UNIVERSIDAD DEL CAUCA

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS Y DE LA

EDUCACIN
DEPARTAMENTO DE QUMICA
LABORATORIO DE BIOQUMCA I: BIOMOLECULAS
Elaborado por: Brandon Rosero Lpez
Katerin Andrea Perafan Macas

Actividad de la amilasa salival

1. Objetivos.
Estudiar la actividad enzimtica de la amilasa salival a travs de diferentes
sustratos y condiciones del sistema.
2. Resultados

# Tubo

Enzima

1
2
3

Amilasa
Amilasa
Amilasa

Condiciones del
experimento
Enz calentada prev
Enzima nativa
Enzima nativa

Sustrato

Incubacin

Almidn
Almidn
Almidn

10 min, 37C
10 min, 37C
10 min, 0C

Coloracin
con yodo
Azul oscuro
Incoloro
anaranjado

Resultado
( + o -)
+
-

Tabla 1. Labilidad trmica de los enzimas

# Tubo

Enzima

pH del medio

Sustrato

Incubacin

1
2
3

Amilasa
Amilasa
Amilasa

5
6.8
8

Almidn
Almidn
Almidn

10 min, 37C
10 min, 37C
10 min, 37C

Coloracin
con yodo
Azul oscuro
Incoloro
Violeta

Resultado
( + o -)
+
-

Tabla 2.Influencia del pH sobre la actividad de los enzimas

# Tubo

Enzima

Sustrato

Incubacin

1
2
3
4

Amilasa
Sacarasa
Amilasa
Sacarasa

Almidn
Almidn
Sacarosa
Sacarosa

10 min, 37C
10 min, 37C
10 min, 37C
10 min, 37C

Coloracin
con yodo
Incoloro
Azul oscuro
---

Reaccin de
Fehling
--Azul claro
Caf

Resultado
( + o -)
+
+

Tabla 3.Especificidad de los enzimas

# Tubo
1:NaCl
2:CuSO4

Enzima
Amilasa
Amilasa

Sustrato
Almidn
Almidn

Incubacin
10 min, 37C
10 min, 37C

Coloracin con yodo

Amarillo plido
Azul oscuro

Resultado ( + o -)
+
-

Tabla 4.Influencia de los activadores e inhibidores

Como propuesta adicional para discutir si el NaCl es un activador o inhibidor se realiz el siguiente
procedimiento:
# Tubo
1: Blanco
2

Amilasa
(mL)
0,5
0,5

Almidn
(mL)
2
2

NaCl
(mL)
-0,5

Incubacin
No
No

Coloracin
con yodo
Azul oscuro
Azul oscuro

Actividad de la amilasa salival

0,1

0,5

No

Azul claro

Tabla 5.Resultados para la propuesta del NaCl

3. Anlisis de los resultados.

La saliva humana se caracteriza por ser un fluido que cumple con una variedad de
funciones en el organismo como la digestin, la lubricacin de los alimentos para permitir
un mejor transporte del bolo alimenticio, mantener el pH a un valor de 6,5 - 7,2
(aproximadamente) por lo que se dice que tiene capacidad de buffer [1], entre otras. La
composicin de la saliva se estima en un 99% de agua y en 1% de diferentes solutos, en
este 1% se encuentran importantes sustancias que se resumen en la tabla 6, cabe resaltar
que esta composicin de cada soluto no est reportada debido a que la saliva humana puede
variar su composicin de persona a persona debido a muchos factores.
Componentes

Observaciones
Iones tales como Na+, K+, Ca+, Cl-, F-, fosfatos,
Inorgnicos
bicarbonatos. Los iones cloruro activan la amilasa, y
los iones de calcio permiten una mejor digestin
Orgnicos
Urea, cido urnico, colesterol, cAMP, glucosa,
citrato lactato, amoniaco, creatinina, etc.
Proteicos y
Amilasa, mucinas, lisozimas, protenas acidicas ricas
glucoprotenas en prolina, cistatinas, histantinas, catalasas,
peroxidasas, lactoperoxidasas, dexosiribunocleasa,
fosfatasa acida, etc.
Tabla 6. Componentes del 1% del volumen total de la saliva [1], obsrvese la presencia de
amilasa, y adems algunas funciones de componentes inorgnicos.
La -amilasa es la responsable de la degradacin del almidn y del glucgeno presentes en
los alimentos, esta enzima acta sobre los enlaces 1-4 (ver figura 1), que unen a las
glucosas (enlaces glicosidicos) generando disacridos oligosacridos como la Maltosa,
Maltotriosas, etc. [2]

Figura 1. Estructura del almidn, los enlaces de coloracin azul corresponden a los
enlaces 1-4, los cuales sern romper por la alfa amilasa, generando disacrido de
maltosa (seccin punteada)
Actividad de la amilasa salival

Existen diversas reacciones cualitativas para poder identificar los carbohidratos presentes
en los productos finales despus del tratamiento con la amilasa salival, o de cualquier otro
tratamiento qumico, uno de los utilizados en la experimentacin es el relativo de lujo, que
es una solucin compuesta por una disolucin de yodo-yoduro de potasio, esta solucin
permite mantener al yodo en forma ionizada, y generar una especie I3-, el cual reacciona
con la amilosa que forma una espiral lineal, el I 3- se incrusta en ella dando una coloracin
(ver figura 2), azul, si el almidn est parcialmente hidrolizado la coloracin ser pardo
rojiza.

Figura 2. Incrustacin del yodo en la elice de la amilosa.

Otro mtodo utilizado es el del reactivo de Fehling. Si se calienta una suspensin de
hidrxido de cobre en solucin alcalina, se forma xido cprico de color negro, sin
embargo en presencia de sustancias reductoras, se precipita xido cuproso de coloracin
parada-orn:

En la prctica se utiliz un compuesto un azcar reductor (sacarosa), el cual debe dar

positivo para el reactivo de Fehling.
El fin de nuestro estudio es analizar y observar los cambios que sufre la actividad de la
amilasa cuando se vara alguno de los parmetros del sistema, los parmetros estudiados
son la labilidad trmica, influencia de pH, la especificidad de una enzima e influencia de
inhibidores y activadores. Iniciemos observando el parmetro de la labilidad trmica y as
sucesivamente en el orden anterior.
Es sabido que el aumento de la temperatura en una reaccin qumica proporciona una
mayor cintica en el sistema generando una mayor probabilidad de choques efectivos, lo
Actividad de la amilasa salival

que da como resultado una mayor velocidad en la reaccin, por cada 10 C de incremento
de en la temperatura la velocidad de reaccin se duplica [3], esta ley cintica es seguida
tambin por las enzimas en general, Sin embargo por ser protenas pueden sufrir una
desnaturalizacin por rompimiento de los enlaces de hidrogeno que mantienen la forma
nativa de las protenas, por lo que es necesario una temperatura optima que genere el mayor
efecto cintico, esto es una mayor actividad enzimtica, sin que haya una desnaturalizacin
de la enzima, este tipo de desnaturalizacin es irreversible; la disminucin de la
temperatura tambin ocasiona una desnaturalizacin pero esta es reversible, la cintica con
disminuye al igual que los choques efectivos que proporcionaran la reaccin qumica, por
lo que la actividad de la enzima tambin disminuye, pero no se suprime.
En la figura 3 se muestra un esquema en general de la temperatura ptima de una enzima, la
temperatura de desnaturalizacin reversible e irreversible.

Figura 3. Temperatura ptima, temperatura de desnaturalizacin reversible e irreversible.

Si se observa la tabla 1, se obtuvieron diferentes resultados para la variacin de la
temperatura, el tubo de ensayo 1 se someti a una temperatura alta (100 C) lo que conllevo
a la desnaturalizacin irreversible de la enzima por lo tanto una prdida total de su
actividad enzimtica, la coloracin presente fue azulada al momento de adicionar el
reactivo de Lugol por lo que se concluye la presencia de yodo, el tubo de ensayo 2 se
incubo a 37 C la cual se obtuvo como la temperatura ptima permitiendo que la actividad
enzimtica se mxima y as garantizar una ptima hidrlisis de los enlaces 1-4 del
almidn, al adicionar el reactivo de Lugol se obtuvo una solucin incolora, lo que indico
una hidrlisis total del almidn, si se observa la temperatura optima concuerda con la
temperatura corporal humana , tal vez se puede pensar que la temperatura optima est muy
relacionada con la adaptacin de la enzima con su medio (cuerpo humano), el tubo de
ensayo 3 se llev a una desnaturalizacin reversible disminuyendo su temperatura, al
adicionar Lugol se obtuvo una solucin parda rojiza, lo que indica una hidrlisis parcial del
almidn.
Las enzimas son protenas, y por lo tanto son polielectrolitos, como consecuencia de ello el
pH tiene un efecto importante sobre la velocidad de las reacciones enzimticas. La carga
Actividad de la amilasa salival

neta de las protenas varia con el pH, por esta razn a determinados valores las cargas de
los residuos de los aminocidos que participan en el sitio activo est en condiciones
ptimas para la actividad cataltica [4] .Por lo tanto a ese pH la velocidad de la reaccin ser
mxima si se toma esta variable como nica claro est. Por supuesto, en valores de pH
demasiados cidos o alcalinos, no solamente podr ser modificado el sitio activo, si no que
la estructura ternaria de toda la molcula se encontrara alterada e incluso puede llegar a
desnaturalizarse inhibindose la actividad enzimtica. Para cada enzima existe un pH
ptimo en relacin con la actividad, para la -amilasa el rango se encuentra entre 6,8-7,2[5]
pH optimo

pH

Figura 4. pH ptimo para la -amilasa

Los pH que se emplearon para determinar la influencia de este parmetro en la enzima
salival fueron 5, 6,8 y 8. Como ya se haba mencionado anteriormente se espera que los pH
extremos; es decir muy cidos o muy bsicos inactiven la enzima, cuando la -amilasa
entra en contacto con el almidn se produce la hidrolisis de este polisacrido a unidades de
azucares ms pequeas, al adicionar el reactivo de Lugol (que se utiliza como un test
colorimtrico que detecta el almidn), compuesta por con una solucin de iodo/ioduro de
potasio (I 2/KI) interacciona con el polisacrido formando un complejo en solucin que
adquiere una coloracin azul caracterstica cuando la actividad enzimtica no se lleva a
cabo completamente en las condiciones ptimas, en los tubos 1 y 3 esta coloracin se
observ pues en estas condiciones la -amilasa no hidroliza completamente al almidn,
contrariamente sucede cuando el pH es 6,8; procedimiento realizado en el tubo 2, dando
como resultado una solucin incolora por lo tanto se puede inferir que a este pH la enzima
presento su mejor actividad cataltica.
Una de las caractersticas ms importantes de los enzimas es su alta especificidad sobre la
reaccin que catalizan. Cada enzima cataliza un solo tipo de reaccin, y casi siempre acta
sobre un nico sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos. Esta especificidad se debe
a la complementariedad que debe existir entre el sustrato y el centro activo del enzima.
En la tabla 3 se puede observar claramente lo anteriormente enunciado, por ejemplo la
amilasa solo acta sobre almidn y la sacarasa (invertasa) sobre sacarosa, este tipo de
Actividad de la amilasa salival

especificidad es denominada especificidad de sustrato, lo que significa que casa enzima

slo puede actuar sobre un determinado sustrato o sobre un reducido nmero de sustratos.
La sacarasa es tambin llamada invertasa debido a que puede disociar a la sacarosa en sus
monmeros esenciales, glucosa y fructosa

Figura 5. Reaccin de inversin de la sacarosa en sus monmeros constituyentes

Como ya se ha anunciado anteriormente la coloracin azul oscuro para los tubos de ensayo
2 y 3 son negativos debido a la presencia de los sustratos en el medio.
La actividad de los enzimas est regulada tanto por su medio interno como externo; por
una serie de diferentes tipos de sustancias de bajo peso molecular que actan sobre la
enzima. Estas sustancias pueden causar efectos activadores, acciones que son llevadas a
cabo por algunas sustancias no proteicas como iones metlicos y algunos aniones. Otro
tipo de compuestos disminuyen la actividad por lo que se denominan inhibidores, pueden
alterar la conformacin de la enzima por lo tanto su actividad. Los iones cloruro hacen
parte la composicin salival, activan a la -amilasa ya que se introducen en su sitio activo
aumentando la actividad enzimtica.
Activadores
Cloruro
Yoduro
Bromuro
Nitratos

Inhibidores
Sales de Hg y Ag (plata)
Protena (germen del trigo)
---

Tabla 7. Algunos activadores e inhibidores que actan sobre la -amilasa

En la prctica se utiliz NaCl y CuSO 4 para determinar la influencia de los activadores e
inhibidores, en el tubo de ensayo 1 la actividad debera aumentar pues el ion cloruro es un
activador de la enzima, como respuesta a la prueba se obtuvo una solucin de tonalidad
amarilla, el resultado ideal es la obtencin de una solucin incolora por lo tanto se puede
concluir parcialmente que para este caso la adicin de la sal inica no activo
completamente a la enzima, en el tubo de ensayo 2 la coloracin con el yopo dio como
resultado una solucin de coloracin azul lo que no indica que los iones Cu 2+ actan como
inhibidor pues no permite la hidrolisis de los enlaces glucosidicos del almidn.
Actividad de la amilasa salival

Se plante una propuesta adicional en la que se mantiene constante la cantidad de almidn,

NaCl y se vara la cantidad de -amilasa (tabla 5) para determinar si el NaCl es un
cofactor. Cuando disminuye la cantidad de enzima la coloracin de la solucin del tubo 3 y
2 disminuye en comparacin al blanco, sin embargo la solucin resultante es azul, lo que
indica el reactivo de Lugol ha reaccionado con el almidn que no fue hidrolizado.
Para precisar la influencia del NaCl en la -amilasa se deben tener presente otros
parmetros como el tiempo de reaccin enzimtica y variar la cantidad de NaCL
adicionada, en la siguiente grafica se ejemplifica la metodologa que se debe emplear para
concluir correctamente [6]
Tub
o
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Masa de NaCL

T (min)

0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,10

23,00
19,13
15,02
13,13
11,80
10,60
9,35
8,02
6,24
4,53

Tabla 8. Masa del soluto agregado y tiempo de reaccin enzimtica.

25
20
15
Tempo (min) 10
5
0
0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

Masa de NaCL (g)

Grafica 1 . Tiempo de reaccin enzimtica de la -amilasa en funcin a la cantidad de

masa de NaCl.
De la grfica 1 se puede decir que la cantidad de NaCl adicionada es inversamente
proporcional al tiempo de reaccin enzimtica por lo tanto a mayores cantidades de sal
agregada el tiempo que requiere para que la enzima cumpla con sus funciones catalticas
disminuye aumentando la velocidad de la actividad enzimtica por ende se puede deducir
Actividad de la amilasa salival

que el NaCl es un activador. A partir del diseo experimental planteado para nuestra
prctica no se puede concluir acerca de la capacidad inhibidora o activadora de la sal
inica.
4. Conclusiones

La temperatura puede aumentar la actividad de una determinada enzima, pero esta

(la temperatura) debe ser regulada ya que si se sobrepasa la temperatura optima
puede presentarse una desnaturalizacin de la enzima debido a los rompimientos de
los enlaces de hidrogeno que mantienen la enzima en forma nativa, adems una
disminucin de la temperatura hace que la actividad enzimtica se pierda pero este
fenmeno es reversible, ya que los enlaces de hidrogeno se conservan y puede
regenerar la enzima a su forma nativa
El pH es un parmetro que influye en la conformacin de las enzimas, se debe
encontrar un valor ptimo para que la actividad enzimtica sea mxima y por lo
tanto la actividad cataltica sea mayor. A una solucin -amilasa se adicionaron 3
buffers, el mejor resultado se obtuvo con la solucin tampn que tena un pH de
6,8, a partir de una prueba colorimtrica que proporciona el Lugol al formar
complejos coloreados con yodo se determin experimentalmente que este valor es
el indicado para conseguir una actividad enzimtica elevada.
La selectividad de una enzima est determinada por la complementariedad que
existe en entre la enzima y sustrato, un ejemplo muy tpico para explicar este
concepto es la teora de llave cerradura, para una determinada cerradura solo
existir un llave.
La capacidad activadora o inhibidora de una sustancia, se debe medir en funcin de
diferentes variables, este inconveniente se present en la clasificacin del NaCl ,
pues al realizar la metodologa diseada los resultados no me proporcionaron una
base confiable para concluir.
Las pruebas cualitativas realizadas permitieron corroborar si la enzima tena una
actividad mxima, media o nula, segn los procedimientos realizados.
5. Bibliografa

[1]Ferraris M, Muoz A. Histologa, Embriologa e ingeniera tisular Bucodental, 3 a ed,

Editorial Panamericana S.A, Madrid Espaa, 2009, pg. 198.
[2] Motenegro R, Losano G. Nutricion clnica y gastroenterologa peditrica, 1 ed,
Editorial medica Panamericana, Bogot Colombia, 1999, pg 32 tabla 2-2.
[3] http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz22.htm#t (Consultado 20/05/13)
[4] Pea; Arroyo; Gomez, Bioqumica, Editorial Limusa S.A, Mxico D.F. , 2004, pg.200
[5] Quesada S, Manual de experimentos de laboratorio para Bioqumica; Editorial
universidad estatal a distancia, San Jose , Costa Rica 2007, pg. 41
Actividad de la amilasa salival

[6]http://www.champagnat.edu.pe/tisg/bio/PDFs/Monografia%20de%20Jaime
%20Ponce.pdf (Consultado 20/05/13)

Actividad de la amilasa salival