas.
La siembra se realiz por puncin , con el fi n de poder medi r ms fcilment e el
dimetr o de los halos formado s por stas en el medio .
Pruebas de antagonismo
A parti r de las cepas desarrollada s en aga r Tributirina , con formaci n de
halo, se realiz una p r u e b a d e a n t a g o n i s m o po r e l m t o d o d e difusi n en
agar (Gauze en 1965).

En cada caja de Petri se colocaro n tres anillos de vidri o equidistantes, identificados

con los cdigos asignados a las bacterias; uno de los anillos lleva agua destilada
estril com o contro l negativ o de la prueba . Se coloc un volume n de 0,8 ml de la
suspensin con una concentraci n por 25X10 8
UFC/ml. Posteriorment e se incubaro n las cajas de petr i por 24 horas a 37C.
Curva de crecimiento
Esta prueb a se hace com o complement o de la prueba de antagonismo , para
conocer el tiemp o de desarrollo de los microorganismos aislados y
qu e alcance n la fase logartmic a en tiempo s similares permita n la preparaci
n de un inoculo qu e se evaluar posteriormente .
En el tu b o 1 de Mc Farland qu e contien e 300 microorg/ml , se sembraro n en
caldo nutriti v o cada una de las cepas escogidas, siendo sta la c o n c e n t r a c i n d e
l a fas e d e r e t a r d o ; los microorganismos se llevaron a incubacin a 37C,
realizand o lecturas cada hora hasta las 24 horas y lueg o cada 24 horas hasta
cuand o alcanzaran l a fas e l o g a r t m i c a d e c r ec i m i e n t o e n e l
espectrofotmetr o a 615 nm. , comparand o con un patr n estril com o blanco.
Evaluacin de actividad lipoltica a diferentes volmenes
- Ensayo en reactor (5 litros):
Con las cepas escogidas se aplic el inculo mixt o con una concentraci n de 54x10 8,
en 5 litros del agua residual provenient e de la laguna 2 de Pal mar del Oriente ,
con el fi n de saber si degra daba n el aceite all contenido .
Esto se realiz en un erlenmeye r de 5 litros con desprendimient o lateral en la
base y con airea cin constante , a una temperatur a de 37C .
A parti r de muestra s de 1 litr o se realizaro n anlisis fisicoqumic o de grasas y
aceites a los 8,
15 y 30 das, mtod o infrarroj o con dos repe ticiones, y se compararo n con el
contenid o inicial de estos componente s en el agua residual.
- Ensayo de 60 litros en campo
Este ensayo se realiz con el fi n de simular las condiciones reales bajo las cuales
van a actuar las bacterias en campo . Para esto se probaro n diferente s
tratamiento s con dos repeticiones.
Tratamiento s
T1 Agu a residual de la lagun a 2 (control) T2 Agu a residual de la laguna 2
+ bacteria
T3 Agu a residual de la laguna 2 + bacteria +nutrient e
T4 Agu a residua l de la lagun a 2 + nutrient e (control )