Introdução à Biologia Molecular

GRUPO DE ESTUDO 1

Propriedades de Ácidos Nucleicos

1. Os ácidos nucleicos apresentam absorbância a 260nm.

Cite uma aplicação desta propriedade.
Através do uso de um espectroscópio, é possível fazer uma análise
qualitativa e quantitativa de uma amostra contendo ácidos nucleicos, uma
vez que a absorbância lida nessa faixa (260nm) pode acusar sua presença.

2. Os ácidos nucleicos podem sofrer desnaturação. Dê

exemplos de um agente desnaturante e explique qual a base da sua
ação sobre o DNA e o RNA.
Em altas temperaturas, ou pH fora da faixa ideal (muito altos ou
muito baixos) ocorre a desnaturação do DNA e do RNA. Esses agentes são
capazes de quebrar as pontes de hidrogênio das cadeias duplas, também
através de interações hidrofóbicas, e desestruturar a conformação espacial
da molécula de DNA ou RNA. Isso separa as duas fitas de DNA, que podem
voltar a se unir quando a temperatura e o pH voltam ao ideal.

3. Discuta brevemente como é possível monitorar a

desnaturação de ácidos nucleicos e dê um exemplo de uma
aplicação desse processo.
Isso é possível através do monitoramento da absorbância. O DNA
desnaturado tem absorbância A1 numa primeira leitura, e após ser
submetido a um agente desnaturante, apresenta A2. A segunda absorbância
lida é maior que a primeira, uma vez que, após desnaturado, mais bases
nitrogenadas são expostas na solução, de modo a aumentar a absorbância.
Desse modo, quanto mais bases estiverem expostas, maior a absorbância
(A2) e maior será o grau de desnaturação dos ácidos nucleicos.

4. Explique o que é Tm, sua importância biológica e sua

aplicação em Biologia Molecular.
Tm é a temperatura de desnaturação (Melting Temperature).
Corresponde uma certa temperatura na qual dada molécula de DNA se
encontra 50% no estado de dupla fita, ou seja, está 50% desnaturada. O Tm
depende primariamente em função da estrutura primária da molécula
(sequências de DNA com mais C e G, que tem três pontes de hidrogênio,
costumam ter Tm maior). Pode-se estimar, portanto, que quanto maior é a
Tm de uma dada molécula, mais rica em timina e guanina a molécula é.

5. Qual a aplicação do princípio de hibridização de ácidos

nucleicos em Biologia Molecular.
A hibridização pode ser usada para se identificar genes de interesse
em um genoma. Uma vez feita uma biblioteca genômica, o processo de
identificar genes em especial é a triagem de biblioteca. Uma sonda para tal
é feita, contendo uma fita simples de DNA complementar à da sequência
desejada, marcada. Com a hibridização e lavagem da amostra, pode-se
detectar através do marcador usado a sequência desejada a fim de separá-
la da biblioteca. O mesmo princípio é usado em testes de análise do DNA ou
RNA, testes de paternidade, etc.

6. Cite dois métodos de marcação de sondas, comparando

suas vantagens e desvantagens.
O uso da radioatividade era um método muito usado antes de outros
mais recentes serem aperfeiçoados. Tem a vantagem da sua boa
sensibilidade, mas o uso de radioatividade traz vários inconvenientes como
o custo, tempo de meia vida dos isótopos, instabilidade e próprio risco da
utilização de isótopos radioativos.
Já o uso de elementos fluorescentes tem a vantagem de apresentar
uma alta sensibilidade e não necessitar o uso de elementos radioativos.
Suas desvantagens são o alto custo e decréscimo de intensidade do sinal
com exposição à luz.

7. Explique como pode ser feita a visualização ou detecção

do híbrido formado entre uma sonda marcada e a sequência alvo.
Isso depende do tipo de marcação utilizada na sonda. Uma sonda
marcada com elementos fluorescentes pode ser detectada com a exposição
da membrana a luz com uma determinada frequência e a emissão medida
por um fotosensor. A frequência emitida e refletida são características do
próprio composto usado para a marcação. Quando uma sonda é marcada
com elementos radioativos, a detecção se faz por meio da exposição da
membrana a uma chapa fotográfica. A sonda também pode ser marcada
com biotina, de modo que o híbrido pode ser detectado através das
interações da biotina com outras proteínas, como a avidina e estreptavidina.

8. Com as técnicas de Biologia Molecular pode-se

confirmar uma paternidade. Para isso, o DNA dos indivíduos em
questão é extraído, submetido à digestão enzimática (com
endonucleases de restrição), gerando diversos fragmentos. Após, a
separação por eletroforese, esses fragmentos são transferidos para
uma membrana e hibridizados com sondas específicas para
sequências conhecidas. Dados os perfis de hibridização abaixo,
obtidas com sondas marcadas radioativamente, diga em qual das
situações (em qual dos casos), confirma-se a paternidade do
suposto pai.
Caso 1. Pois todos os filhos têm sequências de DNA em comum com
o pai ou com a mãe, enquanto que no caso 2 o filho possui sequências
diferentes das sequências tanto do pai quanto da mãe, o que se faz supor
que pertença a outra pessoa.
 9. Ao analisar o protocolo de uma reação de PCR, um
estudante observou que os seguintes reagentes/condições
deveriam estar presentes: no meio tamponado, DNA genômico,
desoxiribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs), iniciadores, Mg2+ e
DNA polimerase (Taq Polimerase). Em sua opinião, o protocolo está
correto? Qual a função dos componentes adicionados à reação e do
meio tamponado?
O protocolo está correto. A função de cada componente é a
seguinte:
Meio tamponado: Como a reação envolve uma atividade enzimática
(da DNA Polimerase), um pH ideal é mantido para que a enzima tenha suas
condições ideais.
DNA genômico: É necessário pois é onde a sequência alvo está, e
portanto de onde ela deve ser “retirada” para a clonagem.
dNTPs: É a matéria prima necessária à DNA polimerase realizar suas
reações.
Iniciadores: Necessários para que a DNA polimerase reconheça a
sequência alvo a ser replicada e aja especificamente sobre ela.
Mg2+: É um importante cofator que aumenta o rendimento da reação
da DNA polimerase. Uma concentração muito baixa não tem o efeito
esperado, enquanto que uma concentração muito alta faz a enzima perder
sua especificidade e agir sobre sequências que não a sequência alvo.
DNA polimerase (Taq Polimerase): É uma DNA polimerase
termoestável, de modo que não se desnatura com as mudanças de
temperatura necessárias para a desnaturação das fitas duplas de DNA. Após
a separação das fitas, é ela que vai completar as sequências alvo a partir
dos iniciadores, de modo que a cada ciclo, a quantidade de sequências alvo
aumente exponencialmente.

10. Porque o controle da temperatura é tão importante na

PCR?
Porque é basicamente o que propicia a reação da DNA polimerase.
Primeiro a temperatura é aumentada a aproximadamente 95°C, de modo
que a dupla fita de DNA se abra. A temperatura então é baixada a 60°C
para que os primers possam se ligar às regiões alvos que irão ser transcritas
pela DNA polimerase. A enzima então sintetiza o DNA complementar a partir
dos primers em ambas as fitas (separadas), e para isso costuma-se
aumentar um pouco a temperatura a aproximadamente 72°C, para uma
maior eficiência da polimerase. Esse é o primeiro ciclo da reação em cadeia
da polimerase, que começou com uma fita dupla de DNA e ao final do
primeiro ciclo tem duas fitas parcialmente duplas, contendo a sequência
alvo. Apenas as fitas contendo a sequência alvo são transcritas porque o
primer adicionado é específico para elas. Desse modo, no início do próximo
ciclo, a temperatura é aumentada novamente a 95°C para separar as fitas
duplas e recomeçar todo o processo. Observa-se que a manutenção da
temperatura é essencial ao desenvolvimento do processo em si. É também
muito importante para evitar a complementaridade ou anelamento com
outras sequências que não a alvo.