Técnicas Histológicas e Citológicas

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Conceitos e Mtodos para a Formao de Tcnicos em Laboratrios de Sade
2 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade
FUNDAO OSWALDO CRUZ

Presidente
Paulo Ernani Gadelha Vieira
ESCOLA POLITCNICA DE SADE JOAQUIM VENNCIO
Diretora
Isabel Brasil Pereira
Vice-diretor de Pesquisa e Desenvolvimento Tecnolgico
Maurcio Monken
Vice-diretora de Ensino e Informao
Mrcia Valria Morosini
Vice-diretor de Gesto e Desenvolvimento Institucional
Sergio Munck
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Diretora
Tnia Cremonini Arajo Jorge
Vice-diretora de Pesquisa, Desenvolvimento Tecnolgico e Inovao
Mariza Gonalves Morgado
Vice-diretora de Ensino, Informao e Comunicao
Helene dos Santos Barbosa
Vice-diretora de Servios de Referncia e Colees Cientficas
Elizabeth Ferreira Rangel
Vice-diretor de Desenvolvimento Institucional e Gesto
Christian Maurice Gabriel Niel
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Conceitos e Mtodos para a Formao de Tcnicos

em Laboratrios de Sade
Volume 2
ORGANIZADORAS
Etelcia Moraes Molinaro

Luzia Ftima Gonalves Caputo
Maria Regina Reis Amendoeira
Copyright 2010 dos autores

Todos os direitos desta edio reservados
Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/Fundao Oswaldo Cruz
Conselho Editorial
Dr. Ana Luzia Lauria Filgueiras
Dr. Ftima Conceio Silva
Dr. Herman Schatzmayr
Dr. La Camillo-Coura
Dr. Lycia de Brito Gitirana
Dra. Marcia Ferro
Dr. Marco Antonio Ferreira da Costa
Dr. Margareth Maria de Carvalho Queiroz
Dr. Maria Regina Reis Amendoeira
Dr. Otlio Machado Pereira Bastos
Fotos
Rodrigo Mexas
Maria Eveline Castro Pereira
Moyses Gomes Marcelino
Desenhos
Newton Marinho da Costa Jnior
Reviso
Luciana Duarte
Joo Sette Camara
Secretria Executiva da Coleo
Josane Ferreira Filho
Capa
Z Luiz Fonseca
Projeto Grfico e Editorao
Marcelo Paixo
Catalogao na fonte
Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio
Biblioteca Emlia Bustamante
M722c
Molinaro, Etelcia Moraes

Conceitos e mtodos para a formao de profissionais em laboratrios
de sade: volume 2 / Organizao de Etelcia Moraes Molinaro, Luzia
Ftima Gonalves Caputo e Maria Regina Reis Amendoeira. - Rio de
Janeiro: EPSJV; IOC, 2010.
290 p. : il. , tab.
ISBN: 978-85-98768-41-0
1. Tcnicas e Procedimentos de Laboratrio.2. Pessoal de Laboratrio.
3. Laboratrios. 4. Formao de Tcnicos. 5. Sade e Educao. I. Ttulo.
II. Caputo, Luzia Ftima Gonalves. III. Amendoeira, Maria Regina Reis.
CDD 542.1
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Autores
Anna Christina Rosa Guimares
Tecnloga em Processos Qumicos Industriais, Tcnica em Sade Pblica do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade/INCQS/Fiocruz.
Daniel Santos de Souza
Bilogo, Especialista em Polticas Pblicas em Sade, Mestrando em Sade Pblica
pela Escola Nacional de Sade Pblica/ENSP/Fiocruz, Tcnico em Sade Pblica da
Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/EPSJV/Fiocruz. (Egresso do Curso Tcnico de Laboratrio de Biodiagnstico em Sade/Escola Politcnica de Sade Joaquim
Venncio/EPSJV/Fiocruz).
Emanuele Amorim Alves
Farmacutica industrial, Especialista em Percia Criminal pela Universidade Castelo Branco, Mestranda em Qumica pela Universidade Federal do Rio de Janeiro/UFRJ, Tcnica
em Sade pblica da Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/EPSJV/Fiocruz.
Ester Maria Mota
Biloga, Doutora em Biologia Parasitria pela Fundao Oswaldo Cruz. Pesquisadora
Associada do Laboratrio de Patologia do Instituto Oswaldo Cruz/IOC/Fiocruz.
Helene Santos Barbosa
Biloga, Especialista em Protozoologia pelo Bernhard Nocht Institut da Alemanha, Doutora em Biologia Celular e Molecular pela Fundao Oswaldo Cruz. Pesquisadora Titular
do Laboratrio de Biologia Estrutural do Instituto Oswaldo Cruz/IOC/Fiocruz.
Leandro Medrado
Bilogo, Especialista em Educao Profissional pela Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/EPSJV/Fiocruz. Mestrando em Educao Profissional em Sade pela
EPSJV/Fiocruz. Tcnico em Sade Pblica da EPSJV/Fiocruz (Egresso do Curso Tcnico de Laboratrio de Bodiagnstico em Sade/Escola Politcnica de Sade Joaquim
Venncio/EPSJV/Fiocruz)
Biloga, Tecnologista em Sade Snior do Instituto Oswaldo Cruz/IOC/Fiocruz. (Egressa
do Curso Tcnico de Pesquisa em Biologia Parasitria/Instituto Oswaldo Cruz/IOC/Fiocruz,
1984)
Lycia de Brito Gitirana
Biloga, Mestre em Histologia e Embriologia pela Universidade Federal do Rio de Janeiro/UFRJ, Doutora em Biologia pela University of Heidelberg. Professora Associada II do
Instituto de Cincias Biomdicas/ICB/UFRJ.
Pedro Paulo de Abreu Manso
Bilogo, Mestre em Cincias pelo programa de Biologia Celular e Molecular do Instituto
Oswaldo Cruz/IOC/Fiocruz. Tecnologista em Sade Pblica do IOC/Fiocruz. (Egresso do
Curso Tcnico de Histologia da Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/EPSJV/
Fiocruz)
Suzana Crte-Real
Biloga, Doutora em Patologia pela Universidade Federal Fluminense e Especialista em
Microscopia Eletrnica pelo Instituto Pasteur Lyon Frana. Pesquisadora Titular III do
Laboratrio de Biologia Estrutural do Instituto Oswaldo Cruz/IOC/Fiocruz.
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Sumrio
Prefcio 9
Apresentao 13
Um sonho quase realizado 15
Captulo 1. Biologia celular e ultraestrutura 19
Captulo 2. Histologia 43
Captulo 3. Tcnicas histolgicas 89
Captulo 4. Tcnicas citolgicas 189
Captulo 5. Cultivo celular 215
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PREFCIO
O Chico Trombone costumava me dizer:
Isso eu sei fazer, dr. Luiz Fernando, aprendi com Joaquim Venncio.
E era com orgulho que se referia a seu mestre.
Vimos, portanto, que a formao de tcnicos j vem dos tempos de
Oswaldo. claro que no era institucionalizada como hoje. Eram outros
tempos.
Joaquim Venncio nasceu na fazenda Bela Vista, em Minas Gerais. Era
a fazenda da me de Carlos Chagas, pai. Em 1916, veio trabalhar no Instituto
Oswaldo Cruz. Veio e deu certo. O dr. Lutz teria dito certa vez:
No troco o Venncio por nenhum doutor de Oxford ou de
Cambridge.
Se no disse, pensou.
Eficincia nos processos de seleo de pessoal? Competncia do
servio de recursos humanos? Evidentemente que no. No havia nada
disso nessa poca. As coisas eram muito mais simples, e davam certo. Veio
porque era amigo do velho Carlos Chagas. Amigos de infncia. Brincaram
juntos na fazenda.
Quando Joaquim Venncio faleceu, em 27 de agosto de 1955, teve
seu necrolgio publicado na Revista Brasileira de Biologia. Lugar de ne-
crolgio de cientista famoso. Cito textual: Joaquim Venncio conseguiu,

durante cerca de 35 anos que trabalhou ativamente, aprender zoologia
que conhecia de modo invejvel. Como decorrncia das contingncias da
vida, no teve oportunidade de instruir-se, mas sua mentalidade era de um
homem culto. Pela convivncia com o dr. Lutz, pela observao direta do
que via nas excurses e no laboratrio, adquiriu conhecimento detalhado
de vrios grupos zoolgicos, principalmente anfbios, moluscos fluviais e
trematdeos. Chegou a conhecer muito bem os anfbios e, com grande
facilidade, os classificava nas excurses pela voz. Dadas as indicaes feitas
pelo dr. Lutz em seus trabalhos, h casos em que foi citado na literatura
como colaborador direto.
Joaquim Venncio era, sem dvida, um naturalista. Era competente,
tinha o domnio do ofcio, a maestria da arte.
E gostava de ensinar. Ensinou muita gente.
Certa vez, o Venancinho me disse:
Era a Escola do Venncio, n? Foi muito boa, n?
* * *
Na presidncia de Sergio Arouca, resolvemos atualizar a Escola de
Venncio. E foi assim que surgiu a Escola Politcnica, com o nome do seu
patrono. Cresceu e abriu vrias frentes, desde a vocao cientfica aos
cursos de nvel mdio complementados pela formao de tcnicos. Foi um
xito, como a antiga. Aparece sempre nos primeiros lugares nas avaliaes
e j se estendeu a outras instituies.
* * *
E agora surgem os livros didticos. Organizado por Etelcia Moraes
Molinaro, Luzia Ftima Gonalves Caputo e Maria Regina Reis Amendoeira,
vem luz a coleo Conceitos e Mtodos para a Formao de Tcnicos
Prefcio | 11
em Laboratrios de Sade, reunindo professores de vrias unidades da

Fiocruz.
Os captulos oferecem a histria da tcnica, os seus fundamentos, a
maneira moderna de realiz-la, as suas aplicaes, a organizao do laboratrio etc.
til para os cursos da Fundao e para outros externos. Mostra,
tambm, o quanto as unidades da Fiocruz esto integradas na realizao de
suas tarefas.
Ensino questo primordial. Sem ele, o pas no se desenvolve.
Est de parabns a Fiocruz pela realizao de mais uma tarefa de
primordial importncia.
Oswaldo Cruz est orgulhoso dos seus continuadores.
Luiz Fernando Ferreira
Pesquisador Emrito da Fundao Oswaldo Cruz
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Apresentao
A coletnea de livros intitulada Conceitos e Mtodos para a Formao
de Profissionais em Laboratrios de Sade, organizada por Etelcia Moraes
Molinaro, Luzia Ftima Gonalves Caputo e Maria Regina Reis Amendoeira
antes de tudo uma obra original, importante e necessria. Original porque no
existe na literatura tcnica em sade, na rea biomdica brasileira e internacional, pelo menos que eu saiba, algo semelhante em abrangncia, profundidade
e seleo dos temas abordados; importante pelo pblico-alvo a que se destina, muito alm da Formao de Tcnicos de Laboratrios, abrangendo certamente todos os profissionais de sade; e necessria porque servir como
obra de referncia para a formao dos mencionados tcnicos e de consulta
obrigatria para todos os profissionais de sade que necessitem de esclarecimento dos aspectos tcnicos ali abordados.
Versada em 5 volumes e 22 captulos, organizados em sequncia lgica, desde a biossegurana e boas prticas de laboratrio, passando por todos
os fundamentos das tcnicas laboratoriais, bioqumica bsica, biologia celular e
molecular, histologia e ultraestrutura, at atingir o cerne da prtica laboratorial,
da imunologia infectoparasitologia virologia, bacteriologia, micologia,
protozoologia e helmintologia e seus vetores, com a entomologia mdica e a
malacologia. Os autores que escrevem os respectivos captulos so do melhor
nvel intelectual e cientfico, com a titulao de mestres, doutores e especialistas, com grande experincia prtica nos assuntos de que tratam.
Parabenizo o Instituto Oswaldo Cruz e a Escola Politcnica Joaquim
Venncio, que patrocinaram esta obra de referncia e que desde seus primrdios,
valorizaram a qualidade da formao dos seus tcnicos e com eles povoaram e
esto povoando o Brasil de Norte a Sul e de Leste a Oeste com o que temos
de melhor os fundamentos para uma boa pesquisa. Aproveito esta oportunidade para homenagear a figura de Henry Willcox, que, no incio da dcada
de 1980, quando o convidei para me ajudar na coordenao dos cursos de
ps-graduao em Biologia Parasitria e Medicina Tropical do Instituto Oswaldo
Cruz, foi o grande incentivador para criarmos paralelamente o Curso de Tcnico em Pesquisa, do qual foi o seu primeiro coordenador.
Igualmente parabenizo as organizadoras desta coletnea e a Fiocruz como
um todo pelo lanamento desta obra pioneira.
Jos Rodrigues Coura
Pesquisador Titular Emrito
Chefe do Laboratrio de Doenas Parasitrias IOC/Fiocruz
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Um sonho quase realizado

(Oswaldo Cruz, 1872-1917)
As alteraes pelas quais passa o mundo com a globalizao trazem

como consequncia o surgimento de novos paradigmas tecnolgicos, fazendo-se necessrio que o ensino da rea da sade atenda s exigncias do
mundo moderno, do trabalho e do atual perfil do tcnico da rea.
Os cursos para a formao de tcnicos da Fundao Oswaldo Cruz
(Fiocruz) buscam demonstrar os princpios cientficos envolvidos com as tcnicas laboratoriais, preparando os alunos para as transformaes no mundo do
trabalho em sade, decorrentes do desenvolvimento tecnolgico e cientfico.
Neste contexto, duas unidades tcnicas cientficas desta instituio, o Instituto Oswaldo Cruz (IOC) e a Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio
(EPSJV), historicamente so as responsveis por coordenarem cursos e especializaes tcnicas que se firmaram como modelos desses princpios. Essas
unidades, na rea de ensino tcnico, sempre estiveram intrinsecamente ligadas,
e os professores realizam permanente parecerias entre si. Muitos de ns,
egressos desses cursos, so hoje docentes e autores desta coleo.
Alm da formao tcnica de profissionais em nvel regional e nacional,
intensificou-se, na Fiocruz, a demanda para o estabelecimento de cooperaes
tcnicas internacionais, que por sua expertise e capacidade de produzir, pas-
sou a divulgar conhecimentos, elaborando cursos, metodologias e tecnologias

educacionais. A Escola Politcnica Centro Colaborador da Organizao
Mundial da Sade (OMS) para a educao de tcnicos em sade desde
2004.
A ideia da publicao dessa coleo surgiu da necessidade conjunta das
duas Unidades da Fiocruz de produzir material didtico, que atendesse aos
alunos dos cursos de nvel tcnico em Sade da Fiocruz e de outros locais.Desse
modo, o nosso principal desafio oferecer contedo que abarque toda a rea
tcnica de sade utilizada nos principais cursos de nvel mdio, e que, ao
mesmo tempo, possa manter-se suficientemente atualizado.
Dada a complexidade da estrutura instrumental e pedaggica dos cursos
tcnicos, se fez necessria a publicao de uma coleo, escolhendo-se tpicos de importncia bsica. Para tanto, foram convidados pesquisadores/professores com experincia em ensino de cursos de nvel tcnico e de destacado
conhecimento nos temas abordados nos 22 captulos, que constituem os 5
volumes da coleo.
A coleo Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em
Laboratrios de Sade tem como objetivo integrar conhecimentos tericos e
prticos, proporcionando ao aluno informaes que possibilitem uma permanente reflexo de seu papel como agente transformador dos processos e
atividades de ensino, pesquisa cientfica e desenvolvimento tecnolgico. Outro objetivo inconteste destes livros servir para professores, como norteadores
da definio curricular de seus cursos.
Visando garantir a autonomia dos autores, e respectivas responsabilidades, foi mantida a formatao original dos textos, inclusive as fotos,
figuras, diagramas. Podem ocorrer tambm algumas repeties de contedo
em alguns captulos, mas, a nosso ver, a retirada de partes de captulos j
abordadas poderia descontextualizar o texto.
Um Sonho Quase Realizado | 17
O pontap inicial deste sonho s foi possvel pelo incondicional apoio

dado pelo professor Andr Paulo da Silva Malho, pela dra. Isabel Brasil
Pereira, pessoa-chave desencadeadora do processo, e pela dra. Tnia
Cremonini de Arajo Jorge, que apoiaram e incentivaram institucionalmente
este projeto. Agradecemos especialmente aos autores que abraaram este
trabalho com muito entusiasmo e que possibilitaram a sua concretizao. E
um carinho especial para Josane Ferreira Filho pela organizao paciente de
nossas reunies e textos, com a gratido das organizadoras e autores.
Agradecemos em especial aos renomados cientistas emritos da
Fundao Oswaldo Cruz, doutores Luiz Fernando Ferreira patrono
da EPSJV e Jos Rodrigues Coura, que nos deram a honra de apresentar esta coleo.
Esperamos, assim, contribuir para a sistematizao do conhecimento
dos leitores sobre os diversos tpicos abordados em cada captulo, apresentando cada assunto de forma didtica e sinttica, recomendando a consulta literatura especializada sempre que houver necessidade de
aprofundamento do conhecimento em determinados temas.
Etelcia Moraes Molinaro
Maria Regina Reis Amendoeira
Organizadoras
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Captulo 1
Biologia celular e ultraestrutura
Helene Santos Barbosa
Suzana Crte-Real
istrico
1. H
Histrico
Citologia, ou biologia celular, a cincia que estuda os vrios sistemas

celulares, a maneira como as clulas so reguladas e a compreenso do funcionamento de suas estruturas. A construo dos microscpios pticos foi um
passo decisivo para a descoberta das clulas, e acredita-se que o primeiro
tenha sido inventado em 1592, por Jeiniere da Cruz e seu pai, Zacharias
Jansen, dois holandeses fabricantes de culos. Tudo indica, porm, que o
primeiro a fazer observaes microscpicas de materiais biolgicos foi o holands Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723). O microscpio simples com
apenas uma lente, construdo por Leeuwenhoek, foi aprimorado por Robert
Hooke em 1665, ganhando mais uma lente.
A partir dos estudos de Hooke em biologia, publicados em um livro
intitulado Micrographia (1665), que analisou cortes finos de cortia obtidos
da casca do sobreiro, verificou que estes eram constitudos por pequenas
cavidades polidricas (no latim, cella), as quais foram denominadas clulas.
Estes compartimentos representavam as paredes das clulas vegetais mortas. Em
1838, o botnico alemo Matthias Schleiden descreveu que a clula era a

unidade bsica de todas as plantas e, mais tarde, em 1839, o zologo alemo
Theodor Schwann chegou mesma concluso para os animais. Com base
nestes conhecimentos, elaborou-se a teoria celular que foi proposta por Schleiden
e Schwann. Posteriormente, a associao de tcnicas de colorao e de
citoqumica foi capaz de revelar as estruturas e a fisiologia das clulas.
O grande avano no conhecimento da biologia celular, sem dvida, foi
a inveno dos microscpios eletrnicos em 1931, por dois engenheiros
alemes Ernst Ruska e Max Knoll , o que possibilitou a visualizao das
organelas celulares em grande detalhe.
A clula uma unidade funcional que estabelece interao entre seus
componentes, sob o aspecto fisiolgico, biossinttico e reprodutivo. A dinmica celular para a manuteno da vida regida por um processo de
automanuteno, que compreende a modificao de estruturas, a substituio
de componentes, de tal forma articulada que garanta a sua organizao estrutural e funcional.
2. Clulas procariticas e eucariticas
A divergncia entre procariontes e eucariontes deve ter ocorrido aps

serem estabelecidos os mecanismos de replicao e transcrio do cido
desoxirribonucleico (DNA), a traduo, o sistema de cdons e os metabolismos energticos e biossintticos. O principal critrio de distino entre estes
grupos a sua organizao celular. As clulas procariticas (do latim proprimeiro e cario-ncleo) so relativamente simples e se caracterizam por no
apresentarem membrana, segmentando os cidos nucleicos DNA) e ribonucleicos
(ARN) do citoplasma. Alm disso, algumas destas clulas apresentam uma
membrana plasmtica circundada externamente pela parede celular. As clulas
eucariticas (do latim eu-verdadeiro e cario-ncleo) constituem o tipo celular
da constituio dos fungos, protozorios, animais e plantas. Estruturalmente,
so clulas mais complexas, ricas em membranas que formam compartimentos,
Biologia Celular e Ultraestrutura
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ou seja, uma diviso de funes metablicas entre as organelas citoplasmticas

e o ncleo, circundado pelo envoltrio nuclear, onde est contido todo seu
material gentico. Para os eucariontes, a compartimentalizao de atividades
celulares em organelas circundadas por membranas fosfolipdicas foi decisiva
para a homeostase celular.
Os componentes das clulas eucariticas (Figura 1) compreendem: a membrana citoplasmtica, o citoplasma, o ncleo, o retculo endoplasmtico, o complexo de Golgi, os lisossomos, as mitocrndrias, os peroxissomos, as incluses lipdicas,
o glicognio, o citoesqueleto, os centrolos, o centrossomo, os cloroplastos (encontrados em vegetais) e a parede celular, sendo esta ltima encontrada em fungos
e vegetais. As caractersticas morfolgicas e fisiolgicas das principais estruturas
encontradas nas clulas eucariticas sero apresentadas a seguir.
Figura1. Clula eucaritica mostrando membrana plasmtica, ncleo (N) e organelas.
2.1. Membrana celular
A membrana plasmtica ou celular atua na manuteno de microambientes,

formando uma barreira que impede o contedo celular de escapar e se misturar
com o meio circundante. Esta membrana confere individualidade a cada clula,
definindo os meios intra e extracelulares. Alm desta funo, a membrana

plasmtica o primeiro contato entre esses meios, traduzindo informaes para
o interior da clula e permitindo que ela responda a estmulos externos que
podem influenciar nas suas funes biolgicas, participando decisivamente das
interaes clula clula e clula matriz extracelular.
A membrana plasmtica e a membrana das diferentes organelas celulares
medem cerca de 7 a 10 m de espessura e so visveis somente ao microscpio eletrnico. Trata-se de uma estrutura trilaminar constituda de duas camadas
eletrondensas (escuras) e uma camada eletronlcida (clara) central. Molecularmente
so formadas por uma bicamada fluda de fosfolipdios (fosfoglicerdeos e
esfingolipdios) e colesterol, onde esto inseridas molculas de protenas. A
membrana plasmtica no uma estrutura esttica, os lipdios movem-se proporcionando fluidez membrana.
Esquema mostrando a bicamada da membrana plasmtica:
Figura 2. A membrana plasmtica formada por molculas de lipdeos (fosfoglicerdeos
e esfingolipdeos), colesterol, protenas perifricas (localizadas somente em uma das
camadas dos fosfolipdeos) e as transmembranares (localizadas nas duas camadas
dos fosfolipdeos, ligando o meio extracelular ao citoplasma). A cadeia de pequenas molculas verdes representa os carboidratos localizados somente no lado externo da membrana plasmtica.
Biologia Celular e Ultraestrutura | 23
Os carboidratos presentes nesta estrutura, como, por exemplo, glicose,

manose, fucose e galactose, esto ligados s protenas, formando as glicoprotenas;
ou aos lipdios, resultando nos glicolpidios e nos glicoesfingolipdios. Estes
carboidratos esto presentes apenas na face externa da membrana e fornecem identidade clula.
A membrana apresenta uma propriedade imprescindvel para manuteno da viabilidade celular, que a permeabilidade seletiva, controlando
a entrada e a sada de substncias da clula. A passagem de molculas polares
maiores e os ons requer canais, formados por protenas transmembranares.
O transporte de molculas para o interior das clulas pode ser:
a) transporte passivo por difuso ou por osmose, quando no envolve o consumo de energia do sistema, sendo utilizada apenas a energia
cintica das molculas. Sendo assim, a movimentao dos ons e molculas d-se a favor do gradiente de concentrao (do meio hipertnico
para o meio hipotnico). A difuso pode ser auxiliada por enzimas
(difuso facilitada) ou pode no ter participao de nenhuma delas
(difuso simples). A difuso simples ocorre quando molculas hidrofbicas
pequenas e polares, como O2, CO2, N2 e C6 H6, passam pela
membrana sem serem bloqueadas;
b) transporte ativo quando o transporte das molculas envolve a
utilizao de energia pelo sistema, na forma de adenosina trifosfato
(ATP). A movimentao das substncias se d contra o gradiente de
concentrao, ou seja, do meio hipotnico para o hipertnico, como,
por exemplo, a bomba de sdio e potssio, que tem funo de manter
o potencial eletroqumico das clulas.
Entretanto, partculas maiores no conseguem atravessar a membrana,
mas podem ser incorporadas clula pela prpria estrutura da membrana
celular, ocorrendo, assim, a formao de vesculas. A este processo, no qual a
membrana celular envolve partculas ou fluido do exterior, d-se o nome de
endocitose. Ele ocorre por dois mecanismos:
a) fagocitose quando ocorre a captao de molculas maiores, partculas ou microrganismos. Neste processo, a partcula a ser ingerida toca
na membrana celular, formando projees chamadas de filopdios;
b) pinocitose processo utilizado pela clula para englobar pores
de fluidos extracelulares e pequenas molculas. Neste caso, a membrana sofre um processo de invaginao, ocorrendo a formao de
pequenas vesculas. Estas so direcionadas para o citoplasma para que
ocorra a absoro dos nutrientes. Por outro lado, para eliminar substncias residuais, a clula utiliza o processo de exocitose, no qual uma
vescula, vinda do citoplasma contendo material que deve ser eliminado, se funde membrana plasmtica, lanando o seu contedo no
meio extracelular.
2.1.1. Especializaes da membrana plasmtica
A comunicao e a coeso entre as clulas so estabelecidas por meio

das membranas, formando trs classes funcionais de junes celulares:
a) juno ancorante ou aderente clula-clula ou clula-matriz, s
quais a fora de estresse transmitida ao citoesqueleto. Existem vrios
tipos desta juno; destacamos, dentre eles, os desmossomas, os
hemidesmossomas e junes que circundam completamente as clulas,
atuando como uma barreira de permeabilidade e tenso;
b) juno apertada ou oclusiva (tight junctions) um tipo de juno
que liga duas clulas vizinhas, selando os espaos entre elas e tornando
essa regio impermevel, no permitindo, assim, a passagem de pequenas molculas ou ons;
c) juno mediada por canais proteicos so as junes comunicantes
(gap junctions) que permitem a passagem de molculas e de ons entre
duas clulas adjacentes.
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2.2. Citoplasma
O citoplasma, ou citossol das clulas eucariotas, formado por uma

soluo coloidal, viscosa e de aspecto relativamente uniforme, que contm
gua (80%), ons diversos, aminocidos e protenas. No citoplasma esto
localizados o ncleo e as organelas celulares, o retculo endoplasmtico, o
complexo de Golgi, os lisossomos, as mitocndrias, os peroxissomos e, ainda,
as incluses lipdicas, os grnulos de glicognio e os ribossomos. Estas estruturas so responsveis pelas funes celulares, como digesto, respirao, secreo, sntese e transporte de protenas. No citoplasma esto tambm os elementos do citoesqueleto, responsveis por vrias atividades dinmicas das clulas, e os centrolos, estruturas geradoras dos microtbulos.
2.3. Ncleo
Estrutura extremamente importante para as clulas eucariticas, pois

nele esto contidos os cidos nucleicos (cdigo gentico), protegidos pelo
envoltrio nuclear. no seu interior que ocorre a duplicao do DNA e a
transcrio dos ARNs.
O ncleo tem sua localizao geralmente no centro da clula e a sua
forma pode estar relacionada ao tipo celular. O envoltrio nuclear composto
por duas membranas, uma externa e outra interna, com composies proteicas
distintas, que delimitam um espao varivel que oscila entre 40 e 70 mm. A
membrana interna deste envoltrio se encontra associada lmina nuclear, que,
por sua vez, est ligada fortemente cromatina. A membrana externa do envoltrio
circunda a membrana interna e contnua com a membrana do retculo
endoplasmtico (RE). Este fato faz com que o espao existente entre as membranas do envoltrio seja tambm contnuo luz do RE. Assim como a membrana
do RE, a membrana externa do envoltrio face citoplasmtica apresenta
ribossomos aderidos que esto envolvidos ativamente na sntese proteica. O
envoltrio nuclear interrompido regularmente, formando os poros nucleares.
Eles tm nmero e densidade bastante variveis, dependendo do tipo celular e

estado metablico da clula. Pelos poros, ocorre o transporte bidirecional seletivo de protenas e ARNs entre o citossol e o ncleo.
No ncleo (Figura 3) de clulas em intrfase encontra-se a cromatina
compactada (heterocromatina) ou frouxa (eucromatina) composta de molculas de DNA, protenas histnicas e no histnicas. As histonas, protenas bsicas
encontradas nos eucariotos, so importantes componentes da estrutura da cromatina,
participando no somente como repressoras, mas tambm como ativadoras na
transcrio do DNA. Por outro lado, as protenas no histnicas desempenham
papel estrutural e enzimtico, participando da atividade gnica.
No ncleo interfsico tambm esto os nuclolos, cuja funo sintetizar
ARNs e envi-los para o citoplasma. Os nuclolos podem ter estrutura reticular
ou compacta e o tamanho e a forma dependem do estado funcional da clula,
variando conforme o tipo celular. Durante o ciclo celular, geralmente os nuclolos
desaparecem a partir do final da prfase, reaparecendo no final da telfase.
A lmina nuclear est presente no ncleo, tendo papel importante na
reorganizao nuclear aps o trmino da diviso celular. Ela est ancorada s
protenas integrais da membrana interna do envoltrio nuclear e ligada fortemente cromatina. constituda por protenas filamentosas intermedirias do
tipos A e B que se polimerizam em uma rede bidimensional.
Da estrutura do ncleo faz parte a matriz nuclear, que forma uma rede
proteica fibrogranular alicerando o ncleo. Ela est associada ao DNA durante os processos de duplicao e regula a transcrio nos eucariotos, juntamente
com as histonas.
Figura 3. (A) Moncitos mostrando o ncleo ocupando grande extenso do

citoplasma da clula; (B) clula eucaritica, apresentando ncleo com poros
(setas) e mitocndrias (M).
(A)
(B)
2.4. Retculo endoplasmtico
O retculo endoplasmtico (RE) encontrado na maioria das clulas,

ocupando cerca de 10% do volume celular. formado por uma rede de
membranas interconectadas na forma de tubos ou cisternas. Dois tipos de
retculo endoplasmtico so observados: liso (ou agranular) e rugoso (ou
granular), os quais apresentam caractersticas morfolgicas e funcionais distintas.
O retculo endoplasmtico liso, ou agranular, caracterizado pela ausncia de ribossomos aderidos sua membrana e apresenta-se como uma rede
de delgados tbulos que se anastomosam entre si. As funes desse retculo
so muito variadas, dentre elas a sntese de hormnios e de lipdios, a
desintoxicao celular com a converso de substncias nocivas lipossolveis
ou insolveis em compostos hidrossolveis e o armazenamento de clcio.
O retculo endoplasmtico rugoso (Figura 4), ou granular, caracterizado pela presena de polirribossomos (ribossomos e ARNm) aderidos ao lado
externo da membrana. Esta organela apresenta formas variadas, frequentemente
em forma de tbulos achatados e longos ou bem dilatados, podendo estar
localizada em vrios pontos da clula ou concentrada em determinadas reas

do citoplasma. O RE rugoso, em parceria com os polirribossomos, tem um
importante papel na sntese e exportao de protenas. As protenas so capturadas pelo RE, por receptores presentes na sua membrana, assim que comeam a
ser sintetizadas pelo complexo de ribossomos e ARNm. As protenas sintetizadas podem ter dois destinos: como protenas transmembranares ou protenas
hidrossolveis. As protenas transmembranares podem permanecer na membrana do retculo ou serem destinadas membrana plasmtica e membrana de
outras organelas. Por outro lado, protenas hidrosolveis, quando sintetizadas,
podem ser direcionadas para o complexo de Golgi ou encaminhadas ao lmen
de alguma organela e secretadas no meio extracelular.
Figura 4. Retculo endoplasmtico rugoso (RE) dilatado de fibroblasto, apresentando ribossomos aderidos membrana.
2.5. Complexo de Golgi
O complexo de Golgi, aparelho de Golgi ou simplesmente Golgi

(Figura 5) foi descrito em 1898 pelo bilogo italiano Camilo Golgi e
formado por vesculas e tbulos achatados empilhados e organizados, chama-
dos de cisternas (cerca de 4 a 8 cisternas). As cisternas voltadas para o

retculo endoplasmtico so convexas (cisternas cis). As centrais so denominadas cisternas medianas, e as mais prximas ao stio de secreo so cncavas
(cisternas trans). O complexo de Golgi apresenta como principais funes o
processamento de lipdeos e protenas (denominados de glicosilao, sulfatao
e fosforilao) e a separao e o endereamento de molculas sintetizadas
fazendo parte da via biossinttica secretora (RE sntese; Golgi processamento
e seleo; vesculas transporte). As vias secretoras compreendem o transporte de lipdeos, protenas e polissacardeos aos destinos finais e o empacotamento
das macromolculas em diferentes vesculas de transporte. Essas vesculas transportadoras direcionam protenas/lipdeos/hormnios do retculo endoplasmtico
para o complexo de Golgi (face cis); o transporte de protenas/lipdeos (modificados) do complexo de Golgi para o retculo endoplasmtico (face cis) e
para a superfcie celular (face trans) e, ainda, o transporte das molculas que
originam os lisossomos (face trans).
Figura 5. Citoplasma de clula eucaritica apresentando complexo de Golgi
(G) com suas cisternas empilhadas, vesculas e mitocndrias.
2.6. Lisossomos
Os lisossomos so estruturas geralmente esfricas, delimitados por uma

membrana, que apresentam uma grande variao no seu tamanho. Eles so
formados no complexo de Golgi, e em seu interior se encontram acumuladas
cerca de quarenta enzimas hidrolticas com propriedade de digerir uma grande
gama de substratos, incluindo nucleases, proteases, glicosidases, lipases,
fosfolipases e sulfatases. Estas hidrolases tm um pH timo entre 3 e 6, e,
assim, o interior dos lisossomos cido. A acidificao realizada por bombas
de H+, que usam ATP. As suas enzimas so glicoprotenas provenientes do
Golgi, que saem da sua face trans em vesculas especficas. A compartimentalizao
destas enzimas impede a lise indiscriminada dos contedos celulares. A principal funo do lisossomo a digesto intracelular, permitindo, assim, que a
clula seja capaz de degradar partculas, macromolculas, microrganismos ou
outras clulas provenientes da endocitose. Alm disso, os lisossomos agem na
eliminao de organelas ou partes danificadas da prpria clula, por um processo denominado autofagia. A formao dos autolisossomos se inicia quando uma poro de RE envolve uma organela que deve ser destruda, formando
uma vescula em seu redor. Esta vescula posteriormente acidificada e fundese com um lisossomo primrio, que inicia a degradao. Na heterofagia, os
lisossomos fundem-se com endossomos (provenientes da endocitose) ou
fagossomos (provenientes da fagocitose).
2.7. Mitocndrias
As mitocndrias (Figura 6) esto presentes no citoplasma das clulas

eucariticas, sendo caracterizadas por uma srie de propriedades morfolgicas,
bioqumicas e funcionais. Geralmente, so estruturas cilndricas, podendo ser
esfricas, ovoides e alongadas, com aproximadamente 0,5 mm de dimetro e
vrios micrmetros de comprimento. Possuem grande mobilidade, localizandose em stios intracelulares onde h maior necessidade de energia, pois sua
funo principal a produo de ATP. Uma clula heptica normal pode
conter de 1.000 a 1.600 mitocndrias, enquanto alguns ovcitos podem

conter at 300 mil. Possuem organizao estrutural e composio lipoproteica
caractersticas, e contm um grande nmero de enzimas e coenzimas que
participam das reaes de transformao da energia celular. Esta organela
caracterizada pela presena de um envoltrio formado por duas membranas
estrutural e funcionalmente distintas, as quais delimitam dois espaos. Existe um
espao intermembranar separando as membranas interna e externa, e um segundo gerado pela membrana interna, delimitando a matriz mitocondrial. A membrana interna apresenta uma srie de invaginaes para o interior da mitocndria,
gerando as cristas mitocondriais, onde esto presentes os componentes da
cadeia respiratria responsveis pela sntese de ATP. As mitocndrias apresentam uma molcula de DNA circular, semelhante quelas encontradas nas bactrias. Alm disso, contm todo mecanismo necessrio para replicao e transcrio do DNA e traduo de protenas. Entretanto, apenas uma pequena
quantidade de protenas codificada pelo DNA mitocondrial. Com base
nessas evidncias, surge a teoria endossimbitica.
A mitocndria considerada a usina da clula, uma vez que esta
capaz de processar oxignio e glicose e convert-los em energia na forma de
ATP, por meio do ciclo de Krebs e da cadeia respiratria.
Figura 6. Fibroblasto: mitocndrias apresentando a matriz mitocondrial eletrodensa,
cristas mitocondriais e a dupla membrana.
2.8. Peroxissomos
Os peroxissomos (Figura 7) so organelas envolvidas por apenas

uma membrana e no contm DNA e nem ribossomos; todas as suas
protenas devem ser importadas do citosol. Apresentam em seu interior um
contedo granuloso fino e so geralmente arredondadas, medindo cerca
de 0,5mm de dimetro. No seu interior, comum se observar a presena
de uma poro fortemente eletrodensa, o nucleoide. Dentre as enzimas
encontradas nos peroxissomos destacam-se a catalase, a urato oxidase, a Daminocido oxidase e as enzimas responsveis pela beta oxidao dos cidos
graxos. Os peroxissomos assemelham-se ao retculo endoplasmtico porque
se autorreplicam sem possuir genomas prprios. Nas clulas animais, os
peroxissomos participam da biossntese de precursores de glicerolipdeos, do
colesterol e do dolicol. O nmero relativo de peroxissomos na clula pode
variar rapidamente em resposta s mudanas ambientais e s condies fisiolgicas. Os processos de sequestro e degradao dos peroxissomos so denominados macroautofagia e microautofagia.
2.9. Incluses lipdicas
Incluses lipdicas (tambm chamadas de corpos lipdicos, gotas lipidcas

ou adipossomas) so organelas ricas em lipdios presentes em todos os organismos, incluindo fungos, procariotos e eucariontes. Elas variam de tamanho, tm
aspecto circular e esto distribudas por todo o citoplasma das clulas.
Os corpos lipdicos so circundados no pela clssica bicamada de
membrana, mas por uma monocamada de fosfolipdios, a qual, no mnimo em
algumas clulas, deve ter uma nica composio de cidos graxos. O ncleo
interno dos corpos lipdicos rico em lipdios neutros, mas estudos com
leuccitos tm demonstrado que os corpos lipdicos no so simples sacos de
lipdios neutros. Considera-se atualmente que sejam organelas funcionalmente
ativas, altamente reguladas e dinmicas. Pelo uso de tcnicas para identificao
subcelular de fraes enriquecidas de corpos lipdicos, combinado com

imunodeteco de protenas por microscopia eletrnica e de luz, tem sido
demonstrado que corpos lipdicos compartimentalizam enzimas envolvidas na
biossntese, transporte e catabolismo de lipdios, caveolina e de protenas
envolvidas no transporte vesicular. A formao regulada de corpos lipdicos,
seus contedos proteico e lipdico, e sua associao com outras organelas
intracelulares, em algumas clulas especializadas, atuam na sinalizao e ativao
celulares, regulao do metabolismo de lipdios, trfego de membrana e controle da sntese e secreo de mediadores inflamatrios.
Figura 7. Incluses lipdicas.
2.10. Glicognio
O glicognio (Figura 8) um polissacardeo constitudo por subunidades

de glicose com uma ramificao a cada oito ou dez unidades. Ocorre internamente, na forma de grandes agregados ou grnulos no citoplasma. o meio
de armazenamento mais importante nas clulas animais, servindo de reservatrio
de glicose. Os hepatcitos so responsveis pela manuteno da glicemia, ao
mesmo tempo em que fornecem glicognio para outras clulas do organismo.

Principal fonte de energia no crebro, os glicognios produzidos pelos astrcitos
so mobilizados para atividade neuronal.
Figura 8. Glicognio distribudo no citoplasma de clula eucaritica.
2.11. Citoesqueleto
O citoesqueleto confere s clulas eucariticas a manuteno da diversidade de formas, a realizao de movimentos coordenados e direcionados e
sua estruturao interna. Esse citoesqueleto depende de uma complexa rede
de filamentos de protenas que se estende por todo o citoplasma, sendo
constitudo por trs principais tipos de estruturas: os microtbulos, os filamentos
intermedirios e os filamentos de actina.
Os microtbulos so formados por subunidades: b-tubulina e a-tubulina,
as quais se associam uma s outras, conferindo-lhe assim uma forma cilndrica,
com o dimetro de 25 mm. Os microtbulos direcionam o deslocamento de
vesculas, participam da diviso celular com a formao do fuso mittico para o
deslocamento dos cromossomos e esto presentes na manuteno da estrutura
celular e na morfologia dos clios e flagelos.
Os filamentos intermedirios recebem esta denominao por apresentarem um dimetro intermedirio entre filamentos de actina e microtbulos (10
mm de dimetro). Sua composio proteica, formando uma rede estrutural
por toda a clula.
Os filamentos de actina (Figura 9) esto distribudos por todo o citoplasma
das clulas eucariticas e apresentam dimetro de 5 mm. Eles so formados por
uma protena globular, a actina, que apresenta as isoformas: a, b e g. Estes
filamentos, nas clulas epiteliais, esto concentrados nos prolongamentos
citoplasmticos, participando, juntamente com os desmossomos, do contato
com outras clulas e com a membrana basal, mantendo, assim, a integridade
organizacional do epitlio. Nos miofibroblastos, importantes clulas do tecido
muscular, os filamentos de actina esto organizados paralelamente membrana
plasmtica, mantendo estas clulas tensionadas ao substrato e so, ento,
denominados fibras de estresse.
Figura 9. Fibra estresse (asterisco) localizada abaixo da membrana, formada por
microfilamentos de actina.
2.12. Centrossomo
O centrossomo, principal centro organizador de microtbulos, est localizado prximo ao ncleo da clula em intrfase e contm um par de formaes cilndricas e curtas dispostas perpendicularmente entre si e envolvidas por
material pericentriolar, denominadas centrolos. Estas estruturas so formadas
por nove triplex de microtbulos, semelhantes aos corpos basais de flagelos e
clios. Esto presentes na maioria das clulas animais, porm ausentes nas
clulas vegetais.
3. Tcnicas para visualizao das organelas celulares
3.1. Protocolos para revelao do ncleo
O ncleo pode ser visualizado tanto por microscopia de campo claro,

com a utilizao do corante Giemsa, quanto por microscopia de fluorescncia,
utilizando o corante fluorescente DAPI (4,6-diamidino-2-phenilindole). Por
ME, ele pode ser visualizado quando se utiliza acetato de uranila, que torna a
cromatina eletrodensa.
3.1.1. Marcao nuclear com DAPI
1- Fixar com 4% de PFA por 20 minutos a 4C;

2- Lavar duas vezes com PBS;
3- Lavar duas vezes com soluo de BSA 1% diluda em PBS
por 10 minutos cada;
4- Incubar com DAPI 1:10.000 em 0,85% NaCl por 5 minutos
em temperatura ambiente;
5- Lavar trs vezes com soluo de BSA 1% diluda em PBS
por 10 minutos cada;
6- Montar com DABCO;
7- Selar com esmalte.
3.1.2. Colorao com Giemsa
1- Fixar com Bouin por 5 minutos em temperatura ambiente;

2- Lavar trs vezes com lcool etlico a 70%;
3- Lavar uma vez com gua destilada;
4- Corar com Giemsa (6 gotas de corante para cada 1mL de tampo
fosfato 0,2M soluo de uso filtrado), por 15 minutos em temperatura ambiente;

5- Lavar duas vezes em gua destilada. Para clarificao, passar em
srie de acetona / xilol (acetona 100% duas vezes, acetona 70% /

xilol 30%, acetona 50% / xilol 50%, acetona 30% / xilol 70%,
xilol 100% duas vezes);
6- Montar com Permount.
Preparao do tampo fosfato 0,2M:

Soluo A:
NaH2PO4 . 1 H2O (fosfato de sdio monobsico) ................. 27,6 g
gua tridestilada.......................................................................... 1 L
Soluo B:
Na2HPO4 (fosfato de sdio bibsico)...................................... 39,4 g
gua tridestilada.............................................................................1L
Soluo estoque do tampo:
Soluo A................................................................................28 mL
Soluo B.................................................................................72 mL
Soluo de uso:
Diluir 1:10 (soluo estoque: gua tridestilada).
3.2. Protocolo de marcao do retculo endoplasmtico
O RE pode ser observado por microscopia de fluorescncia pela utilizao de marcador fluorescente especfico, o ER-Tracker. E, por microscopia
eletrnica de transmisso, utilizando-se citoqumica ultraestrutural, revelando a
enzima glicose-6-fosfato.
3.2.1. ER-Tracker
Preparao de reagentes
O ER-Tracker Green fornecido liofilizado em 100 mg. Preparar uma
soluo estoque de 1mM. Para isso, deve-se diluir todo o contedo do frasco
liofilizado em 128 mL de DMSO. recomendado que esta soluo seja
separada em alquotas e estocada em freezer com dessecante.
Preparo da soluo de marcao
Diluir a soluo estoque de ER-Tracker a 1 mm para a concentrao
recomendada de 500 mm em meio simples;
Para clulas aderidas, remover o meio da cultura, lavar trs vezes com
meio simples e adicionar a soluo de marcao pr-aquecida. Incubar

as clulas por 30 minutos a 37 C. Substituir a soluo de marcao
por meio de cultura e visualizar as clulas, utilizando microscpio de
fluorescncia. Se as clulas a serem marcadas precisarem ser fixadas,
consultar as etapas de marcao a seguir.
Fixao das clulas ER-Tracker Green
Lavar as clulas em meio simples por trs vezes. Fixar com PFA 4% por
20 minutos em temperatura ambiente. Lavar trs vezes com PBS, montar entre lmina e lamnula com DABCO.
| 39
3.3. Protocolo para marcadores seletivos de mitocndria
Mitocndrias podem ser reveladas com marcadores fluorescentes especficos, como MitoTracker e Rhodamine 123, os quais so visualizados por
microscopia de fluorescncia. Graas sua morfologia tpica, so facilmente
identificadas durante as anlises por microscopia eletrnica.
3.3.1. Mito-Tracker
Preparando a soluo estoque
Dissolver o produto liofilizado em DMSO de alta qualidade para uma

concentrao final de 1 m; o peso molecular indicado no rtulo do
produto. Solues em que se utilizam derivados di-hidro devem ser
preparadas no dia do uso. A soluo estoque pode ser armazenada em
freezer a -20 C, protegida da luz.
Preparando soluo de marcao
A concentrao para uma boa marcao varia de acordo com a sua

aplicao. As condies sugeridas aqui podem necessitar de modificaes baseadas nos tipos celulares utilizados ou em outros fatores, tais
como permeabilidade das clulas ou dos tecidos a serem marcados.
Diluir a soluo estoque de MitoTracker a 1 mm para uma soluo de
uso com meio de crescimento Dulbeccos modified Eagle medium
(D-MEM), sem soro, ou de acordo com o meio em que as clulas
esto crescendo. Para marcao em clulas vivas, usar uma concentrao
de 100 mm.
Marcando clulas aderidas
Crescer as clulas em lamnulas dentro de uma placa de Petri coberta

pelo meio de cultura apropriado. Quando as clulas alcanarem a confluncia desejada, remover o meio da placa, lavar trs vezes em meio
simples e adicionar o meio pr-aquecido (37 C) contendo MitoTracker.
Incubar as clulas por 30 minutos sob condies de crescimento apro-
priadas para cada tipo celular. Substituir o meio com marcador por meio
pr-aquecido e observar as clulas em microscpio de fluorescncia,
utilizando o filtro adequado. Para fixar as clulas, deve-se retirar o meio
com marcador e lav-las com meio simples. Fixar com PFA 4% por 20
minutos em temperatura ambiente, lavar trs vezes com PBS e montar
entre lmina e lamnula com DBCO.
3.4. Protocolo de marcao de grnulos de glicognio
Para caracterizar a expresso de polissacardeos grnulos de glicognio ,

utilizamos mtodos citoqumicos ultraestruturais, empregando a tcnica de Thiry.
O material deve ser processado de acordo com o protocolo de microscopia
eletrnica de transmisso, sendo as amostras includas em resina Epon. Os
cortes ultrafinos so obtidos e recolhidos em grades de ouro e submetidos ao
seguinte protocolo:
3.4.1. Thiry
1- As clulas so oxidadas por 20 minutos com 1% de cido peridico;

2- Lavadas rapidamente por duas vezes em gua destilada;
3- Incubadas por 30 minutos, 24, 48 ou 72 horas, em cmara mida,
com 2% de tiocarbohidrazida diluda em 20% (v/v) de cido actico;
4- Lavadas sucessivamente em concentraes decrescentes de cido
actico (10%, 5%, 3% e 1%) por 1 minuto cada;
5- Reveladas com 1% de proteinato de prata diludo em soluo aquosa
por 30 minutos. OBS: metodologia alternativa, aps as etapas descritas
anteriormente, a revelao ser realizada pelo vapor de tetrxido de
smio por 1 minuto;
| 41
6- Lavadas com gua (uma vez rapidamente), seguidas de uma lavagem

por 10 minutos, trocando a gua sucessivas vezes;
7- Ao final, os cortes sero examinados diretamente ao microscpio
eletrnico EM10C da Zeiss, sem prvia contrastao.
Os controles da reao sero feitos por:
a) Omisso de tiocarbohidrazida;
b) Omisso da oxidao com cido peridico;
c) Omisso dos agentes reveladores.
3.5. Protocolo para marcao de compartimentos
intracelulares cidos
A marcao de compartimentos intracelulares cidos lisossomos

pode ser feita utilizando os marcadores laranja de acridina e Lysotraker:
1- Diluir a soluo estoque a 1 mM para uma soluo de uso a uma
concentrao de 75 nM. A diluio deve ser feita em meio de cultura
simples;
2- Remover o meio da placa, lav-la com meio simples trs vezes e
adicionar o meio pr-aquecido (37 C) contendo o marcador;
3- Incubar as clulas com laranja de acridina ou Lysotraker diluda em
meio utilizado para o cultivo celular na concentrao de 10mg/ml e
75 nM, respectivamente, por 30 minutos a 37 C, sob condies
apropriadas para crescimento de cada tipo celular;
4- Aps incubao, lavar duas vezes em salina tamponada com fosfato
(PBS) e observar as clulas em microscpio de fluorescncia com o
filtro adequado;
5- Fixar com 2% paraformaldeido durante 20 minutos a 4 C e, em
seguida, lavar trs vezes com PBS;
6- Em seguida, incubar com 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)

para visualizao do ncleo por cinco minutos temperatura ambiente;
7- Lavar com PBS;
8- Montar a lmina com antifading 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane
(DABCO).
Referncias bibliogrficas
ALBERTS, B. et al. Biologia molecular da clula. 4. ed. Porto Alegre: Artes Mdicas,
2004.
CARVALHO, H. F.; RECCO-PIMENTEL, S. M. A Clula. So Paulo: Manole, 2001.
GIEMSA, G. Eine Vereinfachung und Vervollkommung meiner Methylenblau-EosinFrbemethode zur Erzielung der Romanowsky-Nochtschen Chromatinfrbung. Centralblatt
fr Bakteriologie, I, Abteilung Originale, v. 32, p. 307-313, 1904.
THIRY, J. P.; RAMBOURG, A. Cytochimie des polysaccharides. J. Microscopie, v.
21, p. 279-282, 1974.
| 43
Captulo 2
Histologia
Daniel Santos Souza
Leandro Medrado
1. Introduo
A histologia um ramo da cincia que estuda os tecidos de animais e

vegetais e como estes tecidos se organizam e se relacionam para compor estes
diferentes organismos.
A separao dos tecidos em estruturas distintas algo artificial e
feita com fim puramente didtico, como estratgia para a compreenso de
suas caractersticas principais. S com um bom conhecimento das suas caractersticas individuais poderemos entender e avaliar a histologia nos diferentes
rgos do organismo e como os diferentes tecidos se inter-relacionam de
maneira dinmica.
O termo histologia foi usado pela primeira vez em 1819 por Mayer,
ao utilizar o termo tecido (do grego histos) cunhado pelo anatomista e
fisiologista francs Xavier Bichat (1771-1802). Foi Bichat quem aprofundou
a anlise anatomopatolgica, deslocando a doena dos rgos para os tecidos,
utilizando como princpio bsico o isomorfismo dos tecidos (Foucault, 2008).
De acordo com suas anlises, o organismo era composto de tecidos com

texturas semelhantes, que podiam ser lidas, identificando as similaridades,
parentescos e inter-relaes das doenas inscritas na configurao do corpo.
Ao identificar estas semelhantes texturas do organismo e suas respectivas funes que nasce a histologia como base da que conhecemos hoje.
Nos humanos, os tecidos so divididos em quatro grandes grupos de
acordo com as diferenas morfolgicas e suas especializaes funcionais
(condutibilidade, contratilidade, absoro, excreo e reproduo, dentre outras).
Esses quatro tecidos so: os tecidos epiteliais, tecidos conjuntivos, tecidos musculares e tecidos nervosos.
ecido epitelial
2. T
Tecido
O tecido epitelial se caracteriza principalmente por ser constitudo de

clulas bem justapostas, geralmente polidricas, com pouca substncia intercelular
e ausncia de vascularizao.
As clulas epiteliais so bastante dinmicas, possuindo uma elevada
atividade mittica que promove a constante renovao epitelial. Essa taxa de
renovao, entretanto, varivel de acordo com o tecido avaliado.
As funes mais caractersticas dos epitlios so a de revestimento de
superfcies externas e internas do organismo, e a formao das glndulas.
As clulas epiteliais so provenientes das clulas que constituem os trs
folhetos germinativos do embrio (ectoderma, endoderma e mesoderma).
A forma de suas clulas e a justaposio celular que apresentam
garantida por um conjunto de junes celulares especializadas. Essas junes
celulares vo ter apresentao varivel de acordo com a especificidade funcional do tecido no qual se encontram, mas de uma forma geral apresentam as
seguintes caractersticas:
Histologia | 45
Znula de ocluso: localizada na poro apical das clulas epiteliais,
formada por protenas integrais da membrana plasmtica que se ligam ao

cinturo adesivo das clulas vizinhas, impedido a passagem de molculas
entre elas, havendo, portanto, obliterao do espao intercelular.
Znula de adeso: localizada abaixo da znula de ocluso, tem como
funo aumentar a adesividade intercelular.

Desmossomos: podem ser comparados a um boto de presso, cons-
titudos por duas metades que se encaixam, estando uma metade localizada na membrana de uma das clulas e, a outra, na clula vizinha. So
responsveis por conferir maior adeso celular e resistncia.
Junes comunicantes: interconectam clulas epiteliais, mas esto pre-
sentes tambm em alguns tecidos musculares, permitindo a troca de

molculas por meio dos poros que constituem.
Membrana basal, lmina basal e camada basal
Como o tecido epitelial no possui vasos sanguneos, apesar de participar

na constituio deles, ele nutrido por meio da difuso dos nutrientes que
chegam por meio de vasos sanguneos presentes no tecido conjuntivo (este sim,
rico em vasos sanguneos). Uma fina camada composta de colgeno do tipo IV,
a protena laminina e proteoglicanos1 a responsvel por selecionar e filtrar o que
se poder passar do tecido conjuntivo para as clulas epiteliais. Essa estrutura a
lmina basal, que totalmente sintetizada pelas clulas epiteliais, sendo somente
visvel em microscopia eletrnica. A lmina basal desempenha importante funo
de nutrir as clulas epiteliais, alm de sustent-las e promover sua adeso ao
tecido conjuntivo.
Proteoglicanos so formados por polissacardeos que formam ligaes covalentes com protenas. So
molculas grandes capazes de manter um grande espao de hidratao na matriz extracelular.
1
Em algumas regies, em continuao lmina basal, h uma camada de

fibras reticulares (principalmente colgeno do tipo III) conjugadas a complexos
de protenas, produzidas pelo tecido conjuntivo. Esses elementos formam uma
espessa camada, identificada na microscopia de luz pela reao do cido
peridico + reativo de Schiff (PAS) ou impregnao pela prata. Nem todos
os estudiosos da rea concordam com esta distino, mas a lmina basal
somada camada de fibras reticulares que se denomina membrana basal (MB).
2.1. Epitlios de revestimento
O tecido epitelial de revestimento responsvel por separar o tecido

conjuntivo subjacente do meio externo ou das cavidades internas do corpo e
funciona como um protetor e um controlador da passagem de substncias do
meio externo para o tecido conjuntivo (TC).
Classificao dos epitlios (EP)
Os epitlios de revestimento se classificam principalmente de acordo

com a forma das clulas e o nmero de camadas nas quais essas clulas esto
dispostas.
De acordo com a forma das clulas, os epitlios podem ser classificados em:
Epitlios pavimentosos (Figura 1A): clulas mais largas do que
altas, achatadas como ladrilhos e com o ncleo redondo ou alongado e central.
Histologia
| 47
Figura 1A. Epitlio pavimentoso. EP epitlio, MB membrana basal, TC

tecido conjuntivo.
Epitlios cbicos (Figura 1B): clulas com altura e largura equivalen-
tes, com forma de cubo e ncleo redondo central.

Figura 1B. Epitlio cbico. EP epitlio, MB membrana basal, TC
tecido conjuntivo.
Epitlios cilndricos (Figura 1C): tambm chamados de prismticos
ou colunares, estes epitlios possuem clulas cuja altura maior do

que a sua largura. Suas clulas so alongadas, com um ncleo basal
tambm alongado.
Figura 1C: Epitlio cilndrico. EP epitlio, MB membrana basal, TC

tecido conjuntivo.
Epitlio especial ou de transio: clulas epiteliais cuja forma varia
constantemente, impedindo sua classificao nas categorias anteriores.

De acordo com o nmero de camadas, os epitlios podem ser:
Simples: formado por uma s camada celular, na qual todas as clulas
esto em contato com a lmina basal, como representado nas figuras

1A, 1B e 1C.
Estratificado (Figura 2): formado por mais de uma camada celular, de
forma que s as clulas da base (camada basal) tm contato com a

lmina basal.
Figura 2: Tecido epitelial
estratificado. EP epitlio, MB
membrana basal, TC tecido
conjuntivo.
Histologia | 49
2.2. Epitlios glandulares
As clulas epiteliais glandulares so originadas durante o processo de proliferao das clulas do epitlio de revestimento no desenvolvimento embrionrio. Essas
clulas de revestimento invadem o tecido conjuntivo subjacente e se diferenciam,
especializando-se na elaborao de produtos de secreo variados (Figura 3).
Figura 3: Formao das glndulas pela invaginao do tecido epitelial em
direo ao tecido conjuntivo. EP epitlio, MB membrana basal, TC
tecido conjuntivo.
Os epitlios glandulares podem ser classificados de acordo com diversos aspectos:

Glndulas unicelulares e multicelulares
Clulas que desempenham, isoladamente, funo de secreo so chamadas de glndulas unicelulares. Dessas, o melhor exemplo a clula caliciforme,
presente tanto na via digestria quanto na via respiratria, atuando na produo de muco.
O termo glndula , entretanto, usado de forma mais comum para se
fazer referncia s glndulas multicelulares, que so compostas pelo agrupamento de vrias clulas secretoras. As glndulas sudorparas, salivares e adrenais
so alguns exemplos de glndulas multicelulares.
Glndulas excrinas e endcrinas
Durante o processo de diferenciao celular e formao das glndulas, quando ocorre a invaso do tecido conjuntivo pelo epitlio de revestimento embrionrio,
algumas glndulas mantm sua ligao s clulas de revestimento. Essa ligao

adquire a forma de um tubo ou ducto celular pelo qual as secrees podem ser
eliminadas para a superfcie do tecido, do rgo, ou mesmo do organismo.
Dessa forma, quando h um ducto secretor, a glndula considerada excrina
(Figura 4).
Quando, durante este processo de diferenciao celular, as clulas
glandulares no mantm nenhuma ligao com o epitlio de revestimento,
isolando-se no interior do tecido conjuntivo, a glndula chamada endcrina.
Nesse caso, devido ausncia de um ducto secretor, estas glndulas
endcrinas liberam suas secrees, os hormnios, diretamente na corrente
sangunea (Figura 5).
Figura 4. Gndula Excrina. EP epitlio, MB - membrana basal, TC
- tecido conjuntivo, DE - ducto
excretor, PS - poro secretora
Figura 5. Gndula Endcrina. EP epitlio, MB - membrana basal, TC tecido conjuntivo, VS - vaso sanguneo, PS - poro secretora, HR hormnio
No corpo humano, o fgado2 e o pncreas3 realizam funes excrinas

e endcrinas, e so chamados glndulas mistas.
A funo excrina do fgado representada pela produo da bile, que liberada na luz do tubo digestrio
(mais especificamente no duodeno). O fgado tambm classificado como endcrino por produzir protenas
(como a albumina, protrombina e fibrinognio) que so liberadas diretamente na corrente sangunea.
2
A secreo excrina do pncreas o suco pancretico, rico em enzimas digestivas e liberado no duodeno.
A poro endcrina do pncreas produz e libera os hormnios insulina e glucagon, ambos fundamentais no
metabolismo da glicose no organismo.
3
Histologia | 51
Glndulas mercrinas, holcrinas e apcrinas (Figura 6)
As glndulas so classificadas tambm pelo modo como as suas clulas secretam.

Nas glndulas mercrinas, as clulas glandulares eliminam somente a
sua secreo, por meio de exocitose, mantendo intacto o seu citoplasma
(pncreas, por exemplo).
Nas glndulas holcrinas, as clulas glandulares acumulam os seus produtos de secreo no citoplasma, morrem em seguida, desfazendo-se e passando a
constituir, elas prprias, a sua secreo (glndulas sebceas, por exemplo).
As glndulas apcrinas representam um meio-termo entre estas e
outras formas de secretar. Nelas, as clulas glandulares, ao eliminarem sua
secreo, perdem certa quantidade do seu citoplasma apical (glndulas
mamrias, por exemplo).
Figura 6. Diferentes modos de secretar. Glndulas mercrinas, apcrinas e
holcrinas. GS - grndulos de secreo, EP - epitlio, MB - membrana basal,
TC - tecido conjuntivo.
Um grupo de clulas que desempenha uma atividade de apoio secreo glandular excrina so as clulas mioepiteliais. Trata-se de clulas epiteliais
cujo citoplasma contm filamentos de actina e de miosina, o que lhes confere a
capacidade de se contrair. Essas clulas possuem uma forma estrelada, e se

localizam entre a lmina basal e a clula secretora, ligando-se umas s outras,
envolvendo assim a poro secretora da glndula. Elas atuam contraindo-se e
ajudando a glndula excrina a expelir seu produto pelo ducto excretor.
3. T
Tecidos
ecidos conjuntivos
Os diversos tipos de tecido conjuntivo existentes no corpo tm a funo de unir outros tecidos, conferindo-lhes sustentao e dando conjunto ao
corpo, da sua denominao.
A denominao tecido conjuntivo, entretanto, um ttulo geral que
designa um grupo de diversos tecidos com vrias funes. O tecido conjuntivo
compreende um tecido tradicionalmente conhecido como tecido conjuntivo
propriamente dito e um amplo grupo de tecidos chamados tecidos conjuntivos especiais, com funes altamente especializadas. Esse grupo de tecidos
conjuntivos especiais compreende os tecidos adiposo, cartilaginoso, sseo,
sanguneo e hematopoitico, que sero tratados mais adiante.
De uma forma geral, todos os tecidos conjuntivos so originrios de
clulas alongadas no mesnquima embrionrio4, e so formados essencialmente por clulas mesenquimais e uma matriz extracelular abundante. Sero
variaes tanto nas caractersticas celulares quanto nas peculiaridades da matriz extracelular que determinaro, nos diferentes tecidos conjuntivos, sua
especializao no desempenho de determinadas atividades e funes.
3.1. Tecido conjuntivo propriamente dito
O tecido conjuntivo propriamente dito o que mantm as caractersticas mais elementares nos seus componentes. ricamente vascularizado e se
Clulas mesenquimais ou mesenquimatosas so originadas do mesoderma, folheto germinativo intermedirio dos tecidos embrionrios.
4
Histologia | 53
encontra sempre abaixo do tecido epitelial, dando-lhe suporte e garantindo

sua nutrio.
Suas clulas tero funes na manuteno da homeostase5 tecidual, mas
no tero caractersticas especializadas no sentido de conferir especificidade
funcional ao tecido. Da mesma forma, a matriz extracelular se apresentar em
sua configurao mais bsica.
Clulas do tecido conjuntivo propriamente dito
Grande parte das clulas encontradas nos tecidos conjuntivos produzida nos prprios tecidos, mas algumas outras clulas, como os leuccitos, por
exemplo, que transitam na corrente sangunea, podem habitar temporariamente
o interior desses tecidos. De um modo geral, as clulas do tecido conjuntivo
propriamente dito so:
Fibroblastos/fibrcitos
So as mais importantes clulas deste tecido conjuntivo, estando responsveis pela produo e manuteno da matriz extracelular.
Os fibroblastos (Figura 7) so clulas jovens, com forma estrelada
devido a seus vrios prolongamentos celulares. Apresentam tambm grande
basofilia6, devido ao seu ncleo grande e ao retculo endoplasmtico granular
e complexos de Golgi desenvolvidos, o que indica a sua produo ativa de
componentes da matriz extracelular.
Funcionando de certa maneira como uma regra entre os tecidos conjuntivos, a clulas essenciais dos tecidos, jovens e encarregadas de produzir
a matriz extracelular, tm em sua nomenclatura o termo blasto, que indica
Homeostase a propriedade de um sistema orgnico regular o seu ambiente interno de modo a manter
uma condio estvel, mediante mltiplos mecanismos de ajuste.
6
A basofilia caracterizada pela afinidade de uma clula ou de um tecido pelos corantes bsicos por
possuir carter cido. Indica a presena de organelas associadas produo ativa de substncias
proteicas, como retculo endoplasmtico granular, complexo de Golgi e polirribossomos no citoplasma.
5
que esta clula est em crescimento ativo e sintetizando matriz extracelular.

Essas clulas, porm, no se mantm continuamente ativas, e quando entram
em estado de repouso retraem-se, tornando-se menores e mais alongadas,
sem os prolongamentos celulares, com organelas menos desenvolvidas. Essas
clulas passam, ento, a receber o sufixo cito. Nesse caso, os fibroblastos,
ao entrarem em repouso, adquirem as caractersticas descritas acima, e passam a ser chamados fibrcitos (Figura 7), embora esse termo no deva ser
mais empregado, pois sugeriria um tipo celular diferenciado, o que no a
realidade, mas representa apenas um momento funcional do fibroblasto. Esse
processo pode ser revertido se o tecido for lesionado ou se, por outro
motivo, houver a necessidade de novos fibroblastos para produzir novamente a matriz extracelular. Nestes casos, os fibrcitos so estimulados e passam,
de novo, a produzir ativamente, readquirindo suas caractersticas peculiares
de quando estavam ativos.
Figura 7. Clulas do tecido conjuntivo: fibroblasto e fibrcito
FIBROBLASTO
FIBRCITO
Macrfagos
So clulas grandes e ameboides, com ncleo ovoide ou em forma

de rim, que se deslocam continuamente entre as fibras procura de bactrias e restos de clulas. Sua funo principal proteger os tecidos,
fagocitando agentes infecciosos que penetram no corpo, e identificando
Histologia
| 55
substncias potencialmente nocivas ao organismo, apresentando antgenos

e alertando o sistema imunolgico.
Os macrfagos fazem parte do sistema fagocitrio mononuclear (SFM),
derivando indiretamente de clulas da medula ssea.
Mastcitos
Clulas globosas, grandes, com o ncleo pequeno e central e o citoplasma

repleto de grnulos basfilos. Seu ncleo, s vezes, fica encoberto pela grande quantidade de grnulos e no visto.
Plasmcitos
Essas clulas esto presentes em pequena quantidade nos tecidos conjuntivos, sendo responsveis pela produo de imunoglobulinas (anticorpos)
importantes nos processos imunolgicos. So derivadas da ativao, proliferao e diferenciao de linfcitos B originrios da medula ssea.
Em caso de aumento da permeabilidade vascular, causada por processos
inflamatrios, outros leuccitos podem ser tambm encontrados no tecido
conjuntivo propriamente dito.
Matriz Extracelular
A matriz extracelular um meio no qual as clulas do tecido conjuntivo esto

dispostas, e lhes confere nutrio e substrato para sua organizao e atuao.
formada por um conjunto de fibras imersas em uma substncia fundamental amorfa.
Elementos fibrosos do tecido conjuntivo
As principais fibras que compem o tecido conjuntivo so compostas

de protenas produzidas pelos fibroblastos (no caso do tecido conjuntivo
propriamente dito). Sua distribuio varia conforme o tipo de tecido conjuntivo, sempre de acordo com as caractersticas morfofuncionais destes tecidos.
Os elementos fibrosos observados por meio de tcnicas histoqumicas
nos preparados histolgicos so:
Fibras colgenas
O colgeno um tipo de protena que possui mais de 20 variaes
conhecidas, apresenta um ntido padro de estrias transversais e representa a
protena mais abundante do corpo, constituindo 30% de seu peso seco. As
fibras colgenas so o principal componente da matriz extracelular e podem ter
caractersticas peculiares que as diferenciam nos vrios tipos conhecidos. As
fibras colgenas tm como componente bsico a protena colgeno, e, para os
estudos histolgicos mais bsicos, os tipos mais importantes de colgeno so:
Colgeno I: o tipo de colgeno mais abundante em todo o
organismo, sendo capaz de formar fibras espessas, as quais conferem resistncia aos tecidos.
Colgeno II: o tipo de colgeno encontrado na matriz
extracelular das cartilagens, formando fibrilas e atuando como molas

biomecnicas.
Colgeno III: forma delicadas fibrilas, sendo o principal consti-
tuinte das fibras reticulares.

Colgeno IV: so fibrilas extremamente delicadas presentes na
lmina basal.
Fibras reticulares
Apesar da designao fibras, as fibras reticulares so formadas principalmente por colgeno do tipo III e, na realidade, so fibrilas delicadas. Por essa
razo, muitos autores preferem inclu-las no sistema de fibras colgenas, isto ,
Histologia
| 57
elementos fibrilares que tm o colgeno como protena bsica, independente

do tipo do colgeno.
As fibras reticulares so delicadas e formam uma rede de tranado firme,
dando sustentao aos rgos hematopoiticos7 e s clulas musculares,
estando presente na parede de rgos de forma varivel, como no intestino,
no tero e nas artrias. So chamadas fibras argirfilas por sua grande afinidade aos mtodos histoqumicos que tm como base a prata, como a reticulina
de Gomori.
Fibras elsticas
So fibras delgadas que se ramificam e formam uma malha irregular. As
fibras elsticas tm uma cor amarelada a fresco, que a sua presena abundante
confere a alguns tecidos. As fibras elsticas so, na verdade, formadas por
fibrilas maiores da glicoprotena fibrilina, na forma de um arcabouo, que ter
sua poro central preenchida pela protena elastina.
Estas fibras vo conferir elasticidade aos tecidos, sendo evidenciadas por
tcnicas histoqumicas especiais, particularmente nos tecidos de sustentao do
pulmo, na pele e nos vasos sanguneos.
Substncia fundamental
A substncia fundamental corresponde a uma matriz gelatinosa hidratada,

na qual as fibras e as clulas esto imersas. composta em parte por um
lquido chamado fluido tissular ou plasma intersticial, que derivado do plasma
sanguneo e apresenta a mesma composio; porm, a gua presente na substncia fundamental no gua lquida, mas est sob a forma de gua de
rgos hematopoiticos so aqueles capazes de produzir os elementos figurados do sangue, como a
medula ssea hematognica, o fgado e o bao.
7
solvatao. A esse meio aquoso somam-se glicosaminoglicanos8, proteoglicanos

e glicoprotenas adesivas que atuam como componentes estruturais da matriz
extracelular, relacionando-se com as clulas e dando coeso a este conjunto.
Variedades do tecido conjuntivo propriamente dito
O tecido conjuntivo propriamente dito pode se apresentar como frouxo

e denso.
O tecido conjuntivo propriamente dito frouxo, ou simplesmente tecido conjuntivo frouxo, o tecido conjuntivo com ampla distribuio no
corpo, estando presente em praticamente todos os rgos. chamado de
frouxo, pois apresenta uma consistncia delicada, com clulas e fibras esparsas,
casualmente organizadas e largamente espaadas, imersas em abundante
substncia fundamental.
O tecido conjuntivo denso, em contrapartida, se caracteriza pela abundncia de elementos fibrosos, preferencialmente fibras de colgeno, o que lhe
confere grande resistncia, no deixando grandes espaos visveis de substncia
fundamental. De acordo com a disposio de suas fibras, pode ser subclassificado
ainda como tecido conjuntivo denso modelado ou no modelado.
Tecido conjuntivo denso modelado: apresenta predomnio de fibras
colgenas orientadas em um mesmo sentido, paralelas e alinhadas aos

fibroblastos e s clulas que as produzem. Essa orientao em um determinado sentido confere ao tecido maior capacidade de resistncia
trao. Esse tecido denso e modelado o principal constituinte dos
ligamentos, tendes e aponeuroses.
Glicosaminoglicanos so polissacardeos grandes que contribuem para a integridade tecidual e auxiliam

na difuso de substncias pela matriz extracelular (Stevens e Lowe, 2001).
8
Histologia | 59
Tecido conjuntivo denso no modelado: neste tecido, h grande
quantidade de fibras colgenas, que esto dispostas de maneira irregular, orientadas em vrias e distintas direes.
3.2. Tecido adiposo
O tecido adiposo um tecido conjuntivo especial caracterizado pela

predominncia de clulas especializadas, os adipcitos, associados a uma grande irrigao sangunea.
O tecido adiposo corresponde, em pessoas de peso normal, a 2025% do peso corporal na mulher e 15-20% no homem.
Esse tecido considerado a maior reserva de energia do corpo, apesar
de no ser a nica. Alm da dimenso do depsito energtico que o tecido
adiposo representa, por meio dos triglicerdeos, esse lipdeo ainda mais
eficiente na produo de energia do que o glicognio. Um grama de
triglicerdeos fornece 9,3 Kcal, enquanto um grama de glicognio fornece
apenas 4,1 Kcal de energia.
O tecido adiposo no tem s a funo de armazenar energia, mas ele
atua tambm:
na modelagem da pele, tendo uma distribuio diferenciada em homens
e mulheres, conferindo-lhes as formas que lhes so peculiares;

na absoro de choques, amortecendo impactos externos sobre o
corpo;
no isolamento trmico, impedindo a perda de calor do corpo;
preenchendo espaos e sustentando rgos.
Os tecidos adiposos podem ser de dois tipos:

Tecido adiposo unilocular
Nos seres humanos adultos, praticamente todo o tecido adiposo o

unilocular (Figura 8). Os adipcitos uniloculares so clulas arredondadas e
volumosas, com um ncleo achatado localizado na periferia da clula. Seu
citoplasma escasso e aparece de forma delgada envolvendo a gota lipdica.
Esse tipo de tecido adiposo possui uma cor que varia do branco ao amarelo a
fresco, de acordo com a dieta do indivduo e a ingesto de alimentos com
caroteno, um corante natural que escurece a cor da gordura.
Ao nascimento, o tecido adiposo do beb forma uma camada uniformemente distribuda sob a pele, chamada panculo adiposo. Com o envelhecimento do indivduo, aspectos genticos e a liberao de hormnios sexuais e
hormnios do crtex da glndula adrenal, essa gordura redistribuda por
todo o corpo, remodelando o corpo do jovem.
Tecido adiposo multilocular
O tecido adiposo multilocular (Figura 8) recebe esse nome porque seus

adipcitos apresentam vrias pequenas gotas lipdicas distribudas em seu
citoplasma, em contraposio grande e nica gota do tecido unilocular.
tambm chamado de tecido adiposo pardo, devido vascularizao abundante
e presena de numerosas mitocndrias (que tm cor avermelhada) em
suas clulas.
Esse tecido tambm chamado, em animais que hibernam, de glndula
hibernante, por ser abundante e possuir clulas dispostas de forma epitelioide.
A principal funo deste tecido gerar energia na forma de calor,
auxiliando na termorregulao do organismo.
Histologia
| 61
Figura 8. Tipos celulares do tecido adiposo.
3.3. Tecido cartilaginoso
A cartilagem um tipo de tecido conjuntivo formado de dois tipos

celulares, condrcitos e condroblastos, e de uma matriz extracelular abundante, altamente especializada e vascular.
Tem as funes de conferir suporte a tecidos moles (anis da traqueia,
por exemplo), revestir as superfcies articulares dos ossos, e propiciar a formao e o crescimento dos ossos longos.
Formao da cartilagem
Durante sua formao embrionria, as clulas do mesnquima retraem

seus prolongamentos e adquirem uma forma arredondada, multiplicando-se
rapidamente e formando um aglomerado celular. Essas clulas jovens so chamadas condroblastos (Figura 9), e iniciam a sntese da matriz extracelular,
distanciando-se umas das outras.
Quando a matriz comea a adquirir uma consistncia mais rgida, os condroblastos
ficam presos em espaos ligeiramente maiores do que eles, denominados cpsulas ou
condroplastos. Os condroblastos multiplicam-se por mitose, dando origem a grupos
de at 8 condrcitos chamados grupos de isgenos (Figura 9).
Figura 9. Tecido cartilaginoso
Pericndrio
Como o tecido cartilaginoso no possui vasos sanguneos prprios, suas

clulas so nutridas por meio da difuso de substncias a partir de vasos do
tecido conjuntivo adjacente. Desta forma, quase todas as cartilagens so envolvidas por uma camada de tecido conjuntivo chamada pericndrio (Figura 9).
O pericndrio responsvel pela nutrio, oxigenao e eliminao de
resduos metablicos da cartilagem, mas sua importncia vai alm disso. Suas
clulas so semelhantes aos fibroblastos, mas as localizadas mais prximas da
cartilagem podem se multiplicar, dando origem a novos condroblastos.
Nas cartilagens presentes em articulaes sinoviais, a nutrio deste tecido feita por difuso pelo lquido sinovial.
Tipos de cartilagem
Cartilagem hialina
a cartilagem mais comum no corpo humano. Possui uma cor brancoazulada e translcida a fresco e a responsvel pela formao do esqueleto
Histologia | 63
temporrio no desenvolvimento fetal, at que esse esqueleto seja substitudo

por tecido sseo.
encontrada principalmente sustentando as fossas nasais, a traqueia e os
brnquios, na extremidade ventral das costelas e recobre as superfcies articulares dos ossos longos. Localiza-se ainda entre a epfise e a difise9 dos ossos
longos, na forma de um disco cartilaginoso chamado disco epifisrio (Figura
10). esse disco epifisrio o responsvel pelo crescimento dos ossos longos
em comprimento.
Cartilagem elstica
Essa cartilagem encontrada no pavilho auditivo e na epiglote. Possui

uma matriz extracelular semelhante da cartilagem hialina, mas possui ainda
uma rede de fibras elsticas que confere a esse tipo de cartilagem, quando
examinada a fresco, uma cor amarelada.
Cartilagem fibrosa
Tambm chamada de fibrocartilagem, a cartilagem mais resistente das

trs, apresentando caractersticas intermedirias entre o tecido conjuntivo denso
e a cartilagem hialina. Durante sua diferenciao, as fibras de colgeno orientam
as clulas, de forma que esta cartilagem vai apresentar os condrcitos dispostos
em fileiras, de acordo com a disposio das fibras de colgeno.
Na cartilagem fibrosa no existe pericndrio morfologicamente distinto,
sendo esse tecido nutrido pelos vasos do tecido conjuntivo denso ao qual est
intimamente ligado.
Por ser to resistente, encontrada em locais sujeitos a grande presso,
como nos discos intervertebrais e na snfise pubiana.
As extremidades dos ossos longos so chamadas de epfises e o alongamento que as une chamado
de difise. Essas denominaes sero mais bem exploradas no tpico sobre tecido sseo.
9
O crescimento das cartilagens acontece de duas formas:

Crescimento intersticial: s acontece nos primeiros momentos
da vida da cartilagem, referindo-se diviso mittica dos

condroblastos, dando origem aos grupos isognicos e expanso
da cartilagem da resultante.
Crescimento aposicional: esse tipo de crescimento se d a partir
das clulas condrognicas do pericndrio, que se diferenciam em

condroblastos, se multiplicam e produzem uma nova matriz
cartilaginosa, promovendo o crescimento da cartilagem.
3.4. Tecido sseo
Os ossos so os principais componentes do esqueleto, tendo diversas funes:

proteo para rgos como corao, pulmes e o sistema nervoso
central;
sustentao e conformao do corpo;
local de armazenamento de ons de clcio e fsforo10 e a restituio
desses elementos corrente sangunea de acordo com as necessidades

do organismo, ou seja, participam da regulao da calcemia, cuja estabilidade indispensvel ao bom equilbrio de vrias funes orgnicas
(ao de enzimas, permeabilidade de membranas, coagulao do sangue, transmisso do impulso nervoso, contrao muscular etc.);
constituem um sistema de alavancas que, juntamente com os msculos,
permite a locomoo de partes do corpo e a ampliao da fora muscular;

alojam e protegem a medula ssea.
Durante a gravidez, a calcificao fetal se faz em grande parte pela reabsoro desses elementos
armazenados no organismo materno, por isso, recomendvel a ingesto, pela me, de alimentos ricos
em clcio durante a gestao.
10
Histologia | 65
De uma forma geral, nos indivduos adultos, os ossos so constitudos

de uma parte externa de osso compacto, sem cavidades aparentes, e de uma
parte interna, trabecular, com mltiplas cavidades intercomunicantes, constituindo o osso esponjoso.
As cavidades intertrabeculares do osso esponjoso e o canal medular da
difise dos ossos longos correspondem a um espao designado medula ssea,
a qual possui duas variedades de tecido relacionadas com a produo dos
elementos figurados do sangue: medula ssea vermelha ou hematognica (encontrada nos ossos longos, nos ossos chatos, no esterno e nas costelas), na
qual desenvolvem-se os elementos figurados do sangue, e medula ssea amarela, preenchida por tecido adiposo e encontrada na cavidade medular dos
ossos longos.
Tanto o osso compacto quanto o osso esponjoso possuem os mesmos
componentes histolgicos, mudando apenas a sua disposio estrutural, que
lhes confere to distinta aparncia.
Figura 10. Esquema de um osso longo, evidenciando suas pores: epfise,
metfise e difise.
Matriz ssea
A matriz extracelular do tecido sseo pode ser dividida em dois tipos

de constituintes: uma matriz orgnica e uma matriz inorgnica.
Matriz orgnica: formada principalmente por colgeno I, cujas fibras
esto imersas em um meio gelatinoso de mucopolissacardeos, gua e

eletrlitos, alm de glicoprotenas especficas com grande afinidade pelo
clcio (osteocalcina, por exemplo).
Matriz inorgnica: representa cerca de 50% da matriz ssea, e
composta de ons, principalmente de clcio e fosfato, alm de bicarbonato, magnsio, potssio, sdio e citrato em pequenas quantidades.
Assim que produzida, a matriz ssea ainda no est classificada e
possui uma consistncia delicada, sendo chamada osteoide. ons de clcio e
fosfatos provenientes da circulao sangunea se ligam, formando cristais de
hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2). Esses cristais de hidroxiapatita, por sua
vez, ligam-se s fibras de colgeno I do osteoide, promovendo o endurecimento caracterstico do osso.
Clulas do tecido sseo
Osteoblastos
So as clulas do tecido sseo encarregadas de produzir a osteoide, a

parte orgnica da matriz ssea. So clulas grandes e cuboides com vrias
expanses citoplasmticas que se ligam s expanses citoplasmticas dos
osteoblastos vizinhos. Mantm essas caractersticas descritas at o enrijecimento
da matriz ssea decorrente da ligao da hidroxiapatita osteoide.
Ostecitos
Quando ocorre o enrijecimento da matriz ssea, os osteoblastos ficam

aprisionados em espaos chamados lacunas (ou osteoplastos), que circunscre-
Histologia
| 67
vem a estrutura principal das clulas. A partir desse momento, suas caractersticas se modificam e eles passam a ser chamados ostecitos.
A interrupo da produo de matriz faz com que toda a clula se
retraia, tornando-se achatada e com pouca basofilia. Os prolongamentos celulares percorrem canais, os canalculos sseos que vo se ligar s lacunas e
canalculos vizinhos, constituindo uma rede que vai permitir a intercomunicao
entre os prolongamentos dos ostecitos, permitindo a sua nutrio a partir de
vasos sanguneos que atravessam a estrutura ssea.
Embora no produzam mais matriz, a presena dos ostecitos essencial
para a homeostase do tecido e a manuteno da matriz ssea. A morte de uma
dessas clulas seguida pela reabsoro da matriz que a envolve.
Osteoclastos
Localizadas na superfcie do tecido sseo que vai ser reabsorvido,

essas clulas so caracterizadas por sua grande dimenso, sua multiplicidade de
ncleos, sua mobilidade e por possuir vrias projees celulares na face voltada
para o tecido sseo.
A superfcie dos osteoclastos, que est em contato com a regio onde
ocorrer a reabsoro da matriz ssea, rica em microprojees celulares
irregulares, chamadas tambm borda em escova. O citoplasma, principalmente nessas reas, contm abundantes vesculas e vacolos, cujo material
vai realizar a hidrlise enzimtica da osteoide, liberando o clcio para ser
reutilizado pelo organismo.
Todo tipo de osso vai possuir dois elementos essenciais que revestem
suas superfcies internas e externas. Essas estruturas so, respectivamente, o
endsteo e o peristeo, e so responsveis, principalmente, pela nutrio,
crescimento e recuperao de danos nos ossos.
Endsteo: representado por uma camada de clulas osteognicas
achatadas que revestem a cavidade do osso esponjoso, o canal medular

e os canais de Havers e de Volkmann.
Peristeo: a camada de tecido conjuntivo denso, muito fibroso na
sua poro mais externa, estando ancorado ao osso por suas fibras
colgenas, que a ele se ligam fortemente (fibras de Sharpey). Sua
poro mais interna, mais prxima do osso, mais celular, com clulas
osteoprogenitoras, sendo bastante vascularizada.
Essas clulas osteognicas (ou osteoprogenitoras) apresentam caractersticas semelhantes aos fibroblastos. Porm, quando ativadas, dividem-se por
mitose e diferenciam-se em osteoblastos, atuando na reparao de fraturas e
possibilitando o crescimento dos ossos.
Tipos de tecido sseo
Histologicamente, o tecido sseo pode estar estruturado de duas formas distintas: o tecido sseo primrio e o tecido sseo secundrio. As clulas
e componentes da matriz so os mesmos nos dois tipos e essa distino se
refere disposio das fibras colgenas na matriz ssea.
Tecido sseo primrio
O tecido sseo primrio (ou imaturo) se estrutura durante a vida

embrionria ao ocorrer a primeira ossificao, ou durante a reparao de
uma fratura.
Nesse tipo de osso, as fibras colagenosas esto dispostas aleatoriamente, sem orientao definida, havendo uma menor quantidade de minerais, o que confere a esse tecido sseo resistncia menor que o tecido
sseo secundrio.
Histologia | 69
Tecido sseo secundrio
O tecido sseo secundrio (ou lamelar) surge em substituio ao

tecido sseo primrio. No tecido sseo secundrio, as fibras colagenosas se
organizam de modo a formar lamelas concntricas ao redor de canais onde
transitam vasos sanguneos. Esse conjunto chamado sistema de Havers, e
confere ao osso secundrio maior resistncia do que o osso primrio. O
canal no centro das lamelas sseas que contm um vaso sanguneo chamado
canal de Havers. Acompanhando a arquitetura ramificada dos vasos sanguneos, h canais transversais chamados canais de Volkmann. Os canais de
Volkmann ligam os canais de Havers entre si e os canais de Havers com a
cavidade medular e com a superfcie externa do osso (Figura 11).
Figura 11. Sistema de Havers ou steon: LC lacunas, CN - canalculos,
CH canal de Havers, SH sistema de Havers.
Tipos de ossificao
No embrio, a formao do osso ocorre por meio de dois mecanismos: a ossificao intramembranosa e a ossificao endocondral.
Histologicamente, no h diferenas entre os tecidos sseos formados
por esses dois tipos de ossificao, e ambos produziro tecido sseo primrio,
o qual ser reabsorvido e substitudo por tecido sseo secundrio.
Ossificao intramembranosa ou endoconjuntiva
A designao intramembranosa conferida a esse processo por ele

ocorrer em uma rea de densificao de elementos fibrosos do tecido conjuntivo embrionrio, erroneamente denominado membrana conjuntiva. Atualmente, h autores que utilizam a designao endoconjutiva para ressaltar que esse
processo de ossificao ocorre no tecido conjuntivo.
As clulas mesenquimais, de determinada rea do mesnquima programado a se diferenciar em tecido sseo, comeam a se diferenciar em osteoblastos,
que por sua vez iniciam a produo de osteoide. O local onde se inicia a
ossificao chamado centro de ossificao primria. Nesse novo tecido, os
osteoblastos estabelecem contato e, com a deposio de clcio no osteoide,
se transformam em ostecitos. Assim estruturam-se os canalculos sseos, as
lacunas e todas as outras estruturas caractersticas do tecido sseo.
As regies do mesnquima que no se diferenciam em clulas sseas
originam o peristeo na superfcie externa e o endsteo na superfcie interna
do osso em formao.
Nos processos de reabsoro e reestruturao ssea que se seguem, se
originam as camadas de osso compacto que constituem a superfcie perifrica
desses ossos.
Ossificao endocondral
A ossificao endocondral o processo de formao dos ossos longos

e curtos, a partir de um molde de tecido cartilaginoso.
Pode-se dizer que este processo segue os seguintes passos:
1- Ao redor da pea cartilaginosa, o pericndrio comea a se ossificar,
formando, assim, um cilindro sseo ao redor da pea de cartilagem.
2- Os condrcitos, situados no interior deste modelo cartilaginoso, se
hipertrofiam, dilatando as suas cpsulas. Eles tambm, quando
Histologia
| 71
hipertrofiados, produzem fatores angiognicos (fator de crescimento

endotelial vascular VEGF) que induziro formao de vasos sanguneos a partir do pericndrio.
3- Com o surgimento desses vasos sanguneos, as clulas condrognicas
se transformam em osteognicas, dando origem a osteoblastos. Estes
osteoblastos iniciam a produo de osteoide, que enrijece formando
centros de ossificao primria, colaborando na formao de um colar
subperistico ao redor da difise cartilaginosa.
4- Esse colar sseo impede a difuso dos nutrientes para o interior da
cartilagem, levando morte dos condrcitos hipertrofiados, formando
grandes concavidades no interior do molde cartilaginoso.
5- Osteoclastos, ao reabsorver o tecido sseo, formam orifcios no
colar sseo, permitido que um broto vascular peristico (composto de
clulas osteognicas, clulas hematognicas e vasos sanguneos) penetre
nas cavidades do molde cartilaginoso.
6- As clulas osteognicas que penetraram no molde diferenciam-se em
osteoblastos, iniciando a produo de tecido sseo por sobre os restos
de cartilagem ainda existentes, formando um complexo cartilagem
calcificada/osso calcificado.
7- Conforme o osso subperistico se espessa, osteoclastos comeam
a reabsorver o material do complexo cartilagem calcificada/osso
calcificado, aumentando a cavidade interna da difise, que ser a
futura cavidade medular.
8- Nas epfises, ocorre um processo semelhante ossificao da difise,
com a diferena de no se formar um colar sseo. As clulas osteognicas
invadem as cavidades ocasionadas pela destruio da cartilagem, produzindo o complexo cartilagem calcificada/osso calcificado. Esse complexo
ser reabsorvido pelos osteoclastos, restando apenas a cartilagem hialina
do disco epifisrio e a cartilagem articular.
3.5. Tecido sanguneo
O sangue um tecido conjuntivo especializado que circula em um

sistema fechado de canais, representado pelo corao, artrias, capilares e
veias. Alm de transportar nutrientes a todas as clulas e retirar os produtos
txicos resultantes do metabolismo, o sangue conduz, de um rgo para o
outro, hormnios e outras substncias reguladoras da atividade celular. O
sangue atua tambm nos processos de defesa, carregando anticorpos e clulas
que destroem agentes invasores e ajudam na cicatrizao e recuperao de
tecidos lesionados. O sangue ainda distribui calor, mantendo constante a
temperatura do corpo, e auxilia na manuteno do equilbrio cido/bsico e
osmtico dos fluidos corporais.
No homem, o sangue consiste de um fluido viscoso, de cor vermelha e
tonalidade varivel. Possui um pH levemente alcalino (7,4) e responsvel por
aproximadamente 7% do peso corporal (+/- 5,5 L num indivduo adulto).
Os componentes do sangue podem ser separados por centrifugao,
desde que seja coletado com uso de anticoagulantes. Dessa forma, podem-se obter:
glbulos vermelhos (hemcias): representam de 42% a 47% do
volume total de sangue (hematcrito);

glbulos brancos (leuccitos) e plaquetas: vo formar a papa
leucocitria, designao conferida camada delgada e translcida, que

representa apenas 1% do volume total de sangue;
plasma sanguneo: componente lquido do sangue, no qual os outros
componentes esto diludos e que representa aproximadamente 55%

do volume do sangue.
Histologia | 73
Plasma sanguneo
O plasma sanguneo a parte lquida do sangue, que transporta substncias solveis em gua. constitudo por gua, protenas, glicose, sais minerais e outros nutrientes, materiais de excreo, hormnios e anticorpos.
Dentre as protenas presentes no plasma, destacam-se:
as albuminas: encarregadas de regular a presso osmtica do sangue;
as globulinas: representam os anticorpos que atuam na defesa do
organismo;
o fibrinognio: atua nos processos de coagulao sangunea.
Na ausncia de anticoagulantes, o fibrinognio, juntamente com os

outros elementos celulares do sangue, forma um cogulo. Esse processo de
coagulao permite a obteno do soro sanguneo, que , essencialmente, o
plasma sanguneo sem o fibrinognio.
Glbulos vermelhos
Nos vertebrados no humanos, os glbulos vermelhos so tambm

chamados de eritrcitos (do grego erythros = vermelho). Porm, em humanos, esses elementos, por no possurem ncleo, so chamados hemcias. As
hemcias so estruturas altamente diferenciadas, encarregadas de manter em
estado funcional o pigmento respiratrio, a hemoglobina.
As hemcias possuem a forma de um disco bicncavo de 6,5 a 8,5 mm
de dimetro e 2 mm de espessura na regio mais larga, sendo flexveis, sem
organelas e anucleadas11.
A concentrao normal de hemcias de +/- 4,5 e 5,5 milhes por
mm3 de sangue, na mulher e no homem, respectivamente.
As hemcias so clulas anucleadas somente em mamferos. Aves, peixes e rpteis, por exemplo,
possuem hemcias nucleadas.
11
Glbulos brancos
Essas clulas, tambm chamadas de leuccitos, so incolores e esfricas

quando no sangue. So originadas na medula ssea e s permanecem na
circulao sangunea enquanto so transportadas at os locais onde atuam. Ao
chegar nesses locais, orientadas pela liberao de substncias quimiotticas, os
leuccitos atravessam a parede dos vasos, por um processo chamado diapedese,
e, s ento, ao atingirem os tecidos, que vo desempenhar suas funes
especficas.
Em um indivduo adulto normal h entre 6.500 e 10 mil leuccitos por
mm . Quando esse nmero est alterado, pode ser classificado como leucocitose
(nmero aumentado) e leucopenia (nmero reduzido).
3
De acordo com a presena de grnulos citoplasmticos, os leuccitos

so classificados em dois grupos:
os granulcitos, que possuem grnulos primrios (lisossomos) e grnu-
los especficos como os neutrfilos, eosinfilos e basfilos;

os agranulcitos, que possuem apenas grnulos primrios e so os
moncitos e os linfcitos.
Neutrfilos
Os neutrfilos so clulas esfricas tambm chamadas de leuccitos

polimorfonucleares, sendo os mais numerosos, equivalendo a aproximadamente 65% da populao total dos leuccitos circulantes, e possuem grnulos azurflicos.
Os neutrfilos no fagocitam quando transitam no sangue circulante,
mas tornam-se ameboides e fagocitrios ao atingir os tecidos, onde so muito
mveis, com a funo primordial de ingerir e destruir micro-organismos encontrados neles. Exerce papel principal nos estgios iniciais da resposta bacteriana
aguda, em leses teciduais, e o principal constituinte do pus.
Histologia
| 75
Eosinfilos
Os eosinfilos representam de 2% a 4% do total de leuccitos e

tm o mesmo tamanho dos neutrfilos. Seu ncleo bilobado e os grnulos
citoplasmticos, altamente eosinoflicos, so ovoides e maiores do que os
grnulos dos neutrfilos.
Representam a primeira linha de defesa contra parasitas, pois so
especializados na digesto de complexos antgeno anticorpo, caractersticos dos processos alrgicos.
Basfilos
So os leuccitos menos frequentes no sangue, representando menos

de 1% do seu total. Seu ncleo volumoso, em forma de S retorcido e
irregular. Possuem grnulos citoplasmticos grandes, basfilos e metacromticos,
que frequentemente recobrem o ncleo. Ao deixar a circulao e penetrar no
tecido conjuntivo, adquirem aparncia semelhante ao mastcito.
Ao entrar em contato com algum alrgeno, os basfilos exocitam seus
grnulos e provocam uma reao de hipersensibilidade imediata (anafilaxia),
que , de fato, uma reao exagerada do organismo no combate ao alrgeno.
Moncitos
Os moncitos so as maiores clulas do sangue circulante e representam

de 3% a 8% da populao leucocitria.
Os moncitos so constituintes da unidade funcional denominada sistema mononuclear fagocitrio. Esse sistema se origina da clula mononuclear
fagocitria, presente na medula ssea. A clula precursora atinge o sangue
circulante, onde permanece alguns dias completando sua maturao e se torna
um moncito. Enquanto circulante, essa clula continua um moncito; porm,
quando realiza a diapedese e penetra no tecido conjuntivo, transforma-se num
macrfago. Dependendo do rgo no qual se encontre, esse macrfago recebe diferentes designaes: clulas de Kupffer, no fgado; macrfagos alveolares,
nos pulmes; clulas de Langerhans, na pele; microglia, no sistema nervoso
central; dentre outros.
Linfcitos
De uma forma geral, os linfcitos so clulas pequenas (de 9 a 12

mm) com ncleos centrais, ovoides ou reniformes, e cromatina condensada;
o citoplasma levemente basfilo e se apresenta normalmente como um
anel delgado ao redor do ncleo. De 20% a 25% dos leuccitos
circulantes so clulas desprovidas de capacidade fagocitria e podem ser
divididos em dois grupos:
Linfcitos B
Os linfcitos B se originam e amadurecem na medula ssea. Durante seu
amadurecimento, essas clulas produzem milhares de imunoglobulinas (anticorpos)
que so inseridas na sua membrana plasmtica, permanecendo com seus stios
de ligao expostos na superfcie externa da clula. Quando esses anticorpos
membranares entram em contato com os seus antgenos, o linfcito B ativado, sofrendo mitoses e dando origem a dois tipos celulares: os plasmcitos e
as clulas de memria (linfcito B de memria).
Linfcitos T
Os linfcitos T so produzidos na medula ssea, mas terminam seu
processo de amadurecimento no timo, da a origem de seu nome: linfcitos T.
Quando estas clulas concluem seu amadurecimento no timo, elas se
diferenciam em trs tipos celulares:
linfcito T helper (auxiliar): essas clulas secretam fatores
que estimulam a ao de outros linfcitos T e B;
Histologia
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linfcito T supressor : libera substncias que reduzem a ao
de linfcitos T e B. Desempenha papel fundamental na supresso

da resposta aos antgenos do prprio indivduo (doenas
autoimunolgicas);
linfcito T citotxico: essa clula age diretamente sobre clu-
las estranhas, como, por exemplo, clulas transplantadas, e sobre

clulas infectadas por vrus. Atuam de duas formas: secretando
protenas chamadas perforinas, que formam orifcios na membrana
das clulas atacadas, provocando sua lise; ou liberando substncias que induzem as clulas-alvo apoptose12.
Alguns autores relatam ainda a existncia de um terceiro grupo de
linfcitos, os linfcitos NK (natural killers) ou assassinos naturais. Esses linfcitos
representam aproximadamente 10% dos linfcitos circulantes, e recebem o
nome de NK porque atacam clulas cancergenas e infectadas por vrus sem a
necessidade de um estmulo prvio. Em uma distenso sangunea, no possvel distinguir essas clulas.
Plaquetas
So fragmentos citoplasmticos pequenos (2 a 4 mm) e anucleados,

derivados dos megacaricitos residentes da medula ssea e desempenham
um importante papel na hemostasia 13, promovendo a coagulao do sangue e ajudando na reparao de danos na parede dos vasos, evitando
processos hemorrgicos.
A apoptose um tipo de morte celular que possui importante papel durante o processo de
diferenciao, crescimento e desenvolvimento dos tecidos adultos normais e patolgicos. Fisiologicamente, a apoptose um dos participantes ativos da homeostase, controlando o equilbrio entre a
proliferao e a degenerao celular, ajudando na manuteno do tamanho dos tecidos e rgos.
erroneamente conhecida como morte celular programada, de vez que a definio correta morte
celular no seguida de autlise.
13
Hemostasia um conjunto de mecanismos que o organismo emprega para coibir hemorragias, dizendo
respeito s rotinas de coagulao sangunea e reparao de vasos.
12
3.6. Tecido hematopoitico
O tecido hematopoitico uma variedade do tecido conjuntivo

relacionado produo dos elementos figurados (hemcias, leuccitos e
plaquetas), e proporciona um microambiente tissular propcio a esse processo.
Medula ssea
A medula ssea (do grego myelon = medula) a cavidade ssea que

aloja um tecido delicado e gelatinoso, rico em vrios vasos sanguneos e uma
delicada rede de fibras reticulares. A medula ssea aloja o tecido hematopoitico.
Clulas-tronco, clulas progenitoras e clulas precursoras
As clulas mais importantes do tecido hematopoitico so as clulastronco pluripotentes, capazes de originar todas as clulas sanguneas.
As clulas-tronco pluripotentes tm a importante caracterstica de se
autorrenovar. Ao se dividirem, essas clulas do origem a duas clulas-filhas,
sendo que somente uma delas vai continuar se desenvolvendo, permanecendo
a outra clula-filha como uma clula-tronco de reserva, tornando seu estoque
praticamente inesgotvel.
Ao contrrio do que se acreditava inicialmente, as clulas-tronco da
medula ssea tm uma capacidade de diferenciao celular que no se restringe
s clulas sanguneas. Inicialmente, as pesquisas se restringiam utilizao de
clulas-tronco embrionrias, mas os estudos revelam a obteno de clulastronco de um indivduo adulto.
Depois de retiradas da medula ssea, as clulas-tronco so mantidas em
um meio de cultura no qual tm sua diferenciao direcionada, havendo a
produo de clulas especializadas de um tecido especfico que se deseje
transplantar. Essas clulas so, ento, utilizadas para substituir clulas afetadas
por processos patolgicos. Embora o tema ainda seja controverso e impregna-
Histologia
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do de problemas de carter tico, j h experincias bem-sucedidas na reparao de tecidos nervosos e cardacos, dentre outros.
4. T
Tecido
ecido ner voso
O tecido nervoso tem sua origem do ectoderma, mais especificamente

no neuroectoderma, e forma o sistema nervoso. Esse sistema responsvel
pelo bom funcionamento interno do organismo (sistema neurovegetativo) e
por mediar sua relao com o meio ambiente (sistema nervoso cerebroespinhal).
O tecido nervoso constitudo por clulas especializadas chamadas
neurnios, responsveis por definir a caracterstica fundamental desse sistema,
e por outras clulas que do suporte ao neurnio, as clulas da neuroglia ou
neuroglia ou glia. A especializao celular consiste na capacidade de receber
informaes externas ou internas e convert-las em impulsos eltricos que sero
transmitidos por redes de comunicao integradas e complexas.
O sistema nervoso pode ser dividido anatomicamente em sistema nervoso central (SNC) e sistema nervoso perifrico (SNP).
4.1. Neurnios
Os neurnios tambm so chamados de clulas nervosas, e representam as unidades funcionais do tecido nervoso. Seu nmero no sistema nervoso humano aproxima-se da ordem de grandeza de 1010. Funcionalmente, os
neurnios so classificados em trs tipos principais: neurnios sensoriais,
responsveis por transportar os impulsos das terminaes nervosas para o
SNC; neurnios motores, que transportam o impulso do SNC em direo s
clulas efetoras; e os neurnios que formam uma extensa rede intermediria
que liga os neurnios sensoriais aos neurnios motores, chamados
interneurnios14. Grande parte dos neurnios existente no corpo faz parte
desta rede intermediria.
Os interneurnios podem ser chamados ainda de neurnios centrais, neurnios intercalados, neurnios
intermedirios, dentre outros.
14
Algumas caractersticas estruturais so comuns a todos os neurnios, sendo

possvel identificar trs regies morfolgicas com funes especficas: dendritos,
corpo celular ou pericrio e axnio. O corpo celular, tambm conhecido como
pericrio, contm o ncleo e grande parte das organelas da clula, apresentando
regies basfilas denominadas corpsculos de Nissl (Figura 12).
Do corpo celular partem prolongamentos que podem ser os dendritos
ou o axnio. De acordo com o nmero desses prolongamentos, poderemos classificar os neurnios como multipolares (apresentam um axnio e
dois ou mais dendritos), bipolares (um axnio e um dendrito), ou unipolares
(um axnio que se divide em dois ramos em uma regio prxima ao corpo
celular) (Figura 12).
Figura 12. Neurnio.
Sinapse
Representa o local de comunicao entre dois neurnios. Na sinapse

qumica, h uma proximidade entre o boto terminal do axnio de um neurnio
Histologia
| 81
(chamado de boto pr-sinptico) e o dendrito de outro neurnio (chamado

boto ps-sinptico), sem que haja contato fsico entre esses dois elementos.
O espao entre os dois neurnios chamado fenda sinptica. O boto prsinptico contm mediadores qumicos (neurotransmissores) em seu interior,
armazenados em vesculas sinpticas, que sero liberados na fenda sinptica
provocando o estmulo do neurnio seguinte. O impulso nervoso, ao chegar
ao boto sinptico, provoca a entrada de clcio, fazendo com que as vesculas
sinpticas fundam-se membrana pr-sinptica, liberando os transmissores para
o espao extracelular.
Alguns transmissores, como a acetilcolina (ACh), noradrenalina (NA),
dopamina (DA) e serotonina foram identificados. A acetilcolina, por exemplo, o transmissor que funciona entre o neurnio e o msculo estriado
esqueltico. O efeito do transmissor rapidamente interrompido aps ter sido
liberado na fenda sinptica (Figura 13).
Figura 13. Representao de uma sinapse neural, demonstrando as vesculas
repletas de neurotransmissores que so liberados na fenda sinptica, ligandose aos receptores da membrana ps-sinptica e dando continuidade ao impulso nervoso.
4.2. Neuroglia
A neuroglia atua na estruturao do SNC e conhecida como clulas

da glia ou neuroglia. So identificados trs principais tipos celulares: astrcitos,
oligodendrcitos e microglia.
Microglia
So os macrfagos do SNC, responsveis pela remoo de restos celulares durante o desenvolvimento normal do sistema nervoso e pela fagocitose de
outras substncias estranhas que possam aparecer no SNC. So clulas ricas em
lisossomos e apresentam retculo endoplasmtico rugoso bem desenvolvido.
Astrcitos
So as maiores clulas da neuroglia. Dividem-se em dois tipos:

protoplasmticos (predominantes na substncia cinzenta) e fibrosos (predominantes na substncia branca). Essas clulas apresentam numerosas projees
citoplasmticas que envolvem grande parte dos vasos sanguneos (chamadas
ps-vasculares) e se expandem em direo aos neurnios (ps-terminais). Participam do processo de regulao do transporte de substncias para os neurnios
do SNC, contribuindo para a formao da barreira hematoenceflica.
Oligodendrcitos
Esse tipo celular o responsvel pela formao da fibra nervosa do

SNC. Seus prolongamentos so capazes de envolver os prolongamentos
dos neurnios, podendo formar a bainha de mielina de vrios neurnios ao
mesmo tempo.
Clulas de Schwann
So as clulas responsveis pela formao da fibra nervosa no SNP. As

clulas de Schwann podem se enrolar em volta do axnio seguidas vezes,
formando a bainha de mielina. So necessrias vrias clulas de Schwann para
envolver um axnio.
Histologia
| 83
Epndima
Geralmente classificada como constituinte da neuroglia, forma o revestimento dos ventrculos e do canal espinhal (cavidades repletas de lquido).
Em muitos locais do encfalo, o revestimento ependimrio modificado de
modo a permitir a produo do lquido cefalorraquidiano a partir das alas de
capilares adjacentes. A unio dessas alas com as clulas ependimrias modificadas chamada plexo coroide.
Conduo do impulso nervoso
As clulas do nosso corpo, principalmente as clulas do tecido nervoso, apresentam um potencial eltrico na sua membrana plasmtica. Esse potencial eltrico confere uma carga positiva na face externa da membrana
plasmtica e uma carga negativa na face interna. Essa polarizao da membrana se deve s variaes de concentraes de ons entre o meio intra e
extracelular. Essa diferena mantida pelo funcionamento da bomba de Na+
e K+, graas presena de ATPases na membrana que liberam energia para
o transporte dos ons. Em uma condio de repouso, a concentrao externa
de Na+ maior do que a interna e a concentrao interna de K+ maior do
que a externa.
Quando um neurnio estimulado com determinada intensidade, h
uma modificao do funcionamento da bomba inica. O estmulo provoca um
aumento da permeabilidade da membrana plasmtica do neurnio ao on sdio,
levando entrada deste on no citoplasma. Essa entrada de ons sdio provoca
uma inverso local da polaridade da membrana: a face interna da membrana
passa a ter carga positiva, e a face externa, carga negativa. Essa inverso de
polaridade se propaga pela membrana da clula nervosa, normalmente dos
dendritos ao axnio, sendo que as regies iniciais tendem a voltar a seu estado
inicial de polarizao pela ao da bomba de Na+ e K+.
Nas fibras nervosas que possuem bainha de mielina, o impulso adquire

uma caracterstica distinta de conduo saltatria. A bainha de mielina no
contnua em todo o axnio. Alguns pontos entre as clulas formadoras da
mielina ficam sem mielina, sendo estes locais chamados ndulo ou n de
Ranvier. A presena desses ns torna a conduo do impulso mais rpida,
visto que a onda de despolarizao salta de um n para o outro (a bainha de
mielina funciona como um isolante).
A onda de despolarizao, ao chegar ao boto pr-sinptico, provoca a
fuso das vesculas, que contm os transmissores, membrana plasmtica. Os
transmissores so liberados na fenda sinptica e, ao entrar em contato com os
receptores presentes na membrana do boto ps-sinptico, provocam uma
nova onda de despolarizao no neurnio seguinte.
5. T
Tecido
ecido muscular
O tecido muscular formado por clulas especializadas cuja funo

a contrao. Essas clulas so tambm chamadas fibras musculares, e so
encontradas agrupadas em massas macroscpicas denominadas msculos, que
so as estruturas ativas do aparelho locomotor, enquanto os ossos so as
estruturas passivas.
Os tecidos musculares podem ser classificados em: tecidos musculares
estriados, que podem ser esquelticos ou cardacos, e tecidos musculares lisos.
5.1. Tecido muscular estriado esqueltico
O tecido muscular estriado esqueltico constitui a maior parte da musculatura dos vertebrados e recobre totalmente o esqueleto, estando inserido nos
ossos (Figuras 14 e 15).
Os msculos esquelticos so de contrao voluntria e se formam pela
fuso de clulas precursoras (mioblastos), originando uma clula cilndrica ex-
Histologia | 85
tremamente longa (atingindo vrios centmetros), com muitos ncleos perifricos, e com estriaes transversais.
O citoplasma das fibras musculares esquelticas encontra-se repleto por
miofibrilas, possuindo retculo sarcoplasmtico, mitocndrias e outras organelas.
As miofibrilas so estruturas cilndricas que se estruturam formando
sarcmeros, que so as unidades funcionais (contrteis) do msculo esqueltico.
O alinhamento dos sarcmeros responsvel pelas estriaes transversais presentes nos msculos estriados.
Os sarcmeros das miofibrilas so compostos de miofilamentos que vo
gerar a contrao muscular. Esses filamentos contrteis so formados por um
conjunto de protenas, e podem ser:
Miofilamentos finos de actina
So compostos por actina, tropomiosina e tropomina.

A actina que constitui filamentos chamada actina F (filamentosa) e
constituda por monmeros de actina G (globosa). A actina globosa possui
duas polaridades, que vo orientar a formao do filamento proteico.
A tropomiosina formada por duas cadeias polipeptdicas enroladas
em alfa-hlice, que vo ocupar o sulco formado pelos filamentos de actina F.
Cada molcula de tropomiosina se estende por 7 monmeros de actina e se
liga a um complexo troponina.
A troponina um complexo formado por trs protenas: TnI, TnC e
TnT. A troponina T se liga molcula de tropomiosina; a troponina I
responsvel por inibir a ligao da miosina com a actina; e a troponina C se liga
aos ons de clcio.
Miofilamentos grossos de miosina
Esses filamentos so espessos e podem ser subdivididos em duas estruturas essenciais. A poro mais alongada, que compe a cauda da molcula de
miosina, d estruturao ao miofilamento de miosina de uma forma geral e

chamada meromiosina leve. Na extremidade dessa poro alongada, encontra-se uma cabea, semelhante extremidade de um taco de golfe, que
recebe o nome de meromiosina pesada, juntamente com um discreto pescoo. A meromiosina pesada possui atividade ATPsica e responsvel pela
interao com os filamentos de actina.
Nos sarcmeros, esses miofilamentos esto organizados de forma apropriada, que compe reas claras e escuras que se intercalam, formando todo
um conjunto de bandas (I, A, H) e de linhas (Z e M) que, ao se repetirem
por toda a extenso da fibra muscular, so responsveis pela imagem das
estriaes transversais visualizadas ao microscpio de luz.
Figura 14. Msculo estriado
esqueltico (corte longitudinal).

Esqueltico (corte transversal).
5.2. Tecido muscular estriado cardaco
O msculo cardaco um msculo de contrao involuntria e, assim

como o esqueltico, constitudo por fibras que apresentam estrias transversais, denotando a organizao dos seus miofilamentos em sarcmeros (Figuras 16 e 17).
Histologia | 87
As clulas cardacas so envoltas por uma delicada camada de tecido

conjuntivo, e suas clulas so alongadas, mas no tanto quanto as esquelticas,
e ramificadas, com um ou dois ncleos centrais.
Unindo duas clulas cardacas, h complexos juncionais especializados
chamados discos intercalares. Os discos intercalares so visualizados ao microscpio de luz como uma linha mais escura, na forma de uma reta ou em
degraus, e so compostos por junes de adeso, desmossomos e junes
comunicantes. So estruturas caractersticas do tecido muscular cardaco.
Figura 16. Msculo estriado cardaco
(corte longitudinal).

cardaco (corte transversal).
5.3. Msculo liso
As clulas do msculo liso so alongadas e fusiformes, com um nico

ncleo oval e central. So clulas de contrao involuntria, presentes na
parede de vrios rgos, como, por exemplo, a via digestria, na qual so
responsveis pelos movimentos peristlticos (Figura 18).
As clulas musculares lisas so envoltas por uma lmina basal e uma fina
rede de fibras reticulares, que recebe a denominao lmina externa. Como
nos outros tipos de tecido muscular, os seus elementos contrteis so os
miofilamentos de actina e miosina. A diferena reside no fato de esses
miofilamentos no estarem dispostos na forma de sarcmeros, mas de forma
aleatria. Assim, no h estriaes transversais em sua estrutura. Alm
disso, os filamentos de actina so formados somente de molculas de

actina e tropomiosina.
O clcio utilizado na contrao muscular desse tecido armazenado no
interior da clula, em vesculas denominadas cavolas.
Esse tipo de msculo recebe inervaes simpticas e parassimpticas
(que so antagnicas), mas no h estruturas parecidas com a placa motora. As
fibras nervosas liberam neurotransmissores (acetilcolina e noradrenalina) no espao intercelular que se difundem, alcanando e despolarizando as clulas
musculares. Quando despolarizadas, as cavolas liberam o clcio e se inicia a
contrao dos miofilamentos.
Figura 18. Msculo liso (corte longitudinal).
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YOUNG, B. et al. Wheater histologia funcional. 5. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2007.
| 89
Captulo 3
Tcnicas histolgicas
Pedro Paulo de Abreu Manso
A histologia a cincia que estuda as clulas no contexto da estrutura

tecidual e a inter-relao delas com os constituintes da matriz extracelular. A
histotecnologia proporciona o entendimento dos fundamentos tcnicos para a
anlise dos elementos teciduais, normais ou patolgicos, isto , suas clulas e
os elementos da matriz extracelular, abrangendo diversas tcnicas histoqumicas.
Os procedimentos tcnicos aplicados na histotecnologia incluem tcnicas citoqumicas, histoqumicas, imuno-histoqumicas, voltadas para a pesquisa
cientfica e para o diagnstico patolgico, alm de anlises em nvel de
microscopia eletrnica. Neste captulo, sero realizadas consideraes somente
sobre as tcnicas histolgicas voltadas para a anlise histoqumica e imunohistoqumicas dos tecidos.
A tcnica histolgica representa um conjunto de procedimentos tcnicos
que, inicialmente, se difundiu entre os diversos profissionais das cincias naturais, como os botnicos e zoologistas, sendo empregada tambm pelos
anatomistas e histologistas da poca. Geralmente, os estudiosos utilizavam um
microscpio simples para descrever os tecidos; porm, somente duzentos anos

aps a descoberta do microscpio, a utilizao da tcnica histolgica foi utilizada
como ferramenta para diagnstico histopatolgico. Por volta de 1828, Rudolph
Virchow, mdico alemo e antropologista, utilizou a anlise histopatolgica como
ferramenta bsica e essencial em qualquer laboratrio de histologia e/ou anatomia
patolgica para elaborar as bases da patologia celular.
Histotecnologista, ou histotcnico, a designao conferida ao profissional responsvel por executar a tcnica histolgica para atuar em instituies de
sade, instituies voltadas pesquisa cientfica e ao controle de qualidade,
normalmente em laboratrios de histo ou anatomopatologia. Sua funo, alm
de ser essencial aos servios de sade, pelo apoio ao diagnstico e ao tratamento de pacientes, est tambm localizada de forma central no moderno
paradigma mdico anatomoclnico.
Os procedimentos utilizados para se obterem amostras de tecido ou
preparados histolgicos retirados de um organismo para exame microscpico
incluem: coleta do material, fixao, clivagem, processamento, incluso,
microtomia (corte) e colorao. No caso de tecidos calcificados, o material
descalcificado aps a fixao e, em seguida, realizam-se os outros procedimentos, os quais discutiremos um a um.
Vale a pena ressaltar a importncia do planejamento para a execuo de
qualquer procedimento que envolva a tcnica histolgica, pois tal planejamento facilita e evita acontecimentos indesejados durante a realizao de qualquer
etapa desse processo. De forma geral, a organizao um dos principais
fatores para se criar um ambiente seguro para o desempenho do trabalho. Um
laboratrio limpo e organizado fundamental para se desenvolver um bom
trabalho, ao contrrio de um que apresente bancada entulhada por materiais e
sem espao adequado para a realizao dos procedimentos. Deve-se evitar
tambm empilhar caixas e deixar coisas pelo cho, obstruindo ou dificultando o
trnsito dos trabalhadores no laboratrio.
Tcnicas Histolgicas | 91
1. Coleta, fixao e clivagem

A . Coleta
Consiste em remover amostras de tecido de um determinado organismo.

Essa coleta pode ser feita quando o organismo ainda est vivo, por meio de
bipsia ou durante uma cirurgia, ou mesmo post mortem, durante a realizao
de necropsia de animais ou seres humanos.
Quando a coleta realizada para diagnstico de determinada enfermidade, o material originado de necropsia ou bipsia deve ser previamente
analisado por um patologista, o qual fornecer o laudo macroscpico, ressaltando aspectos macroscpicos da pea anatmica, como cor, tamanho e
aparncia do rgo analisado. Durante a coleta, tambm devemos respeitar
algumas regras que so fundamentais para a boa qualidade final da amostra,
que sero abordadas mais adiante.
Aps a coleta, o material deve ser registrado em um livro prprio de
protocolo, para registro. Por meio desse registro, o material ser identificado
por um nmero, que o acompanhar durante todos os procedimentos da
tcnica histolgica. Em instituies credenciadas para realizar procedimentos
histopatolgicos, o material obtido cirurgicamente deve ser acompanhado de
uma ficha com o pedido da anlise histopatolgica, contendo a identificao
do rgo e as datas da fixao e de entrada do material no laboratrio. Essa
ficha tcnica dever conter a identificao do paciente (nome, sexo, cor,
idade, estado civil, nacionalidade, naturalidade e profisso) e, no caso de
paciente de rede hospitalar, devero ser informados sua qualificao (registro
ou nmero do leito), registro ambulatorial, ou consultrio particular, identificao do mdico responsvel, data da interveno cirrgica, descrio da bipsia,
morte ou necropsia, e outros dados que o mdico julgar importantes, que
auxiliaro o histopatologista no diagnstico.
Para material proveniente de trabalhos experimentais com animais em

instituies de pesquisa credenciadas, o registro dever ser feito aps a
eutansia, em livro prprio. No livro de registro experimental devem constar a identificao do laboratrio, a data da eutansia, os rgos colhidos,
o tipo de procedimento realizado com o animal experimental (por exemplo, infeco), o ttulo do projeto e as observaes necessrias para avaliao do pesquisador ou tecnologista. Atualmente, deve-se realizar tambm o registro no comit de tica da instituio, que aprovar a realizao
da pesquisa, fornecendo o nmero de protocolo. Esse nmero importante, pois deve ser informado ao se elaborar um trabalho cientfico, seja uma
dissertao de mestrado, tese de doutorado, publicao em revista indexada,
ou outro meio de divulgao cientfica. Tratando-se de animal experimental
nativo, originrio diretamente do meio ambiente, o pesquisador deve submeter o seu projeto ao Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos
Recursos Naturais Renovveis (Ibama) a fim de obter uma autorizao para
coleta, sem a qual poder estar sujeito a sanes da legislao vigente.
Sem esses registros, o material no poder ser manipulado no laboratrio,
podendo o responsvel pela coleta responder a processo na Justia por
desrespeito s leis vigentes no territrio nacional.
Notas de biossegurana
Todo material biolgico coletado para anlise potencialmente infectante.
Assim, deve-se ter muito cuidado durante a coleta e a manipulao dos
espcimes, utilizando sempre os equipamentos de proteo individual (EPI).
imprescindvel, durante os procedimentos de coleta, o uso de luvas,
jaleco, mscara e culos de proteo. Voc deve ainda procurar se informar
na instituio sobre qual a poltica de descarte de material infectado.
Nunca descarte material biolgico ou seus derivados em lixo comum.
B. Fixao
Voc alguma vez refletiu sobre o que acontece quando esquecemos um

pedao de carne fora da geladeira? Por que a carne apodrece? O que,
realmente, acontece com esse material?
Ao se remover qualquer material (rgo ou tecido) de um organismo
aps a sua morte, esse material inicia um processo de autlise, ou seja, por no
receber o suprimento necessrio de oxignio e de substncias essenciais ao seu
funcionamento, comea a haver acmulo de dixido de carbono nos tecidos e,
em suas clulas, inicia-se o processo autoltico, no qual enzimas lisossomais
atuam no citoplasma da prpria clula.
Ao se colocar um pedao de carne na geladeira, esse processo
atrasado; porm, fora da geladeira a autlise acelerada.
Assim, ao se analisar as estruturas teciduais de um determinado rgo ao
microscpio, precisa-se preservar os tecidos, sendo imprescindvel a realizao
do processo de fixao.
A fixao uma das etapas mais importantes da tcnica histolgica, pois
visa interromper o metabolismo celular, estabilizando as estruturas e os componentes bioqumicos intra e extracelulares, preservando e conservando os elementos teciduais, alm de permitir a penetrao de outras substncias
subsequentes fixao.
Diversos protocolos de fixao e tipos de fixadores so citados na
literatura tcnica; porm, nenhum desses procedimentos de fixao reconhecido como perfeito. Alguns fixadores se revelam excelentes para determinadas
estruturas tissulares, enquanto outros so preferenciais para as clulas ou mesmo excelentes para anlise da bioqumica tecidual. Alm disso, h, tambm,
fixadores indicados para a preservao da antigenicidade dos elementos teciduais
que sero analisados pela imuno-histoqumica, em contraste com aqueles que
no preservam as molculas antignicas. Porm, no existe um fixador ideal que
alcance todos os objetivos da fixao, mas deve-se investigar qual o fixador

mais apropriado para o tipo de material a ser analisado. Por essa razo, devese consultar a literatura cientfica antes de se realizar qualquer tipo de experimento ou interveno cirrgica.
Basicamente, existem dois tipos de fixao: a fsica e a qumica. De fato,
sempre se utiliza uma associao dos dois tipos de fixao, pois mesmo a
fixao qumica sempre pode sofrer a influncia de um fator fsico ambiental,
como a temperatura. Outros fatores fsicos podem influenciar na fixao, como
as ondas eletromagnticas (micro-ondas) e a agitao molecular (ultrassom).
A fixao qumica obtida quando se utilizam substncias qumicas
capazes de formar reaes com os stios das biomolculas, estabilizando-as e
impedindo a alterao tecidual, tanto qumica quanto fsica.
Inicialmente, os fixadores eram divididos em duas classes: (1) fixadores
coagulantes ou desnaturantes, que precipitam as protenas dos tecidos. Esses
fixadores tambm so chamados de fixadores no aditivos, pois no se ligam s
protenas; (2) fixadores no coagulantes ou aditivos, que se ligam s protenas, precipitando-as.
Sabe-se pouco sobre os efeitos dos fixadores qumicos; porm, na
tcnica histolgica se utiliza uma ou mais substncias qumicas, denominadas
lquidos ou misturas fixadoras, reunindo vrias substncias numa tentativa de
superar as desvantagens de uma determinada substncia pela vantagem de outra
substncia adicionada mistura. Tais misturas so capazes de agir sobre os
tecidos de forma a buscar a melhor preservao dos elementos teciduais.
A escolha de um fixador depende da natureza do processo patolgico
presente no tecido, da estrutura celular e/ou tecidual, ou, ento, da natureza
bioqumica do elemento que se deseja preservar. Por essas razes, o histotcnico
deve conhecer os diversos tipos de fixadores e saber qual a compatibilidade
do fixador com os diversos mtodos de colorao, com a propriedade antignica
do elemento tecidual, visando adequar o tipo de fixador com a propriedade

dos vrios tipos de tecidos. Essas informaes so importantes para auxiliar o
pesquisador ou o patologista.
Atualmente, com frequncia se utiliza a classificao de fixadores descrita por Leong (1996), que teve como base a classificao desenvolvida por
Hopwood (1977), sem muitas alteraes. Leong classificou as substncias
fixadoras da seguinte maneira:
Fixadores aldedos: formaldedo, glutaraldedo e paraformaldedo co-
mercial.
Agentes oxidantes: tetrxido de smio, dicromato de potssio,
permanganato de potssio e cido crmico.

Agentes desnaturantes ou coagulantes de protenas: metanol, etanol,
acetona e cido actico.

Mecanismo desconhecido: cloreto de mercrio, cido pcrico e sais
de zinco.
Combinao de reagentes: tetrxido de smio e glutaraldedo, tetrxido
de smio e iodeto de zinco, glutaraldedo e carbodiamida e formaldedo

com glutaraldedo.
Fixao a seco: carbowax 6000 (20% de polivinil lcool ou 20%
de polietileno glicol) ou fixao no vapor.

Micro-ondas: fixao pelas ondas eletromagnticas com ou sem a
utilizao de agentes fixadores.

Ser dada maior ateno aos fixadores aldedos, pois estes so fixadores
base de aldedos de amplo uso nos laboratrios de anatomia patolgica e
de histologia.
Os fixadores aldedos comumente utilizados so o formaldedo, o
glutaraldedo, e o paraformaldedo, que o prprio formaldedo na sua forma
pura polimerizada. Esses fixadores formam ligaes cruzadas com as protenas tissulares, tornando-as insolveis em forma de um gel.
Dentre os fixadores aldedos, o formaldedo comercial o mais usado
na rotina histolgica devido ao seu baixo custo financeiro, alm de ser de
fcil preparo. Contudo, algumas consideraes se fazem necessrias. O
formaldedo comercial, um gs incolor, comercialmente fornecido em soluo na concentrao de 37% ou 40%. Ao se preparar uma soluo base
de formaldedo comercial a 10%, de fato a soluo estar a 3,7% ou 4%;
apesar disso, convencionou-se chamar essa soluo de formalina, ou
formaldedo a 10%. Outro ponto importante a se mencionar que o
formaldedo, na presena de gua, encontra-se na sua forma monomrica. J
o paraformaldedo, por ser livre de metanol, muito utilizado para a fixao
de tecidos a serem analisados pela microscopia eletrnica, pois o metanol
pode ocasionar grandes prejuzos, interferindo nas anlises ultraestruturais.
Porm, o paraformaldedo comercial tem sido recomendado para anlise
imuno-histoqumica. Na realidade, o formaldedo contm polmeros de
paraformaldedo comercial, mas que s sero hidrolisados quando diludos
em gua.
Quando o formaldedo exposto luz, isto , ao oxignio atmosfrico e tecidual, ocorre a oxidao do formaldedo, formando cido frmico.
O cido frmico pode se precipitar nos tecidos sob a forma de um pigmento de colorao marrom, sendo considerado um artefato. Para se evitar a
formao desse precipitado, deve-se preparar o fixador em solues
tamponadas, ou, ento, adicionar carbonato de clcio (giz) para neutralizar a
ao do pH da soluo. Contudo, o giz s recomendado em ltimo caso,
pois poder deixar reas de pseudocalcificao tecidual.
A seguir, encontram-se alguns dos fixadores aldedos e suas principais caractersticas:
Formalina 10%
Formaldedo comercial .......................................100 mL

gua destilada ................................................900 mL
Caractersticas:
soluo hipotnica (clulas intumescidas);
pode levar deposio de pigmento formlico;
baixo custo;
fixa bem as protenas.
Tempo de fixao: 24-48 horas.

Lavagem: gua corrente por 1 ou 2 horas.
Tratamento prvio dos cortes para a retirada do pigmento formlico
Desparafinizar e hidratar as lminas at a gua destilada.
Imergir os cortes em uma soluo saturada de cido pcrico em etanol
95% por 24 horas.

Lavar as lminas em gua corrente at desaparecer a cor amarela do
cido pcrico.
Seguir com o protocolo da colorao desejada.
Ao manipular formaldedo, ou solues contendo essa substncia, deve-se
fazer uso de luvas, mscara com filtro prprio para vapores orgnicos, em local
arejado e com exausto. O preparo de solues fixadoras deve ser feito em
capela de exausto. Por serem muito volteis e sensveis luz, as solues
contendo formaldedo devem ser guardadas ao abrigo da luz em vidro mbar
firmemente fechado. O formaldedo txico quando ingerido, inalado ou em
contato com a pele. A inalao deste composto pode causar irritao nos
olhos, nas mucosas e no trato respiratrio superior. Em altas concentraes,
pode causar bronquite, pneumonia ou laringite. Este composto classificado
como carcinognico e teratognico. Nunca descarte solues contendo
formaldedo ou outras solues fixadoras em esgoto sanitrio convencional;
procure saber a poltica de descarte de produtos txicos de sua instituio.
Formol-salino
Formaldedo comercial........................................100 mL
gua destilada................................................900 mL
Cloreto de sdio...................................................9 g
Caractersticas:
soluo isotnica;
pode levar deposio de pigmento formalnico;
indicado para algumas reaes histoqumicas.
Tempo de fixao: 24 a 48 horas.

Lavagem: gua corrente por 1 a 2 horas.
Indicado para algumas reaes histoqumicas.
Formalina tamponada de Carson ou formalina em tampo Millonig
Formaldedo comercial ........................................100 mL

gua destilada.................................................900 mL
Fosfato de sdio monobsico.................................18,6 g
Hidrxido de sdio..............................................4,2 g
Caractersticas:
utilizar soluo isotnica em pH 7,2 - 7,4 (310 mOsm);
indicado para a microscopia eletrnica e microscopia de luz;

provoca menor extrao de elementos celulares;
microtomia sofrvel de tecidos com muito sangue;
no interfere na maioria das coloraes;
fixa muito bem a maioria dos tecidos;
preserva a imunorreatividade de hormnios gastrintestinais, quan-
do preparado com paraformaldedo comercial no lugar do

formaldedo comercial.
Lavagem: gua corrente por 1 a 2 horas.
Formalina-alcolica
lcool 95%...................................................900 mL
Caractersticas:
utilizada para a observao de minerais (cobre, magnsio, ferro
e clcio); indicada para tecido nervoso, parasitas, glicognio,

amiloide e mucossubstncias.
Lavagem: lcool 95% por 1 hora iniciando a desidratao.
Formalina neutra tamponada 10%
gua destilada.................................................900 mL
Fosfato de sdio monobsico.....................................4 g
Fosfato de sdio dibsico.......................................6,5 g
Caractersticas:
soluo hipotnica (clulas intumescidas);
aproximadamente 165 mOsm;
pH 6,8;
indicada para clulas pancreticas, bactrias, alguns tipos de
carboidratos, clulas do tecido conjuntivo, fungos, minerais, tecido nervoso, pigmentos e glndulas.
Tempo de fixao: 24-72 horas.
Lavagem: gua corrente por 1 ou 2 horas.
AFA ou FAA lcool - formalina - cido actico:
Etanol (95 - 100%)..........................................85 mL

Formaldedo comercial..........................................10 mL
cido actico glacial............................................5 mL
Caractersticas:
um fixador de rpida penetrao;
preserva relativamente bem a morfologia, cidos nucleicos e
carboidratos;
os lipdeos no so preservados;
misturar no momento do uso;
muito utilizado para fixar helmintos.
Tempo de fixao: 4 a 48 horas em tecidos e 10 a 30 minutos para

esfregaos e/ou distenses.
Lavagem: direto para o lcool 95% do processador.
Vrios so os fatores que influenciam no processo da fixao, interferindo diretamente na preservao tecidual e, em ltima instncia, no tecido que
se deseja observar. Assim, deve-se analisar criteriosamente o protocolo de
fixao para identificar os fatores que podem influenciar diretamente na fixao
do tecido a ser analisado e consequentemente interferir na preservao tecidual.
Esses fatores so:
temperatura;
espessura do tecido;
penetrao;
tempo de fixao;
escolha do fixador;
relao volume do fixador tamanho do espcime;
estocagem apropriada;
pH do fixador;
osmolaridade da soluo fixadora;
adio de sais na mistura;
concentrao dos fixadores.
C. Clivagem
A clivagem consiste em reduzir as dimenses dos fragmentos dos tecidos coletados. Dependendo do tipo de fixador empregado, a clivagem poder ocorrer em at algumas horas aps a fixao. Na clivagem ideal, os fragmentos devem atingir cerca de 3 mm de espessura; porm, dependendo do tipo
de rgo, esse fragmento pode chegar a mais do que 5 mm (Figuras 1 e 2).
Figura 1. Clivagem de coluna verte- Figura 2. Clivagem com 3mm de

bral de camundongos Swiss webster. espessura.
A reduo das dimenses do fragmento facilita a penetrao dos

fixadores e a difuso dos reagentes durante as demais etapas do processamento
dos tecidos.
Para uma boa anlise histolgica, devemos respeitar algumas regras durante a coleta, a fixao e a clivagem:
fixar o tecido logo aps a coleta da amostra;
retirar, primeiramente, os rgos conhecidamente com alto metabolis-
mo, pois so os primeiros a sofrer autlise;

nunca comprimir o material a ser fixado com pina ou qualquer outro
instrumental, pois a fora imprimida pode causar distoro da estrutura

tecidual;
para se obter uma boa fixao de rgos encapsulados, a cpsula deve
ser removida;
os fragmentos devem possuir preferencialmente 3 mm de espessura,
pois geralmente os fixadores no penetram mais do que isto em tempo

hbil de evitar a autlise.
para se obterem fatias delgadas de rgos compactos, como fgado,
bao, rins, entre outros, coloque-os sobre uma placa de cortia ou

placa de Petri, previamente revestida com parafina, e com uma gilete
nova e afiada proceda confeco dos fragmentos;
como os fragmentos frequentemente se deformam durante a fixao,
conveniente que, aps essa etapa, sejam novamente clivados com gilete, de modo que cada fragmento apresente uma superfcie lisa de corte
que servir no somente de orientao ao tcnico durante o processo
de incluso, mas tambm auxiliar a etapa subsequente, ao se desbastar
o bloco;
usar, no mnimo, vinte vezes o volume de fixador em relao ao
volume dos fragmentos a serem fixados. Agitar, suave e periodicamente,

os fragmentos dos rgos durante a fixao do material para que o
fixador se misture uniformemente no frasco;
os frascos utilizados para a fixao devem ter boca larga, pois, alm de
facilitar o acesso aos fragmentos, ou mesmo aos rgos inteiros, esses

costumam aumentar seu volume aps a fixao;
nunca coloque o material a ser fixado em um frasco vazio, pois este
pode se aderir superfcie do vidro, impedindo que o fixador penetre

na rea em contato com o vidro;
acondicionar os tecidos clivados em cassetes histolgicos identificados
(Figuras 3 e 4).
Figura 3. Espcime clivado e acondicionado em cassetes histolgicos.
Figura 4. Cassete identificado

pronto para o processamento.
Durante o procedimento de clivagem do material, tome muito cuidado com
as navalhas e giletes utilizadas. O material perfurocortante, bem como os
restos de material biolgico, devem ser descartados em lixo prprio.
2. Descalcificao
Em muitos tecidos, verifica-se a deposio de sais minerais, como clcio

e fosfato. Por exemplo, o tecido sseo uma especializao do tecido conjuntivo, sendo rgido e inflexvel devido presena de cristais de hidroxiapatita
em sua matriz extracelular.
Em microscopia de luz, existem dois procedimentos tcnicos que auxiliam o estudo do tecido sseo: (1) a descalcificao, que remove a poro
mineral e analisa somente os constituintes orgnicos do tecido sseo; e (2)
o desgaste, que permite analisar os componentes inorgnicos do tecido.
Comentaremos neste captulo somente o procedimento da descalcificao,
que visa retirada dos componentes inorgnicos, como fosfato de clcio presente em tecidos sseos, em tumores sseos ou em determinadas patologias.
A descalcificao, por remover os sais de clcio, se faz necessria para

tecidos mineralizados, pois os cristais de clcio destroem o fio da navalha,
criando dentes que impedem a confeco de bons cortes e levam formao
de artefatos tcnicos, impedindo a anlise histolgica adequada.
A escolha do mtodo de descalcificao depende da urgncia, do grau
de mineralizao, do interesse da investigao, das tcnicas de colorao que
se pretende empregar e do tipo de fixador utilizado. Quanto mais rpida for a
ao de um descalcificador, pior ser a preservao morfolgica do tecido.
A prtica da descalcificao
Aps a coleta o tecido, este deve ser fixado, lavado para retirar o
excesso de fixador e, s ento, submetido descalcificao.
A descalcificao pode ser realizada por mtodos qumicos e fsicos.
Os mtodos qumicos utilizam solues descalcificadoras em pH cido, solues quelantes e meios de troca inica. Os mtodos fsicos esto sempre
associados a descalcificao qumica, englobando a dissociao eletroltica e
submisso do material contido em solues descalcificadoras, ao ultrassom e s
micro-ondas, que aceleram o processo de descalcificao.
Descalcificao qumica
A. Descalcificao por cidos

Os descalcificadores cidos possuem a propriedade de solubilizar sais
minerais. Na matriz inorgnica dos tecidos mineralizados, ocorrem principalmente sais de fosfato e de carbonato, que so pouco solveis na gua. Esse
mtodo possui a vantagem de ser simples; porm, recomenda-se fazer um
banho neutralizante com hidrxido de amnia ou oxalato de amnia ou
sdio aps a descalcificao.
A desvantagem desse mtodo a ocorrncia de dilatao e hidrlise da

matriz ssea e destruio de enzimas, cidos nucleicos e polissacardeos.
A soluo descalcificadora cida age removendo o clcio dos sais de
carbonato ou fosfato presentes no osso, efetuando uma troca inica que
resulta na formao de um sal de clcio solvel. Algumas das solues
descalcificadoras constituem-se de cidos orgnicos ou inorgnicos, que sero
citados a seguir.
Existe um grande nmero de agentes descalcificadores cidos, incluindo
cidos fracos ou fortes, que podem ser aquosos ou alcolicos, diludos ou no
em agentes fixadores.
cidos fortes - possuem maior poder descalcificante, causando dano
aos tecidos, principalmente aos ncleos que so hidrolisados, o que prejudica

a utilizao posterior de corantes nucleares. Esse tipo de descalcificador
empregado para anlises urgentes; para material no urgente, aconselham-se
agentes quelantes pelos motivos que sero descritos mais adiante.
cido ntrico (HNO3) - no causa o intumescimento dos tecidos e
proporciona maior nitidez nas coloraes. Geralmente utilizado em
concentraes de 5% a 10%, no se devendo expor o tecido a esta
soluo por mais de 48 horas. um descalcificador rpido muito prejudicial ao tecido.
cido clordrico (HCl) - um dos cidos de ao rpida mais utilizados. Geralmente usado em soluo tampo, como, por exemplo, o
sulfato de sdio a 5% ou 10%, ou, ainda, diludo em lcool.
cido ntrico aquoso a 5%:
cido ntrico.........................................................5 mL
gua destilada......................................................95 mL
cido ntrico aquoso a 10%:

cido ntrico........................................................10 mL
gua destilada......................................................90 mL
Formalina - cido ntrico:
Formaldedo.........................................................10 mL
gua destilada......................................................80 mL
cido ntrico........................................................10 mL
Fluido de Perennyi:
cido ntrico 10%................................................40 mL
Etanol absoluto.....................................................30 mL
cido crmico 0,5%.............................................30 mL
cidos fracos - os cidos mais usados nas misturas descalcificadoras
so o cido actico, cido pcrico e cido frmico. Os cidos actico e

pcrico tambm so muito utilizados em misturas fixadoras, fixando ao mesmo
tempo em que descalcificam os tecidos pouco mineralizados, como os tecidos embrionrios. Dentre os cidos, o cido frmico o mais utilizado na
soluo de 5% a 10 %.
cido frmico (HCOOH) - pode ser utilizado em soluo a 5%
aquosa ou alcolica, ou em mistura fixadora com o formol 10% a
20%. Geralmente usado em solues tampes, como o tampo
citrato de sdio, que proporciona uma melhor colorao em relao ao
mtodo com cido ntrico.
cido frmico a 5%:
cido frmico 90%.................................................5 mL
gua destilada......................................................95 mL
cido frmico a 5%:

cido frmico 90%.................................................5 mL
gua destilada......................................................95 mL
Formalina cido frmico:
cido frmico 90%...............................................10 mL
Formaldedo comercial...............................................5 mL
gua destilada......................................................85 mL
Mistura descalcificadora cido frmico-clordrico:
Soluo A cido clordrico 8%:
cido clordrico concentrado .......................40 mL
gua destilada..........................460 mL
Soluo B cido frmico 8%:
cido frmico......................................................40 mL
gua destilada....................................................460 mL
Soluo de uso: (preparar antes de usar):
Soluo A.........................................................500 mL
Soluo B..........................................................500 mL
cido pcrico (C6H2(NO2)3OH) - esse cido age muito lentamente
e utilizado principalmente em soluo aquosa saturada para descalcificar
tecidos embrionrios. Os tecidos devem ser lavados em lcool 70%
aps a descalcificao para remover o precipitado amarelo.
Procedimentos gerais para a descalcificao por misturas cidas:
1- A pea a ser descalcificada no deve possuir mais do que 5 mm de
espessura. Esta deve ser clivada para isso.
2- O volume da mistura descalcificadora deve ser de dez a vinte vezes

as dimenses da pea a ser descalcificada.
3- O material a ser descalcificado deve estar suspenso na mistura
descalcificadora, pois o clcio, ao sair do tecido, se deposita no fundo
do frasco (Figura 5).
4- A mistura descalcificadora deve ser substituda a cada 24 horas. O
tempo de descalcificao depender das dimenses da pea e do tipo
de soluo descalcificadora.
5- Ao trmino da descalcificao, deve-se neutralizar, os tecidos com
uma soluo alcalina de sulfato de sdio (Na 2SO4) a 5% por
24 horas.
6- Lavar com vrios banhos de gua por um perodo de 48 horas.
7- Seguir a rotina de processamento histolgico.
Figura 5. Suspenso dos tecidos durante a descalcificao.
B. Descalcificao por resinas de troca inica
Essa resina promove a acelerao do processo de descalcificao pela

rpida troca inica entre o cido frmico e os fosfatos ou carbonatos de clcio
tecidual, proporcionando, alm da rapidez, boa preservao dos detalhes
celulares, com qualidade superior aos mtodos de descalcificao por cidos.

Essa resina pode ser reaproveitada.
Resina :
WIN 3000 (resina de troca inica).............................100 g
cido frmico em soluo aquosa a 10% ...................800 mL
Figura 6. Resina de troca inica.
C. Mtodos histoqumicos
So mtodos escolhidos quando se deseja preservar enzimas (fosfatase

alcalina e desidrogenases), cidos nucleicos e polissacardeos (glicognio) presentes no tecido sseo. Os mtodos habituais que utilizam descalcificadores
cidos no permitem a anlise dessas molculas e substncias.
Os mtodos histoqumicos incluem dois procedimentos para a
descalcificao.
Mistura de tampes - nesse procedimento, os sais de clcio so
removidos do osso, quando imersos em soluo tampo de citrato com pH

4,5. Uma desvantagem desse mtodo a inativao reversvel da fosfatase
alcalina, que se torna ativa aps a neutralizao com a soluo de sdio
barbital.
Procedimento para a descalcificao:
1- Fixar os tecidos em lcool 80% de 24 a 48 horas.
2- Descalcificar com a soluo tampo (4C) o tempo de
descalcificao varia de acordo com o tamanho da pea e seu grau
de mineralizao.
3- Lavar em gua corrente e depois em gua destilada.
4- Neutralizar em soluo de sdio barbital a 37C por 6 horas.
5- Lavar em gua corrente por 6 horas.
Tampo cido ctrico-citrato (pH 4,5):
cido ctrico 1N...................................................50 mL
Citrato de amnio 1N..............................................50 mL
Sulfato de zinco 1%.................................................2 mL
Clorofrmio........................................................0,1 mL
Agentes quelantes - so compostos orgnicos que se ligam ao on
clcio (metal, ver tabela peridica) formando um metal quelado, por exemplo,
sequestrante ou versene (cido etilenediaminetetractico ou EDTA). Esse mtodo bem lento, sem dano ao tecido. Assim, como as misturas de tampes,
ele inativa a fosfatase alcalina, que reativada aps um banho de 2 a 6 horas
em soluo de cloreto de magnsio 6%. A descalcificao por agentes quelantes
no produz artefatos durante a maioria das coloraes histolgicas, diferente
da descalcificao por cidos, que gera artefatos quase irreversveis.
Descalcificantes quelantes (EDTA)

EDTA neutro:
Sal de EDTA dissdico............................................250 g
gua destilada.................................................1.750 mL
A soluo fica esbranquiada e deve ser neutralizada (pH=7,0)
pela adio de aproximadamente 25g de hidrxido de sdio.
Hilleman e EDTA de Lee:
Sal de EDTA dissdico.............................................5,5 g
gua destilada......................................................90 mL
Formoldedo comercial.............................................10 mL
Soluo descalcificadora EDTA em Tampo Fosfato 0,1M:
1) Tampo fosfato 0,1 M para o preparo final da soluo descalcificadora
de EDTA:
Tampo fosfato 0,1 M (pH=7,0):
Soluo A:
Fosfato monobsico de sdio.........................................13,7g
gua destilada..............................................................1 L
Soluo B:
Fosfato dibsico de sdio..............................................35,8g
gua destilada..............................................................1 L
Para 1 litro coloca-se em um bquer 750 mL da soluo B e adicionase gota a gota a soluo A at o pH atingir o pH 7,0.
Soluo de uso do descalcificador EDTA em tampo fosfato 0,1 M:

EDTA....................................................................100 g
Tampo fosfato 0,1 M (soluo 1)........... .................1000 mL
Acertar o pH do EDTA para 7,0 com hidrxido de sdio 10 M
Procedimento:
1- Suspender o espcime no lquido (Figura 5) descalcificador, com
o volume igual ou superior a vinte vezes o volume da pea.
2- Trocar a soluo descalcificadora diariamente. Se possvel, manter
o frasco em agitao.
3- Testar aps duas a trs semanas, para ver se j ocorreu a descalcificao.
4- Lavar em gua por algumas horas.
5- Proceder ao processamento histolgico.
Descalcificao fsica
A. Descalcificao eletroltica ou ionizao eltrica

Esse mtodo permite a formao de um campo eltrico entre dois eletrodos,
fazendo os ons de clcio migrarem rapidamente do osso (anodo) para o eletrodo
de carbonato (catodo). Os radicais cidos migram para o anodo.
um mtodo rpido; porm, a temperatura no deve exceder 45oC.
Aps a descalcificao, recomenda-se a neutralizao das peas, com soluo
sulfato de sdio (Na2SO4) a 5% por 24 horas, para evitar a formao de
artefatos durante a colorao. Aps a neutralizao, as peas devem ser lavadas em vrios banhos de gua por no mximo 48 horas.
Soluo descalcificadora eletroltica:

cido frmico a 90% ..........................................100 mL
cido clordrico....................................................80 mL
gua destilada....................................................820 mL
Figura 7. Descalcificao eletroltica.
B. Descalcificao com auxlio das micro-ondas

O efeito benfico do calor foi reconhecido antes da era das microondas e foi primeiramente utilizado durante o procedimento de fixao por
Ehrlich (1898) para acelerar a fixao qumica por meio de calor externo.
As micro-ondas penetram vrios centmetros para dentro dos tecidos
biolgicos, e o calor produzido pode ser controlado pela potncia e o tempo
de exposio. O calor o principal responsvel pelos efeitos produzidos
pelas micro-ondas, assim como a agitao molecular e o fluxo eletromagntico,
acelerando o processo de descalcificao. Durante o aquecimento, a energia
termal aumenta a dinmica molecular, na qual a agitao molecular induzida pela
oscilao do campo eletromagntico aumentar a coliso de molculas, acelerando as reaes qumicas. Esse mtodo reduz o tempo de descalcificao; o
que normalmente levaria dias, nesse mtodo levar somente algumas horas.
Deve-se imergir a pea na mistura descalcificadora de escolha e irradiar

as micro-ondas.
C. Descalcificao com auxlio do ultrassom
Assim como as micro-ondas, o ultrassom acelera o processo de
descalcificao, promovendo a agitao molecular, com a vantagem de no
elevar a temperatura, mantendo as estruturas celulares.
Como possvel saber se a pea est totalmente descalcificada?
Existem mtodos fsicos e qumicos que permitem controlar o momento
de finalizao da descalcificao.
Mtodos fsicos
Manipulao do operador: tenta-se dobrar a pea ou inserir
uma agulha bem fina e verificar, assim, o grau de mineralizao.

Teste radiolgico: o raio-X o mtodo mais sensvel e confivel
para acompanhar a descalcificao.

Mtodos qumicos
Teste do oxalato de amnia: esse mtodo detecta a presena
de clcio no lquido descalcificador, indicando se a descalcificao

est completa ou no.
Teste do oxalato de Amnia / Hidrxido de Amnia:
Solues estoque:
Soluo A soluo estoque de hidrxido de amnia 5%:
Hidrxido de amnia 28%.....................................5 mL
gua destilada..................................................95 mL
Soluo B estoque de oxalato de amnia 5%:

Oxalato de amnia...............................................5 mL
gua destilada..................................................95 mL
Soluo de uso de oxalato de amnia / hidrxido de amnia
Soluo A soluo estoque de hidrxido de amnia 5% - 5 mL
Soluo B soluo estoque de oxalato de amnia 5% - 5 mL
A soluo deve ser preparada no momento do uso.
Procedimento:
1- retirar 5 mL de lquido descalcificador do fundo do frasco que
em se encontra a pea;
2- colocar em um tubo Falcon de 15 mL;
3- adicionar ao tubo 10 mL da soluo de uso de oxalato de
amnia-hidrxido de amnia;
4- misturar bem e deixar repousar em p por 12 horas;
5- se a descalcificao for completa, o lquido se manter lmpido;
caso contrrio, haver precipitao do clcio;
6- esse processo deve ser repetido at que o lquido descalcificante
se encontre lmpido por dois dias.
Muitos inconvenientes podem ser gerados durante o processo de
descalcificao e, para minimiz-los, devemos tomar alguns cuidados
Regras gerais para uma boa descalcificao:
somente descalcificar tecidos muito bem fixados;
reduzir ao mximo o tamanho da pea a ser descalcificada,
reduzindo assim o tempo de descalcificao;
a lavagem do material essencial antes da descalcificao e
antes do processamento subsequente;

renovar o descalcificador diariamente, pois esse vai perdendo
sua concentrao original;

o volume do lquido descalcificador deve ser no mnimo vinte
vezes o tamanho da pea;

verificar constantemente se a descalcificao foi finalizada;
neutralizar sempre os tecidos aps a descalcificao por substn-
cias cidas.
Ao manipular solues cidas e agentes quelantes, deve-se fazer uso de luvas
especficas para manipulao qumica, de mscara com filtro prprio para
vapores cidos e orgnicos, e deve-se faz-lo em local arejado e com exausto.
O preparo dessas solues deve ser feito em capela de exausto. Deve-se,
previamente, consultar as fichas de emergncia qumica das solues cidas e
quelantes antes da sua manipulao. A inalao destes compostos pode
causar irritao e queimaduras.
Nunca descarte solues cidas em esgoto sanitrio convencional, procure
saber a poltica de descarte de produtos txicos de sua instituio.
3. P
rocessamento
Processamento
O princpio do processamento histolgico consiste na difuso de reagentes

para o interior dos tecidos e na remoo do lquido tecidual que, aps a
fixao do material, o prprio fixador empregado.
O processamento tecidual tambm torna os fragmentos rgidos capazes
de proporcionar o seccionamento de fatias finas e delicadas para a observao
ao microscpio.
Diversas substncias podem ser utilizadas como meio de incluso; porm, no processamento convencional, comumente se utiliza a parafina.
O processamento para incluso de material em parafina passa por trs
etapas: desidratao, clarificao e impregnao.
A. Desidratao
A desidratao consiste na remoo da gua dos tecidos, pois as substncias previamente utilizadas para incluso em parafina no se combinam
homogeneamente com a gua.
Vrios so os agentes desidratantes. A substncia utilizada na rotina
histolgica o lcool etlico, por produzir bons resultados e possuir baixo
custo. Contudo, outros agentes desidratantes tambm so eficientes, variando
apenas o tempo de desidratao.
B. Clarificao ou diafanizao
A clarificao visa remover completamente o lcool do interior dos

tecidos, preparando-os para as etapas subsequentes. A remoo do lcool
de extrema importncia, pois a parafina no se mistura homogeneamente com o
lcool. Dessa forma, fundamental a completa remoo do lcool para que a
parafina possa penetrar completamente no interior dos tecidos.
Para remover o lcool e preparar o tecido para a penetrao da parafina
utiliza-se, nessa etapa, o xilol. Conforme o xilol penetra o tecido, em substituio ao lcool, o material se torna mais claro, transparente. Por essa razo,
essa etapa denominada clarificao.
C. Infiltrao em parafina
A infiltrao dos elementos teciduais em parafina importante, pois a

parafina tambm o meio de incluso tecidual. Para a infiltrao, ela deve ter
sido previamente aquecida, pois a parafina lquida somente em temperatura

entre 56C a 60C, sendo slida temperatura ambiente.
Os tecidos tambm podem ser infiltrados por outros meios de incluso,
necessitando de processamentos especiais dependendo do meio de incluso.
Meios de incluso como polietilenoglicol (carbowax), resinas hidroflicas
e hidrfobas, gelatina, dentre outros, funcionam como meios alternativos de
incluso dependendo do objetivo da anlise.
O processamento dos tecidos possui variveis que podem afetar consideravelmente os resultados do processo histolgico. Dentre as variveis, temos: condies de operao (manual ou equipamentos automtico), temperatura, caractersticas e concentrao dos reagentes utilizados e as propriedades
qumicas dos tecidos.
Processamento manual (Figura 9)
Limitaremos aqui a descrio para material destinado a incluso em

parafina.
Desidratao
Para a desidratao adequada, necessrio que o volume do lcool seja
vinte vezes o volume da amostra. Contudo, sendo a gua mais densa do que
o lcool, ela tende a se localizar no fundo do frasco aps a sua retirada do
tecido, exatamente onde a amostra se encontra (Figura 8).
Para que a desidratao seja satisfatria e a gua se acumule no fundo
do frasco, recomenda-se:
agitar constantemente o recipiente, para que a gua se misture
ao lcool;
realizar vrias trocas de lcool, pois a gua ser eliminada com o
lcool desprezado;
usar recipientes de fundo largo para diminuir o nvel de gua;

nunca aquecer o lcool, pois, alm de ser perigoso, o meio
ficar hidratado mais facilmente.
Figura 8. Material sendo desidratado e clarificado.
Clarificao
Apesar de as substncias diafanizadoras serem insolveis em gua e
solveis no lcool, que removido da pea durante a clarificao, deve-se
tomar algumas precaues:
agitar o frasco para melhorar a difuso (sada do lcool e
entrada do xilol); antigamente, esse procedimento seria reprovado, pois como o lcool menos denso do que a gua, ele
ficaria na superfcie do frasco e no estaria em contato com a
pea (Figura 8);
proceder, no mnimo, a duas trocas com a substncia clarificadora;
no deixar o material por muito tempo em xilol, pois ele resseca
muito o material, interferindo na sua qualidade.
Impregnao
A impregnao deve ser realizada em estufa a 60oC. Os fragmentos
sero transportados de uma parafina a outra em intervalos de tempo predeterminados. No se deve realizar somente uma passagem pela parafina, pois ser
insuficiente para remover todo o xilol dos tecidos. Contudo, recomenda-se
nunca deixar o material permanecer na parafina por muito tempo, pois como a
parafina somente lquida em temperatura alta, o calor em um longo perodo
de tempo poder causar grande dano ao tecido.
Figura 9. Processamento manual de tecidos.
Processamento automtico
Existem dois tipos de equipamentos automticos (processadores) acessveis no mercado e que so tambm chamados histotcnicos ou autotcnicos.
Um tipo de processador o carrossel (Figura 10), mais tradicional
e de baixo custo, no qual os cassetes contendo os fragmentos so colocados em uma cesta que transportada mecanicamente de forma a imergir os
cassetes em cada reagente. Outro tipo possui uma cmara fechada, na qual
os reagentes so transferidos de recipiente a recipiente e, esses processadores

automticos, chamados processadores com transferncia de fluidos. Ambos
os equipamentos possuem doze estgios de processamento.
Alguns processadores esto acoplados a um sistema de vcuo (Figura
11) que, no do tipo carrossel, est no ltimo banho de parafina. Nos
processadores com transferncia de fluidos, o vcuo pode ser includo em
todos os banhos do processo. Todo o processamento ocorre em vcuo,
revelando significativa melhoria dos resultados em perodos de tempo reduzido, em comparao aos resultados obtidos no processamento sem vcuo.
importante salientar que os recipientes com parafina para infiltrao
possuem termostatos que controlam a temperatura ideal de infiltrao. Alm
disso, todos os processadores possuem agitao automtica.
O trabalho com processadores automticos mais confivel, pois
no ocorre falha humana durante o processamento. O tcnico somente
deve programar o aparelho e trocar os reagentes para obter um bom
processamento do material. O protocolo de execuo tambm elaborado pelo prprio tcnico e pode ser alterado a qualquer momento de forma
simples e rpida.
Geralmente, os aparelhos so programados para trabalhar durante
toda a noite e, no dia seguinte pela manh, o material estar pronto para
ser includo. Outro fato considerado quando se quer ganhar tempo na
rotina laboratorial, pois se pode programar o equipamento para trabalhar
durante feriados e finais de semana.
Figura 10. Processador de tecidos

automtico.
Figura 11. Sistema de vcuo.
Protocolos de processamento
Os protocolos de processamento variam de acordo com:
as dimenses dos fragmentos do material a ser processado;
tipo de reagentes utilizados;
tipo do espcime biolgico (material humano, de rato, de
camundongo, entre outros);

tipo de tecido;
processamento automtico ou manual;
presena de vcuo.
Citaremos um dos protocolos utilizados para processamento de tecidos

clivados com 3mm de espessura:
Passo
Estgio
Reagente
Durao
Desidratao
lcool 70 %
1h
Desidratao
lcool 80 %
1h
Desidratao
lcool 90 %
1h
Desidratao
lcool 95 %
1h
Desidratao
lcool 100 %
1h
Desidratao
lcool 100%
1h
Desidratao
lcool 100%
1h
Desidratao
lcool 100%
1h
Clarificao
Xilol I
1h
10
Clarificao
Xilol II
1h
11
Impregnao
Parafina I
1h
12
Impregnao
Parafina II
2h
Fatores que influenciam no processamento

Temperatura;
Vcuo;
Agitao.
Todo material utilizado no processamento de tecidos altamente inflamvel.
Use luvas, jaleco e mscara com filtro de proteo contra vapores orgnicos.
Durante a manipulao dos reagentes, evite contato com o lquido e o vapor
de xilol. Este elemento txico para as vias areas. Quando inalado por
tempo prolongado, pode causar a morte. Em caso de incndio, extinguir
com espuma, p qumico seco ou dixido de carbono. O vapor de xilol
mais pesado do que o ar, exigindo capela com exausto inferior. No
descarte os resduos do processamento em esgoto sanitrio comum, procure
saber em sua instituio qual a poltica de descarte de substncias qumicas.
4. Incluso
A incluso se baseia em colocar, com o auxlio de uma pina previamente

aquecida, os tecidos que foram previamente infiltrados em parafina no interior de
um molde que j contm parafina lquida com a superfcie a ser seccionada (a ser
cortada ao micrtomo) para baixo (Figuras 11, 12, 13 e 14).
Os fragmentos devem ser colocados na parafina enquanto aquecidos,
evitando-se a formao de bolhas de ar em torno deles. Aps o resfriamento,
os blocos de parafina com o material includo so obtidos.
Para se realizar uma boa incluso, necessrio que o fragmento esteja
completamente desidratado, clarificado e corretamente impregnado.
Quando se observa que uma dessas etapas no foi corretamente efetuada (observando reas opacas ou esbranquiadas no material), deve-se,
nesse caso, retroceder o processamento executando-o da seguinte forma:
remover a parafina de infiltrao com vrios banhos do agente
clarificador (xilol);
aps a completa remoo da parafina, proceder remoo do xilol,
passando o fragmento por vrias trocas do agente desidratante (lcool),

ou mesmo gua, caso o tecido no tenha sido desidratado corretamente;
em seguida, desidratar e clarificar novamente;
infiltrar e incluir o material novamente em parafina.
importante que logo aps o trmino da infiltrao seja efetuada a

incluso, evitando que o material se torne quebradio e retrado pelo efeito da
temperatura da parafina aquecida.
Figura 12. Central de incluso.
Figura 13. Incluso do material.
Figura 14. Colorao do suporte

com identificao do tecido.
Figura 15. Blocos prontos para a

microtomia.
Em alguns laboratrios de histologia, observa-se que o tcnico remove

os fragmentos da parafina de infiltrao e deixa-os esfriar at o momento da
incluso. Esse comportamento est totalmente errado. O fragmento, ao ser
novamente submetido ao da temperatura elevada (56-58oC), pode ter
sua textura consideravelmente prejudicada pelo calor. Assim, devemos incluir o
fragmento logo aps o trmino da infiltrao.
A temperatura da parafina de incluso pode estar cerca de 5C acima
do ponto de fuso da parafina. Essa temperatura necessria para que possamos manusear o fragmento dentro do molde, que por vezes metlico e esfria
rapidamente. No mercado existem aparelhos que possuem dispositivos que
auxiliam no processo de incluso, como tanques de acondicionamento da
amostra. Nesses equipamentos, o termostato permite o controle mais preciso

da temperatura.
As centrais de incluso (Figura12) possuem normalmente duas placas,
uma aquecedora para efetuar a incluso, e outra refrigerada para resfriar os
moldes com as amostras includas. Essas centrais tambm possuem um local
para aquecimento das pinas que sero utilizadas durante a incluso. Esses
aparelhos facilitam o procedimento da incluso, principalmente por manterem a
mesma temperatura de infiltrao em todos os tanques e placas, diminuindo
consideravelmente o tempo gasto com a incluso propriamente dita.
Dependendo do fabricante, alguns produtos, ao serem adicionados
parafina de incluso, alteram a sua consistncia, tornado-a mais macia ou mais
densa. A mudana de consistncia deve ser avaliada, pois sua consistncia
um fator importante na microtomia. Dentre as substncias que podem ser
adicionadas parafina, tm-se: cera de abelha, estearina, cera de carnaba,
dietileno glicol, dentre outras.
Outro fato a ser considerado o uso de cassetes durante o procedimento at a incluso. Os cassetes de plstico so aconselhados, pois permitem
escrever, a lpis, o nmero de registro do material. Os cassetes tambm so
importantes para a microtomia, pois podem ser adaptados ao micrtomo.
Procedimentos para incluso (Figuras 13, 14, 15,16 e 17)
Abrir o cassete e verificar o nmero de fragmentos contidos no
cassete.
Selecionar o molde a ser utilizado de acordo com as dimenses dos
fragmentos a serem includos de maneira a sobrar cerca de 2 mm de

parafina nas margens do bloco.
Preencher o molde com parafina lquida pr-aquecida.
Com o auxlio de uma pina, selecionar o fragmento, sem deix-lo
esfriar, e coloc-lo no molde preenchido previamente com parafina.
Colocar a base do cassete, ou suportes, sobre o molde de maneira
que a parafina entre em contato com o cassete. Se para a incluso no

se utilizar o cassete, deve-se utilizar um papel para escrever a identificao do bloco.
Levar o molde com o material includo para a placa resfriada.
Quando o molde comear a suar, o momento certo de retirar o
bloco do molde.
Figura 16. Procedimento de incluso. Figura 17. Molde com material
que foi includo.
Orientao dos fragmentos

A orientao dos fragmentos de rgos no molde um processo importante na confeco dos cortes e anlise dos tecidos. Por exemplo, rgos
tubulares, como intestinos, devem ser includos no plano transversal; fragmentos de msculos tambm devem ser includos, considerando-se seus planos
longitudinais e transversais. Ao se incluir um fragmento de pele, deve-se
considerar a anlise de suas estruturas bsicas, isto , a epiderme e a derme.
Pequenos fragmentos de tecidos podem ser includos paralelamente,
enquanto fragmentos alongados so orientados longitudinalmente.
Para melhor compreenso do sentido desses materiais durante a incluso,
sugere-se que o tcnico procure atualizar seu conhecimento bsico sobre a
histologia, consultando a literatura especializada ou buscando orientao com o

chefe ou pesquisador do setor.
A parafina altamente inflamvel, mantenha esta substncia longe de chamas.
Evite queimaduras, pois as placas e pinas utilizadas neste procedimento so
aquecidas. A incluso deve ser realizada em local arejado ou com exausto. Os
vapores de parafina so txicos s vias respiratrias.
5. Microtomia
Para permitir a anlise dos tecidos ao microscpio de luz, eles devem ser
seccionados em fatias bem finas e uniformes. A espessura ideal varia de acordo
com o objetivo de estudo; recomenda-se a espessura de 4 a 6 mm na rotina
dos laboratrios.
O instrumento capaz de confeccionar cortes com tal preciso o
micrtomo (Figura 18), sendo constitudo por trs partes: corpo, porta-bloco
e porta-objeto. Considera-se, ainda, que em alguns modelos possua duas
manivelas, uma manivela de ajuste e outra de corte.
Existem dois tipos de micrtomos: do tipo rotatrio, tambm conhecido como do tipo Minot, em que o material, no porta-objeto, vai de
encontro navalha que est imvel no porta-navalha; e o do tipo corredia,
que avana o porta-navalha e vai de encontro ao porta-objeto onde se
encontra a amostra.
Encontram-se venda no mercado diversos modelos dos dois tipos de
micrtomo, podendo ser automticos ou manuais. Muitos micrtomos foram
desenvolvidos para confeccionar cortes a partir de blocos de parafina, outros,
para realizar cortes congelados, e h ainda aqueles micrtomos especficos para
a microscopia eletrnica, chamados ultramicrtomos, capazes de confeccionar
cortes ultrafinos. A ttulo de conhecimento geral, iremos descrever alguns
destes modelos.
Figura 18. Micrtomo.
Micrtomos
Micrtomo rotativo ou modelo Minot: so instrumentos peque-
nos e mais utilizados para microscopia de luz para tecidos includos em

parafina.
Criostato: utilizado para confeccionar cortes de tecidos que foram
congelados. Esse equipamento consiste de um micrtomo rotatrio acondicionado dentro de uma cmara frigorfica com temperatura abaixo de 20 oC (Figura 19).
Figura 19. Criostato.
Micrtomo de corredia: indicado quando os blocos contm frag-
mentos grandes, podendo ser utilizado para bloco de gelatina ou parafina. um micrtomo muito pesado, o que evita qualquer tipo de
vibrao mecnica. Muito utilizado para a confeco de cortes de tecido nervoso.
Micrtomo de congelao: esse tipo de micrtomo usado para
cortes de material fresco congelado. O sistema desse micrtomo igual

ao do micrtomo de corredia, em que a navalha que se move em
direo amostra, que permanece imvel. equipado com um cilindro
de dixido de carbono lquido que congela as amostras de tecidos e a
navalha. Esse tipo de micrtomo muito utilizado em centros cirrgicos
para um diagnstico rpido.
Ultramicrtomo: utilizado para confeccionar cortes de material includo
em resinas acrlicas ou epoxi. Esse equipamento permite seces semifinas

(com espessura em micrmetros) de pequenas amostras para microscopia
de luz, e ultrafinas (com espessura em nanmetros) em microscopia eletrnica. O ultramicrtomo vem adaptado com suporte para navalhas de vidro
para a confeco de cortes semifinos, e suportes para facas de diamante
ou safira, utilizadas para confeccionar cortes ultrafinos. um micrtomo
automtico que possui um controle de operao mecnica.
Micrtomo do tipo serra: um micrtomo especial utilizado para
cortar ossos calcificados, vidros ou cermicas. As amostras includas em

resinas so movidas contra uma serra de diamante.
Micrtomo vibratrio: utilizado para fazer seces de tecidos frescos
de material no fixado, ou tecidos moles; tambm utilizado para a

obteno de cortes de tecidos vegetais. O nome do micrtomo deriva
do fato de ele possuir um sistema de alta vibrao da navalha para cortar
o tecido. Diferentes graus de vibraes podem ser produzidos para
cortar os tecidos de diferentes densidades.
Utilize luvas ao cortar em criostatos, e lembre-se de que no caso de material
congelado, os espcimes no esto fixados.
Navalhas (ou facas)
Existe uma variedade de navalhas disponveis no mercado, variando de

qualidade conforme o grau de dureza do material, o meio de incluso ou o
tipo de micrtomo.
Navalhas de ao: so fabricadas com ao de alta qualidade. A super-
fcie de corte do ao no deve possuir impurezas e nem ser revestida

por substncias anticorrosivas. Essas navalhas so tradicionalmente usadas
para microtomia de material includo em parafina.
Navalhas de ao para criostato: so navalhas mais resistentes e total-
mente livres de impurezas, contendo ainda 12% a 15% de material

cromado ou de teflon, pois no oxidam na presena de gua e oferecem maior durabilidade.
Navalhas descartveis: possuem adaptadores prprios, alm de produ-
zirem cortes de alta qualidade por no comprimirem os tecidos e permitirem cortes sequenciais, denominados cortes em fita. Essas navalhas so
confeccionadas em platina ou material cromado para prolongar o uso
do gume ou fio da navalha muito afiado. Para confeco de cortes
includos em parafina, so comercializadas navalhas descartveis de alto
e baixo perfis; as navalhas de alto perfil servem para microtomia de
tecidos mais slidos, enquanto as de baixo perfil servem para cortar
tecidos mais delicados.
As navalhas descartveis so recomendadas por possurem custo menor
em relao s de ao, alm de dispensarem a utilizao de equipamentos,
como afiadores automticos, que so muito caros. Assim, representam economia de tempo para o tcnico, que no mais precisar amolar suas navalhas.
Existem tambm navalhas descartveis de tungstnio para a execuo de

cortes de rgos ou osso inclusos em resinas acrlicas.
Execuo dos cortes
Com o auxlio de uma navalha bem afiada, um micrtomo bem aferido e
um bloco contendo material condizentemente includo, possvel iniciar a
microtomia.
Material e equipamento necessrio:
micrtomo;
pina histolgica com ponta curva;
banho-maria;
cuba com gelo;
pincel (opcional);
gaze;
bloco de tecido;
navalha bem afiada;
suporte para lminas;
lminas com adesivo;
placa aquecedora (opcional);
estufa a 58oC.
Procedimento para a microtomia (Figuras 20, 21, 22 e 23)

1- Fixar o bloco no micrtomo.
2- Colocar o maior eixo do bloco verticalmente ao fio (gume) da
navalha. Se o rgo possuir cpsula, essa deve ficar no lado superior
do bloco.
3- Acertar o bloco para que a sua superfcie fique paralela navalha.
4- Colocar no micrtomo uma navalha j utilizada (velha) para desbastar

o bloco (retirar o excesso de parafina at se alcanar o material).
5- Aparar o bloco (desbastar).
6- Substituir navalha velha por nova e afiada.
7- Resfriar o bloco para endurecer mais a parafina e umedecer a superfcie do tecido. Pode-se utilizar um cubo de gelo, o qual deve ter a
superfcie lisa para entrar em contato com a superfcie do material.
8- Secar a navalha e o bloco com cuidado para no atingir o fio da
navalha nem causar ranhuras.
9- Efetuar a microtomia propriamente dita, obtendo os cortes com o
auxlio de uma pina, a qual auxilia na manipulao da fita formada.
10- Retirar a fita do micrtomo, com o auxlio da pina, e transport-la
para o banho-maria, para realizar a distenso dos cortes. A temperatura
do banho-maria deve estar em torno de 40oC para que os cortes se
distendam sobre a superfcie da gua, evitando-se a formao de pregas. Pode-se, tambm, aps a execuo dos cortes, coloc-los em
banho-maria em temperatura ambiente e distend-los em placa aquecedora com a temperatura em torno de 40 oC a 45 oC.
11- Se o tecido formar dobras, ainda no banho-maria, elas devem ser
removidas com o auxlio de uma pina curva, pois tais dobras interferem
na anlise histolgica.
12- Coletar o corte com lmina limpa e adesivada.
13- Transferir a lmina com o corte para uma placa aquecedora.
14- Levar a lmina estufa aquecida a 60 oC para retirar o excesso de
parafina e melhorar a adeso do corte a lmina.
Figura 20. Microtomia de tecidos.
Figura 21. Distenso dos cortes

em banho-maria.
Figura 22. Coleta ou pescagem

dos cortes.
Figura 23. Lminas em um suporte

para secar.
Preparo prvio das lminas

As lminas devem ser muito bem limpas e desengorduradas para que os
cortes no se desprendam da lmina durante as etapas subsequentes.
Marcao: as lminas devem ser identificadas com o nmero de
registro correspondente ao bloco, o que pode ser feito com lpis

de diamante (permanente) ou lpis dermogrfico.
Adesivos
Geralmente, como os cortes podem se soltar das lminas durante a
colorao, para evitar que se desprendam podem-se usar adesivos colocados
antes da microtomia nas lminas lavadas e secas.
Os adesivos mais usados so:

albumina de Mayer;
gelatina;
celoidina
polylisina (para imuno-histoqumica);
silano (para tcnicas imuno-histoqumicas, hibridizao in situ e
PCR).
Problemas que podem ocorrer durante a microtomia
A maioria dos artefatos observados nos cortes causada por problemas
com a navalha durante a microtomia ou durante o processamento. Vamos listar
alguns dos problemas:
Problemas
Principais causas
1. A navalha e o bloco no esto
paralelos
2. O bloco de forma irregular de
paredes no paralelas
1. Fitas de cortes curvas ou
3. Borda de corte da navalha
irregulares
irregular
4. Parafina misturada no
homogeneamente ou impura
1. Faca mal afiada
2. Faca ou bloco quente
2. Cortes comprimidos, irregulares
3. ngulo irregular da navalha
ou pregueados
4. Parafuso do micrtomo solto
3. Fragmentao dos cortes ou
rasgados
1. Incluso imperfeita
2. Parafina quente demais durante
a infiltrao ou incluso
4. Arranhaduras nos cortes ou

cortes divididos em segmentos
5. Os cortes que se aderem no

bloco ao subir o brao do
micrtomo
6. Espessura desigual no mesmo

corte, lembrando veneziana
7. Enrolamento dos cortes
8. Fragmentao do tecido
durante a microtomia ou
separao do tecido do bloco
de parafina
9. Cortes aparecem
alternadamente finos e grossos
1. Parafina suja (no filtrada

durante a incluso)
2. Sujeira no molde de incluso
3. Sujeira no bloco ou na navalha
4. Dente na faca
1. ngulo da navalha grande
demais
2. Borda da faca suja
3. Faca sem fio
4. Borda do bloco suja de
parafina
1.Tecido duro demais
2. Parafuso solto
3. Bancada do micrtomo com
vibrao
4.Tecido queimado durante a
infiltrao ou incluso
1. Parafina muito dura
2. Navalha cega
3. ngulo incorreto da navalha
1. O lcool ou o clarificador no
foram completamente removidos
2. Parafina de infiltrao ou
incluso muito quente
3. Excessiva clarificao do tecido
4. A infiltrao foi insuficiente
1. Bloco grande demais
2. Parafusos soltos
3. ngulo da faca pequeno
demais
Uma causa frequente de acidente em laboratrios de histotcnica a falta
de ateno na manipulao de navalhas durante a confeco do corte. A
microtomia deve ser realizada em local calmo, onde o tcnico possa se
concentrar exclusivamente no seu trabalho. Muito cuidado ao descartar as
navalhas. Utilize sempre caixas de descarte especial para perfurocortantes.
Lembre-se de que os funcionrios do setor de limpeza podem se acidentar
com navalhas descartadas indevidamente.
6. Colorao dos tecidos
A utilizao de corantes fundamental para visualizar os tecidos ao

microscpio de luz. Aps a microtomia, as clulas e o material extracelular
so habitualmente transparentes e os corantes melhoram a visualizao das
estruturas teciduais.
Os corantes aplicados para corar tecidos que foram previamente fixados so chamados corantes no vitais, como a hematoxilina, eosina, fucsina,
entre outros.
Podemos tambm corar clulas em cultura ou clulas de organismos
ainda vivos; nesse caso, necessria a utilizao de corantes chamados vitais,
que no causam danos s clulas e tambm no interferem no metabolismo
celular. Dentre eles, temos: o azul de tripan, verde janus B, vermelho tripan,
azul de metileno, vermelho neutro, entre outros.
Para compreender os conceitos bsicos sobre coloraes, devemos conhecer algumas definies importantes.
O que so corantes?
Os corantes (Figura 24) so compostos orgnicos, aromticos e ionizveis,

fundamentalmente baseados na estrutura do benzeno. Contudo, esses corantes
so incolores e necessitam da adio de novos grupos qumicos sua estrutura

chamados cromforos (C=O cetona, C=N carboamnico, N=N
azoico, N=O nitroso, NO2 nitro e C=C etileno). Quanto
mais cromforos em um corante, mais intensa ser a sua cor.
A unio do cromforo aos compostos aromticos constitui os cromgenos,
compostos benznicos contendo grupamentos cromforos. Para que o corante
se ligue especificamente aos elementos tissulares, necessrio que um grupo
auxiliar do corante, denominado auxocromo, se ligue ao cromgeno. O
auxocromo determina o carter cido ou bsico do corante. As aminas bsicas
(-NH2) e os grupos hidroxila cidos (-OH) so exemplos de auxocromos.
Simplificando:
Corantes so compostos orgnicos aromticos formados pelo cromgeno
e auxocromo e coram seletivamente os componentes teciduais, como as clulas
e a matriz extracelular. De acordo com a carga inica, os corantes podem ser
cidos, bsicos ou neutros.
Corantes cidos: possuem auxocromo aninico (carga eltrica negativa
(-)), com afinidade por componentes bsicos do tecido (catinico (+)).

As estruturas coradas pelos corantes cidos so chamadas acidfilas,
como, por exemplo, o citoplasma e matriz extracelular. Um exemplo de
corante cido a eosina.
Corantes bsicos: possuem auxocromo catinico (+) com afinidade
por componentes cidos dos tecidos (aninico (-)). As estruturas coradas pelos corantes bsicos so chamadas basfilas, como o ncleo. A
hematoxilina um exemplo clssico de corante bsico.
Figura 24. Esquema da associao do corante com os tecidos.
Os corantes podem ser naturais ou sintticos (artificiais), sendo tambm

chamados corantes biolgicos, por revelar estruturas biolgicas dos tecidos.
Naturais: hematoxilina, ndigo, orcena, brasilina, entre outros.
Artificiais: so aqueles derivados do benzeno.
As coloraes podem ser classificadas segundo a ao do corante, o

tempo de colorao e a sua cromatizao.
Para compreender essa caracterizao, necessrio conhecer a definio
de dois termos da tcnica histolgica: o mordente e a diferenciao.
Mordente: um elemento, metal ou ons de metal, que se liga
covalentemente ao corante e facilita a ligao do corante ao tecido. O
mordente empregado para reforar a ao dos corantes e tornar as
coloraes mais seletivas, podendo ser usado antes, durante (adicionado soluo corante) ou aps a utilizao do corante.
Diferenciao: esse termo se refere remoo do excesso de corante

do tecido, descorando seletivamente determinada estrutura e melhorando a sua visualizao.
As coloraes podem ainda se caracterizar segundo a:
A. Ao
Diretas: quando o corante penetra no interior dos tecidos sem trata-
mento intermedirio com mordente.

Indiretas: quando necessrio um tratamento intermedirio com
uma soluo mordente para o corante se ligar ao tecido durante a

colorao.
B. Tempo
Progressiva: a colorao feita gradualmente sem a necessidade de se
proceder sua diferenciao, isto , que seja retirado o excesso do

corante.
Regressiva: hipercora-se o tecido e posteriormente remove-se seu
excesso pela diferenciao para melhor visualizao dos elementos

teciduais.
B. Cromatizao
Depende da quantidade de corantes utilizados durante a execuo de
uma determinada tcnica de colorao.
Monocrmica = 1 cor.
Bicrmica = 2 cores.
Tricrmica = 3 cores.
Policrmica = mais de 3 cores.
Aps os comentrios apresentados, deve-se ainda aprofundar alguns

conhecimentos sobre a colorao.
Aps a microtomia, o preparado histolgico est pronto para ser
corado. Deve-se, inicialmente, utilizar uma colorao que proporcione
uma viso geral de todo o tecido de modo a permitir a identificao dos
elementos teciduais, propiciando o diagnstico histolgico. A colorao
pela hematoxilina (H) e pela eosina (E) cumpre muito bem esse papel.
Nessa colorao, os ncleos so corados pela hematoxina, sendo evidenciados em roxo, enquanto o citoplasma e os espaos intercelulares so
corados pela eosina, sendo visualizados em rosa. Havendo a necessidade
de se identificar certos elementos teciduais especficos, empregam-se tcnicas histoqumicas especiais.
H diversos mtodos especiais de colorao que propiciam uma melhor
identificao de determinados componentes teciduais. Por exemplo, a colorao pelo mtodo tricomtico de Masson, que utiliza corantes especiais, permite evidenciar tecido muscular e fibras colgenas; a colorao pela resorcina
fucsina de Weigert demonstra fibras do sistema elstico; o azul de toluidina
em pH cido uma colorao especfica para mastcitos.
Outros mtodos utilizados para identificao de elementos teciduais
podem utilizar sais pesados a base de prata metlica e no corantes. Nessa
categoria podem-se citar o mtodo da reticulina de Gomori, que identifica
especificamente as fibras reticulares do tecido conjuntivo, sendo o mtodo de
Grocott especfico para fungos, e o mtodo de PAMS, especfico para
membrana basal.
Em determinadas coloraes histoqumicas, certas substncias, ao se combinarem com o tecido, formam uma nova substncia, e essa ligao pode ser
irreversvel. Essa a base da colorao com o azul da Prssia (ou Perls) e do
mtodo que utiliza o cido peridico associado ao reativo de Schiff (PAS).
Na colorao com o azul da Prssia, devido ao do cido clordrico, o ferro
conjugado s protenas ionizado e evidenciado aps reao com o ferrocianeto

de potssio. O resultado dessa reao produz um precipitado azul e insolvel
de ferrocianeto frrico.
Na reao do mtodo do PAS, o cido peridico oxida os grupos
hidroxila vicinal dos hidratos de carbono do glicognio, mucoprotenas e
glicoprotenas, os quais so convertidos a grupamentos aldedicos, de modo
que a cadeia polissacardica se transforma numa cadeia polialdedica. Os compostos aldedos se combinam com o reagente de Schiff, que incolor, e esse
complexo formado revela-se como um composto colorido.
As coloraes histolgicas de rotina e especiais, quando surgiram na
patologia clssica, constituram uma grande revoluo e avano na metodologia
de estudo da clula, fornecendo subsdios importantes para a anlise dos
tecidos, e representam o ponto de partida para o uso de tcnicas mais modernas incorporadas rotina de investigao.
A seguir, encontram-se algumas sugestes de tcnicas histoqumicas.
Para evidenciar
Clulas
Ncleo e citoplasma
HE, Feulgen, Papanicolau, Shorr,

Giemsa, azul de toluidina, metil
green-pironina
Melancitos
Fontana-Masson
Clulas do tecido nervoso
Violeta cresil, azul de toluidina,

Golgi (Prata)
Secrees celulares
PAS, PAS alcian blue pH 1,0

ou 2,5
Mastcitos e eosinfilos
AB-safranina, Geimsa, azul de

toluidina, sirius red em pH 10,2
Para evidenciar
Elementos da matriz extracelular
Glicoprotenas neutras
PAS
Proteoglicanos
PAS-alcian blue em pH 1,0 ou

pH2,5
Glicoprotenas no colagenosas
PAMS, reticulina
Elementos fibrosos base de

colgenos
Tricomtica de Masson, tricomtica

de Gomori, picrossirius red
Fibras do sistema elstico
Resorcina fucsina de Weirgert
Para evidenciar
Tecidos especficos
Tecido conjuntivo
Tricomtica de Masson, tricomtica

de Gomori, Goldner, picrossirius
red, reticulina de Gomori
Tecido linfoide e mieloide
Giemsa, reticulina de Gomori
Tecido adiposo
Sudan black
Tecido muscular
Coloraes tricromticas, azul de

toluidina
Tecido cartilagionoso
Coloraes tricromticas, PAS alcian blue em pH1,0 ou pH 2,5
Para evidenciar
Micro-organismos
Fungos de forma geral
Grocott e PAS
Treponema pallidun, Leptospira,

Helicobacter pylori
Warthin-Starry, Giemsa
Mycobacterium leprae
Mtodo de Fite, Wade, Kinyoun
Giardia lamblia,
Entamoebahistolytica,
Trichomonas vaginalis
Giemsa, HE, leishman, PAS,

hematoxilina frrica, Feulgen
Helmintos
HE
Incluses virais
HE
Criptococcus
Mucicarmin, PAS, prata

metenamina
Consideraes importantes
Geralmente as estruturas teciduais so visualizadas na mesma cor, ou

muito semelhante em tom ao do corante utilizado. Essa propriedade conhecida como ortocromasia. Porm, em alguns casos, certos elementos teciduais,
ao serem visualizados aps a sua interao com o corante, exibem uma cor
distinta do corante. Esse fenmeno designado metacromasia. Algumas tcnicas de colorao podem demonstrar a metacromasia, como a colorao pelo
azul de toluidina em condies especficas, que evidencia em magenta os
grnulos dos mastcitos e os proteoglicanos da matriz cartilaginosa.
Procedimentos gerais para coloraes
Antes de iniciar qualquer colorao, devemos nos lembrar de que, aps

a microtomia, os cortes dos tecidos esto impregnados pela parafina, que
precisa ser removida para que os corantes penetrem e se combinem com os
elementos teciduais.
O procedimento geral para qualquer colorao o seguinte:
Desparafinizao: visa retirada da parafina dos cortes aps a microtomia.
Esse procedimento realizado com o auxlio do xilol, a mesma substncia utilizada para a clarificao dos tecidos durante o processamento para
a confeco do bloco contendo o fragmento do material a ser analisado.
Hidratao: realizada por meio de sequncias alcolicas em concen-
traes decrescentes, ou seja, lcool 100%, 95%, 80%, 70%, at a

gua destilada. Cabe ressaltar que a maioria dos corantes se encontra
diluda em gua, devendo o ltimo banho ser com gua. Porm, quando se utiliza um corante alcolico, deve-se interromper a hidratao em
lcool 70%.
Colorao: a imerso propriamente dita dos cortes no corante,
favorecendo a combinao de suas estruturas com o corante para posterior visualizao em microscpio de luz.
Desidratao: retira a gua do tecido, pois os meios de selagem no
so miscveis em gua, e so necessrios para a confeco dos preparados histolgicos permanentes. Assim, utiliza-se com concentraes alcolicas crescentes: lcool 70%, 80%, 95% e 100%.
Clarificao: utiliza-se o xilol como lquido intermedirio entre o lcool
e o meio de selagem.
Selagem ou montagem da lmina propriamente dita: a etapa final da
preparao da lmina para anlise ao microscpio de luz. Essa etapa

consta em cobrir o tecido com uma lamnula de vidro, usando uma
substncia para fixar a lmina lamnula (selagem).
Protocolos de colorao para os tecidos
Colorao pela hematoxilina mayer e eosina-floxina
Solues:
A) Hematoxilina de Mayer (Mayer, 1903):
Hematoxilina.........................................................1 g
gua destilada..............................................1000 mL
Iodato de sdio................................................. 0,2 g
Almen de amnia ou potssio................................. 50 g
cido ctrico.........................................................1 g
Hidrato de cloral..................................................50 g
Dissolver a hematoxilina na gua destilada agitando (aquecer um pouco
at 60 C). Acrescentar o iodato de sdio e o almen. Agitar at dissolver
totalmente. Adicionar, ento, o cido ctrico e o hidrato de cloral. Deixar
agitando para que todos os componentes se dissolvam totalmente. A cor final
do corante vermelho-violeta. O corante estar pronto para o uso imediato e
poder ser usado por cerca seis meses (no mximo), sem que ocorra o amadurecimento exagerado.
Nota tcnica: existem vrios tipos distintos de solues para o preparo da
hematoxilina, como a de Mayer, Harris, Delafield e Erlich. Esses tipos de
solues variam de acordo com o tempo de colorao, aplicao e composio qumica do corante. A hematoxilina de Harris muito utilizada nos laboratrios de anatomia patolgica por produzir bons resultados com um tempo
curto de colorao. A hematoxilina de Mayer apresenta bons resultados,
porm com um tempo maior de colorao. As hematoxilinas de Erlich e
Delafield so empregadas em tecidos sseos que sofrero a ao por

descalcificadores contendo cidos fortes. A seguir, sero descritos os mtodos
de colorao pela hematoxilina e eosina, utilizando a hematoxilina de Mayer e
a de Harris.
B) Eosina-floxina:
1- Soluo estoque de eosina 1% em gua destilada.
2- Soluo estoque de floxina 1% em gua destilada.
3- Soluo de uso de eosina-floxina:
Eosina 1% (soluo estoque 1)............................100 mL
Floxina 1% (soluo estoque 2).............................10 mL
lcool etlico 95%...........................................780 mL
cido actico glacial PA........................................ 4 mL
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar as lminas at a gua destilada.
2- Corar com a hematoxilina de Mayer durante 20 minutos 1.
3- Lavar em gua corrente durante 25 minutos.
4- Comear a desidratao com lcool 70% durante 1 minutos.
5- Corar pela eosina-floxina durante 2 minutos.
6- Lavar rapidamente em lcool 95%.
7- Desidratar em 3 banhos de lcool absoluto por 1 minuto cada.
8- Clarificar em 3 banhos de xilol e selar.
Resultados: ncleos em azul e citoplasma em vrias tonalidades de rosa.
Recomendamos fazer um teste prvio, pois, conforme o material, esse tempo poder ser reduzido e
ainda se obterem bons resultados.
1
Ateno, pois o xilol e o lcool so altamente inflamveis. Use luvas nitrlicas,
jaleco e mscara com filtro de proteo contra vapores orgnicos. Durante a
manipulao dos reagentes, evite contato com o lquido e o vapor de xilol.
Esse elemento txico para as vias areas e, quando inalado por tempo
prolongado, pode causar a morte. Em caso de incndio, extinguir com espuma, p qumico seco ou dixido de carbono. O vapor de xilol mais
pesado do que o ar, exigindo capela com exausto inferior.
Colorao pela hematoxilina de Harris e eosina-floxina
Solues:
A) cido-lcool a 1%:
cido clordrico (HCl)..........................................1 mL
Etanol a 70%...................................................99 mL
B) gua amoniacal:
Hidrxido de amnio (NHOH)..........................2 a 4 mL
gua destilada......................................800 a 1000 mL
C) Carbonato de ltio saturado:
Carbonato de ltio (LiCO)...................................1,54 g
gua destilada................................................100 mL
D) Eosina-floxina (ver o mtodo de hematoxilina de Mayer e esosinafloxina)
E) Hematoxilina de Harris (Harris, 1900):

Hematoxilina .....................................................5,0 g
Etanol a 100%..............................................50,0 mL
Almen de potssio ou de amnio...........................100 g
gua destilada..............................................1.000 mL
xido mercrio (p vermelho) (HgO)......................2,5 g
Dissolva o almen em gua destilada com o auxlio de uma placa aquecedora e um agitador magntico em um recipiente. Dissolva a hematoxilina no
lcool temperatura ambiente, em recipiente separado. Lentamente, misture as
duas solues aquecendo em placa aquecedora, at entrar em ebulio. Retire
da fonte de calor e, com cuidado, acrescente lentamente o xido mercrio,
que faz com que a soluo entre rapidamente em ebulio, podendo transbordar do recipiente. Retorne a soluo para a fonte de calor at que adquira a
cor prpura-escura. Esfrie, e a soluo estar pronta.
Para o uso:
Acrescente 20 mL de cido actico glacial para intensificar a colorao
dos ncleos.
Filtre sempre antes de cada uso.
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar os cortes at a gua destilada.
2- Corar com soluo recm-filtrada de hematoxilina de Harris
por 6 a 10 minutos2.
2
3- Lavar em gua de torneira por 5 minutos.

4- Diferenciar em lcool-cido, com 1 ou 2 mergulhos.
5- Lavar rapidamente em gua de torneira.
6- Colocar em soluo fraca de gua amoniacal ou de carbonato
de ltio saturada at que os cortes fiquem azul-brilhantes.
7- Lavar completamente em gua de torneira por 10 minutos.
8- Colocar em lcool etlico a 80% por 1 a 2 minutos.
9- Contracorar em soluo de eosina-floxina por 2 minutos3.
10- Desidratar a partir do lcool 95%.
11- Desidratar com 3 banhos de lcool absoluto.
12- Clarificar em 3 banhos de xilol e selar.
Resultados:
Ncleos..............................................................azul
Citoplasma...........................................rseo a vermelho
Demais estruturas tissulares.........................rseo a vermelho
Nota de biossegurana: O xido mercrio txico, venenoso e combustvel
(oxidante).
Mtodo de colorao pelo Giemsa de Lennert (Lennert, 1978)
Solues:
A) cido actico 0,5%.
B) lcool isoproplico.
3
C) lcool etlico 95%.

D) Xilol
E) Soluo de Giemsa:
Giemsa Merck em soluo estoque..........................20 mL
gua destilada..................................................80 mL
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar as lminas at a gua destilada.
2- Corar utilizando a soluo de uso de Giemsa por 1 hora.
3- Diferenciar em cido actico 0,5% - 3 mergulhos
4- Continuar a diferenciao em lcool etlico 95%, olhando
sempre ao microscpio (o tempo varia de acordo com o tipo e
espessura do tecido).
5- Desidratar em lcool isoproplico - 3 banhos, de 3 minutos
cada.
6- Clarificar em xilol e selar.
Nota: A soluo de Giemsa descora com o tempo; aconselha-se examin-la e
fotograf-la o mais rpido possvel.
Resultados:
Citoplasma..........................................................rosa
Ncleos.............................................................azul
Hemcias.......................................................vermelho
Grnulos de mastcitos.......................................prpura
Bctrias..............................................................azul
Parasitas da malria..................................................azul
Mtodo do cido peridico + reativo de Schiff (PAS)
(McManus, 1946)
Solues:
A) cido Peridico 0,5%.
B) Reagente de Schiff:
Fucsina bsica........................................................1 g
Metabissulfito de sdio ou bissulfito de sdio..................2 g
gua destilada.................................................200 mL
cido clordrico 1 N..........................................20 mL
Procedimento:
1- Dissolver em 200 mL de gua destilada quente, 1 g de
fucsina bsica.
2- Deixar entrar em ebulio.
3- Esfriar at 50 C.
4- Adicionar 2 g de metabissulfito ou dissulfito ou bissulfito de
sdio anidro.
5- Filtrar.
6- Colocar uma pitada de metabissulfito de sdio anidro e em
seguida adicionar 20 mL de cido clordrico 1 N.
7- Agitar, esfriar e guardar na geladeira em frasco mbar ou
envolvido em papel alumnio.
8- No dia seguinte, colocar uma pitada de carvo ativado e

filtrar. O filtrado deve ficar branco ou cor-de-palha; caso contrrio, deve-se colocar mais uma pitada de metabissulfito de sdio
anidro e filtrar novamente.
C) Soluo sulfurosa:
Soluo estoque:
Metabisssulfito de potssio ou bissulfito de potssio...10 g
gua destilada................................................200 mL
cido clordrico 1 N..........................................10 mL
Soluo de uso:
Soluo estoque..........................................................6 mL
gua destilada........................................................114 mL
Procedimento:
2- Colocar as lminas na soluo de cido peridico 1% por 15
minutos.
3- Lavar em gua destilada por 5 minutos.
4- Corar pelo Schiff (guardado na geladeira e no escuro 4), por
15 minutos temperatura ambiente.
5- Colocar em trs trocas de soluo sulfurosa de uso durante 5
minutos cada e desprezar aps o uso.
Envolver o vidro com papel alumnio.

7- Corar pela hematoxilina de Mayer durante 10 minutos.
9- Desidratar, clarificar e selar.
Resultados:
Membrana basal, mesngio, fibrina, muco, amiloide, coloide, de colorao rsea a vermelho prpura.
Mtodo de Gomori para fibras reticulares (Gomori, 1937)
Solues:
A) Soluo de permanganato de potssio 1%.
B) Soluo de cido oxlico 3%.
C) Soluo de almen de ferro 2%.
D) Soluo de nitrato de prata amoniacal de uso:
Nitrato de prata 10% (aquoso).............................20 mL
Hidrxido de potssio 10% (aquoso)........................5 mL
Hidrxido de amnia 28% (aquoso): adicionar aos poucos,
gotejando at que o precipitado marrom desaparea, sempre agitando.
A soluo se tornar transparente. Acrescentar ento 3 gotas de nitrato
de prata 10%, agitando. Acrescentar gua destilada na proporo de 1:1.
Acrescentar finalmente 25 mL de gua.
E) Formaldedo 10%: (1 parte de formaldedo comercial + 3 partes

de gua destilada)
F) Cloreto de ouro 1%.
G) Tiossulfato de sdio 5%.
Observao: Os cortes devem ser aderidos em lminas quimicamente limpas e
desengorduradas, com uma fina camada de albumina de Mayer.
Procedimento:
2- Mergulhar em soluo de permanganato de potssio 1% por
1 minuto.
4- Descorar pelo cido oxlico 3% por 3 minutos.
5- Lavar em gua corrente por 3 minutos.
6- Colocar as lminas no almen de ferro 2% ou sulfato de ferro
e alumnio por 1 minuto.
8- Soluo de nitrato de prata amoniacal (soluo de uso) por 1
minuto.
10- Formaldedo 10% por 3 minutos.
11- gua corrente por 5 minutos.
12- Soluo de cloreto de ouro 1% por 10 minutos.

14- Tiossulfato de sdio 5% por 1 minuto.
Resultado:
Fibras reticulares ...........................negro.
Mtodo de colorao tricromtica de Masson (Masson, 1929)
Solues:
A) Soluo aquosa, saturada, de cido pcrico:
cido pcrico.....................................................1,2 g
gua destilada.................................................100 mL
B) Soluo fixadora de Bouin:
Soluo aquosa, saturada, de cido pcrico ...750 mL
Formalina (37-40%)..........................................250 mL
cido actico, glacial...........................................50 mL
C) Soluo de uso de hematoxilina frrica de Weigert:
Misturar, em partes iguais, as solues estoques A e B (100 mL da
soluo A + 100 mL da soluo B).
Soluo estoque 1:
Hematoxilina, cristais................................................1 g
Etanol, 95%..................................................100 mL
Soluo estoque 2:
Cloreto frrico (FeCl ), 29%..................................4 mL
gua destilada..................................................95 mL
cido clordrico concentrado (HCl)............................1 mL
D) Soluo de fucsina cida - Biebrich Scarlet:
Biebrich Scarlet (C.I. 26905), soluo aquosa a 1%....90 mL
Fucsina cida (C.I. 42685), soluo aquosa a 1%.......10 mL
cido actico glacial.............................................1 mL
E) Soluo de cido fosfotngstico - fosfomolbdico:
cido fosfotngstico................................................5 g
cido fosfomolbdico..............................................5 g
gua destilada..................................................200 mL
F) Soluo de azul de anilina:
Azul de anilina....................................................2,5 g
cido actico glacial..............................................2 mL
gua destilada.................................................100 mL
G) Soluo de cido actico glacial a 1%:
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar at a gua destilada.
2- Colocar no lquido de Bouin por 1 hora a 56 oC ou
temperatura ambiente, por uma noite, se os cortes foram fixados

em formalina. Essa etapa no necessria se a fixao for feita no
lquido de Bouin.
3- Deixar esfriar por 10 minutos.
4- Lavar em gua corrente at que os cortes fiquem claros. Em
seguida, enxaguar em gua destilada.
5- Corar na soluo de hematoxilina frrica de Weigert por 10
minutos.
6- Lavar em gua corrente por 10 minutos. Aps, enxaguar em
gua destilada.
7- Corar em soluo aquosa de Biebrich Scarlet a 1% por 5
minutos.
8- Enxaguar em gua destilada.
9- Colocar na soluo de cido fosfotngstico-fosfomolbdico
por 10 a 30 minutos.
10- Corrar em soluo de azul de anilina por 15 a 30 minutos.
12- Diferenciar na soluo aquosa de cido actico a 1%, por 3
a 5 minutos.
13- Desidratar a partir do etanol a 95%, clarificar com xilol e selar.
Resultados:
Ncleos............................................................preto
Msculo, citoplasma, queratina..............................vermelho
Colgeno.............................................................azul
Mtodo de Weigert (Weigert, 1898)
Solues:
A) Resorcina fucsina de Weigert:
Fucsina bsica........................................................2 g
Resorcina.............................................................4 g
gua destilada................................................200 mL
Cloreto frrico 30 %.........................................25 mL
Dissolver 2 g de Fucsina bsica e 4 g de Resorcina em 200 mL de gua
destilada em ebulio. Adicionar 25 mL de cloreto frrico a 30%, deixando
ferver por mais 5 minutos. Filtrar e desprezar o filtrado. O precipitado que
ficou no papel de filtro deve ser dissolvido em 200 mL de etanol 90%
aquecido. Aps esfriar, completar para 200 mL com etanol 90% e juntar
4 mL de cido clordrico concentrado. O corante deve ser guardado na
geladeira, pois o lcool pode evaporar com o calor.
B) Soluo de persulfato de potssio 10% ou monopersulfato de
potssio 10% ou oxona 10%
C) Soluo de Van Gieson:
Fucsina cida, soluo aquosa a 1%...........................5 mL
cido pcrico, soluo saturada aquosa
(21 g para 1 L de gua) ..................................100 mL
cido clordrico concentrado................................0,25 mL
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar os cortes at o lcool 70%.
2- Oxidar pela oxona 10% (desprezar aps o uso).
3- Corar pela resorcina-fucsina durante 1 hora.
4- Passar por 3 banhos de lcool 95% (em borris), para retirar
o excesso de corante por alguns segundos em cada banho.
5- Lavar em gua destilada.
6- Contracorar ou no com a soluo de Van Gieson
7- Desidratar rapidamente em 3 banhos de lcool absoluto (em
borris).
8- Clarificar em 3 banhos de 3 minutos de xilol.
Resultados:
Fibras elsticas ......................................... marrom-avermelhado.
Mtodo da prata metenamina de Grocott (Grocott, 1955)
Solues:
A) Soluo de cido crmico (trixido de cromo) a 4%.
B) Soluo de nitrato de prata a 5%.
C) Soluo de metenamina (hexametilenotetramina) a 3%.
D) Soluo de brax a 5%.
E) Soluo estoque de nitrato de prata-metenamina:

Soluo de nitrato de prata a 5%.............................5 mL
Soluo de metenamina a 3%..............................100 mL
F) Soluo de trabalho de nitrato de prata-metenamina:
Soluo estoque de nitrato de prata-metenamina...........25 mL
gua destilada..................................................25 mL
Soluo de brax a 5%.........................................2 mL
Prepare no momento de usar. No use se ficar turva.
G) Soluo de bissulfito de sdio ou metabissulfito de sdio a 1%:
Prepare no momento de usar.
H) Soluo de cloreto de ouro a 0,1%.
I) Soluo de tiossulfato de sdio (hipossulfato de sdio) a 5%.
J) Soluo estoque de light green a 0,2%:
Light green SF yellow.......................0,2 g

gua destilada.................................................100 mL
Aps misturar, acrescente 0,2 mL cido actico glacial.
K) Soluo de uso de light green:
Soluo estoque de light green ...............................10 mL
gua destilada...................................................50 mL
Procedimento:
2- Oxidar pela soluo de trixido de cromo a 4%, preparada
no momento de usar, e deixar por 1 hora.
3- Lavar em gua de torneira por poucos segundos.
4- Colocar na soluo de bissulfito de sdio a 1% por 1 minuto.
5- Lavar em gua corrente por 5 a 10 minutos.
6- Enxaguar em gua destilada; 3 trocas.
7- Colocar os preparados na soluo de trabalho de nitrato de
prata-metenamina, preparada no momento de usar, e deixar na
estufa a 58C - 60C, por 50 a 60 minutos.
8- Enxaguar em gua destilada vrias vezes.
9- Colocar na soluo de cloreto de ouro a 0,1% e deixar por
2 a 5 minutos.
11- Colocar na soluo de tiossulfato de sdio a 5%, e deixar
por 2 a 5 minutos.
12- Lavar em gua de torneira.
13- Contracorar na soluo de trabalho de light green por 30
a 45 segundos (esse tempo pode variar).
Resultados:
Fungos ............................nitidamente delineados em preto
Mucina.....................................................cinza-escuro
Parte interna de miclios e hifas.....................rosa-acinzentado
Fundo..............................................................verde
Mtodo de Warthin-Starry (Kerr, 1938)
Solues:
A) cido ctrico 1%.
B) Soluo de gua acidulada:
gua tridestilada deionizada...............................1000 mL
Acrescentar a soluo de cido ctrico a 1%, o suficiente para
alcanar o pH 4,0.
C) Soluo impregnante de nitrato de prata a 1%:
Nitrato de prata.....................................................1 g
gua acidulada................................................100 mL
D) Soluo de nitrato de prata 2% para revelao:
Nitrato de prata.....................................................2 g
gua acidulada................................................100 mL
E) Soluo de hidroquinona a 0,15%:
Hidroquinona cristalina qualidade fotogrfica...............0,15 g
gua acidulada...............................................100 mL
F) Soluo de gelatina a 5%:
Gelatina pura......................................................10 g
gua acidulada................................................200 mL
Conservar as solues de nitrato de prata 2%, gelatina 5% e

hidroquinona 0,15% em frascos de Erlenmayer de 50 mL, em banho-maria
54 C, at preparar a soluo G:
G) Soluo reveladora:
Nitrato de prata 2%..........................................1,5 mL
Gelatina 5%..................................................3,75 mL
Hidroquinona 0,15%........................................2,0 mL
Misturar num pequeno bquer os ingredientes acima na ordem descrita,
assegurando-se que a mistura do nitrato de prata e gelatina esteja totalmente
completa. Aps isso, adicionar a hidroquinona. Preparar a soluo somente
na hora de usar.
Procedimento:
2- Impregnar pela soluo de nitrato de prata a 1%, por 30
minutos em banho-maria pr-aquecido 43 oC.
3- Preparar a soluo reveladora. Usar a soluo imediatamente
aps colocar a hidroquinona.
4- Recobrir os cortes com a soluo reveladora, preparada no
momento do uso. Os cortes tornam-se marrons-claros ou amarelos. Controlar ao microscpio. As espiroquetas aparecem em
negro com fundo amarelo ou marrom-claro.
5- Lavar rapidamente em gua morna comum (56oC).
6- Mergulhar em gua destilada.
7- Desidratar a partir do lcool 95%, clarificar e selar.
Resultados:
Espiroquetas, corpos de Donovani...negro
Colorao de fundo....................de amarelo a marrom-claro
Referncias:
C. H. Bridges e L. G. Luna estudaram vrias modificaes da
tcnica, que se encontra publicada em Lab. Invest.,1957.
Sirius red em pH 10,2 (Bogomoletz,1980; Luque,1989)
Soluo:
A) Soluo de sirius red em pH 10,2:
Sirius red ou direct red 80......................................0,5g

gua destilada..................................................45 mL
lcool absoluto.................................................50 mL
Adicionar NaOH 0,1N, at atingir o pH 10,2.
Deixar repousar por 2 horas.
Gotejar lentamente o cloreto de sdio 20% em baixo de luz
forte at aparecer o precipitado.

Deixar repousar durante a noite sob luz forte e filtrar na manh
seguinte.
Esta soluo dura um ms temperatura ambiente; mas pode durar mais,
caso fique na geladeira. Aps um ms, aumentar o tempo de colorao.
Procedimento:
2- Corar por 5 minutos pela hematoxilina de Mayer.
5- Passar pelo lcool 70% por 3 minutos.
6- Corar pela soluo de sirius red pH 10,2 por 1 hora ou mais.
Resultados:
Grnulos do eosinfilos......................................vermelho
Ncleos..............................................................azul
Mtodo de Fite (Fite, 1947)
Solues:
A) Vaselina terebentina:
Terebentina......................................................70 mL
Vaselina...........................................................30 mL
ou Soluo de leo de Anilina - Xilol:
leo de anilina..................................................30 mL
Xilol..............................................................70 mL
B) Soluo de carbol-fucsina de Ziehl-Neelsen:

Fenol, cristais fundidos........................................2,5 mL
Etanol absoluto...................................................5 mL
Fucsina bsica.....................................................0,5 g
gua destilada..................................................50 mL
Primeiro, deve-se dissolver a fucsina bsica no etanol, juntar o fenol e,
por ltimo, adicionar a gua destilada. Esta soluo deve ser filtrada.
C) Soluo de lcool-cido a 1%:
cido clordrico..................................................1 mL
lcool etlico (etanol) a 70%................................99 mL
D) Soluo estoque de azul de metileno:
Azul de metileno.................................................1,4 g
Etanol a 95%.................................................100 mL
E) Soluo de trabalho de azul de metileno:
Soluo estoque de azul de metileno........................10 mL
gua destilada...................................................90 mL
cido actico glacial............................................0,5 mL
Procedimento:
1- Desparafinizar as lminas em 2 trocas, de 10 minutos cada,
em soluo de vaselina terebentina ou leo de anilina xilol em
estufa 60oC. Lembrar-se de que essas solues devem estar a
60oC antes de imergir as lminas.
2- Deixar os cortes secarem ao ar por 15 minutos. O filme de

leo remanescente prevenir a retrao e os danos aos cortes.
3- Corar na soluo filtrada de carbol-fucsina de Ziehl-Neelsen
por 30 minutos.
4- Lavar em gua de torneira por 10 minutos.
5- Diferenciar os cortes na soluo de lcool-cido a 1% at que
fiquem rosa-plidos.
7- Contracorar com a soluo de trabalho de azul de metileno
por 30 segundos a 1 minuto.
8- Enxaguar, em gua de torneira, o excesso de soluo de
trabalho de azul de metileno.
9- Desidratar os cortes rapidamente, em 2 trocas cada, em etanol
a 95% e etanol absoluto.
10- Clarificar em xilol; 2 trocas de 2 minutos cada.
11- Selar.
Resultados:
Bacilos da lepra e outros cido resistentes...............vermelho.
Fundo....................................................... azul-plido.
Mtodo do mucicarmim (Southgate, 1927)
Solues:
A) Soluo estoque mucicarmim de Southgate:
Carmim...............................................................1 g
Hidrxido de alumnio.............................................1 g
Etanol a 50%........................................................100 mL
Cloreto de alumnio, anidro..............................................5 g
Faa essa soluo em banho-maria. Quando frio, filtre.
B) Soluo de trabalho de mucicarmim de Southgate:
Soluo-estoque de mucicarmim de Southgate...............10 mL
gua destilada..................................................90 mL
C) Soluo de trabalho de hematoxilina frrica de Weigert:
Partes iguais das solues estoque A e B (100 mL de A + 100 mL
de B). Ver o mtodo de colorao pela tricromtica de Masson.
D) Soluo de amarelo metanil a 0,25%:
Amarelo metanil.......................................................0,25 g
gua destilada........................................................100 mL
cido actico glacial................................................0,25 mL
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar at a gua destilada.
2- Deixar na soluo de trabalho de hematoxilina frrica de Weigert
por 7 minutos.
3- Lavar em gua corrente de torneira por 10 minutos.
4- Corar na soluo de trabalho de mucicarmim de Southgate por
30 minutos e descart-la aps o uso.
5- Enxaguar rapidamente em gua destilada.
6- Contracorar na soluo de amarelo metanil por 1 minuto.

7- Desidratar a partir do etanol 95%.
8- Clarificar e selar.
Resultados:
Mucina......................................................rosa-escuro
Cpsula de Cryptoccocus sp............................ rosa-escuro
Ncleos............................................................preto
Fundo............................................................amarelo
Mtodo de Feulgen para DNA (Feulgen e Rossenbeck, 1924)
Solues:
A) cido clordrico 1N:
cido clordrico................................................8,3 mL
gua destilada...............................................91,7 mL
B) Metabissulfito de sdio 0,5%.
C) Reagente leuco fucsina de Schiff (ver mtodo do cido peridico +
reativo de Schiff (PAS)).
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar dos cortes at a gua destilada.
2- Lavar os cortes em cido clordrico 1N em temperatura
ambiente.
3- Transferir para o cido clordrico 1N pr-aquecido, a 60oC

para hidrolisar os cortes.
O tempo de hidrlise depende do fixador utilizado:
Formaldedo = de 8 a 12 minutos.
Bouin = de 5 a 8 minutos.
Helly = em torno de 5 minutos.
4- Transferir para a soluo o reagente leuco fucsina de Schiff

durante 45 minutos.
5- Lavar em 3 banhos de metabissulfito de sdio 0,5%, de 2
minutos.
6- opcional contracorar com light green 1% durante 1 minuto.
7- Desidratar, clarear e montar.
Resultados:
DNA.................................................. vermelho-prpura
Citoplasma.........................................................verde
Mtodo de Colorao pelo alcian blue em pH 2,5
(Lev. e Spicer, 1964).

Solues:
A) Soluo de cido actico glacial a 3%.
B) Soluo de alcian blue:
alcian blue, 8GX.................1 g

Soluo de cido actico a 3%............................100 mL
C) Soluo de nuclear fast red (kernechtrot):
Nuclear fast red (kernechtrot) ................0,1 g

Soluo de sulfato de alumnio a 5% .....................100 mL
Aquea a soluo lentamente, at ferver. Esfriar e filtrar. Acrescente
timol para preservar.
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar at gua destilada.
2- Colocar em soluo de cido actico glacial a 3% e deixar
por 3 minutos.
3- Corar na soluo de alcian blue por 30 minutos.
6- Contracorar com a soluo de nuclear fast red filtrada por 5
minutos.
7- Lavar em gua corrente por 1 minuto.
Resultados:
Mucossubstncias cidas sulfatadas e carboxiladas......... azul escuro
Ncleos................................................vermelho a rosa
Citoplasma...................................................rosa-plido
Mtodo de colorao pelo alcian blue, pH 1,0
(Lev e Spicer, 1964)

Solues:
A) Soluo de cido clordrico 1N:
cido clordrico..............................................83,5 mL
gua destilada..............................................916,5 mL
B) Soluo de cido clordrico 0,1 N:
Soluo de cido clordrico 1N..............................10 mL
gua destilada..................................................90 mL
C) Soluo de alcian blue:
Alcian blue, 8GX...................1 g

Soluo de cido clordrico 0,1 N........................100 mL
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar as lminas at gua destilada.
2- Colocar na soluo cido clordrico 0,1N e deixar por 3 minutos.
3- Corar pela soluo de alcian blue por 30 minutos.
4- Retirar o excesso de corante com papel de filtro. No enxaguar em gua.
Resultados:
Mucossubstncias sulfatadas .....................................azul-escuro
Ao manipular vrios produtos qumicos para os mtodos de colorao, use
mscara com filtro prprio para vapores orgnicos, em local arejado e com
exausto. O preparo dessas solues deve ser feito em capela de exausto,
evitando sempre o contato com a pele ou a vias respiratrias. Observe a
ficha de segurana de cada produto qumico utilizado para os mtodos de
colorao, muitos so danosos sade se inalados, engolidos, ou se entrarem em contato com a pele. Nunca descarte as solues corantes ou
qualquer soluo preparada para o desenvolvimento das coloraes em
esgoto sanitrio convencional, procure saber a poltica de descarte de
produtos txicos de sua instituio.
7. Tcnicas imuno-histoqumicas
Os corantes auxiliam o estudo histolgico das caractersticas qumicas

teciduais e, no caso de algumas coloraes especiais, destacam regies especficas do tecido ou at mesmo classes de protenas. Contudo, para se identificar alguns elementos teciduais, em situaes normais ou patolgicas, preciso
reconhecer certas protenas especficas, o que no possvel por meio das
tcnicas histoqumicas. Para tal, recomenda-se a utilizao de mtodos imunohistoqumicos, que, como o prprio nome sugere, renem conhecimentos
prprios da imunologia, histologia e qumica.
A imuno-histoqumica se baseia na capacidade de certas substncias com
afinidade especfica para determinados elementos, isto , anticorpos. Os
anticorpos, ao reconhecerem especificamente uma protena-alvo, possibilitam a
identificao molecular de elementos teciduais com observao nos diferentes
tipos de microscpio.
A imuno-histoqumica tem diversas aplicaes como mtodo de auxlio
ao diagnstico de doenas inflamatrias, infecciosas e neoplasias, alm de ser
utilizada para determinar fatores preditivos e prognsticos no cncer.
O que so anticorpos?
Os anticorpos (Ac) ou imunoglobulinas (Ig) so um grupo especial de

glicoprotenas produzidas naturalmente por clulas do sistema imunolgico de
diversas espcies animais e so classificados em cinco isotipos (tipos de
imunoglobulinas): IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.
O antgeno uma substncia que, em condies apropriadas, capaz
de estimular a produo de um determinado anticorpo. Quando um antgeno
originrio, por exemplo, de bactrias, fungos, vacinas, penetra no organismo,
ele reconhecido como elemento estranho, desencadeando uma srie de
eventos, como a produo de anticorpos que reconhecero especificamente
esse antgeno.
O reconhecimento do antgeno pelo anticorpo ocorre de duas formas:
qumica, pela afinidade entre essas molculas; e estrutural, pois os anticorpos
possuem uma estrutura tridimensional que se adapta perfeitamente estrutura
do antgeno, realizando uma ligao designada chave-fechadura.
Ao se introduzir um antgeno especfico em um animal, este reagir contra
esse antgeno e, aps um determinado tempo, ser possvel isolar anticorpos que
reconheam o antgeno do soro desse animal. Os anticorpos so utilizados para
determinar a presena desse antgeno em um tecido de outro animal. Atualmente, os anticorpos comercializados por grandes empresas so obtidos a partir de
diferentes animais, como, por exemplo: camundongo, rato, coelho, macaco,
porco, dentre outros, utilizando metodologias avanadas.
Aplicabilidade do uso de anticorpos
Os anticorpos podem ser utilizados em clulas em cultura, ou em cortes

histolgicos de tecidos processados segundo a tcnica de incluso em parafina,
em cortes obtidos pelo mtodo de congelao ou ainda includo em resina.
importante notar que, independentemente do mtodo de processamento

histolgico, deve-se ter o cuidado de preservar o antgeno no tecido, evitando
modificaes na sua conformao tridimensional ou na composio qumica.
A preservao adequada dos antgenos depende de uma boa fixao
e de um bom processamento. O fixador utilizado em imuno-histoqumica
deve ser capaz de preservar tanto a morfologia tecidual quanto o antgeno,
alm de impedir sua extrao e deslocamento durante o processamento do
material. No existe o fixador ideal; porm, deve-se conhecer o mecanismo
de ao tecidual de cada soluo fixadora para escolher o mtodo de fixao
mais adequado.
O formol, assim como os demais fixadores aldedicos, ao estabelecer
ligaes cruzadas com as protenas teciduais, torna as protenas insolveis na
forma de um gel. Essas ligaes formam uma malha que pode impedir a ligao
do anticorpo ao antgeno tecidual, alm de mudar a configurao tridimensional
dos antgenos. Quanto maior o tempo de fixao, isto , o tempo em que um
determinado tecido submetido ao fixador, mais pontes sero formadas. Por
essa razo, importante controlar o tempo de fixao necessrio para preservar
as estruturas teciduais.
Para haver reao entre o antgeno e o anticorpo em materiais fixados
por aldedos, necessrio desmascarar os antgenos, desfazendo as pontes
intermoleculares formadas durante a fixao. Com esse objetivo, utiliza-se um
procedimento denominado recuperao antignica. Existem diversos mecanismos para se recuperar os antgenos em um tecido. A escolha do mtodo ideal
depende do tipo de tecido a ser analisado e da prtica do laboratrio.
Os principais mtodos de recuperao antignica so:
Mtodo enzimtico, empregando-se enzimas como a tripsina ou pepsina.
Mtodo fsico-qumico por aquecimento, utilizando-se panela de pres-
so, panela a vapor, banho-maria e micro-ondas, devendo o material

ser imerso em uma soluo de tampo citrato ou tris-EDTA.
Mtodo fsico-qumico por sonicao5, isto , realiza-se a sonicao
em tampo citrato ou tampo tris-EDTA.

A reao imuno-histoqumica deve ocorrer em temperatura e pH controlados. Por essa razo, as lminas devem ser mantidas em estufa ou geladeira
durante o procedimento e os cortes cobertos por uma soluo tamponada.
Temperaturas elevadas aceleram a reao entre antgeno e anticorpo, embora
diminuam a especificidade do anticorpo ao antgeno. Temperaturas mais baixas
diminuem a velocidade da reao, aumentando tal especificidade.
Geralmente, na rotina laboratorial, utilizam-se estufas reguladas a 37C
em um tempo de reao de 1 hora, ou geladeira a 4C em um tempo de
reao de um dia para o outro (over night).
A reao imuno-histoqumica tambm pode variar dependendo do pH
do meio em que a reao ocorre. Assim, utiliza-se uma soluo de tampo
fosfato (PBS) ou tampo tris (TBS) em pH 7,0 para recobrir os cortes
durante as lavagens ou para diluir as demais solues.
Tampo fosfato (PBS) pH 7,2 0,1M:
Fosfato de sdio, dibsico (Na2HPO4), anidro..................1,48 g
Fosfato de sdio, monobsico (NaH2PO4), anidro..............0,43 g
Cloreto de sdio (NaCl)..............................................7,2 g
gua destilada......................................................1000 mL
Sonicao o procedimento que utiliza a energia das ondas sonoras, mais comumente o ultrassom,
aplicado sobre determinados sistemas qumicos.
Outro fator que influencia a reao a concentrao do anticorpo.

Os anticorpos devem estar diludos em uma concentrao que permita o
reconhecimento do antgeno pelo seu respectivo anticorpo, sem haver
perda de sua especificidade. Para se encontrar a diluio ideal de cada
anticorpo, deve-se proceder a um teste utilizando-se um controle positivo,
isto , um material que se tenha conhecimento prvio da sua positividade
ao anticorpo que se deseja testar. Assim, usam-se diversas diluies at se
encontrar a diluio onde a marcao seja bem evidente e no haja reao
inespecfica de modo a mascarar a reao.
Para visualizar a reao, os anticorpos devem estar marcados com alguma
substncia capaz de exibir cor. Em geral, utiliza-se um anticorpo associado a
enzimas que, em etapa posterior, reagiro com substncias cromgenas, ou
anticorpos diretamente associados a fluorforos, radioistopos ou ouro coloidal.
A tcnica enzimtica mais usual na rotina laboratorial utiliza vrias
substncias. Inicialmente, empregam-se anticorpos associados a uma vitamina chamada biotina (anticorpo biotinilado). Esse anticorpo reage com a
estreptavidina, uma protena que possui quatro stios de ligao. A
estreptavidina que se encontra complexada a trs molculas de biotina
ligadas enzima peroxidase reconhecer, atravs de um stio vazio, a biotina
presente no anticorpo secundrio. A peroxidase reage com o perxido de
hidrognio na presena de 3,3-diaminobenzidina (DAB), que funciona
como um doador de eltrons para a reao. O DAB reduzido se precipita
no local da reao, sendo o produto dessa reao visualizado como um
precipitado castanho (Figuras 25 e 26).
Figura 25. Repesentao da tcnica imuno-histoqumica indireta. O antgeno

presente no tecido reconhecido pelo anticorpo primrio. Um anticorpo
secundrio biotinilado se liga ao anticorpo primrio. A estreptavidina se ligar
por meio do seu stio livre biotina, que est associada a peroxidase. Uma
soluo contendo perxido de hidrognio reage com a peroxidase na presena
do DAB, formando um precipitado insolvel castanho no local da reao.
H2O2+DAB
H2O2+DAB
Figura 26. Tcnica imuno-histoqumica indireta utilizando o mtodo de

estreptavidina biotina-peroxidase revelada por DAB.(A) Marcao nuclear
identificando o receptor de progesterona. (B) Marcao citoplasmtica identificando a desmina.
Existem outros mtodos enzimticos, assim como outros cromgenos,

que so relatados em literatura mais especfica.
Pode-se tambm utilizar anticorpos associados a fluorforos. As primeiras tcnicas imuno-histoqumicas descritas utilizavam fluorforos associados a
anticorpos como marcadores, e so utilizadas at hoje. Diversas substncias so
utilizadas com este propsito, como FITC (isotiocianto de florescena), TRICT
(isotiocianato de tetrarodamina), Alexa 488, Cy5, dentre outras, mas necessitam de um microscpio de fluorescncia para visualizar a reao, o que torna
por vezes esta tcnica mais onerosa.
Normalmente, os anticorpos que fazem ligao com os antgenos teciduais
(anticorpos primrios) no esto associados a enzimas ou fluorforos. Dessa
forma, para visualiz-los, utilizam-se anticorpos secundrios complexados
peroxidase ou a fluorforos. Assim, denomina-se esse mtodo como mtodo
indireto. Contudo, h anticorpos primrios comerciais j associados com enzimas,
e, por essa razo, chama-se esse tipo de reao mtodo direto. A marcao
direta diminui o risco de reaes inespecficas pela diminuio de etapas, em
contraste com reaes indiretas, que amplificam o sinal facilitando a identificao dos antgenos.
Mesmo com o cuidado na escolha da concentrao adequada dos
anticorpos e na manuteno da temperatura e do pH, podem ocorrer reaes
inespecficas com componentes teciduais carregados eletricamente ou com receptores de imunoglobulinas teciduais. Podemos eliminar essa marcao
recobrindo esses stios inespecficos antes da reao com uma soluo contendo albumina e um soro.
Soluo de bloqueio de stios inespecficos :
PBS....................................................................200 mL
Leite em p desnatado....................................................5 g
Filtrar a soluo.
Soluo de uso:
Filtrado de leite 2,5%...............................................100 mL
Albumina bovina.........................................................2,0 g
Soro fetal bovino........................................................8 mL
Guardar soluo em geladeira.
Outro elemento capaz de causar reaes inespecficas a peroxidase
endgena tecidual. Esse problema s ocorre quando o mtodo escolhido o
enzimtico, pois o substrato cromgeno reagir tanto com a peroxidase ligada
ao anticorpo da reao quanto com a peroxidase tecidual. Nesse caso, devemos inibir a ao da enzima, utilizando uma soluo de perxido de hidrognio (H2O2) 3%.
Para garantir a sua qualidade, sempre importante incluir um controle
positivo e controle negativo da reao. O controle positivo obtido com um
material que sabidamente possui o antgeno analisado. Esse material permitir
confirmar, por sua marcao positiva, a qualidade da reao, caso as lminas
testadas forem negativas. O controle negativo feito omitindo-se o anticorpo
primrio nas lminas testadas, ou utilizando o mesmo isotipo do mesmo animal
no qual foi produzido o anticorpo primrio. Assim, com esses cuidados, o
resultado da reao permite garantir que as demais etapas da reao no esto
reconhecendo inespecificamente nenhum componente tecidual.
A seguir, segue uma sugesto de protocolo de reao indireta para
material includo em parafina. Nesse procedimento, utiliza-se a panela de
presso como equipamento para auxiliar na etapa de recuperao antignica e
um anticorpo secundrio biotinilado, isto , associado biotina.
Protocolo:
1- Aps confeccionar os cortes e aderi-los em lminas previamente tratadas com adesivo, deixar o corte aderir lmina por um
dia em estufa 37 oC.
2- Desparafinizar e hidratar as lminas, deixando-as por 5
minutos em cada banho nas respectivas solues (ver pretapa da colorao).
3- Colocar cerca de 2 litros de tampo citrato em pH 6,0 em
uma panela de presso. Deixar esquentar e, quando o tampo
estiver fervendo, colocar as lminas imersas no tampo e fechar a
panela. Quando a panela comear a apitar, deixar por mais 1
minuto e apagar o fogo. Aliviar a presso pela vlvula de segurana da panela e deixar a panela destampada para esfriar um pouco
a soluo (cerca de 10 minutos). Aps esse tempo, lavar os
cortes em gua corrente por mais 10 minutos.
4- Lavar as lminas por 10 minutos em PBS (tampo fosfato de
sdio 0,1M em pH 7,2) trocando o tampo por duas vezes.
5- Incubar com anticorpo primrio de um dia para o outro ( over
night) em geladeira a 4C. Cobrir os cortes delicadamente com
o anticorpo, mantendo as lminas em cmara mida.
6- Lavar as lminas em PBS em trs banhos consecutivos de 5
minutos.
7- Incubar as lminas por 20 minutos em uma soluo de perxido
de hidrognio 3% em PBS.
8- Lavar as lminas em PBS em trs banhos consecutivos de 5
minutos.
9- Incubar com anticorpo secundrio biotinilado por 1 hora em

estufa a 37C. Cobrir os cortes delicadamente com o anticorpo,
mantendo as lminas em cmara mida.
10- Lavar as lminas em PBS em 3 banhos consecutivos de 5
minutos.
11- Incubar com a estreptavidina-peroxidase por 30 minutos em
cmara mida, em temperatura ambiente.
12- Lavar as lminas em PBS em 3 banhos consecutivos de 5
minutos.
13- Incubar as lminas em uma soluo contendo 10mg de DAB
diludos em 10 mL de PBS e cerca de 150 mL de perxido de
hidrognio 3%. Controlar o tempo de reao ao microscpio,
observando o precipitado castanho se formar nos locais onde o
anticorpo reagiu. Essa reao pode durar em torno de 3 minutos.
14- Lavar as lminas em gua por 5 minutos.
15- Contracorar as lminas em hematoxilina diluda por 30 segundos.
16- Lavar as lminas em gua corrente por 5 minutos.
17- Desidratar, clarificar e montar.
Importante: nunca deixe secar os cortes durante a reao imuno-histoqumica!
Durante o procedimento, tomar os cuidados citados anteriormente para o
manuseio do xilol e do lcool. Manusear a panela de presso com cuidado
para evitar queimaduras ou exploses. Como o DAB um produto altamente txico e tem potencial carcinognico por exposio prolongada, evite
respirar o p seco e o contato com a pele ou mucosas e sempre utilize luvas
e jaleco durante a manipulao. Esse elemento tambm txico para o meio

ambiente, despreze a soluo de DAB num frasco plstico e adicione 10 mL
de hipoclorito de sdio para cada 100 mL dessa soluo. Procure saber a
poltica de descarte de substncias prejudiciais ao meio ambiente de
sua instituio.
8. Meios de selagem
Os meios de selagem, comumente chamados montagem, podem ser

permanentes ou provisrios. Os meios permanentes so meios resinosos e
hidrofbicos, sendo necessria a completa remoo da gua do interior dos
tecidos pela desidratao e pela clarificao com o diluente do meio de selagem. Os meios provisrios so meios hidroflicos e no necessitam da remoo
da gua dos tecidos, sendo os preparados descartados aps a observao ao
microscpio.
Meios de selagem hidrofbicos e permanentes
Esses meios podem ser sintticos, como o DPX e o Entelan, ou
naturais, como o blsamo do Canad ou a goma de Damar. Existem
vrios protocolos para diluio desses meios. Citaremos apenas o da
goma de Damar.
Goma de Damar.................................................200 g
Xilol.............................................................100 mL
Misturar, e esperar dissolver. Acrescentar mais goma ou xilol caso se
queira uma textura mais ou menos viscosa.
Meios de selagem hidroflicos ou provisrios
Esses meios so utilizados quando os corantes aplicados perdem a sua

capacidade tintorial, ou mesmo quando o contedo de determinadas estruturas
teciduais se altera quando os tecidos so submetidos a desidratao ou aos
meios de selagem que tem o xilol como diluente.
A seguir, citamos um dos meios de selagem hidroflicos mais utilizados,
a gelatina - glicerina, por ser de baixo custo e de fcil aplicao.
Gelatina............................................................10 g
gua destilada..................................................60 mL
Aquea at que a gelatina esteja dissolvida. Acrescente, depois, 70 mL
de glicerina.
9. Artefatos de tcnica
So alteraes das imagens de tecidos quando os preparados histolgicos

so observados ao microscpio. Isso pode ocorrer devido a manipulaes
fsicas ou qumicas durante as etapas da tcnica histolgica.
Os artefatos, por exemplo, podem ser ocasionados por:
dente na navalha de corte, causando fendas;
talco na luva utilizada pelo tcnico;
precipitado de corantes ou mesmo pigmentos que se depositaram
sobre o tecido;
retrao ou intumescimento tecidual provocado por algum componen-
te qumico do fixador;
autlise associada proliferao bacteriana devido demora em se
fixar o material;
fragmentao e/ou rachadura do tecido provocada por elevao da
temperatura da parafina durante o processamento.
dobras no tecido formadas durante a microtomia;

bolhas provocadas durante a selagem da lamnula sobre o preparado
histolgico.
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| 189
Captulo 4
Tcnicas citolgicas
Ester Maria Mota
A tcnica citolgica tambm faz parte da histotecnologia e possui grande importncia no diagnstico de algumas doenas que acometem os seres
humanos e os animais. Essa uma ferramenta fundamental no diagnstico de
tumores, funo hormonal e infeces parasitrias. O exame colpocitolgico,
conhecido como Papanicolaou, utilizado para detectar, nas mulheres, tumores de colo de tero. Seu idealizador, dr. George N. Papanicolaou, estabeleceu em 1942 os conceitos bsicos de interpretao citolgica e criou um
mtodo de colorao citolgica que utilizado, universalmente, at hoje.
A citopatologia analisa as clulas individualizadas, descamadas, expelidas
ou retiradas da superfcie de rgos de diferentes partes do organismo. Como
os materiais biolgicos apresentam diferentes caractersticas, devido s distintas
formas de organizao e composio, a coleta do material destinado anlise
citolgica constitui uma etapa fundamental nesse processo. H mtodos especficos para coleta de materiais distintos. Alm disso, nessa fase, so definidos
os tipos de procedimentos mais adequados anlise dos preparados citolgicos.
Algumas etapas da tcnica citolgica so semelhantes s da tcnica

histolgica, mas com peculiaridades prprias, podendo tambm haver considerveis interferncias na qualidade final do diagnstico, como coleta do material,
fixao, processamento, colorao e leitura das lminas citolgicas.
1. Coleta de material
A origem das amostras dos preparados histolgicos vem de fragmentos

de tecidos oriundos de necrpsias e bipsias. Nos preparados citolgicos,
essa origem um pouco mais diversificada, proveniente de lquidos orgnicos
(urina, lquor, lquido asctico, pericrdico, sinovial), punes aspirativas por
agulha fina (pulmo, mama, tireoide, linfonodos, dentre outros), secrees
(escarro, abscesso e fstula), lavados cavitrios (brnquicos e broncoalveolares,
vesiculares) e raspados (cervicovaginal, ocular).
Segundo suas caractersticas, as amostras so divididas em trs grupos, e
chegam ao laboratrio para anlise da seguinte forma:
Classificao da amostra
Mtodo de coleta
Origem da amostra
Disteno celular
(esfregao)
Raspagem
swab
(Figura 11)
Colpocitologia
Imprint
ou decalque
Olhos
Lavado brnquico
Leses cutneas
Bipsias
Peas cirrgicas
Puno aspirativa
Sangue
Lavado brnquico
Lquor espinhal
Tcnicas Citolgicas | 191
Amostras pastosas
Expectorao
Puno ou drenagem
Amostras lquidas
Escarro (Figura 6)
Abscessos
Massas necrticas
Espontnea ou por
cateter
Urina
Escovao
Lquido sinovial
Escovao ou lavado
Lquido peritoneal ou
asctico
Lquido pleural
Lquido peritoneal ou
asctico
Lquido pericrdico
Puno
Lavado brnquico
alveolar
Lavado vesical
Lquido estomacal
Lavado brnquico
Lquido sinovial
A natureza da amostra (lquida, pastosa ou slida) ir definir a forma de

coleta e preparo do material segundo as etapas da tcnica citolgica escolhida.
Distenso celular (esfregao),(Figuras 1, 3, 8, 9, 10 e 11): feita
ao se distender sobre uma lmina de vidro uma leve camada de fluidos corpreos
para o exame ao microscpio.
Lavado: o material colhido com o auxlio de um cateter de instilao
para lavagem, contendo soluo salina, de uma cavidade do organismo. Exemplos: lavado broncoalveolar (LBA), brnquico (LB), peritoneal, entre outros.
Geralmente os lavados se apresentam pouco celulares.
Escovados (Figuras 1, 2, 3 e 4): o material colhido por esfoliao da

superfcie de mucosas, utilizando-se uma escova. O material obtido pode ser
distendido sobre a superfcie de uma lmina de vidro, ou cortando-se a cabea
da escova e imergindo-a em soluo salina ou em lquido conservante apropriado, procedendo-se em seguida citologia de lquidos.
Impresses teciduais (imprint) (Figura 5): denomina-se impresses
teciduais o procedimento em que se coloca a rea lesionada do tecido em
contato com a superfcie de uma lmina de vidro lisa, de forma semelhante ao
procedimento para se obter impresso digital. As clulas superficiais da leso
passam para a superfcie da lmina de vidro e podem ser observadas ao microscpio. Esse procedimento tambm denominado citologia de decalque.
Figura 1. Coletores para citologia
esfoliativa.
Figura 2. Escovado cervicovaginal.
Figura 3. Disteno citolgica pela

esptula de Ayre.
Figura 4. Fixao de escovado

citolgico.
Figura 5. Impresso tecidual em

lminas (imprint).
Figura 6. Escarro espontneo ou

induzido para coleta de material.
2. Fixao das amostras
O principal objetivo da fixao preservar a morfologia celular e a

composio qumica das clulas aps a sua retirada do organismo.
Tipos de fixao
A. Fixao seca
Esse tipo de fixao utilizado quando se realiza a colorao de MayGrnwald-Giemsa, pois o metanol presente na soluo corante age como
fixador. o tipo de fixao utilizada para distenso de clulas sanguneas,
imprint de bao, gnglios linfticos, entre outros.
B. Fixao por revestimento
usada na obteno dos esfregaos citolgicos. Os fixadores so constitudos de polietilenoglicol (Carbowax) e lcool, comercialmente vendidos na
forma lquida ou em spray. As amostras so fixadas pelo gotejamento do
fixador ou pela pulverizao do aerossol das embalagens em spray (Figura 7),
sendo secas temperatura ambiente, pois o lcool fixa e evapora, enquanto o
polietilenoglicol forma uma pelcula que protege e preserva a amostra. Existem
vrios protocolos para este tipo de fixador; citaremos um dentre os vrios que
existem na literatura.
Carbowax em etanol 95%

Etanol 95%.............................................................95 mL
Polietilenoglicol 4000......................................................5g
Lembrar: antes de corar as amostras fixadas em Carbowax, banh-las em etanol
95% por 10 minutos para remover a pelcula de polietilenoglicol.
Figura 7. Fixao por revestimento.
C. Fixao por lquidos fixadores

O fixador citolgico universal o etanol 95%, um agente coagulante,
que penetra na clula desidratando-a e intensificando a diferenciao nuclear e
citoplasmtica aps a colorao.
Outros fixadores, como o Carnoy, metanol, lcool isoproplico 80%,
etanol 50%, lquido de Bouin, dentre outros, tambm podem ser utilizados
como fixadores celulares, variando a escolha e o tempo de fixao de acordo
com natureza da amostra.
3. P
rocessamento das amostras
Processamento
O acondicionamento do material essencial para evitar a perda de

contedo. A identificao da amostra e o preenchimento correto da ficha de
solicitao mdica (contendo o nome do paciente, idade, data da coleta,
natureza da amostra e sua localizao, tipo de exame requerido, dados clni-
cos, nome do mdico requisitante e telefone) so informaes relevantes para

evitar o extravio do material.
O processamento da amostra requer procedimentos especficos de
acordo com a natureza do material a ser analisado. Descreveremos aqui
alguns desses procedimentos.
A. Distenso celular (Figuras 1, 3, 8, 9, 10 e 11): geralmente, a
distenso chega ao laboratrio pronta, tendo sido manipulada pelo clnico ou
cirurgio e fixada em etanol 95%. Na maioria das vezes, quando a distenso
chega seca, o material destinado colorao pelo mtodo de May-GrnwaldGiemsa e, dependendo da amostra, pode-se ou no fixar pelo metanol durante
cinco minutos. Deve-se preparar esse tipo de amostra de modo a formar uma fina
camada de clulas, permitindo assim melhor diferenciao celular. Distenses
espessas produzem artefatos e hipercoram as clulas dificultando sua anlise.
Figura 8. Distenso celular.
Figura 9. Distenso aps bipsia por

agulha.
Figura 10. Formas de distenso celular. Figura 11. Distenso celular por swab.
Forma espiral
Forma ondulada
Forma em distenso
Forma de espalhamento
B. Amostras pastosas: devem ser analisadas antes de processadas para a

anlise. Coloca-se o material em uma placa de Petri com fundo escuro e
selecionam-se as regies mais densas, escuras e/ou sanguinolentas. Essas reas
so colocadas sobre lminas de vidro para distender, obtendo-se uma camada
de clulas (distenso celular) e fixando o material imediatamente em etanol
95% (Figura 8).
C. Amostras lquidas: so as amostras que possuem maior diversidade de procedimentos, dependendo do tipo de amostra. Citaremos aqui
os mais utilizados:
Lquidos, como urina, lavados, derrames de cavidades e lquido sinovial
podem ser pr-fixados em etanol 50%, ou enviados imediatamente ao laboratrio aps a coleta, podendo ser tambm conservados a 4C at o envio. O
uso de anticoagulantes deve ser avaliado de acordo com o tipo de material
coletado. As amostras lquidas subdividem-se em dois grupos:
Transudatos: so pouco celulares e de cor clara.
Exsudatos: so ricos celularmente, escuros, de natureza neoplsica ou
inflamatria.
Estas amostras podem ser processadas de acordo com sua riqueza celular, por
meio da centrifugao (Figura12) ou citocentrifugao (Figuras 13 e 14).
Centrifugao
preferida quando o material se apresenta hipercelular.
Procedimento:
1- Colocar o lquido em tubos Falcon com tampa.
2- Centrifugar a 1.500 rpm por 10 minutos.
3- Descartar o sobrenadante.
4- Aspirar o sedimento com pipeta Pasteur.
5- Colocar o sedimento em lminas limpas e desengorduradas
e proceder distenso celular.
6- Deixar secar ao ar e /ou fixar em lcool 95% imediatamente; a secagem ao ar necessria se o mtodo de colorao for
o May-Grnwald-Giemsa.
Observao: As amostras podero vir em tubos com anticoagulante ou no.
Figura 12. Procedimento para centrifugao
Citocentrifugao
Possibilita a anlise citolgica de lquidos com baixssima densidade celular (hipocelulares). Esse mtodo necessrio para concentrar as clulas em suspenso, que com a centrifugao se depositam diretamente sobre uma regio das lminas de vidro, perfazendo um dimetro de 5 mm, enquanto o meio de suspenso
absorvido por papel absorvente prprio.
Figura 13. Utenslios para citocentrifugao.
Vantagens:
Requer pouco volume (0,1 a 0,5 mL por lmina).
Alta confiabilidade do resultado: as clulas da amostra sero depositadas numa regio pequena da lmina medindo 5 mm de
dimetro.
Procedimento:
1- Pipetar 0,5 mL da amostra no citofunil, previamente
acoplado ao citoclipe, lmina e ao papel absorvente.

2- Centrifugar a 1.200 rpm por 10 minutos.
3- Retirar o conjunto e desacoplar a lmina.
4- Deixar secar ao ar e/ou fixar em lcool 95% imediatamen-
te. Se o mtodo de colorao for o May-Grnwald-Giemsa,

deixar secar ao ar.
Figura 14. Procedimento para citocentrifugao.
D. Bloco celular ou cell block (Figura 14)

um procedimento que rene as tcnicas citopatolgicas e
histopatolgicas e utilizado quando se deseja obter uma alta concentrao
celular, complementando o diagnstico, com a vantagem de aproveitar todo o
sedimento da amostra, alm de permitir a armazenagem desse sedimento para
futuras anlises, se necessrio. Essa tcnica empregada em citodiagnstico de
amostra lquida ou pastosa, quando h dificuldade para fechar diagnstico de
tumores pouco diferenciados.
Fixao vrios so os fixadores utilizados para o cell-block, alguns

inclusive adicionam corantes para facilitar a visualizao da amostra durante e
aps o processamento. Destacamos alguns fixadores a seguir:
Formalina 10%:
Formaldedo comercial..........................................100 mL
gua destilada ..................................................900mL
Formol-Salina:
Formaldedo comercial.........................................100 mL
gua destilada..................................................900 mL
Cloreto de sdio (NaCl).........................................9 g
AFA ou FAA lcool - formalina - cido actico (muito
utilizado para cell-block):

Etanol (95 - 100%)..........................................85 mL
Formaldedo comercial .........................................10 mL
cido actico glacial.............................................5 mL
Carnoy:
lcool etlico absoluto.........................................60 mL

Clorofrmio.......................................................30 mL
cido actico glacial............................................10 mL
Lquido de Bouin:
Soluo saturada de cido pcrico (aquosa).................75 mL

Formaldedo comercial...........................................25 mL
cido actico glacial.............. ...............................5 mL
Tempo de fixao: 4-24 horas. (para linfoma deve-se deixar de
48-72 horas).
Tratamento prvio dos cortes para a remoo do cido pcrico:

1- Desparafinizar e hidratar at o lcool 95%.
2- Colocar as lminas em uma soluo de lcool 70% saturado
com carbonato de ltio durante 5 minutos.
4- Lavar em gua destilada durante 5 minutos.
E. B-5 ou formalina tamponada sublimada:
Muito utilizada para amostras contendo sangue.
Soluo estoque:
Cloreto de mercrio (HgCl2).........................................12 g
Acetato de sdio (CH3COONa) .................................2,5 g
gua destilada........................................................200 mL
Soluo de uso (preparar somente antes do uso):
Soluo estoque de B-5..............................................20 mL
Formaldedo comercial...................................................2 mL
Tratamento prvio dos cortes para remoo de pigmento de mercrio:
1- Desparafinizar e hidratar os cortes
2- Imergir durante 5 minutos na soluo de lugol sob agitao.
3- Lavar em gua.
4- Colocar as lminas em tiossulfato de sdio 5% por 1 minuto
ou at a completa remoo da cor amarela do Iodo.
Soluo de lugol:
Iodo (I2)...........................................................2,5 g
lcool 70%....................................................500 mL
Procedimento para cell-block:
1- Centrifugar as amostras por 10 minutos a 1.000 rpm.
2- Desprezar o sobrenadante, retirar o sedimento e fixar as amos-
tras de 5 minutos a 1 hora o tempo de fixao pode variar de

acordo com o fixador e a quantidade da amostra. Proceder
fixao colocando o sedimento no lquido fixador que se encontra em frasco apropriado para sedimentao.
3- Centrifugar novamente por 2 minutos na mesma rotao, reti-
rar o fixador e manter o sedimento formando um pellet.

4- Iniciar a desidratao com etanol 80% e seguir com um banho
de etanol 95% e dois banhos de etanol 100%. O tempo de

desidratao tambm varia de acordo com a quantidade da amostra, podendo variar de 5 minutos at 1 hora em cada banho.
Centrifugar durante poucos minutos em cada banho.
Obs. Esta etapa e as seguintes podem ser realizadas no processador
automtico de tecidos, desde que o pellet da amostra se encontre envolto em papel de filtro, evitando a perda do material
durante o processamento.
5- Clarificar em dois banhos de xilol, variando de 5 a 15 minu-
tos. Centrifugar ao final por poucos minutos para formar o pellet.

Obs. Para retirar o xilol, deve-se descartar o sobrenadante e secar
o pellet com papel absorvente.
6- Fazer dois banhos, de 15 minutos a 1 hora, em parafina
fundida na estufa; o tempo varia de acordo com o tamanho do

pellet formado.
7- Esfriar e retirar o pellet impregnado pela parafina.
8- Montar um bloco de parafina.
9- Seccionar o bloco em micrtomo e corar pelo mtodo desejado.
Figura 15. Processamento manual para cell-block (esquema adaptado do original do Dr. N. Fukushima, Doai Memorial Hospital, Tquio).
4. Coloraes citolgicas
A qualidade da colorao citolgica est diretamente relacionada s

caractersticas tintoriais dos corantes, ao processamento da amostra (espessura
dos esfregaos) e fixao. Esses cuidados devem ser observados para se
evitar artefatos e dificuldade de anlise do material.
Muitas coloraes histolgicas podem ser empregadas na citologia, algumas das quais com pequenas modificaes. Os mtodos mais empregados
so o mucicarmin de Mayer, May-Gruenwald-Giemsa, hematoxilina e eosina,

cido peridico Schiff (PAS), Grocott, Shorr, entre outros. Porm, o mtodo
de Papanicolaou (Pap) o mais difundido e empregado, pela grande demanda
diagnstica, e por ser a colorao comumente aplicada s amostras colpocitolgicas
para diagnstico de cncer ginecolgico.
O mtodo de Papanicolaou utiliza um conjunto de corantes e tem como
objetivo a evidenciao das variaes na morfologia e dos graus de maturidade
e de atividade metablica celular. Esse mtodo se baseia nas aes de um
corante bsico (com afinidade pelo ncleo das clulas: a hematoxilina), um
corante cido (que se combina com o citoplasma das clulas queratinizadas:
orange G) e um corante policromtico (que oferece tonalidades de cores
diferentes no citoplasma das clulas: EA-65).
Este mtodo abrange cinco etapas:
Hidratao: esta etapa requer a reposio gradual da gua das clulas
por meio de banhos alcolicos de concentraes decrescentes at a

gua destilada.
Colorao nuclear: as clulas hidratadas podem agora receber um
corante aquoso para corar os ncleos (hematoxilina de Harris).

Desidratao: para receber corantes alcolicos citoplasmticos, deve-
mos agora retirar a gua das clulas com banhos alcolicos de concentraes crescentes.
Colorao citoplasmtica: nesta etapa, o citoplasma das clulas cora-
do pelos corantes orange G e EA-65, de modo a diferenciar com

diversas tonalidades o citoplasma das clulas de acordo com a sua maturidade e metabolismo.
Desidratao, clarificao e selagem: a gua agora deve ser retirada com
concentraes alcolicas crescentes, clarificadas e seladas com meios permanentes hidrofbicos.
Descreveremos a seguir os mtodos mais empregados. Outros mtodos

esto descritos na literatura recomendada.
A. Mtodo de Papanicolaou (Papanicolaou, 1942)
Solues:
Hematoxilina de Harris (Harris, 1900)
Hematoxilina.......................................................5,0 g
Etanol 100%.................................................50,0 mL
Almen de potssio [KAl(SO4)2]................100 g
gua destilada...............................................1.000 mL
xido de mercrio (HgO p vermelho)..................2,5 g
Dissolva o almen em gua destilada com o auxlio de uma placa aquecedora e um agitador magntico em um recipiente com capacidade para 2.000
mL, para evitar que derrame quando a soluo entrar em ebulio. Misture a
hematoxilina no lcool temperatura ambiente em outro recipiente separado.
Lentamente, combine as duas solues aquecendo em placa aquecedora, at
entrar em ebulio. Retire da fonte de calor e acrescente lentamente o xido
mercrio, com cuidado, pois o xido reage com a soluo fazendo-a entrar
rapidamente em ebulio, podendo sair, inclusive, do recipiente. Retorne a
soluo para a fonte de calor at que tome a tonalidade prpuro-escura.
Esfrie, e a soluo estar pronta.
Para uso:
Acrescente 20 mL de cido actico glacial para intensificar a colorao
dos ncleos.
Filtre sempre antes de cada uso.
cido-lcool a 1%:
cido clordrico (HCl)..........................................1 mL

Etanol 70%.................................................... 99 mL
gua amoniacal:
Hidrxido de amnio (NH OH)........................2 a 4 mL

gua destilada.....................................800 a 1.000 mL
Corante orange G:
Soluo estoque de orange G 10%:

Orange G..........................................................10 g
gua destilada.................................................100 mL
Soluo de uso do orange G :
Soluo estoque................................................20 mL
cido fosfotngstico[H3P(W3O10)4]......................0,15 g
Etanol 95%...................................................980 mL
Corante EA-65:
Solues estoque eosina Y a 20%:

Eosina Y............................................................20 g
gua destilada................................................100 mL
Soluo estoque light-green SF a 3%:
Light-green SF.....................3 g
gua destilada................................................100 mL
Soluo de uso do EA-65:

Soluo estoque de eosina Y.................................20 mL
Soluo estoque de light-green SF...........................10 mL
cido fosfotngstico [H3P(W3O10)4].........................2 g
Etanol 95%...................................................700 mL
Metanol absoluto.............................................250 mL
cido actico glacial...........................................20 mL
Mtodo
1- Etanol 80%......................................5-10 mergulhos
2- Etanol 70%.......................................5-10 mergulhos
4- gua destilada I..................................5-10 mergulhos
5- gua destilada II.................................5-10 mergulhos
6- Hematoxilina de Harris ...............................1-5minutos
7- gua destilada....................................5-10 mergulhos
8- Diferenciar em lcool-cido..........................3 mergulhos
9- gua destilada.....................................5-10 mergulhos
10- Banho de gua amoniacal..........................5 mergulhos
11- gua destilada...................................5-10 mergulhos
12- Etanol 50%.....................................5-10 mergulhos
13- Etanol 70% ....................................5-10 mergulhos
14- Etanol 95%...................................5 a 10 mergulhos
15- Orange G, soluo de trabalho.......................1 minuto
16- Etanol 95%..... ...............................5-10 mergulhos
17- Etanol 95%....................................5-10 mergulhos

19- Eosina-EA65, soluo de trabalho..................5 minutos
23- Etanol 100% I ................................5-10 mergulhos
24- Etanol 100% II ...............................5-10 mergulhos
25- Etanol 100% III ...............................5-10 mergulhos
26- Xilol I............................................5-10 mergulhos
27- Xilol II............................................5-10 mergulhos
28- Xilol III...........................................5-10 mergulhos
29- Selar em meio hidrfobo.
Resultado:
Clulas escamosas maduras...............................rseo-avermelhada
Nuclolo..................................................vermelho-arroxeado
Clulas metabolicamente ativas............................... verde-azulado
Citoplasma queratinizado................................ laranja ou amarelo
B. Mtodo de May-Grnwald-Giemsa
Esse mtodo de colorao aplicado em distenses para a anlise de

elementos figurados do sangue perifrico, medula ssea, ou elementos celulares colhidos por puno, esfoliao, imprint de tecidos ou concentrado de
lquidos celulares, por meio de dois corantes.
Solues:
Soluo estoque de May-Grnwald (vendida comercialmente arti-
go Merck 1524).
Soluo estoque de Giemsa (vendida comercialmente artigo Merck
9204).
Tampo Sorensen pH 6,8.
Soluo A - fosfato de sdio monobsico (NaH2PO4) 0,2 M:
NaH2PO4...............................................27,8 g
gua destilada.......................................1.000 mL
Soluo B - fosfato de sdio dibsico (Na2HPO-4. H2O ) 0,2 M:
Na2HPO-4. H2O....................................28,39 g
gua destilada ......................................1.000 mL
Soluo de uso:
Soluo A Soluo B pH final 6,8

51 mL
49 mL
100 mL
Soluo de uso de May-Grnwald:
Soluo estoque de May-Grnwald.........................25 mL

Tampo Sorensen pH 6,8...................................190 mL
Soluo de uso de Giemsa:
Soluo estoque de Giemsa...................................25 mL

Tampo Sorensen pH 6,8...................................190 mL
Nota: As concentraes finais das solues de uso de May-Grnwald e
Giemsa podem ser ajustadas se necessrio. Elas sempre devem ser preparadas
antes de usar e desprezadas aps o uso.
Mtodo:
1- Fixar em metanol por 15 minutos.
2- Corar pela soluo de uso de May-Grnwald por 5 minutos.
3- Escorrer o corante da lmina.
4- Corar pela soluo de trabalho de Giemsa por 10 minutos.
5- Lavar em tampo Sorensen pH 6,8.
6- Deixar secar temperatura ambiente.
7- Clarificar com xilol.
8- Selar com meio hidrofbico.
Resultados:
Ncleos dos leuccitos...........................................azul-plido
Citoplasma........................................azul muito claro ou incolor
Granulaes neutrfilas........................................vermelho-claro
Granulaes basfilas..............................................azul-escuro
Eosinfilos e eritrcitos..................................vermelho-alaranjado.
Mtodo de Shorr
Este mtodo de colorao possui resultados semelhantes ao mtodo de

Papanicolaou, sendo aplicado como seu substituto em vrios laboratrios de
citopatologia.
Solues:
Soluo corante de Shorr
Biebrich Scarlet ..................................................5,0 g
Orange G ou II..................................................2,5 g
Fast Green........................................................1,0 g
cido fosfomolbdico H3P(Mo3O10)4.......................5,0 g
cido fosfotngstico [H3P(W3O10)4].......................5,0 g
cido Actico Glacial.........................................10 mL
Etanol 50 %...............................................1.000 mL
Mtodo:
6- Hematoxilina de Harris...............................1-5 minutos
8- Diferenciar em lcool-cido..........................3 mergulhos.
10- Banho de gua amoniacal..........................5 mergulhos
11- gua destilada..................................5-10 mergulhos

14- Corante de Shorr......................................6 minutos
15- Etanol 95% I...................................5-10 mergulhos
16- Etanol 95% II..................................5-10 mergulhos
17- Etanol 95% III..................................5-10 mergulhos
18- Etanol 100%...................................5-10 mergulhos
21- Xilol I.............................................5-10 mergulhos
22- Xilol II............................................5-10 mergulhos
23- Xilol III...........................................5-10 mergulhos
Resultados
Clulas eosinoflicas...........................citoplasma vermelho / laranja
Clulas basoflicas.............................citoplasma azul / esverdeado
Ncleos.......................................azul / violeta escuro / marrom
Referncias Bibliogrficas
CAPUTO, L. F. G. Manual da disciplina de histotecnologia do curso tcnico de Pesquisa
em Biologia Parasitria do Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro: Fiocruz, 2008. 112 p.
COPETTI, N. Manual de tcnicas citolgicas da Faculdade de Medicina da UFRGS.
Porto Alegre: UFRGS, 2004. 31 p.
HARRIS , H. F. On the Rapid Conversion of Haematoxylin into Haematein in Staining
Reactions. J. Appl. Microsc, v. 3, p. 777-780, 1900.
PAPANICOLAOU, G. N. A New Procedure for Staining Vaginal Smear. Science, n.
95, p. 438-439, 1942.
Para saber mais:

JUNQUEIRA , C. U.; JUNQUEIRA , L. M. M. S. Tcnicas bsicas de citologia e
histologia. So Paulo: Santos, 1983. 123 p.
LOWE, J. Histotechnology Technical Methods: Stain for Air Dried Cytology Preparations.
Disponvel em : http://www.nottingham.ac.uk/pathology/protocols/mgg.html. Acesso em:
20 jul. 2009.
MICHALANY, J. Tcnica histolgica em anatomia patolgica. 3. ed. So Paulo: EPU,
1981. 295 p.
OLIVEIRA, M. L. C. S.; MOTA, A. R. C.; VIERO, R. M. Citotecnologia manual
de normas tcnicas. So Paulo: Faculdade de Medicina de Botucatu (Unesp), Laboratrio de Citologia, Departamento de Patologia, 2000. 24 p.
PROPHET, E. B. et al. Laboratory Methods in Histotechnology. Washington, D.C.:
Armed Forces Institute of Pathology, 1992 . 279 p.
WOODS, A. E.; ELLIS, R. C. Laboratory Histopathology A Complete Reference.
Nova York: Churchill Livingstone, 1994. v. 2.
| 215
Captulo 5
Cultivo celular
Emanuele Amorim Alves
Anna Christina Rosa Guimares
1 . Histrico de desenvolvimento da tecnologia de

cultura de tecidos
1.1. Histrico da cultura de clulas
O cultivo de clulas se iniciou no princpio do sculo XX com Harrison,

em 1907, e Carrel, em 1912. Essa tcnica foi desenvolvida como um mtodo para estudar o comportamento de clulas animais fora do organismo, em
um meio ambiente controlado. Essa tcnica ainda uma importante ferramenta
de pesquisa nos laboratrios do mundo inteiro.
Os primeiros experimentos consistiam em cultivo de tecidos fragmentados mecanicamente em frascos contendo fluidos dos animais de onde provinham os tecidos. Devido a essa forma de cultivo, durante mais de 50 anos
essa tcnica foi chamada cultivo de tecidos do ingls tissue culture , sendo
esse termo atualmente usado genericamente para denominar tanto o cultivo de
clulas quanto o de tecidos e de rgos.
Harrison foi um pioneiro no uso de cultura de clulas. Na poca, ainda

havia dvidas da dinmica do desenvolvimento do tecido nervoso, pois somente observaes microscpicas no forneciam informaes sobre esse processo. Harrison queria provar que as fibras nervosas eram formadas a partir de
clulas nervosas. Para isso ele necessitou observar essas clulas fora do organismo para comprovar sua teoria. Mas como seria possvel um tecido viver fora
do organismo original? Harrison levou em considerao as necessidades bsicas de uma clula e desenvolveu um experimento no qual ele mimetizou tais
condies. Assim, ele dissecou o tubo medular de um embrio de sapo e o
mergulhou em sua linfa fresca. Esta linfa em instantes se coagulou e, logo em
seguida, Harrison selou o frasco com parafina, observando a sua preparao ao
microscpio todos os dias. Uma das vantagens desse experimento era a falta
de necessidade de controle de temperatura, j que os anfbios so animais cuja
temperatura varia com a temperatura ambiente. Harrison teve o cuidado de
manter as condies asspticas, e suas consideraes sobre a possibilidade de
se manter in vitro clulas vivas por mais de uma semana foram um marco para a
cultura de clulas.
Com esse experimento, Harrison confirmou a sua hiptese, provando
que as fibras nervosas so formadas a partir das clulas nervosas. Com isso,
muitos outros cientistas passaram a se interessar por esse modelo de experimento, introduzindo o uso de cultura de clulas em suas pesquisas.
Em 1912, Alexis Carrel, utilizando informaes obtidas nas observaes de Harrison, desenvolveu um modelo a partir de clulas cardacas de
embrio de galinha para o cultivo. Seus experimentos foram muito importantes,
pois com Carrel descobriu-se a necessidade da troca de fonte de nutrientes
contidos nos frascos. Essa renovao constante de nutrientes em cultivo permitiu que as clulas pudessem ser cultivadas por perodos ainda maiores do que
os utilizados por Harrison.
Em 1951, George Gey cultivou clulas de tecido tumoral humano
estabelecendo a linhagem HeLa, utilizada at hoje em todo o mundo. O fato
Cultivo Celular | 217
de que tumores humanos poderiam dar origem a clulas contnuas em linhagem

aumentou o interesse pelo cultivo de tecidos.
O avano na cultura de clulas ocorreu, em grande parte, por intermdio dos experimentos de Hayflick e Moorhead, em 1961, considerados
clssicos, nos quais eles utilizaram clulas de vida finita.
Em 1962, Nakamura e colaboradores, no Japo, estabeleceram a linhagem VERO, oriunda de rim de macaco-verde africano (Cercopithecus aethiops).
Essa clula uma das poucas, na atualidade, aprovadas para uso em produo de
vacinas pela Organizao Mundial da Saude (OMS), o que a torna um
excelente modelo de pesquisas para o desenvolvimento de novas vacinas.
Muitas outras linhagens foram estabelecidas pelos pesquisadores. Atualmente, a cultura de clulas no se limita ao estudo do comportamento de
determinado tecido ou clula in vitro. Seu uso se estende medicina, pois
clulas em cultivo tm importante papel no tratamento de doenas degenerativas.
Para a terapia celular, as pesquisas com clulas-tronco so um marco nessa rea
que, de ferramenta para outros estudos, tornou-se a protagonista do desenvolvimento tecnolgico mundial.
1.2. Tipos de culturas
Clulas em cultivo so um modelo de funo fisiolgica muito contraditrio, devido perda de caractersticas que ocorre durante o seu desenvolvimento em cultura. A proliferao in vitro difere daquela in vivo. Assim, por
mais prximo que esse modelo esteja da realidade, o processo in vitro ainda
causa problemas para o desenvolvimento celular. Sua adeso clula clula e
clula matriz reduzida, no possui as caractersticas (heterogeneidade e
arquitetura tridimensional) de um tecido in vivo, uma vez que seu meio nutricional
e hormonal est modificado.
Clulas que, num momento anterior, cresciam tridimensionalmente agora
se encontram em um meio que favorece o espalhamento, a migrao e a
proliferao de clulas no especializadas que expressem diferentes funes. A
escolha do meio ideal um caminho a se seguir para a obteno de uma

cultura que expresse uma funo especfica.
Apesar disso, ainda existem muitas vantagens no uso de cultura de
clulas como modelo experimental. O controle do ambiente, a homogeneidade
da amostra, quando comparada ao uso de animais em experimentos, e a
economia so as principais vantagens dessa tcnica. Atualmente, com a
implementao das Comisses de tica de Uso de Animais em Pesquisa
(CEUA), a cultura de clulas o principal modelo alternativo para a substituio dos animais em experimentos de pesquisa.
1.2.1. Clulas primrias, clulas estabelecidas e clulas
transformadas
Uma cultura primria estabelecida a partir do crescimento de clulas

oriundas de um fragmento de tecido obtido por desagregao mecnica ou
enzimtica. As clulas que conseguirem sobreviver ao processo de desagregao e aderirem garrafa formaro a primeira monocamada de clulas daquele
tecido. Essas clulas possuem as caractersticas do tecido de origem, podem
crescer em cultura por um determinado perodo de tempo e so denominadas
clulas primrias. Essa forma de cultivo a mais utilizada para estudar o
comportamento de determinada clula in vitro devido presena de suas
caractersticas genotpicas e fenotpicas.
As clulas primrias que conseguem manter suas caractersticas originais
possuem um tempo de vida curto. No organismo, a morte celular um
mecanismo para renovao tecidual. Essa morte programada e no causa
danos. Esse processo denominado apoptose. Na apoptose, a clula no
rompida, ela simplesmente se autodigere, formando botes apoptticos que
so degradados.
medida que a cultura repicada, as clulas com uma maior capacidade de proliferao iro predominar na garrafa de cultivo em detrimento das
clulas que no se adaptaram bem ao cultivo ou que, devido a traumas do
processo de desagregao, no possuem uma taxa normal de proliferao.
Essas clulas ainda no perderam as caractersticas do tecido de origem, mas

possuem alta proliferao. Esse tipo de clula chamado linhagem celular
contnua, e muito utilizado em pesquisa, pois pode ser mantido em cultura
por um grande perodo de tempo (quando comparado s clulas primrias) e
ainda guarda grande parte das caractersticas do tecido original. Muitas linhagens celulares contnuas podem ser propagadas sem perder suas caractersticas
por at oitenta passagens, alm de serem euploides, ou seja, possuem um
nmero de cromossomos mltiplo do nmero original da espcie. Essas clulas
so muito utilizadas em pesquisa e na produo de vacinas, como o caso da
linhagem MRC-5, oriunda de tecido de pulmo de feto humano e utilizada na
produo da vacina de rubola.
No momento em que as caractersticas genticas das clulas so modificadas, elas deixam de ser semelhantes morfologica e geneticamente ao tecido
original e so ento chamadas clulas transformadas. Tais clulas podem ser
transformadas em cultura utilizando-se substncias qumicas, vrus ou agentes
fsicos como a luz ultravioleta.
A transformao celular uma alterao gentica que permite mutaes
em genes responsveis pelo controle do ciclo celular (proto-oncogenes e
genes supressores de tumor). A mutao pode resultar de uma superexpresso
de proto-oncogenes ou da inativao de genes supressores de tumor. O
principal reflexo dessa mutao a presena da telomerase ativa. Durante a
diviso, a clula perde um pedao da poro final de seus cromossomos o
telmero. Esse processo um tipo de controle para que a clula, ao checar
se h possibilidade de diviso (check point), realize apoptose ao perceber
que seu DNA est danificado a ponto de alterar alguma transcrio. A telomerase
repe o telmero perdido permitindo que a clula se divida indefinidamente
sem que perca um pedao de seu DNA codante. A proliferao exacerbada
est diretamente ligada ao processo de transformao.
As clulas transformadas tambm podem ser obtidas diretamente de

tecidos j mutados, como o caso de tecidos tumorais. O exemplo mais
famoso desse tipo de clula so as clulas HeLa oriundas de um tumor de
crvice uterina humana. As clulas HeLa so clulas gentica e morfologicamente
diferentes do tecido original, e no possuem dependncia de ancoragem nem
inibio por contato, alm de serem capazes de proliferar infinitamente quando
em cultura.
Essas clulas so muito utilizadas em estudos de citotoxicidade, controle
de qualidade, entre outros. As clulas transformadas no so ainda amplamente
utilizadas na produo de vacinas, em face do risco de o DNA alterado dessa
clula alterar o DNA do indivduo que fez uso dessa vacina. A nica clula
transformada usada na fabricao de vacinas a clula VERO. Porm, existem
controles rgidos quanto quantidade de DNA celular residual presente em cada
vial1 da vacina. A OMS estabelece um limite de 10 ng de DNA por vial.
1.2.2. Clulas aderentes e clulas no aderentes
As clulas em cultura possuem, inicialmente, caractersticas semelhantes

aos seus tecidos de origem. Assim, clulas provenientes de tecidos epiteliais
tero uma maior dependncia de interao clula clula, enquanto clulas
hematopoiticas no necessitam de nenhuma interao.
As clulas cultivadas podem apresentar dois aspectos distintos, isto ,
podem ser aderentes ou no aderentes, o que significa dizer que algumas
clulas podero se ligar ao fundo da garrafa de cultura enquanto outras ficaro
em suspenso no meio. As clulas aderentes so oriundas de tecidos duros e,
por isso, so dependentes de ancoragem, ou seja, necessitam de adeso a
uma superfcie de contato para que possam iniciar a sua proliferao. Para as
clulas aderentes, as garrafas de cultura devem possuir uma carga negativa. Essa
1
Frasco de vidro com volume variado utilizado no armazenamento de produtos biolgicos.
carga medeia a produo de protenas de adeso e proteoglicanos que iro

iniciar o processo de adeso da clula superfcie da garrafa. a matriz
extracelular que interage com a carga negativa da garrafa e, ento, as clulas se
ligam matriz por receptores especficos. Nas clulas epiteliais ainda h a
interao clula clula mediada por molculas de adeso clula clula
(CAMs) e pelas caderinas (dependentes de Ca+2).
Quando em cultura, as clulas aderentes se espalham por todo o fundo
da garrafa formando o que chamado monocamada celular.
As clulas no aderentes podem ser cultivadas em suspenso no meio e
so derivadas de tecidos que no necessitam de ancoragem para proliferar e
sobreviver. Essa capacidade est restrita s clulas hematopoiticas, s linhagens
transformadas ou s clulas de tecido tumoral.
Figura 1. Linhagem MA 104 (rim
de macaco-verde africano). Linhagem
aderente.
Figura 2. Linhagem MM6

(monoctica leucmica humana). Linhagem no aderente.
Fonte: Fotos cedidas pelo Setor de Cultura de Clulas do Instituto Nacional de Controle de
Qualidade em Sade (INCQS), Fiocruz.
2. Biossegurana aplicada a laboratrios

de cultivo celular
Como em qualquer atividade laboratorial, antes do incio do cultivo

celular, deve-se planejar o trabalho a ser realizado de modo a execut-lo
com segurana.
Deve ser preparado um procedimento com as especificaes das atividades realizadas e todo pessoal deve ser orientado sobre os possveis riscos e
para a necessidade de seguir as especificaes de cada rotina de trabalho, os
procedimentos de biossegurana e prticas de segurana.
H, pelo menos, 24 casos documentados de infeco em funcionrios
de laboratrio que manipulam culturas de clulas primrias (por exemplo,
clulas de macaco Rhesus) nos ltimos 30 anos.
Embora um nmero limitado de infeces adquiridas em laboratrios
tenha sido relatado como resultado da manipulao de clulas humanas e de
outros primatas, h um risco significativamente maior em adquirir uma infeco
pelo HIV ou pelo HBV por meio da exposio ao sangue humano e a outros
lquidos corporais.
Os riscos potenciais associados s clulas e tecidos humanos incluem os
patgenos do sangue HBV e HIV, bem como agentes presentes nos tecidos
humanos, como Mycobacterium tuberculosis, que pode estar presente nos
tecidos pulmonares.
Outros riscos potenciais aos trabalhadores so representados pelo
uso de clulas transformadas por agentes virais, como o SV-40, assim
como as clulas que carregam material gentico viral. As clulas humanas
tumorognicas tambm podem oferecer riscos potenciais como resultado
de uma autoinoculao.
Alm do risco biolgico, um laboratrio de cultivo celular possui
os riscos:
qumicos lquidos combustveis, corantes txicos (azul de Tripan,
MTT, bis-benzimida), gases txicos;

fsicos calor, radiao, vibrao e frio.
2.1. Barreiras de conteno no trabalho em cultura de clulas
Antes de iniciar os procedimentos de manipulao, o pesquisador, ou

tcnico, deve usar guarda-p limpo ou descartvel, gorro, mscara cirrgica e
sapatilha, como conteno primria. Lavar as mos e a parte anterior do antebrao com gua e sabo, preferencialmente antissptico, realizar antissepsia das
mos com lcool 70% (v/v) e calar luvas cirrgicas. Tais procedimentos so
muito importantes para a manipulao de clulas. O profissional no deve usar
anis, pulseiras, relgios ou outros ornamentos durante as manipulaes.
Clulas animais devem ser manipuladas usando-se as prticas e a conteno do nvel de biossegurana 2. O trabalho deve ser realizado em cabine de
segurana biolgica, e todo o material dever ser descontaminado antes do
descarte. A conteno secundria obtida mediante a combinao de elementos relacionados infraestrutura laboratorial.
2.2. Infraestrutura laboratorial
A organizao de um laboratrio voltado pesquisa com clulas depende da sua finalidade e do nmero de pessoas que nele vo trabalhar. De
maneira geral, o laboratrio necessita dos seguintes espaos:
rea para lavagem e esterilizao;
rea para preparo de meios;
rea para incubao e observao das culturas;
rea para manipulao assptica das culturas.
As diversas reas devem estar funcionalmente distribudas, facilitando o

deslocamento de pessoal e o fluxo de materiais, com a menor circulao
possvel nas reas de manipulao assptica das culturas.
A rea destinada a manipulaes, onde se localizam as cabines de fluxo,
deve ser preferencialmente fechada e muito limpa. Deve-se trabalhar com
avental limpo, exclusivo para uso nessa sala.
A superfcie das bancadas deve ser impermevel gua e resistente a
cidos, lcalis, solventes orgnicos e a calor moderado. As instalaes devem
ser desenhadas de modo a permitir espaos entre as bancadas, equipamentos e
cabines, que devem permitir fcil limpeza.
Os equipamentos necessrios tambm dependem das finalidades do
laboratrio. Em geral, o laboratrio necessita de:
estufa incubadora com atmosfera de CO2;
autoclave;
deionizador de gua;
estufa para secagem de material;
cabine de segurana biolgica (cmara de fluxo de ar laminar estril);
medidor de pH;
balana analtica;
geladeira;
freezer;
microscpio invertido;
agitador magntico;
centrfuga refrigerada;
banho-maria;
bomba de vcuo.
Para trabalhos com culturas de clulas, inmeros instrumentos so necessrios, tais como: cmara para contagem, pipetador automtico, micropipetas,
estante para tubos, alm de uma variedade de vidrarias e reagentes necessrios
para preparo de meios de cultura e solues.
As salas devem ser sinalizadas com smbolo universal de risco biolgico,
com acesso restrito equipe tcnica de apoio.
2.3. Limpeza, desinfeco e esterilizao
A superfcie da rea de trabalho deve sempre ser limpa, utilizando-se

lcool a 70% (v/v), uma vez por dia ou aps cada atividade. O lcool etlico
a 70% (v/v) um excelente desinfetante por sua ao de limpeza ou detergente, sendo eficaz tambm na reduo da flora bacteriana da pele. Suas
propriedades desidratante e desnaturante de protenas podem ser responsveis
por sua ao antimicrobiana.
A gua sanitria comercial (2% a 5% de cloro) , tambm, um bom
desinfetante quando diluda de 5 a 10 vezes, por ser um agente oxidante e
agir sobre os constituintes da membrana, levando os microrganismos morte.
Todo material aquecido no banho-maria, como meios de cultura e solues, deve ter processo prvio de assepsia antes de sua introduo na cabine
de segurana biolgica. Deve-se, ao retirar o material do banho-maria, remover
o excesso de umidade com auxlio de uma gaze e posterior limpeza com lcool
70% (v/v).
Antes de se iniciarem os procedimentos, a cmara interna do fluxo deve
ser limpa com gaze embebida em lcool etlico 70% (v/v). O fluxo de ar,
assim como a lmpada de ultravioleta devem ser ligados trinta minutos antes do
uso. Todo material deve ser limpo com lcool etlico a 70% (v/v) antes de ser
introduzido na cmara. Aps o trmino dos procedimentos, deve-se realizar a
limpeza da cmara interna, removendo possveis sujidades. Manter o intervalo
de pelo menos vinte minutos, com o fluxo de ar e a lmpada de ultravioleta

ligados, antes de iniciar outro procedimento ou encerrar as atividades. Realizar avaliao e monitoramento ambiental da cabine pelo mtodo de exposio de placas, tal como descrito no item controle microbiolgico de ambientes e processos.
2.4. Controle microbiolgico de ambientes e processos
O trabalho com cultivos celulares exige uma srie de cuidados para se

reduzirem os riscos de contaminao. As tcnicas asspticas reduzem a probabilidade de infeco, sendo importante que sejam mantidas a todo momento: antes, durante e ao trmino do experimento. A necessidade de
manuteno da assepsia inclui uma srie de procedimentos que vo desde a
esterilizao dos meios de cultura e instrumentos, at a adoo de quarentena para os cultivos novos. Isso porque as clulas so cultivadas em meios
ricos em nutrientes e a possibilidade de ocorrer propagao de microrganismos contaminantes alta.
As culturas, assim como todos os resduos da manipulao, devem ser
descontaminadas, antes do descarte, em autoclave durante uma hora a 121C.
Culturas contaminadas no devem ser abertas para lavagem antes da
descontaminao. Esse material deve ser retirado do laboratrio imediatamente
em recipientes rgidos e prova de vazamentos.
Deve-se controlar a temperatura e a umidade para evitar o crescimento
de microrganismos no ambiente. A climatizao de uma sala de 15m 2 (45m3)
pode ser feita por um aparelho de ar condicionado de 15.000 BTUs, levando-se em conta que existe o aquecimento produzido pelos equipamentos.
O monitoramento microbiolgico da sala, bem como das cabines de
segurana biolgica para o cultivo de clulas, pode ser realizado pela pesquisa
de microrganismos, como fungos e bactrias. Um procedimento rotineiro indicado para controle ambiental o mtodo de exposio de placas com meios
nutritivos gar casena de soja (trypticase soy agar-TSA) e gar sabouraud 4%

de glicose (Sab4).
O laboratrio deve possuir um programa rotineiro adequado de controle de insetos e roedores. Todas as reas que permitam ventilao devero
conter barreiras fsicas para impedir a passagem de insetos ou outros animais.
3. Tcnicas/conceitos para cultivo celular
3.1. Lavagem e preparo do material para cultura de clulas
A vidraria utilizada para cultura de clulas deve ser exclusiva e processada separadamente das demais.
A vidraria deve ser lavada imergindo-a em gua com detergente neutro a
5%, durante 12 horas, e enxaguando-a 3 a 4 vezes em gua comum, e 2 a 3
vezes em gua destilada. O material limpo deve apresentar uma pelcula uniforme de lquido nas paredes aps o ltimo enxgue. Caso no haja a formao
desta pelcula, o material dever ser submetido a novo processo de lavagem,
pois significa que h traos de gordura ou qualquer sujidade no material.
Frascos muitos sujos, com resduos aderidos, devem ser lavados com
soluo sulfocrmica (soluo de bicromato de potssio a 3% em cido sulfrico concentrado1:9), que requer muito cuidado no uso devido presena
do cromo IV (Cr+4). Muitos materiais necessitam de uma lavagem prvia, sob
agitao durante 5 a 10 minutos, em soluo detergente.
A secagem do material deve ocorrer em estufa de secagem a 120C,
por aproximadamente 6 horas. O material limpo e seco no deve conter
qualquer tipo de resduo, mancha, colorao e/ou opacidade; caso contrrio,
o material deve ser submetido a um novo processo de lavagem.
A montagem e embalo podem ser realizados com envelopes e/ou bolsas prprios para esterilizao, ou ainda material do tipo no tecido. Deve
ser evitado o uso de papel Kraft por gerar aerossis.
A esterilizao da vidraria em geral realizada por autoclavao sob

presso a 121C por 20 minutos. Outros materiais podem ser esterilizados
por mais tempo se necessrio. Toda vidraria estril tambm deve ser mantida
livre de poeira em armrios bem fechados. Pipetas graduadas e tubos de
centrfuga so preferencialmente descartveis.
3.2. Manuteno das culturas: propagao e criopreservao
3.2.1. Propagao celular
Para manter as clulas em cultura necessrio utilizar tcnicas bsicas

que evitem a morte celular dentro da garrafa de cultivo. As clulas normalmente possuem inibio por contato e, quando em uma garrafa de cultivo, se a
quantidade de clulas exceder um nmero tal que impossibilite o crescimento
normal da monocamada, as clulas se inibiro e haver morte. Assim, extremamente importante que se retire quantidades de clulas periodicamente da
garrafa de modo a manter a populao sempre com um nmero ideal.
O processo de renovao de clulas de uma garrafa para outra chamado passagem. O nmero de passagens se refere ao nmero de vezes que essa
cultura foi subcultivada. Muitas linhagens contnuas so capazes de manter as
caractersticas iniciais do tecido original com algumas passagens, enquanto as
clulas transformadas no mantm as caractersticas originais e so capazes de
permanecer em cultura por um grande nmero passagens (chegando at virtualmente ao infinito nmero de passagens).
Para as clulas no aderentes, o procedimento de passagem se assemelha a
uma diluio e basta retirar clulas da garrafa de cultivo, adicionando novo meio ao
seu lugar. Isso ocorre porque estas clulas se encontram em suspenso no meio,
sendo possvel retir-las sem que seja necessrio um procedimento especfico.
As clulas aderentes possuem um mtodo especfico para efetuar a sua

passagem, por se encontrarem aderidas ao fundo da garrafa de cultivo. Para
que as clulas aderentes possam se ligar ao fundo da garrafa necessrio que o
fundo tenha uma carga negativa. Superfcies como vidro e metal, que possuem
uma carga lquida negativa, so excelentes superfcies para a adeso celular.
Plsticos so muito utilizados em cultivo celular, mas para que o plstico
desenvolva carga negativa necessrio um tratamento prvio com agentes
qumicos, como agentes oxidantes, ou fsicos, como a luz ultravioleta e a
radiao. A carga negativa necessria, pois a adeso celular ocorre por meio
de foras eletrostticas e da interao dessas cargas com glicoprotenas de
adeso e com ctions divalentes, como Ca+2 e Mg+2. Esta interao, ento,
desencadeia uma sinalizao intracitoplasmtica que acarretar na produo e
liberao de protenas da matriz extracelular pela prpria clula, onde a clula
ir aderir, espraiar e iniciar sua proliferao.
A matriz extracelular de um tecido uma mistura complexa de protenas,
glicoprotenas, lipdeos, glicolipdeos e mucopolissacardeos. As macromolculas
que constituem a matriz so secretadas por clulas locais, especialmente
fibroblastos. Essa matriz contm trs importantes protenas fibrosas colgeno,
elastina e fibronectina contidas em um gel hidratado formado por uma rede
de cadeias de glicosaminoglicanos. Todas essas macromolculas so secretadas
localmente por clulas em contato com a matriz.
Linhagens macrofgicas so uma exceo, pois sua adeso mediada
por proteoglicanos, um processo diferente do descrito.
Figura 3. Adeso celular medida por protenas de adeso.
Os mtodos de dissociao celular so classificados em mecnicos ou

enzimticos. No mecnico ocorre a desagregao da monocamada fisicamente com
a ajuda do rubber policeman, um dispositivo semelhante a um rodo estril que retira
as clulas do fundo da garrafa de cultivo. Na desagregao enzimtica ocorre a
digesto das protenas de adeso por proteases especficas ou no.
A dissociao de tecidos envolve a dissociao da matriz e a quebra
dos contatos clula clula, sem comprometer a membrana ou danificar a
superfcie celular.
A dissociao mecnica utilizada principalmente para clulas macrofgicas
devido sua adeso diferenciada. Esse mtodo consiste na retirada das clulas
por meio de agentes fsicos, o que muito danoso para as culturas.
A dissociao enzimtica uma das principais aplicaes das enzimas na
cultura de clulas. Proteases so necessrias para romper a matriz extracelular e,
assim, obter clulas individualizadas com a finalidade de transferir as culturas
para um novo substrato. A enzima proteoltica inespecfica mais utilizada a
tripsina, que hidrolisa cadeias polipeptdicas nos radicais lisil-arginil formando
terminaes de clivagem, ster e amida. Essa reao desestrutura a matriz,

impossibilitando a ligao dos receptores da superfcie celular, ligados ao
citoesqueleto e matriz, obrigando as clulas a rearrajarem seu citoesqueleto.
Devido inespecificidade da enzima, no se deve deixar a clula muito tempo
em sua presena, para no haver lise celular.
3.2.2. Congelamento
Na natureza muito comum que os indivduos se adaptem cada vez

mais ao meio ambiente por meio de mutaes genticas. Esse procedimento
evolutivo descrito por Darwin ocorre em todos os seres vivos e no seria
diferente pensar que tambm ocorreria em clulas cultivadas.
A partir do momento em que uma clula se encontra em uma cultura
primria ocorrem adaptaes para o seu estabelecimento como uma linhagem.
Clulas em cultura por longos perodos acabam perdendo suas caractersticas fenotpicas, pois aps vrias divises, h grande probabilidade de ocorrerem alteraes demasiadas em seu DNA.
Manter clulas congeladas significa atrasar, em anos, quaisquer alteraes que poderiam ocorrer quando em cultura. Tais alteraes so dispensveis
para os laboratrios de cultura de clulas e os grandes bancos mundiais fornecedores de linhagens.
As clulas em cultura geralmente so congeladas em nitrognio lquido
em uma temperatura de -196C. Nessa temperatura, todas as reaes bioqumicas nas clulas ficam paralisadas impedindo qualquer alterao na cultura
criopreservada.
O procedimento mais utilizado no congelamento celular o lento.
Nesse processo h diminuio da temperatura, vagarosamente acarretando a
solidificao da gua que se encontra no meio de cultura. Isso aumenta a
concentrao de soluto fora da clula e faz com que a gua saia atravs do
processo de osmose. A sada da gua da clula faz com que ela murche.
Assim, medida que a gua sai, ela se congela no exterior, deixando a clula
desidratada. Nesse processo, a gua do meio externo congelada formando
cristais que podem se reorganizar no exterior da clula. A formao de cristais
e reorganizao dentro da clula leva ao rompimento da membrana celular,
matando as clulas. Isso impedido com o processo lento de congelamento.
Figura 4. Esquema do congelamento lento.
Quando o congelamento lento, a viabilidade das clulas descongeladas maior do que a das congeladas pelo mtodo rpido, ou seja, quando
imersas diretamente no nitrognio lquido.
Mesmo controlando-se a velocidade de congelamento em 1 a 2C por
minuto e tendo o cuidado com a formao dos cristais, a clula sofrer muitos
danos nesse processo. Assim, para aumentar a viabilidade celular, utilizam-se
crioprotetores.
Crioprotetores so substncias que, sob diferentes mecanismos moleculares,
tornam a membrana das clulas protegidas dos cristais. Os crioprotetores mais
utilizados so o glicerol e o dimetilsufrido (DMSO).
O efeito protetor do glicerol se relaciona com a sua capacidade de
ligao com a gua e sua baixa dissociao com sais, diminuindo a osmolaridade
do meio de congelamento. Alm disso, suas hidroxilas so capazes de se ligar

aos oxignios do grupo fosfato dos fosfolipdeos de membrana, estabilizandoa no momento do congelamento.
O DMSO uma molcula sem carga real, mas que possui um momento
dipolar. Sua ao est relacionada interao da molcula com as membranas
fosfolipdicas e com o ambiente externo membrana. Assim, durante um
congelamento, a molcula impede fases de transmisso dos lipdeos de membrana que chegam a promover a fuso de vrias membranas.
Tanto o DMSO quanto o glicerol so txicos para as clulas e devem
ser utilizados somente no momento do congelamento, sendo indispensvel a
sua retirada do meio aps o descongelamento da cultura.
3.2.3. Descongelamento celular
O descongelamento geralmente ocorre de forma rpida. Simplesmente

retira-se a ampola do tanque de nitrognio lquido e coloca-se ela em gua a
37 C imediatamente.
Figura 5. Esquema de descongelamento lento.
Apesar de todo o cuidado durante o congelamento, o processo de

criopreservao danoso para as clulas e, portanto, aps o seu congelamento
as clulas devem ser colocadas em meio de cultivo com uma concentrao de
20% de soro fetal bovino. As clulas aderentes devem ser lavadas aps 24
horas de adeso para a retirada de clulas mortas.
Os procedimentos de congelamento e descongelamento so os mesmos
para as clulas aderentes e para as no aderentes.
3.3. Quantificao celular
Quando se trabalha com experimentos que necessitam do uso de clulas em cultura necessria a avaliao constante das clulas. Umas das formas
de se avaliar o crescimento celular utilizando-se mtodos de quantificao
celular. Quantificar uma cultura significa dizer quantas clulas se encontram em
determinada garrafa de cultivo.
A quantificao utilizada para definir a viabilidade celular, as condies
de crescimento e o incio de experimentos nos quais o nmero de clulas
utilizado deve ser preciso.
Existem duas maneiras de se quantificar clulas em cultura. Na forma
direta, conta-se diretamente o nmero de clulas presente na garrafa de cultivo; a forma indireta feita por meio da quantificao de determinadas estruturas celulares, como protenas, ou pela medio do metabolismo celular.
Como forma de quantificao direta, o mtodo mais utilizado a contagem em cmara de Neubauer. No mtodo indireto existem muitas tcnicas
baseadas no metabolismo celular ou at mesmo na dosagem de macromolculas
presentes na clula, como as protenas ou o DNA.
Para a contagem em cmara de Neubauer, as clulas devem estar totalmente individualizadas. Para clulas aderentes, necessrio fazer uma tripsinizao
prvia, o que no feito no caso de clulas no aderentes.
A cmara de Neubauer uma lmina de vidro com divises que auxiliam

na contagem, possuindo 9 quadrados que medem 1 mm2 de rea. O esquema
de uma cmara ao microscpio tico se encontra na Figura 6. Somente os
quatro quadrados externos so utilizados na contagem de clulas animais. Cada
quadrado externo formado por mais 16 quadrados menores que auxiliam a
contagem.
Figura 6. Esquema da cmara de Neubauer.
Para a contagem, necessrio colocar uma lamnula de vidro sobre a

cmara, que servir para conter a suspenso celular. O espao formado entre a
lamnula e a cmara de 0,1 mm. Dessa forma, o volume determinado por
cada quadrado equivalente a 0,1 mm3. As clulas contadas em um quadrado contidas em 1 mL equivalem ao valor de clulas contado multiplicado por
104 (fator de correo da cmara).
O nmero de clulas por mL de uma suspenso quando contado
em cmara de Neubauer obtido pela equao:
Q1+Q2+Q3+Q4
4
X104 X faror de diluio=n de clulas / mL
Para no ocorrer a contagem de uma clula mais de uma vez, deve-se fazer
uma marcao em forma de L nos quadrados, para que, ao aparecerem clulas
em cima das linhas, se contem somente as que estiverem sobre a marcao.
Para a anlise de viabilidade celular utiliza-se o corante azul de Trypan,
que no atravessa membranas ntegras. Assim, clulas vivas no permitem a
passagem do corante e, logo, no adquirem nenhuma colorao. Como as
clulas mortas tm suas membranas danificadas, ocorre o fluxo de corante para
o interior da clula fornecendo uma colorao azul.
Entre os mtodos de contagem indireta mais utilizados esto o teste de
brometo 3 - [4,5-dimetil-tiazol - 2-il] - 2,5 - difenil-tetrazlio (MTT) e o
ensaio de colorao por Coomassie Brillant Blue R-250 (CBBR 250).
A colorao por CCBR-250 se baseia na capacidade do corante de
corar protenas celulares. Assim, faz-se uma curva padro com concentraes
celulares conhecidas e tambm as leituras das amostras de cultura. Para isso,
deve-se corar a cultura e depois eluir a soluo corante, sendo lida em
espectrofotmetro.
O ensaio do MTT se baseia na reduo do MTT, um sal tetrazlico,
pela desidrogenase mitocondrial de clulas viveis para formar como produto o
azul de Formazan. O ensaio mede a respirao celular, que proporcional
quantidade de Formazan produzida, e ao nmero de clulas viveis em cultura.
A vantagem desse mtodo a contagem somente do nmero das clulas
viveis, o que no ocorre com o mtodo de CBBR 250.
3.4. Conceitos bsicos e controle da qualidade de cultivos
celulares
Para a caracterizao de clulas em cultivo necessria a observao

de vrios aspectos, como a descrio do histrico da clula, incluindo sua
origem (rgo, tecido, idade, sexo e espcie do doador), e a metodologia
utilizada para obt-la, histrico de passagens, meios de cultura usados e
passagem em animais.
Testes como cariotipagem, anlise de isoenzimas e DNA fingerprinting

(impresso digital gentica) servem como identificadores da espcie da linhagem celular, alm de indicarem se h contaminao daquela cultura por outra
clula humana ou animal.
importante enfatizar que a autenticao celular uma parte essencial
no controle de qualidade de um cultivo, tanto para fins de pesquisa quanto
para fins comerciais, devendo ser uma preocupao contnua e importante para
qualquer laboratrio de cultura de clulas.
Alm de identific-la, importante avaliar se a clula est contaminada
por fungos, bactrias, micoplasmas ou vrus.
3.4.1. Cariotipagem
A anlise cromossmica de uma clula um dos principais critrios

utilizados na identificao de uma linhagem, pois relaciona a linhagem em
cultivo a uma determinada espcie e sexo.
O mtodo de cariotipagem um exame citogentico que verifica o estado
do caritipo das clulas. Sua anlise feita por meio de vrias coloraes que
evidenciam partes dos cromossomos. Por meio de anlises visuais destes
cromossomos e com auxlio de atlas de caritipos possvel associar determinado
mapa cromossomial de uma linhagem a uma espcie e ao sexo do indivduo.
Para a cariotipagem, necessria a interrupo da proliferao celular das
clulas em cultivo no momento da metfase utilizando-se a colchicina. A
colchicina uma substncia que inibe a polimerizao das protenas do fuso
mittico, parando a diviso celular em metfase, fase em que os cromossomos
se encontram mais condensados, facilitando a sua observao ao microscpio e
a anlise do caritipo.
A cariotipagem ainda permite verificar se a clula normal ou transformada, j que o perfil gentico de uma clula transformada muito alterado
quando comparado ao perfil gentico do indivduo de origem.
3.4.2. Anlise de isoenzimas
O termo isoenzima define um grupo de vrias formas moleculares da

mesma enzima originrio de uma espcie, resultante da presena de mais de
um gene codificando cada uma das enzimas.
Assim, para utilizar isoenzimas como forma de identificao celular, devese obter um perfil enzimtico chamado zimograma, no qual as enzimas correm em
um gel de eletroforese e seu perfil de corrida avaliado por tcnicas histoqumicas.
Diferenas na mobilidade de isoenzimas em um campo eltrico resultam
de diferenas em nvel de sequncias de DNA, que codificam tais enzimas, e
de sua estrutura molecular. Assim, se os padres de bandas de dois indivduos
diferem, assume-se que estas diferenas tenham base gentica e sejam herdveis.
A anlise de isoenzimas em culturas de clulas de tecido humano pode
ser utilizada para a identificao entre dois indivduos, devido ao polimorfismo
do genoma humano, pois cada indivduo ter o seu prprio perfil isoenzimtico.
As principais enzimas utilizadas na caracterizao de clulas humanas em
cultura so a purina nucleosdeo fosforilase (NP), a glicose-6-fosfato
desidrogenase (G6PD) e a lactato desidrogenase (LDH).
3.4.3. DNA fingerprinting
O DNA contm regies que no so aparentemente transcritas. A

funo dessas regies ainda no est descrita, mas acredita-se que existam
regies que possam ser utilizadas pelo DNA, caso houvesse algum tipo de
evoluo do indivduo.
Essas regies no so conservadas e possuem uma alta variabilidade
entre os indivduos, podendo ser utilizadas como marcadores de identificao
individual, pois so especficas de um determinado indivduo e diferem entre si
na mesma espcie.
Enzimas de restries so utilizadas para cortar segmentos que podem

ser hibridizados com sondas e analisados por eletroforese. O perfil obtido
especfico de um indivduo, assim como sua impresso digital. Devido
especificidade dessa tcnica, idealizada por Jeffreys e colaboradores em 1985.
Ela foi denominada DNA fingerprinting e atualmente a principal ferramenta
utilizada para a identificao exata e precisa de determinada linhagem celular.
uma tcnica muito utilizada para detectar a contaminao cruzada entre duas
clulas em cultura.
3.5. Ciclo celular e fases de crescimento celular
3.5.1. Ciclo celular
A anlise do ciclo celular o primeiro passo para a compreenso

das vias de ativao e proliferao das clulas, sendo necessrio o conhecimento das fases do ciclo celular. A sequncia ordenada de eventos,
durante a qual o DNA replicado e protenas so sintetizadas e depois
dividem a clula em duas, constitui um ciclo conhecido como ciclo celular.
O ciclo celular eucaritico tradicionalmente compreendido em
dois perodos principais: a interfase e a mitose (M). Um ciclo de 16
horas em clulas de mamfero em cultura dividido nos perodos (G 1, S,
G2 interfase):
G1(durao de 5 horas): crescimento e preparao para a replicao
dos cromossomos;
S (durao de 7 horas): sntese de DNA (replicao);
G2 (durao de 3 horas): preparao para a diviso mittica;
M (durao de uma hora): separao das cromtides e constituio de
dois ncleos idnticos.
Aps a mitose as clulas filhas podem:

iniciar nova fase de sntese aps uma fase ps-mittica de durao
normal; ou
entrar numa fase ps-mittica prolongada permanecendo num estado
de quiescncia e, se devidamente estimuladas, podem mais tarde ingressar em ciclo no fim de G1.
A regulao adequada do ciclo celular, com o controle correto da
sntese de substncias reguladoras (ciclinas dependentes de quixases - CDK) e
inibidoras (inibidores de CDK), fundamental para o desenvolvimento normal
dos organismos multicelulares. Uma falha nesse controle pode acarretar uma
superproduo desnecessria de clulas, frequentemente com resultados malficos, como a formao de tumores (cncer).
A dinmica do processo de diviso celular muito complexa. Ela ocorre
por meio de uma srie de eventos e processos nucleares e citoplasmticos de
forma coordenada e possui mecanismos de controle rigoroso envolvendo genes
e protenas regulatrias que atuam em diferentes etapas do ciclo celular.
Em cultura, as clulas de uma populao normalmente apresentam-se em
diferentes fases de ciclo celular. Se todas as clulas de determinada populao
estivessem na mesma etapa do ciclo celular, essa populao estaria em sincronismo
celular. Uma variedade de tcnicas e substncias pode sincronizar clulas em
fases especficas do ciclo celular. Por exemplo, o arraste reversvel de clulas
em G1 pode ser obtido com a deduo de soro ou aminocido isoleucina; e
o inibidor de microtbulos, o nocodazol, empregado para sincronizar clulas
na mitose.
Figura 7. Grfico da quantidade de DNA variando ao longo do ciclo celular.
3.5.2. Fases do crescimento celular
Clulas normais em cultura possuem um padro de crescimento representado por uma curva sigmoidal (Figura 8) denominada curva de crescimento.
Essa curva reflete as fases de adaptao das clulas s condies ambientais,
disponibilidade de nutrientes e ao suporte de ancoragem necessrios para
promover a produo de novas clulas.
A determinao da curva de crescimento importante para a caracterizao de uma cultura de clulas. A biologia celular modifica-se em cada
fase da curva, sendo importante o controle do estgio em que as clulas
sero coletadas, quando ser realizado o repique da cultura, ou quando
novos nutrientes sero adicionados.
Figura 8. Curva de crescimento celular padro de clulas normais
A curva de crescimento de clulas em cultura dividida nas seguintes

fases de crescimento:
Fase lag perodo de adaptao no qual no ocorre proliferao aps
adio das clulas ao meio de cultivo. A durao da fase lag depende da
densidade celular e do estgio de crescimento da cultura, podendo se estender de horas a alguns dias. Nesse perodo h produo de protenas estruturais e enzimas, com aumento na sntese de DNA. Nesse perodo ocorre
intensa atividade metablica.
Fase log fase logartmica ou exponencial, perodo no qual a multipli-
cao celular mxima e constante. a fase de maior viabilidade e atividade

metablica das clulas e, por isso, o melhor perodo para estudo e experimentao. Nesta fase determinado o tempo de duplicao, sendo a velocidade de proliferao caracterstica para cada linhagem.
Fase estacionria ou plateau a velocidade de crescimento diminui, o
nmero de morte celular tende a ser equivalente ao nmero de clulas novas, e

a atividade metablica decresce. Para algumas linhagens, a fase estacionria
pode ser estendida se o meio for renovado.
Fase de declnio ou morte celular h reduo drstica do nmero de
clulas e o nmero de clulas mortas excede o de clulas novas.

A construo da curva de crescimento importante para a manuteno
da rotina e para saber o nmero de clulas depois de determinado o intervalo
de tempo. Permite a caracterizao de certos parmetros prprios de uma
populao sob determinadas condies de cultivo.
Linhagens primrias e permanentes possuem curvas de crescimento diferentes; as linhagens permanentes podem ser mantidas indefinidamente, enquanto as linhagens primrias morrem aps algumas geraes.
3.6. Principais agentes contaminantes em cultura de clulas
Manter a assepsia em cultura algo muito difcil. O material esterilizado erroneamente, a manipulao sem cuidado e, principalmente, a falta de
higiene e de vestimenta correta dos manipuladores podem causar contaminao de uma cultura.
Bactrias, fungos, leveduras e micoplasmas so os principais contaminantes
das culturas celulares.
Em casos de contaminao, importante avaliar onde a clula foi cultivada, quais os meios e solues utilizados e qual tcnico fez a manipulao. Isso
impede que, em caso de contaminao pontual, esta se espalhe para outras
culturas do laboratrio, alm permitir a investigao dos principais motivos da
contaminao, a fim de elimin-la.
3.6.1. Contaminao bacteriana
As bactrias so organismos procariontes com capacidade de proliferao muito rpida e que, na maioria das vezes, conseguem crescer em qualquer
condio. Elas esto presentes no ar, nas superfcies, no trato digestivo humano etc.
Uma contaminao bacteriana na cultura inviabiliza a sua utilizao, visto

que elas competem pelos nutrientes do meio fazendo com que as clulas
morram pela falta de alimento. Alm disso, metabolizam o meio de forma a
torn-lo excessivamente cido para determinadas linhagens.
As bactrias, por crescerem muito mais rpido que as clulas animais em
cultura, especialmente em meios muito ricos, como os de cultivo de clulas
animais, tm sua visualizao ao microscpio tico facilitada, e a contaminao
facilmente detectada. Para isso, necessrio que o cultivo ocorra em meio
livre de antibiticos, para no haver mascaramento do crescimento da contaminao em cultura. A esterilidade deve ser garantida pela qualidade das solues e do material utilizado e pelo bom treinamento dos tcnicos.
3.6.2. Contaminao por micoplasma
Micoplasmas so contaminantes comuns de culturas de clulas, microorganismos procariotos desprovidos de parede celular que possuem uma membrana lipdica em bicamadas, imperceptveis na visualizao por microscpio
tico invertido.
De difcil localizao por se aderir membrana da clula, o micoplasma
prejudicial, pois retira do meio os nutrientes necessrios, em particular a
arginina. O metabolismo dos micoplasmas , em parte, dependente do
metabolismo celular.
Para detectar micoplasmas, pode-se utilizar o teste de colorao fluorescente Hoescht 33258, que cora DNA. Assim, ao observarmos uma cultura
contaminada em microscopia de fluorescncia possvel visualizar o ncleo da
clula e o seu contorno, que formado pelo material gentico dos micoplasmas
aderidos membrana.
Contaminar uma cultura com micoplasmas muito fcil, pois eles se
encontram na via respiratria humana; porm, a descontaminao envolve a
utilizao de antibiticos, como ciprofloxacin e kanamicina associada tetraciclina,

extremamente prejudiciais clula, e, havendo posterior febre, com o aumento da temperatura de 37 C para 41 C. Isso diminui o nmero de clulas
viveis, e o processo nem sempre um sucesso.
3.6.3. Contaminao por leveduras
Leveduras so fungos unicelulares muito comuns em cultura. Caracterizam-se por serem menores do que as clulas animais. Multiplicam-se principalmente por brotamento, formando na cultura estruturas caractersticas na forma
de esferas menores anexadas a esferas maiores.
4. Meios de cultura e solues utilizadas em cultivos
celulares
Os meios nutritivos (meios de cultura ou de cultivo) utilizados para a

cultura de clulas, tecidos e rgos fornecem as substncias essenciais para o
crescimento e controlam o crescimento in vitro.
As mesmas vias metablicas e bioqumicas bsicas no organismo so
consideradas nas clulas cultivadas. Complementando as substncias
biossintetizadas pelas clulas, vrios compostos orgnicos so adicionados ao
meio para suprir as necessidades metablicas, energticas e estruturais especficas das clulas. Sendo assim, os meios de cultura devem apresentar em sua
formulao sais minerais, hidratos de carbono, aminocidos, vitaminas, protenas, peptdeos, lipdeos e cidos graxos (ver Tabela 1). Costuma-se adicionar
tambm soros, tampes, antibiticos e indicadores de pH.
Os meios de cultivo foram estabelecidos a partir de 1950, com vrias
formulaes de meios que proporcionassem o crescimento celular in vitro. Os
meios de cultura, tais como o meio 199 de Morgan e colaboradores de
1950, o meio CMRL, de Parker e colaboradores de 1957, e os meios
basais de Eagle de 1955 e 1959, so utilizados hoje.
Foram elaborados, tambm a partir de 1950, alguns meios de cultura

mais complexos, com o intuito de eliminar a utilizao de fluidos animais, como
o meio NCTC 109, desenvolvido por Evans e colaboradores a partir 1956.
Esses meios livres de soro devem fornecer todos os fatores que as clulas em
cultura necessitam, tais como: metais trao, vrios suplementos e fatores de
crescimento, insulina, transferrina, hormnios, dentre outros. A exigncia desses fatores e a complexidade do meio variam de acordo com o tipo celular a
que se destina e, por ser altamente especfico, em muitos casos precisa ser
adaptado para cada tipo celular. Devido sua complexidade, esses meios so
muito dispendiosos, e utilizados apenas para fins especficos.
Tabela 1. Tabela de componentes bsicos de um meio tpico.
aminocidos vitaminas
Arginina
Cistina
Glutamina
Histidina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina
Fenilalanina
Treonina
Triptofano
Tirosina
Valina
Biotina
Colina
Folato
Nicotinamida
Pantotenato
Piridoxal
Tiamina
Riboflavina
sais
NaCl
outros
Glicose
Penicilina
KCl
Estreptomicina
Vermelho de
NaH2PO4 fenol
Soro
NaHCO3
CaCl2
MgCl2
protenas (necessrias
em meios sem soro
quimicamente definidos)
Insulina
Transferrina
Factores
especficos de
crescimento
Para escolher o meio de cultivo adequado ao de uma determinada

linhagem, consulta-se primeiro a literatura e as referncias de bancos oficiais.
No sistema de cultivo de clulas, importante o controle do pH timo
(7,0-7,6), utilizando para isso tampo e o suplemento do meio de cultivo
que resiste s variaes do pH, principalmente na fase lag do crescimento
celular. Na fase lag do crescimento celular, ou em baixa densidade celular, a
tenso de CO2 deve ser mantida para controle do pH e, por isso, as culturas
so mantidas em atmosfera de 5-10% de CO2.
Para compensar a diminuio do pH gerado pelos metablitos do consumo da glicose, h a suplementao do meio com bicarbonato de sdio e
manuteno do nvel de CO2. O CO2 dissolvido em equilbrio com ons
bicarbonato gera um sistema de tamponamento no meio, como mostra a equao abaixo:
H2O + CO2 + NaHCO3
H+ + Na+ + 2HCO3-
O composto HEPES (N-(2-hidroxietil) piperazina-N-(2-cido

etanosulfnico) e outros tampes orgnicos podem ser utilizados em culturas
em que o tampo bicarbonato no adequado. A sensibilidade da cultura
pelo tampo varia, podendo at ser txica para as clulas. Portanto, deve-se
ser criterioso na escolha do melhor tampo e da sua concentrao.
Antibiticos e fungicidas so utilizados nos meios nutritivos para controle da contaminao microbiolgica. Com essa finalidade, os compostos mais
utilizados so a gentamicina, a estreptomicina, a penicilina e a anfotericina.
importante rotular, imediatamente, qualquer reagente ou soluo preparada com etiquetas com as seguintes informaes: nome da soluo preparada, lote, data do preparo, prazo de validade, nome dos tcnicos responsveis
e temperatura de estocagem. A temperatura adequada para os meios de
cultura de +4-8 C.
4.1. Controle da qualidade da gua e reagentes
A gua o componente predominante na preparao dos meios e

solues, mas uma fonte potencial de impurezas que podem afetar o crescimento de culturas in vitro. Para evitar contaminao por compostos orgnicos
volteis, que permanecem aps a destilao e que inibem o crescimento das
culturas, deve-se utilizar gua classificada como ultrapura, que consiste num
sistema de purificao por filtrao com carvo ativo, colunas de troca inica e
filtros de acetato de celulose. Embora de custo elevado, a gua produzida
com alto grau de pureza. No entanto, a gua deionizada pode ser aplicada
para o preparo da maioria das solues.
Devem-se utilizar substncias testadas para culturas de clulas e com alto
grau de pureza. No rtulo, sempre que possvel, deve constar o nmero do
lote, o prazo de validade e as condies de estocagem. Deve-se utilizar
tripsina na diluio 1:250, obtida de pncreas suno e testada em cultura de
clulas. A L-glutamina um aminocido essencial e suplemento fundamental
dos meios de cultura. Como a L-glutamina degradada a 36,5 oC, ela deve
ser adicionada a meios de cultura suplementados a mais de 15 dias.
4.2. Soro fetal
Apesar da sua constituio qumica, os meios de cultivo so usualmente suplementados com 5% a 20% de soro, pois as clulas em cultura
tambm necessitam de fatores de crescimento, hormnios, protenas e
peptdeos, nucleosdeos, lipdeos e inibidores que podem ser supridos por
esse fluido animal.
Deve-se utilizar um soro fetal certificado, estril, inativado a 56 oC por
30 minutos, livre de micoplasmas e sem endotoxinas. Atualmente, os soros
esto disponveis comercialmente e os mais utilizados em cultivos celulares so
os soros de origem bovina, de cavalo e humano. O soro obtido do plasma,
sob condies asspticas e estreis, por puno cardaca ou venosa. A coleta,

a manipulao, o processamento e a estocagem so realizados visando-se
manter as propriedades e qualidades do soro. A escolha do soro depende de
requisitos de cada tipo celular, e um dos mais utilizados o soro fetal bovino.
No caso do soro fetal bovino, cada procedimento corresponde a uma partida,
ou lote diferente.
As variaes qualitativas e quantitativas dos componentes do soro podem interferir no crescimento das clulas em cultura. Dessa forma, a capacidade
de possibilitar o crescimento celular deve ser avaliada para cada lote de soro
adquirido. Cada lote deve ter um certificado com todos os dados dos testes
bioqumicos e microbiolgicos realizados, devendo ser testados para deteco
de bactrias, fungos, Mycoplasma e agentes virais.
4.3. Sistema de filtrao
Para substncias orgnicas que no resistem ao processo de esterilizao

por autoclave, convm dispor-se de dispositivo para filtrao por membranas.
Algumas substncias orgnicas so degradadas pelo calor, sendo lbeis
autoclavao, precisando ser esterilizadas com um filtro especial de acetato de
celulose com porosidade inferior a 0,22 mm. Uma reao que pode ocorrer
durante a autoclavao a caramelizao (reao entre acares e aminocidos)
e a hidrlise da sacarose. Essas reaes se intensificam com o aumento do
tempo da autoclavao.
Assim, utiliza-se o processo de filtrao, que consiste na passagem de
lquido por membrana filtrante com pequenos poros que impedem a passagem
de microrganismos. Filtros reutilizveis podem ser esterilizados por autoclavao,
sendo os descartveis tambm muito utilizados e, apesar de mais caros, o
processo mais rpido e mais seguro.
A maioria das solues estreis de uso em cultura de clulas preparada

por filtrao em membrana esterilizante de 0,22 m. Contudo, algumas solues podem ser esterilizadas por autoclavao a 121oC por 15 minutos.
Utilizam-se tambm membranas de 0,45 m, como pr-filtro para clarificar
solues menos lmpidas.
Em cmara de fluxo laminar, a filtragem realizada com um sistema para
filtrao sob presso com filtro de 0,22 mm em volumes maiores que 10 L;
para volumes entre 0,1 e 10 L esterilizam-se em sistema de filtrao a vcuo
com filtro de 0,22 mm e, para at 100 mL, sistema de filtrao por seringa
com filtro de 0,20 mm.
Aps a realizao da filtrao, fundamental testar o material filtrado
para verificar a eficincia do procedimento, por meio da realizao de teste de
esterilidade por inoculao direta do filtrado em meio de cultivo.
5. Aplicaes dos cultivos celulares
5.1. Produo de imunolgicos
Existem muitas aplicaes para a cultura de clulas. As primeiras aplicaes se relacionam com a produo de anticorpos monoclonais. Os anticorpos
monoclonais tm sua maior aplicao nos imunoensaios, como o ELISA. Alm
disso, esses anticorpos tambm so muito utilizados associados a marcadores
radioativos em imunocintilografia.
Os anticorpos monoclonais so produzidos em clulas denominadas
hibridomas, que resultam da fuso de clulas de mieloma murino com linfcitos
B produtores de um determinado anticorpo. As clulas do hibridoma so
imortais e produzem anticorpos, assim como a sua precursora.
Vrias protenas diferentes de anticorpos comercializadas so produzidas a partir de cultura de clulas. Eritropoietina humana, fator VIII para
hemofilia, dentre outras, so produzidas em clulas cultivadas, pois necessi-
tam de maquinrio complexo para a sua produo que no encontrado em

clulas procariontes.
Uma aplicao importante da cultura de clulas em imunobiolgicos se
relaciona com a produo de vacinas. Para crescimento viral, necessrio o seu
cultivo em clulas, pois os vrus se replicam em hospedeiros. A vacina de
sarampo produzida em culturas primrias de fibroblastos de embrio de
galinha, enquanto a vacina de poliomelite, fabricada na Frana, em clulas de
rim de macaco-verde africano (cercopithecus aethiops). Um dos grandes desafios da atualidade a produo de vacinas em clulas de linhagens transformadas sem afetar o indivduo que ir utiliz-las. Essas pesquisas esto em desenvolvimento e, em muitos casos, j esto sendo aplicadas. No Brasil, ainda no
existem vacinas fabricadas em clulas transformadas, mas a clula Vero alvo
de pesquisas de muitas instituies.
5.2. Virologia
Na virologia, a cultura de clulas muito utilizada para a obteno viral.

Como os vrus necessitam de hospedeiros, na cultura de clulas que
possvel cultiv-los.
A cultura de clulas permite o isolamento do vrus para avaliar o seu
efeito em determinados tipos celulares, alm de verificar quais clulas so
suscetveis a determinados vrus.
5.3. Terapia celular
O termo terapia celular identifica uma tcnica com o objetivo de restabelecer a funo ou a estrutura de um tecido por meio da utilizao de clulas,
e vem sendo utilizada no caso de traumas, doenas degenerativas ou agresses
aos tecidos do corpo.
Para a terapia celular, necessrio ressaltar a importncia do conhecimento da clula em seu ambiente original, pois informaes sobre a estrutura do
microambiente celular so necessrias para a reproduo desses elementos

em cultura.
Na bioengenharia, a estrutura tecidual reproduzida o mais fiel possvel
quela do tecido original, tanto em contedo de material presente quanto
como ao comportamento das clulas presentes. Dessa forma, seria possvel a
substituio dos tecidos danificados por novos tecidos formados em cultura,
substituindo-se aquele que sofreu algum dano em determinado momento da
vida do indivduo. Uma aplicabilidade da bioengenharia obteno de clulas
do prprio paciente para o cultivo e formao de tecido. Esse tecido
cultivado em laboratrio, acrescido de fatores e do microambiente necessrio
diferenciao e formao tridimensional da clula, mimetizando o tecido
original que, aps um determinado perodo, reimplantado no paciente,
substituindo o tecido lesado.
Outro avano na terapia celular o uso de clulas-tronco no tratamento
de doenas degenerativas. Clulas-tronco possuem alta capacidade de diferenciao e de proliferao sendo possvel formar a partir delas clulas diferenciadas que exeram funes especficas.
As clulas-tronco podem ser de origem embrionria (clulas-tronco
embrionrias) ou de tecidos adultos (clulas-tronco adultas). As clulastronco embrionrias tm alta capacidade de replicao e de diferenciao; no
embrio todo o organismo complexo ser formado a partir destas clulas. As
clulas-tronco adultas so clulas de proliferao modulada, quiescentes,
que se mobilizam para estabelecer a reposio de clulas que morreram ou
que se ativam e proliferam intensamente no momento necessrio regenerao de um tecido danificado.
Para saber mais:
MORAES, A. M.; AUGUSTO, E. F. P.; CASTILHO, L. R. Tecnologia do cultivo de
clulas animais: de biofrmacos terapia gnica. So Paulo: Rocca, 2007. 503 p.
| 253
MANUTENO de linhagens de clulas animais. In: FUNDAO OSWALDO

CRUZ. Manual da qualidade. Rio de Janeiro: INCQS/Fiocruz, 2008.
PERES, C. M.; CURI, R. Como cultivar clulas. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,
2005. 283 p.
FRESHNEY, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 4. ed. Nova
York: Wiley-Liss, 1994. 397 p.
VREMEULEN, K. The Cell Cycle: A Review of Regulation, Deregulation and Therapeutic
Targents in Cancer. Cell Proliferation, n. 36, p. 131-149, 2003.

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crolgio de cientista famoso. Cito textual: Joaquim Venncio conseguiu,

em Laboratrios de Sade, reunindo professores de vrias unidades da

Pesquisador Emrito da Fundao Oswaldo Cruz

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As alteraes pelas quais passa o mundo com a globalizao trazem

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sou a divulgar conhecimentos, elaborando cursos, metodologias e tecnologias

Um Sonho Quase Realizado | 17

O pontap inicial deste sonho s foi possvel pelo incondicional apoio

18 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Citologia, ou biologia celular, a cincia que estuda os vrios sistemas

20 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

1838, o botnico alemo Matthias Schleiden descreveu que a clula era a

A divergncia entre procariontes e eucariontes deve ter ocorrido aps

Biologia Celular e Ultraestrutura

ou seja, uma diviso de funes metablicas entre as organelas citoplasmticas

2.1. Membrana celular

A membrana plasmtica ou celular atua na manuteno de microambientes,

22 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

definindo os meios intra e extracelulares. Alm desta funo, a membrana

Biologia Celular e Ultraestrutura | 23

Os carboidratos presentes nesta estrutura, como, por exemplo, glicose,

24 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

A comunicao e a coeso entre as clulas so estabelecidas por meio

Biologia Celular e Ultraestrutura

O citoplasma, ou citossol das clulas eucariotas, formado por uma

Estrutura extremamente importante para as clulas eucariticas, pois

26 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Eles tm nmero e densidade bastante variveis, dependendo do tipo celular e

Biologia Celular e Ultraestrutura | 27

Figura 3. (A) Moncitos mostrando o ncleo ocupando grande extenso do

2.4. Retculo endoplasmtico

O retculo endoplasmtico (RE) encontrado na maioria das clulas,

28 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

localizada em vrios pontos da clula ou concentrada em determinadas reas

2.5. Complexo de Golgi

O complexo de Golgi, aparelho de Golgi ou simplesmente Golgi

Biologia Celular e Ultraestrutura | 29

dos de cisternas (cerca de 4 a 8 cisternas). As cisternas voltadas para o

30 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Os lisossomos so estruturas geralmente esfricas, delimitados por uma

As mitocndrias (Figura 6) esto presentes no citoplasma das clulas

Biologia Celular e Ultraestrutura | 31

conter de 1.000 a 1.600 mitocndrias, enquanto alguns ovcitos podem

32 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Os peroxissomos (Figura 7) so organelas envolvidas por apenas

Incluses lipdicas (tambm chamadas de corpos lipdicos, gotas lipidcas

Biologia Celular e Ultraestrutura | 33

subcelular de fraes enriquecidas de corpos lipdicos, combinado com

O glicognio (Figura 8) um polissacardeo constitudo por subunidades