Manipulacin de la expresin

Genes Quimricos

Manipulacin de la expresin gnica en bacterias

El objetivo principal de la ingeniera gentica con fines industriales es lograr la
correcta expresin a altos niveles del gen clonado en el microorganismo husped
elegido. Sin embargo, la clonacin directa (sin manipulacin adicional) de un gen

en un vector normal (como el pBR322) no suele asegurar que nuestro gen de

inters se vaya a expresar bien, sobre todo cuando procede de especies alejadas
filogenticamente.
Por esta razn hay que proceder al diseo de vectores especializados y a menudo
a modificaciones del gen de inters, con objeto de que este pueda transcribirse y
traducirse bien en el microorganismo husped.

 He aqu algunos de los elementos que conviene

manipular para este fin:
Naturaleza de las secuencias de inicio y final de la
transcripcin
Eficiencia de la traduccin
Estabilidad de la protena en la clula husped
Localizacin celular de la protena a expresar
Nmero de copias del gen clonado.

Protenas de fusin: una alternativa para mejorar

la expresin de protenas recombinantes

2 problemas principales con la expresin de
protenas forneas
Degradacin
Purificacin

Degradacin
produce un nivel bajo de expresin
es dificil la purificacin de la protena deseada

Una solucin para la degradacin

Unir la protena target a una protena celular estable
(tag o carrier)

Qu debe tener un vector de expresin en E. coli?

(se citan los elementos genticos siguiendo el orden
desde el lado 5 al lado 3):

Un promotor eficiente, dotado de las regiones conservadas 35 (TTGACA

o parecida) y 10 (TATAAT o parecida)
A corta distancia del promotor, una regin que al transcribirse suministre el
sitio de entrada al ribosoma: la denominada secuencia de Shine-Dalgarno,
que es complementaria del extremo 3 del ARNr 16S
A unos 3-11 pb aguas abajo de la secuencia de Shine-Dalgarno, debera
situarse el codn ATG que seala el comienzo de la traducccin del
ARNm. Este codn lo puede suministrar el gen a clonar, o bien el vector
puede disponer de ese codn, seguido de alguna diana que permita la
insercin del gen a expresar
Finalmente, y situado al lado 3 de todo lo anterior, una secuencia que
funcione como terminador de la transcripcin (que en su forma de ARN
constituye la tpica horquilla por emparejamiento intracatenario, donde la
ARN polimerasa se desliga del ARN recin formado).

Protenas de fusin: una alternativa para mejorar

la expresin de protenas recombinantes

Protena de fusin (a nivel DNA o genes)

Regin que codifica una protena celular
fusionada en marco de lectura a la regin que
codifica para la protena target
Cuando se transcribe y traduce genera una
protena de fusin

Qu es una protena de fusin?

Es la combinacin de una protena de inters fusionada a otra
protena o pptido conocidos, denominados Tags. Los Tags
pueden estar en el NH2 o COOH.
Tag Mi Protena
- un dominio con actividad cataltica
- un dominio antignico
Mi Protena Tag
- una seal peptdica
protege de protelisis a la protena de inters
mejora la solubilidad de la protena
estabiliza a la protena de inters

Qu herramienta biolgica de la sntesis de protenas

se utiliza para crear una protena de fusin?

Bsicamente, un mRNA con un marco abierto de lectura

(open reading frame, ORF) de codones cualquiera, sin
STOPs, puede ser traducido a protena. Las protenas de
fusin se basan en esta premisa.
Codn de inicio: ATG (Met)
Codones STOP: TAG, TGA TAA

Por qu son importantes las protenas de fusin?

Las tcnicas de ADN recombinante revolucionaron la produccin y purificacin de
protenas. Permite la purificacin de la protena en pocos pasos, y evita purificar
protenas endgenas.
ADN recombinante

bacterias
(o cel. eucariota)

Fusin de secuencia del gen

de inters con secuencia del Tag
Clonado de gen de inters en
marco con la secuencia del Tag

mucha protena

Introduccin del ADN

recombinante en
bacterias o lnea celular donde
se expresa la protena de fusin

Qu sistema elegiran para expresar protenas recombinantes

y tener mucha protena?

Lo ms comn es usar Escherichia coli

Ventajas:
Se obtiene mucha cantidad de protena, es fcil de crecer, de inducir y de
purificar la protena de fusin.

Desventajas:
No realizan modificaciones post-traduccionales, necesarias para el correcto
plegamiento y/o actividad de ciertas protenas. Es posible que no haya un
correcto plegamiento de la protena y haya que pasar a otro sistema (clulas
de mamfero, de insecto, levaduras).

Cuando se debe inducir la expresin de una protena en

bacterias?

Fase exponencial (o Log): mxima tasa de divisin celular; maquinaria transcripcional

y traduccional muy activa.

En la prctica:
situaciones de
represin y
activacin de la
transcripcin del
gen de inters

Sistema pET: doble sistema de induccin;

disminuye la expresin leaky

pRSET Expression Vector

The pRSET vector is designed for high-level

prokaryotic expression controlled by the strong
bacteriophage T7 promoter. Expression is induced
by the production of T7 RNA polymerase in the
BL21(DE3)pLysS host E. coli cells. These cells also
produce T7 lysozyme to reduce basal expression of
target genes. The pRSETvector offers:
High-level expression from the bacteriophage T7
promoter
T7 gene 10 sequence to provide protein stability
N-terminal polyhistidine (6xHis) tag for rapid
purification with ProBond resin
N-terminal Xpress epitope for protein detection
with the Anti-Xpress Antibody
Enterokinase cleavage site for removal of fusion
tag

Protenas de fusin
A veces la sobreexpresin puede reducir
la cantidad de protena recuperada
La protena forma agregados insolubles:

Cuerpos de inclusin
La formacin de agregados puede deberse a
un plegamiento incorrecto

Cuerpos de inclusin: problema o ventaja?

Son agregados insolubles de protena desnaturalizada.
Su formacin depende de la naturaleza de la protena y su nivel de expresin.
Son fcilmente purificables (casi todo protena recombinante), pero para obtener
la protena hay que hacerlo en condiciones desnaturalizantes (urea 8M).

Cuerpos de inclusin de lactamasa en E. coli.

Soluciones a la formacin
de cuerpos de inclusin:

Protena de fusin con

tioredoxina (soluble)

Protena de fusin con

pptido seal, por ej.
de la fosfatasa
alcalina (periplasma)

Tratamiento con
agentes caotrpicos
(urea, cloruro de
guanidinio)

Las fusiones permiten:

Fcil y rpida purificacin de la protena expresada en bacterias,
basada en las propiedades del Tag (cromatografa de afinidad, anticuerpos).

M: marker
L: lisado de bacterias
F: percolado
E: eludo

Las fusiones permiten:

Direccionar la localizacin de protenas de fusin en bacterias:
Periplasma: fcil purificacin, pocas protenas contaminantes, ambiente
favorable para el buen plegamiento y la formacin de puentes disulfuro.
Secrecin al medio: pocas protenas contaminantes, fcil purificacin.
Aumentar la solubilidad de las protenas de fusin.
Caracterizacin de protenas (principalmente en interacciones protena:protena;
ensayo de doble hibrido, GST-pull down, co-inmunoprecipitacin).

Localizacin de protenas en clulas eucariotas por fusin a protenas o Tags

fluorescentes (microscopa de fluorescencia) o Tags contra los que hay
anticuerpos comerciales (inmunofluorescencia).

Clasificacin de Tags (muchos Tags cumplen ms de una funcin)

Por afinidad a un ligando (GST)
De purificacin

De purificacin
GST (Glutathione S-Transferase):
26 kDa, originalmente clonada del parsito Schistosoma japonicum. Muy fcil
purificacin. GST aumenta la solubilidad de la protena.

La protena de fusin
se purifica por
cromatografa de
afinidad usando
glutation inmobilizado
sobre agarosa.

Ventajas:
Elucin suave
Buen rendimiento
nico paso de purificacin

Desventaja:
solo puede realizarse en
condiciones nativas

Clasificacin de los Tags (muchos Tags cumplen ms de una funcin)

Por afinidad a un ligando (GST)
De purificacin

Por caractersticas qumicas del Tag (His-Tag).

De purificacin
His-Tag:
Tag lineal que contiene 4, 6 o 10 Histidinas consecutivas.
Es muy pequeo (menor a 1kDa).
Permite la purificacin an en condiciones desnaturalizantes (Urea 8M).
Se obtiene buen rendimiento de purificacin. nico paso de purificacin.
El Tag no interfiere con el plegamiento ni con la funcin de la protena.

Se purifican por IMAC

(Immobilized-metal affinity chromatography)
El His-Tag se une a cationes divalentes
(el ms usado es Ni2+) inmobilizados en la resina.
Se eluye compitiendo las histidinas con Imidazol
(residuo de la histidina
)

Purificacin en condiciones desnaturalizantes:

La protena expresada se aglutina en cuerpos de inclusin. Son agregados
insolubles que mayormente contienen la protena de inters. Pueden ser
disueltos usando detergentes suaves y UREA 8M, con la consecuente
desnaturalizacin de las protenas.

Esto puede ocurrir por:

Expresin muy alta de la protena de inters y que esta no se llegue a plegar

bien.

Protenas muy poco solubles, no solubles o que tengan pasos transmembrana

hidrofbicos.

Protenas que necesiten modificaciones post-traduccionales para su correcto

plegamiento.

De purificacin
His-Tag:
Esquema de purificacin:
Muy usado en expresin en bacterias.
Las resinas son reusables.
Alto rendimiento.

Clasificacin de los Tags (muchos Tags cumplen ms de una funcin)

Por afinidad a un ligando (GST)
De purificacin

Por caractersticas qumicas del Tag (His-Tag).

Por anticuerpos comerciales (T7, FLAG, HA, C-Myc, etc)

Purificacin por anticuerpos comerciales sobre tags cortos:

T7-Tag: derivado del gen 10 del fago T7 que es la protena ms abundante del
fago. Secuencia: MASTGGQQMG
FLAG: pptido comercial muy inmunognico. Secuencia: DYKDDDDK
HA-Tag: residuos 98-106 del la hemaglutinina del virus de influenza humano.
Secuencia: YPYDVPDYA
C-Myc: residuos 408-439 del producto del oncogen c-myc humano.

Todos estos Tags pueden usarse para purificar las protenas tanto de bacterias
como de clulas eucariotas transfectadas, usando anticuerpos comerciales. No
es lo ms recomendable en bacterias en el caso de poder usar fusiones a GST
o HIS-Tag.

Clasificacin de los Tags (muchos Tags cumplen ms de una funcin)

Por afinidad a un ligando (GST)
De purificacin

Por caractersticas qumicas del Tag (His-Tag).

Por anticuerpos comerciales (T7, FLAG, HA, C-Myc, etc)

De localizacin en bacterias

Secuencias de localizacin periplsmica

(mejora el plegamiento por favorecer
formacin de S-S).
Secuencias que permiten la secrecin al
medio de cultivo (fcil purificacin).

De aumento de solubilidad

NusA. Es una de las protenas ms solubles

conocidas.

Localizacin de protenas

GFP, DsRed.
Anticuerpos comerciales contra Tags (FLAG, HA,
c-Myc, T7) por inmunofluorescencia.

Localizacin de protenas
GFP (Green Fluorescent Protein):
Proviene de la medusa Aequorea victoria.
GFP es una protena muy estable de 238 aa.
Cuando se expresa en clulas eucariotas o procariotas,
y es iluminada por luz azul o UV, emite fluorescencia verde brillante
(energa de una fuente lumnica es absorbida y reemitida).
La fluorescencia de GFP es independiente de la especie que la expresa, no
necesita cofactores, sustratos u otros productos gnicos de A. victoria.
Ampliamente usada como protena de fusin o gen reportero.

Hay variantes de GFP logradas por mutaciones puntuales.

Localizacin de protenas
GFP (Green Fluorescent Protein):
Puede usarse para taguear protenas individuales en clulas vivas, y hasta 2
o ms protenas distintas en una misma clula con las variantes de GFP.
No modifica la localizacin de su protena partner.
Usada en todos los organismos, desde levaduras hasta mamferos.

Protena de fusin
expresada en levaduras

Ratones que expresan GFP

en todas sus clulas

Localizacin de protenas
DsRed (Protena Roja Fluorescente):
Proviene del coral de arrecife Discosoma sp.
Muy usado ltimamente como marcador de clulas y como tag de fusin.
Comparte las mismas caractersticas con GFP.
A travs de mutaciones en la secuencia de AA se han podido crear variantes
de absorcin y emisin muy tiles para usar ms de un tag por clula.

mHoneydew mBanana mOrange tdTomato mTangerine mStrawberry mCherry

Localizacin de protenas

Tags cortos contra los que existen anticuerpos comerciales:

Inmunofluorescencia indirecta:
FLAG, HA,
c-Myc, T7

1. Anticuerpo primarios (mAb)

2. Anticuerpo secundarios conjugados a fluorforos

Permiten ver localizacin subcelular de protenas fusionadas a estos Tags

(solo en clulas fijadas = MUERTAS); los anticuerpos deben ser introducidos
dentro de las clulas).

Volviendo a las protenas recombinantes...

Muchas veces se necesita eliminar el Tag de la protena de inters

Corte de los Tags

secuencia de clivaje por proteasas includa

Obtencin de la estructura primaria nativa de la protena por corte

con una proteasa. Secuencia de clivaje entre el Tag y la protena de inters.

TAG

PDI

Esquema de obtencin de protenas nativas clivadas del Tag