UNIVERSIDAD DEL CAUCA

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS Y DE LA

EDUCACIN
DEPARTAMENTO DE QUMICA
LABORATORIO DE BIOQUMCA I: BIOMOLECULAS
Elaborado por: Brandon Rosero Lpez (brosero@unicauca.edu.co)

Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin

cualitativa de Casena.
1. Objetivos.

Determinar la concentracin de muestras problemas y muestras conocidas a partir

de una curva de calibracin
Realizar el procedimiento de separacin de la casena segn su punto isoelctrico.

2. Resultados
Concentracin

Absorbancia 1

Absorbancia 2

Absorbancia 3

0
10
20
30
40
50

0,000
0,011
0,017
0,029
0,03
0,036

0,00
0,007
0,012
0,02
0,025
0,031

0,00
0,013
0,017
0,019
0,024
0,032

Tabla 1. Resultados de la curva de calibracin de Albmina para la primera sesin sin

Lowry, cada Absorbancia fue tomada por diferentes grupos a 280 nm.
Concentracin

Absorbancia 1

Absorbancia 2

Absorbancia 3

0
10
20
30
40
50

0,000
0,009
0,012
0,015
0,024
0,026

0,000
0,18
0,008
0,016
0,3
0,052

0,000
0,002
0,023
0,09
0,011
0,035

Tabla 2. Resultados de la curva de calibracin de Albmina para la primera sesin con

Lowry con un tiempo de reaccin de 10 min. Cada Absorbancia fue tomada por diferentes
grupos a 760 nm.

Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .

Concentracin

Absorbancia 1

Absorbancia 2

0
10
20
30
40
50

0,000
0,003
0,006
0,008
0,011
0,012

0,000
0,004
0,007
0,008
0,011
0,013

Tabla 3. Resultados de la curva de calibracin de Casena para la primera sesin sin

Lowry. Cada Absorbancia fue tomada por diferentes grupos
Concentracin

Absorbancia 1

Absorbancia 2

Absorbancia 3

0
10
20
30
40
50

0,000
-0,026
-0,026
-0,015
-0,028
0,012

0,000
0,002
0,003
0,005
0,010
0,042

0,000
-0,027
-0,028
-0,028
-0,018
-0,010

Tabla 4. Resultados de la curva de calibracin de Casena para la primera sesin con

Lowry con un tiempo de reaccin de 10 min. Cada Absorbancia fue tomada por diferentes
grupos.
Concentracin Absorbancia 1 Absorbancia 2
0
50
100
150
200
250

0,000
0,049
0,080
0,115
0,147
0,183

0,000
0,033
0,071
0,104
0,136
0,170

Tabla 5. Resultados de la curva de calibracin de Albmina para la segunda sesin sin

Lowry. Cada Absorbancia fue tomada por diferentes grupos
Concentracin

Absorbancia 1

Absorbancia 2

0
50
100
150
200
250

0,000
-0,007
0,058
0,121
0,198
0,202

0,000
0,056
-0,016
0,002
0,028
0,196

Tabla 6. Resultados de la curva de calibracin de Albmina para la segunda sesin con

Lowry un tiempo de reaccin de 10 min.

Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .

Concentracin

Absorbancia 1

Absorbancia 2

0
50
100
150
200
250

0,000
-0,004
0,074
0,128
0,217
0,238

0,000
0,050
-0,010
-0,002
0,047
0,236

Tabla 7. Resultados de la curva de calibracin de Albmina para la segunda sesin con

Lowry un tiempo de reaccin de 30 min. Las absorbencias fueron tomadas por diferentes
grupos
Concentracin Absorbancia 1 Absorbancia 2
0
50
100
150
200
250

0,000
0,044
0,020
0,127
0,163
0,198

0,000
0,029
0,082
0,117
0,155
0,200

Tabla 8. Resultados de la curva de calibracin de Casena para la segunda sesin sin

Lowry, cada Absorbancia fue tomada por diferentes grupos.
Concentracin

Absorbancia 1

Absorbancia 2

0
50
100
150
200
250

0,000
0,013
0,089
0,091
0,148
0,182

0,000
-0,03
0,025
0,043
0,131
0,158

Tabla 9. Resultados de la curva de calibracin de Casena para la segunda sesin con

Lowry y un tiempo de reaccin de 10 min, cada Absorbancia fue tomada por diferentes
grupos.
Concentracin

Absorbancia 1

Absorbancia 2

0
50
100
150
200
250

0,000
0,050
0,075
0,110
0,185
0,244

0,000
0,018
0,077
0,108
0,118
0,160

Tabla 10. Resultados de la curva de calibracin de Casena para la segunda sesin con
Lowry y un tiempo de reaccin de 30 min, cada Absorbancia fue tomada por diferentes
grupos.

Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .

Muestra
Albumina de huevo
Desconocida

Absorbanci
a sin
Lowry
-----

Absorbancia
con
Lowry 10 min
0,904
1,683

Absorbancia
con Lowry 30
min
-----

Tabla 11. Resultados para las muestras de Albmina, cada muestra fue tratada por
diferentes grupos, para la primera sesin.
Muestra
Casena 1
Casena 2

Absorbanci
a sin
Lowry
-----

Absorbancia
con
Lowry 10 min
0,018
0,088

Absorbancia
con Lowry 30
min
-----

Tabla 12. Resultados para la muestra de Casena cada muestra fue tratada por diferentes
grupos, para la primera sesin.
Muestra

Absorbanci
a sin
Lowry

Absorbancia
con
Lowry 10 min

Absorbancia
con Lowry 30
min

Muestra problema 1
(slida)
Muestra problema 2
(liquida)
Albmina de Huevo

0,067

0,016

-0,001

0,142

0,115

0,133

0,106

0,112
0,105

Tabla 13. Resultados para las muestras de Albmina, cada muestra fue tratada por
diferentes grupos, para la segunda sesin
Muestra

Absorbanci
a sin
Lowry

Absorbancia
con
Lowry 10 min

Absorbancia
con Lowry 30
min

Casena con grasa

Casena sin grasa

0,129
0,135

-0,014
-0,052

-0,031
0,013

Tabla 14. Resultados para las muestras de Casena cada muestra fue tratada por diferentes
grupos, para la segunda sesin

Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .

3. Anlisis y resultados.
La determinacin de la concentracin de protenas es comn en los laboratorios. Existen
diversos mtodos para dicha operacin, entre ellos podemos encontrar el mtodo de Biuret,
el mtodo de Azul de Coomasie, el mtodo de Lowry, cada uno tiene una determinada
sensibilidad, pero este ltimo (Lowry) combina el reactivo de Biuret y el reactivo de Folin,
lo que proporciona una mejor sensibilidad al mtodo.
En general el mtodo se desarrolla en unos determinados pasos estandarizados, se inicia
con la fabricacin de una curva de calibracin, para ello es necesario la utilizacin de un
patrn, en nuestro caso se utilizaron 2 patrones, primero la Albumina y la segundo la
casena, posteriormente se realiza una lectura en el espectrofotmetro el cual arrojara un
valor determinado de absorbancia de cada patrn, finalmente con el previo tratamiento de la
muestras problemas se realiza la lectura de absorbencias, las cuales con la ayuda de la
ecuacin de las curvas de calibracin se determina su concentracin.
Las reacciones qumicas ocurridas en la experimentacin se presentan y se describen a
continuacin. El mtodo de Lowry inicia con la adicin del reactivo de Biuret a las
muestras a trabajar, el reactivo de Biuret est compuesto por una disolucin bsica de
sulfato de cobre (CuSO4) lo cual permite la formacin de un complejo organometlico
donde el centro metlico ser el Cu2+, los pares electrnicos presentes en los tomos de
Nitrgeno se coordinan al centro metlico, adems debido a la geometra plana del enlace
peptdico y la tetrahdrica del carbono , los cuatro enlaces coordinados entre los
nitrgenos y catin cobre (II) solo es posible si en la cadena de -aminocidos existen dos,
tres o ms enlaces peptdicos segn se trate de una estructura hlice o plegada de la
protena. La coordinacin de los cationes cobre (II) se repite sistemticamente a lo largo de
todo la estructura de cadena proteica. El medio bsico en el cual est presente el Sulfato de
Cobre, permite la formacin de hidrxido de cobre (Cu(OH) 2) el cual se disocia como Cu2+
y 2OH-, por lo tanto hay iones cpricos presentes en solucin acuosa para poder reaccionar,
adems de ello evita la reduccin a Cobre (I).

Figura 1. Reaccin del reactivo de Biuret con los enlaces peptdicos.

Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .

Para aumentar la sensibilidad de la reaccin de Biuret, el complejo protena-Cu 2+ se hace

reacciona con el reactivo de Filon- Ciocalteus, dando una coloracin azul, con un mximo
de absorcin de 650 nm [1]. Esta coloracin se atribuye a la reduccin del cido
fosfomolibdico / fosfotungstico a azul de heteropolimolibdeno de composicin no definida
por medio de los residuos tirosilos, triptofanilos, ye una menor grado, cistenilos e histidilos
de la protena que forman complejo con Cu2+ [2]. Unas determinadas caractersticas del
mtodo de Lowry son la intensidad de la coloracin, que vara con la composicin de
aminocidos de de la protena, es ms sensible que el mtodo de Biuret. El rango es de 0,11 mg/mL. [2] la reaccin de Lowry se puede represar mediante el siguiente esquema (figura
2).

Figura 2. Esquema para la reaccin de Lowry.

La experimentacin para esta prctica se realiz en dos sesiones en la primera sesin no se
obtuvieron los resultados esperado, debido a una serie de errores experimentales cometidos
por cada grupo de trabajo, uno de ellos fue el no desengrasado de las muestras de casena,
la cual se extrajo en funcin del punto isoelctrico, otro error que se cometi fue el tiempo
de reaccin para Lowry, cada grupo no se sincronizo para poder obtener un buen resultado,
los valores obtenidos en esta sesin se reportaron en las tablas 1, 2, 3, 4, 11 y 12.
Se tom un rango de concentraciones para las curvas de calibracin de 0 a 50 ppm, que es
un rango muy pequeo para las muestras, en las figuras 3 se representan las curvas de
calibracin realizadas para la albmina (tabla 1) en donde la absorbancia 2 corresponde la
tomada por mi grupo. Se realiz una comparacin entre etas tres grficas y se obtiene que
la mejor grafica para representativa es la que nosotros realizamos debido a que el
coeficiente de Pirson (R2) posee una mayor linealidad que las dems (ver tabla 15).
Coeficiente de
Pearson ( R2)
Ecuacin de la
recta

Absorbancia 1

Absorbancia 2

Absorbancia 3

0,957

0,997

0,934

y=0,000711 x + 0,002714

y= 0,000602x+ 0,000333

y= 0,000557+
0,00357

Tabla 15. Coeficientes y ecuaciones de las rectas representadas en la figura 3.

Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .

0.04
0.04
0.03
Aborbancia 1

0.03
Absorbancia

Linear (Aborbancia 1)

0.02

Absorbancia 2

0.02

Linear (Absorbancia 2)

0.01

Linear (Absorbancia 2)
Aborbancia 3

0.01

Linear (Aborbancia 3)

0
0

10

20

30

40

50

60

Concentracion / ppm

Figura 3. Comparacin entre las curvas de calibracin para la tabla 1.

A las mismos patrones se les adiciono el reactivo de Lowry que se tom un tiempo de
reaccin aproximadamente durante 10 minutos, los resultado de esta parte de la
experimentacin se consignan en la tabla 2. Se procedi a graficar los datos obtenidos para
cada grupo, la grfica 4 refleja los datos presentes en la tabla 2. La absorbancia 2
corresponde a la tomada por nuestro grupo.
0.1
0.09
0.08
0.07
0.06
Absorbancia

Absorbancia 1
Linear (Absorbancia 1)

0.05
0.04
0.03

Absorbancia 2
Linear (Absorbancia 2)
Linear (Absorbancia 2)

0.02
0.01

Absorbancia 3
Linear (Absorbancia 3)

0
0

10

20

30

40

50

60

Concentracion / ppm

Figura 4. Comparacin de las curvas de calibracin para la tabla 2.

Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .

Si comparamos estas tres curvas de calibracin la mejor se para figura 4 (ver tabla 16) se
puede observar que la curva de absorbancia 1 posee mejor linealidad que las dems por lo
tanto es la mejor
Coeficiente de
Pearson ( R2)
Ecuacin de la
recta

Absorbancia 1

Absorbancia 2

Absorbancia 3

0,964

0,783

0,182

y = 0,000509x + 0,001619

y = 0,000869x - 0,001048

y = 0,000769x + 0,007619

Tabla 16. Coeficientes y ecuaciones de las rectas representadas en la figura 4.

La muestra para la curva de calibracin de Casena se realiz por diferentes grupos en
donde como patrn primario se utiliz casena con un buen porcentaje de pureza, en la tabla
3 se representan las absorbancias de cada concentracin obtenida, se representaron las
grficas correspondiente en la figura 5, en la tabla 17 se especifica las caractersticas de la
figura 5.
0.01
0.01
0.01
0.01
Absorbancia

Absorbancia 1
Linear (Absorbancia 1)

0.01

Absorbancia 2
Linear (Absorbancia 2)

Linear (Absorbancia 2)
0
0
0

10

20

30

40

50

60

Concentracion / ppm

Figura 5. Comparacin de las curvas de calibracin para la tabla 3.

Coeficiente de
Pearson ( R2)
Ecuacin de la

Absorbancia 1
0,984

Absorbancia 2
0,975

y = 0,000246x + 0,000524

y = 0,000249x + 0,000952

Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .

recta
Tabla 17. Coeficientes y ecuaciones de las rectas representadas en la figura 5.
Segn la figura 5 y la tabla 17 la mejor linealidad la representa la absorbancia 1. A los
patrones se les adiciono Lowry y se dej reaccionar durante 10 min y se obtuvieron los
datos que estn consignados en la tabla 4, se compararon estos datos con una grfica que se
representa en la figura 6 y las caractersticas de las grficas se representan en la tabla 18.
0.05
0.04
0.03
0.02
Absorbancia

Absorbancia 1

0.01

Linear (Absorbancia 1)
Absorbancia 2

0
-0.01

10

20

30

40

50

60

Linear (Absorbancia 2)
Absorbancia 3

-0.02

Linear (Absorbancia 3)

-0.03
-0.04
Concentracion / ppm

Figura 6. Comparacin de las curvas de calibracin para la tabla 4.

Coeficiente de
Pearson ( R2)
Ecuacin de la
recta

Absorbancia 1
0,0445

Absorbancia 2
0,631

Absorbancia 3
0,011

y = 0,000186x - 0,018476

y = 0,000674x - 0,006524

y = -0,000066x - 0,016857

Tabla 18. Coeficientes y ecuaciones de las rectas representadas en la figura 6.

La grafica que posee mayor linealidad es la de absorbancia 2.
En la segunda sesin se lleg a un acuerdo por cada grupo en donde se acord una mejor
sincronizacin, un desengrasado de muestra de casena, y la correccin para la
concentraciones de la curva de calibracin, los resultados obtenidos en esta sesin se
consignaron en las tablas 5,6, 7, 8, 9 y 10. Ahora se proceder de la misma manera para
graficar y comparar los resultados de diferentes grupos, y posteriormente a este se comparar
los datos de la primera sesin con los de la segunda sesin.
Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .

La grafica 7 muestra la comparacin de los resultados de la tabla que corresponde a la

curva de calibracin de la Albmina, en la tabla 19 se representa las caractersticas de la
figura 7. Cabe resaltar que la absorbancia fue tomada por nuestro grupo
0.2
0.18
0.16
0.14
0.12
Absorbancia

Absorbancia 1

0.1

Linear (Absorbancia 1)

0.08

Absorbancia 2

0.06

Linear (Absorbancia 2)

0.04
0.02
0
0

50 100 150 200 250 300

Concentracio / ppm

Figura 7. Comparacin de las curvas de calibracin para la tabla 5. Albumina sin Lowry
segunda sesin.
Coeficiente de
Pearson ( R2)
Ecuacin de la
recta

Absorbancia 1
0,995

Absorbancia 2
0,999

y = 0,000711x + 0,006810

y = 0,000681x + 0,000524

Tabla 19. Coeficientes y ecuaciones de las rectas representadas en la figura 7.

Se concluye que la grfica Absorbancia 2 posee mayor linealidad. Se adicionaron a los
patrones el reactivo de Lowry y se tom un tiempo de reaccin de 10 minutos, estos datos
estn consignados en la tabla 6, la figura 8 y la tabla 20 representan las caractersticas de las
grficas.

Coeficiente de
Pearson ( R2)
Ecuacin de la
recta

Absorbancia 1
0,935

Absorbancia 2
0,387

y = 0,000965x - 0,025238

y = 0,000522x - 0,020952

Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .

Tabla 20. Coeficientes y ecuaciones de las rectas representadas en la figura 8.

0.25
0.2
0.15
Absorbancia

Absorbancia 1

0.1

Linear (Absorbancia 1)
Absorbancia 2

0.05

Linear (Absorbancia 2)

0
0 50 100150200250300
-0.05
Concentracion / ppm

Figura 8. Comparacin de las curvas de calibracin para la tabla 6. Albmina con Lowry
con 10 min de reaccin, segunda sesin.
La grafica absorbancia 1 posee la mejor linealidad. Se tom un tiempo de reaccin de 30
minutos los resultados estn consignados en la tabla 7, se compararon las dos absorbancias
tomadas y estas se presentan en la figura 9 y en la tabla 21.
0.3
0.25
0.2
0.15

Absorbancia 1

Absorbancia
0.1

Linear (Absorbancia 1)

0.05

Linear (Absorbancia 2)

Absorbancia 2

0
0

100

200

300

-0.05

concentracion / ppm

Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .

Figura 9. Comparacin de las curvas de calibracin para la tabla 7. Albmina con un

tiempo de reaccin de 30 min, segunda sesin.

Coeficiente de
Pearson ( R2)
Ecuacin de la
recta

Absorbancia 1
0,9525

Absorbancia 2
0,4582

y = 0,0011x - 0,0274

y = 0,0007x - 0,0307

Tabla 21. Coeficientes y ecuaciones de las rectas representadas en la figura 9.

Para la curva de calibracin de la casena se tomaron las mismas concentraciones y se
prepararon los patrones, primero se midieron las absorbancias sin Lowry estos datos se
consignaron en la tabla 8, se representaron los datos en la figura 10 y las caractersticas de
estas se representaron en la tabla 22.
0.25

0.2

0.15
Absorbancia 1

Absorbancia

Linear (Absorbancia 1)

0.1

Absorbancia 2
Linear (Absorbancia 2)

0.05

0
0

50 100 150 200 250 300

Concentracion / ppm

Figura 10. Comparacin de las curvas de calibracin para la tabla 8. Casena sin Lowry,
segunda sesin.

Coeficiente de
Pearson ( R2)
Ecuacin de la
recta

Absorbancia 1
0,903

Absorbancia 2
0,996

y = 0,0008x - 0,0119

y = 0,0008x - 0,0038

Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .

Tabla 22. Coeficientes y ecuaciones de las rectas representadas en la figura 10.

De la misma manera se representaron los valores de la tabla 9 que corresponden a un
tiempo de reaccin de 10 minutos.
0.2

0.15

0.1
Absorbancia 1

Axis Title

Linear (Absorbancia 1)

0.05

Absorbancia 2
Linear (Absorbancia 2)

0
0

50 100 150 200 250 300

-0.05

Axis Title

Figura 11. Comparacin de las curvas de calibracin para la tabla 9, Casena con un
tiempo de reaccin de 10 min, segunda sesin.
Coeficiente de
Pearson ( R2)
Ecuacin de la
recta

Absorbancia 1
0,960

Absorbancia 2
0,8603

y = 0,0008x - 0,0069

y = 0,0007x - 0,0377

Tabla 23. Coeficientes y ecuaciones de las rectas representadas en la figura 11.

Para un tiempo de reaccin de los patrones con casena de 30 minutos los datos obtenidos
se representan en la tabla 10, se graficaron los datos (figura 12) y las caractersticas se
representaron en la tabla 24.

Coeficiente de
Pearson ( R2)
Ecuacin de la
recta

Absorbancia 1
0,972

Absorbancia 2
0,968

y = 0,0009x - 0,0079

y = 0,0006x - 0,0006

Tabla 24. Coeficientes y ecuaciones de las rectas representadas en la figura 12.

Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .

0.3
0.25
0.2

Absorbancia

0.15

Absorbancia 1
Linear (Absorbancia 1)

0.1

Absorbancia 2
Linear (Absorbancia 2)

0.05
0
0

50 100150200250300

Concentracion / ppm

Figura 12. Comparacin de las curvas de calibracin para la tabla 10. Casena con Lowry
con un tiempo de reaccin de 30 min, segunda sesin.
En comparacin de las dos sesiones de trabajo en la segunda sesin se obtuvo un resultado
mejor, debido a que se tuvo un mayor cuidado de trabajo, se tomaron las mejores graficas
de cada sesin teniendo en cuanta el coeficiente de Pearson que se encuentran en las
respectivas tablas para cada grficas y se compararon en las figuras 13,14 y 15 y16, no se
puedo comparar los tiempos de reaccin de 30 min debido a que solo se realiz una vez, en
la segunda sesin, pero si se observan sus respectivos coeficientes de Pearson hay unas
absorbancias que poseen mayor linealidad.
0.18
R = 1

0.16
0.14
0.12
0.1

Absorbancia 0.08

R = 1

Primera sesion
Linear (Primera sesion)

0.06

Segunda sesion

0.04

Linear (Segunda sesion)

0.02
0
0

50 100 150 200 250 300

Concentracion / ppm

Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .

Figura 13. Comparacin de las curvas de calibracin de la primera y la segunda sesin

para la Albmina sin Lowry.
0.25
R = 0.94

0.2
0.15

Absorbancia

Segunda sesion

0.1

Linear (Segunda sesion)

R = 0.96

0.05

Primera sesion
Linear (Primera sesion)

0
0

50 100 150 200 250 300

-0.05

Concentracion / ppm

Figura 14. Comparacin de las curvas de calibracin de la primera y la segunda sesin

para la Albmina con Lowry y 10 min de reaccin.
0.25

0.2
R = 1
0.15
Primera sesion

Axis Title

Linear (Primera sesion)

0.1

Segunda sesion
Linear (Segunda sesion)

0.05
R = 0.98

0
0

50 100 150 200 250 300

Axis Title

Figura 15. Comparacin de las curvas de calibracin de la primera y la segunda sesin

para la Casena sin Lowry

Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .

0.2
0.18

R = 0.96

0.16
0.14
0.12

Absorbancia

0.1

Primera sesion
Linear (Primera sesion)

0.08

Segunda sesion

0.06

Linear (Segunda sesion)

0.04

R = 0.63

0.02
0
0

50

100 150 200 250 300

Concentracion / ppm

Figura 16. Comparacin de las curvas de calibracin de la primera y la segunda sesin

para la Casena con Lowry y un tiempo de reaccin de 10 min.
La comparacin de los trabajos realizados en la primera y la segunda sesin permiten
observa la gran diferencia existente, anteriormente se han nombrado alguno problemas que
fueron corregidos para poder obtener un mejor resultado el cual es muy evidente, adems se
puede observar que una curva de calibracin sirve siempre y cuando en el lote de trabajo
los paramentos utilizados sean constantes, en otras palabras que no cambien ningn
reactivo, o algn paso de la experimentacin, o la calibracin del espectrofotmetro y hasta
los experimentadores.
Se define sensibilidad como la pendiente de la curva de calibracin de inters, esta
definicin aceptada por la IUPAC [1], aunque esta tambin est dada por los lmites de
deteccin y los lmites de cuantificacin, en la tabla 25 se comparan las pendientes de las
rectas de las grficas de la segunda sesin de trabajo.
Si se observa las pendientes que corresponden a la adicin de Lowry poseen un mayor
grado de sensibilidad, que es el resultado esperado.
Muestra
Albmina
Casena

Sin Lowry
0,000681
0,00080

10 min con Lowry

0,000965
0,00080

30 min con Lowry

0,0011
0,0009

Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .

Tabla 25. Comparacin de la sensibilidad de las curvas de calibracin realizadas en la

segunda sesin, se tomaron las pendientes de las mejores curvas de calibracin segn el
parmetro de coeficiente de Pearson
Las muestras estudiadas se reportan en las tablas 13 y 14, el tratamiento preliminar de las
muestras se realizaron de la siguiente manera. Las muestras correspondientes a la tabla 13
fueron slida y liquida, la muestra slida correspndete a leche en polvo se llev a una
concentracin de 800 ppm, en donde se diluyeron 0,2 g en 250 mL de agua, despus se
tom 2 mL y se aforo a 25 con agua, con la muestra liquida (muestra problema 2) se
realizaron diluciones se tomaron 2 mL y se aforaron a 25 mL de agua, la muestra de
albumina de huevo se prepar tomando el volumen total de la clara del huevo la que se
diluyo en 250 mL de agua, posteriormente se centrifugo para poder eliminar suspensiones
espumosas que podran actuar como interferencia en la medida, Las muestras reportadas en
la tabla 14 se prepararon de la siguiente manera, La muestra correspondiente a la casena
con grasa se prepar a partir de 500 mL de leche, en donde se llev a un pH entre 4-5
unidades con cido ctrico (limn) para realizar la separacin en funcin del pI (presencia
del Zwiterion), la mezcla se dej reposar durante 1 da, posteriormente se centrifugo 5
veces y se elimin el lquido sobrenadante separando la muestra slida el cual se lav con
agua y para as garantizar la eliminacin de partculas de cido ctrico, se sec la casena
en la estufa a una temperatura de 55-70 C, de aqu despus del secado se tomaron 0,1 g de
casena y se aforo a 250 mL con agua (400 ppm), parte de la muestra de casena se extrajo y
se realiz un proceso de desengrasado, se adiciono etanol lo que garantizaba esto, y as
evitar un reporte errneo de la medida de la absorbancia, se tomaron 0,01 g y se aforaron
con agua a 100 mL (100 ppm).
Con la ayuda de las ecuaciones de las mejores curvas de calibracin para la albmina y la
casena se proceder a calcular la concentracin de las muestras problemas (tabla 13 y 14).
Para la albmina las mejores rectas se pueden observar en las tablas 19, 20 y 21, cuyas
graficas corresponden a las figuras 7,8 y 9 respectivamente.
Para la muestra problema 1 (tabla 13) cuya absorbancia sin el reactivo de Lowry es 0,067 y
y=0,000681 x+ 0,000524
ecuacin de curva de calibracin es
se calcula la
concentracin de la siguiente manera:
Primero la variable independiente x representa la concentracin (ppm) y la Variable
dependiente y representa la Absorbancia, por ende si despejamos x de la ecuacin de la
recta podemos encontrar el valor de la concentracin de la muestra que ha absorbido un una
determinada longitud de onda.
y
x= b
(1)
m
En donde m es la pendiente de la recta y b es el intercepto.
Ahora reemplazamos cada valor en (1) y se obtiene
Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .

x=

0,067
0,000524=98,38 ppm
0,000681

Se procede de la misma manera para cada valor correspondiente de la tabla 13 y 14 con su

respectiva ecuacin de recta y se genera la tabla 26.

Muestra
Muestra problema 1
(slida)
Muestra problema 2
(liquida)
Albmina de Huevo
Casena grasosa
Casena sin grasa

Concentracin (ppm)
0 min
10min
30 min
98,38
16,61
-0,882
208,52

119,20

101,85

195,30
161,26
166,26

150,94
-17,50
-64,50

95,48
-34,44
14,45

Tabla 26. Resultado de las concentraciones en ppm para cada muestra problema tratada
Los resultados obtenidos no fueron los esperados, las inconsistencias corresponden a
determinados errores, si se observa en las tablas 13 y 14 hay absorbancias con valores
negativos, en la literatura se encontr que este tipo de errores se deben a cuatro tipos de
posibles causas [3], la primera es la no presencia de muestra en la celda, una segunda causa
es la mala insercin de la celda en el equipo, una tercera causa puede ser una seleccin
errnea de la longitud de onda, una cuarta causa es la calibracin errnea del
espectrofotmetro, cada una de estas causa tiene una posible solucin por ejemplo para la
tercera causa se debe ajustar la longitud de onda al rango compatible con el anlisis, en
nuestro caso se realiz la medicin a sus respectivas longitudes de ondas para generar la
mxima absorcin de la muestra, para la reaccin sin Lowry fue 280 y para las reacciones
con Lowry fue 760, que coinciden con los valores tericos reportados [4], algunas muestras
presentaron una absorcin mucho menor a las del rango permitido, haciendo que estas
absorbancias este por debajo del lmite de deteccin (intercepto de la recta en el eje de las
ordenadas) ; Se podra pensar en una interpolacin de la recta para permitir que la
absorbancia caiga dentro de la curva de calibracin, pero analticamente no se puede
realizar ya que la curva de calibracin es una parte de una curva, adems los lmites de
deteccin y cuantificacin dela curva de calibracin obtenida segn los parmetros
obtenidos se vera afectados y la desviacin estndar de estos aumentara por ende el error
tambin aumentara, otro posible error es el error Humano, ya que las muestras problemas
fueron tratadas por diferentes personas, y es sabido que cada persona tiene un determinado
error de trabajo. La concentracin de la muestra total es posible calcular a partir de las
concentraciones obtenidas por la absorbancia, si se hace una relacin entre la concentracin
Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .

obtenida a unos determinados gramos o mL trabajos con el peso o volumen total de la

muestra.
Ahora enfaticemos un poco sobre la extraccin de la casena, es sabido que la leche posee
diversas protenas de las cuales la casena es la ms abundante representando ms de 80%
de contenido total de protenas. Las casenas de la leche tienen pesos moleculares que
oscilan entre 25.000 y 40.000; las ms importantes son la , la y la , que representan,
respectivamente, el 50, 30 y 15% del total de las casenas. En la leche, estas protenas se
asocian entre s para formar micelas, que se encuentran estabilizadas y solubilizadas gracias
a la presencia de la casena , y del calcio [5] (ver figura 17).

Figura 17. Micelas de casena en la leche.

La propiedad caracterstica de la casena es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche
es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la casena cargada negativamente y solubilizada
como sal clcica. Si se aade cido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela
se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la protena neutra precipita

Figura 18. Reaccin para la extraccin dela casena.

Como recomendaciones para un mejor resultado en el trabajo se pueden enumerar:
1) Para generar un mejor resultado la extraccin de la casena se debe realizar con un
cido dbil y diluido para as garantizar un mejor control en el gradiente de pH
2) Si la absorbancia es mayor al lmite superior del rango de medida, siempre se puede
realizar la dilucin correspondiente para introducirla en el rango del mtodo. Pero si
Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .

3)
4)
5)
6)

es inferior al lmite de cuantificacin del mtodo seleccionado, hay que emplear un

mtodo ms sensible.
Para la determinacin de la absorbancia despus de la adicin del reactivo de
Lowry, se debera planear un mtodo para poder garantizar una sincrona en con el
tiempo de reacciones estimado
El desengrasado de la muestra de casena es importante para evitar interferencias, es
por ello que el lavado adecuado con etanol ayuda a reducir este inconveniente
Para el tratamiento de la muestra de albumina es necesario hacer un determinado
nmero de centrifugaciones para eliminar las interferencias posibles, estas con la
ayuda de la fuerza centrfuga pueden llevarse a la separacin de la disolucin.
Se deben tener en cuenta los parmetros que puedan generar un valor negativo en la
medida de absorbancia y solucionarlos de manera eficiente y precisa.
4. Conclusiones

La comparacin del trabajo de varios grupos pudo reafirmar que cada persona tiene
un determinado estilo de trabajo lo que es un parmetro importante al momento de
realizar un anlisis cuantitativo, adems es importante tener en cuenta que para un
determinado lote de muestras le corresponde una determinada curva de calibracin,
una determinada calidad de reactivo, adems una determinada especie de reactivos.

Las pendientes de cada una de las rectas son las sensibilidades de cada uno de los
mtodos, y sus valores tambin son los correspondientes coeficientes de absorcin
de los complejos protena-reactivo.

El mtodo de Lowry posee una mejor sensibilidad que el mtodo de Biuret, esto se
pudo comprobar con la sensibilidad ( pendiente de la recta segn la IUPAC) de cada
curva de calibracin realizada, adems el coeficiente de Person es un parmetro
lineal que garantiza la calidad y la generacin de resultados proporcionales a la
concentracin del analito en las muestras dentro de un determinado rango

La eliminacin de cualquier tipo de interferencias de las muestras de trabajo

garantizara un mejor reporte en el anlisis, adems si la absorbancia de la muestra
est dentro del rango de medida del mtodo seleccionado, mediante la ecuacin de
la recta de calibrado se puede calcular la concentracin de protena de la disolucin
problema.
5. Bibliografa

[1] Skoog A, Holler J, Crouch R. Principios de anlisis instrumental, 6

Cengage Learning Mexico D.F 2008, pg. 20.

ta

Ed, editorial:

[2] http://catedras.quimica.unlp.edu.ar/qo3/Apuntes/Proteinas.pdf (consultado 28/04/2013)

Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .

[3] http://www.bvsde.paho.org/bvsacd/cd29/laboratorio/cap11.pdf (consultado 11/05/2013)

[4] http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/MANUALDEBIOQUIMICAEXPERIMENTAL_12313.pdf
(Consultado 11/05/2013)
[5] http://www.uhu.es/480004034/documentos%20de%20texto/practicas/protocolo_practicas_alimentos_08_09.pdf
(Consultado 11/05/2013)

Determinacin cuantitativa de protenas y determinacin cualitativa de Casena .