MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

UNIDAD V
RECUPERACIN DE PRODUCTOS
5.1 UNIDADES DE OPERACIN EN LA RECUPERACIN DE PRODUCTOS
Depende del producto a recuperar, ya que si se trata de una protena de origen celular, solo se
sedimenta la biomasa y se decanta. Sin embargo la mayora, de los productos son de origen
intracelular (vitaminas, enzimas, cidos nucleicos, etc.). Por lo tanto existen varios mtodos, que
incluyen a la floculacin, flotacin, filtracin o centrifugacin, las ltimas etapas del proceso
implican precipitacin, cristalizacin y/o decantacin. (8)

La recuperacin y purificacin de un producto es uno de los aspectos ms importantes de un

proceso de fermentacin. Una etapa de la recuperacin cambia o la pureza o la concentracin de un
metabolito. Un proceso ideal debe optimizar ambos parmetros. En resumidas cuentas la
recuperacin de productos consiste en la separacin de la biomasa celular, y los ingredientes
insolubles. (8)
Productos finales
a) Microorganismos:
Produccin de biomasa
b) Metabolitos intracelulares

cidos nucleicos
Vitaminas
Enzimas
Antibiticos

c) Metabolitos extracelulares
Aminocidos
Alcohol
antibiticos
Las etapas de purificacin dependen de (8):

Concentracin.
Productos laterales presentes.
La naturaleza del producto.
Estabilidad del material biolgico.
Grado de purificacin necesario.

Una etapa de recuperacin cambia por (8):

La pureza de un metabolito.
La concentracin de un metabolito.
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Mtodos

Floculacin
Flotacin
Filtracin
Centrifugacin

NOTA: Si va a ser aislado un metabolito intracelular, debe ser liberado antes de las clulas.

Ejemplo de metabolitos extracelulares: aminocidos, cido ctrico, alcohol algunas enzimas

(aminasas y proteasas).

Una vez que el metabolito se ha separado de las clulas, la seleccin de etapas adicionales de
purificacin depender del producto deseado. (8)
Las ultimas etapas implican (8):
Precipitacin.
Cristalizacin.
Desecacin.
MTODOS DE:
5.1.1 FLOCULACIN Y FLOTACIN
Las clulas aisladas en el rango de 10 micras sedimentan solo muy lentamente y son difciles de
precipitar incluso con la centrfuga. En algunos casos puede utilizarse la floculacin para producir
grandes agregados que sedimentan mucho ms rpidamente. En la mayor parte de los casos se
aade un agente floculante, como una sal inorgnica, un polielectrlito orgnico o un hidrocoloide
mineral. Dependiendo del agente utilizado el proceso de floculacin puede ser reversible o
irreversible. El proceso de floculacin esta tambin influido por la naturaleza de las clulas y los
constituyentes inicos y por su concentracin. (8)
El proceso inverso a la floculacin es la flotacin que es ms fcil de conseguir induciendo gas en
el lquido. Las clulas se adsorben a las burbujas de gas y suben a la capa de espuma en la parte
superior del recipiente donde pueden ser recogidas y sacadas del biorreactor. (8)

Producir grandes agregados que sedimentan mucho ms rpidamente.

Agregar agente floculante (sal inorgnica).

Depende si el proceso ser reversible o irreversible. (8)

Influido por:

La naturaleza de las clulas.

Los constituyentes inicos.
Concentracin.
UNIDAD V RECUPERACIN DE PRODUCTOS 124

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5.1.2 SISTEMA DE FILTROS
Lo ms frecuente es que en la primera etapa del proceso de recuperacin, la separacin de la
biomasa y el filtrado del cultivo, se lleve a cabo por algn tipo de proceso de filtracin; los dos
principales tipos de filtros son los filtros profundos (Fig.114) y filtros absolutos (Fig.115). (8)
Fig. 113 Mecanismo por medio del cual se lleva a cabo la filtracin.

Fig. 114 Filtro profundo.

Los filtros profundos

estn constituidos por
una
matriz
filamentosa,
como
asbesto, lana de vidrio
o papel de filtro,
llevndose a cabo el
proceso de filtracin
debido a que las
partculas que han de
ser removidas quedan
atrapadas dentro de la matriz. Las partculas que van a ser filtradas frecuentemente son ms
pequeas que los poros del filtro, pero a pesar de ello son separadas a medida que pasan a travs de
los intersticios del filtro. (8)
Los filtros absolutos son membranas con tamao de poros ms pequeos que las partculas que van
a ser filtradas, las partculas por lo tanto, son separadas sobre las superficies de los filtros. (8)
Fig. 115 Filtros absolutos

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La eficiencia depende del tamao de los microorganismos, morfologa, pH, viscosidad,
temperatura, presencia de capas mucosas y presencia de otros microorganismos como posibles
contaminantes. (8)
Para mantener la eficiencia en la filtracin se utiliza una cuchilla automtica para raspar
continuamente la biomasa del filtro. (8)
Existen dos procesos de filtracin por membrana: estticos y contra corriente. El filtro contra
corriente se desarroll para evitar las obstrucciones, ya que el filtrado pasa a travs de la membrana
y la biomasa se separa del filtro y se transfiere con un material que se retiene. (8)
Los tipos de procesos de filtracin son:

smosis inversa (tamao de partcula 0.0001 0.001 micras) (Fig.116). (8)

Fig.116 Proceso de osmosis inversa.

La smosis inversa ha sido empleada en agua de mar para des salinizarla. El agua cruza una
membrana semipermeable, si la concentracin de solutos osmticamente activos, tales como sal, es
ms alta en el lado opuesto de la membrana. Sin embargo, si la presin se aplica al lado de la
smosis inversa entonces ocurrir, y el agua ser conducida a travs de la membrana del lado de la
sal. (8)

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Fig. 117 Diferentes ejemplos de equipos para realizar smosis inversa.

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Ultra filtracin (tamao de partcula 0.001 0.1 micras) (8)

Fig. 118 Sistema de ultrafiltracin.

Fig. 119

Sistema de ultrafiltracin.

La ultra filtracin es similar a la microfiltracin solo que en esta las membranas tienen tamaos ms
pequeos del poro, y se utiliza para fraccionar soluciones segn su peso molecular. La ultrafiltracin
es tambin eficaz en quitar los pirgenos (lipopolisacridos bacterianos de la pared de la clula),
desechos celulares, virus de medios, y para el proceso del suero. Otra variacin en el sistema de la
ultra filtracin es la diafiltracin, donde el agua o el otro lquido se filtra para quitar contaminantes
indeseados de bajo peso molecular. Esto se puede utilizar como alternativa a la filtracin o a la
dilisis de gel para quitar el sulfato de amonio de una preparacin de la protena precipitada por esta
sal, para cambiar un almacenador intermediario o en la purificacin del agua. (8)

Microfiltracin (tamao de partcula 0.1 10 micras) (8)

Fig. 120 Equipo utilizado en microfiltracin.

Fig. 121 Equipo utilizado en microfiltracin.

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La microfiltracin es relativamente costosa debido al elevado costo de las membranas, pero tiene
varias ventajas comparadas con la centrifugacin. Incluyen la operacin reservada, necesidades
energticas ms bajas, el producto puede ser lavado fcilmente, control de la temperatura, la
contencin se alcanza fcilmente. Por lo tanto, es conveniente para manejar patgenos y
microorganismos recombinados. (8)
Nota: la ultra filtracin y la smosis dependen del peso molecular de las substancias separadas. (8)
Es influenciada por:

El tamao del microorganismo.

Morfologa.
pH.
Viscosidad.
Presencia de mucosa.
Temperatura.
Presencia de otros organismos.

Los problemas que debemos de considerar son: tamao de poro, selectividad de partcula, velocidad
de flujo, facilidad de limpieza y reutilizacin, rea de superficie de la membrana, volumen muerto
dentro del filtro, la posibilidad de esterilizar el sistema y por ultimo los costos. (8)
Filtracin
La filtracin convencional de los lquidos que contienen los slidos suspendidos implica los filtros
de profundidad integrados por las lanas de los medios (pao, de cristal o la celulosa porosas) que
conservan los slidos y permiten que el lquido filtrado pase a travs. Los slidos se acumulan sobre
el medio del filtro, la resistencia a la filtracin aumenta y atraviesa los poros del filtro. (8)
Estas tcnicas son generalmente tiles para cosechar hongos filamentosos, pero son menos eficaces
para recoger bacterias. (8)
Los dos tipos principales de filtracin convencional usados comnmente en la industria son:
Filtros de la placa y del marco o prensas de filtro
Estn normalmente en la forma de un apilado horizontal que alterna las placas porosas y los marcos
huecos. El apilado se monta en una estructura que se liga con un espoln hidrulico o un tornillo.
Las telas filtrantes se sostienen en el lugar entre las placas que contienen los canales del flujo de
alimentacin y las corrientes empapadas. Esto esencialmente forma una serie de compartimientos
alineados en los cuales la suspensin de la clula sea forzada bajo presin. (8)
En la siguiente etapa se debe desmontar, para quitar el producto de filtracin recogido. Estos
sistemas se utilizan para cosechar microorganismos de fermentaciones, incluyendo la preparacin de
bloques de levadura de panadera, en la recuperacin de los precipitados de protena y de la
desecacin del lodo de aguas residuales. (8)
Los filtros de vaco rotatorios son los sistemas continuos simples del tratamiento de aguas, el
dispositivo abarca un tambor perforado hueco que se apoya en medio el filtro. Este tambor rota
UNIDAD V RECUPERACIN DE PRODUCTOS 129

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lentamente en un tanque continuamente agitado que contiene la suspensin que se filtrar. Los
slidos se acumulan en el medio del filtro mientras que el lquido filtrado se traslada, bajo vaco, con
el medio del filtro dentro del tambor hueco a un recipiente de recepcin, mientras que el tambor rota,
los slidos recogidos sostenidos en el medio del filtro son quitados por un cuchillo. (8)
Filtracin de membrana
Los mtodos modernos de filtracin emplean los filtros absolutos. stos consisten en las membranas
apoyadas con los tamaos especificados del poro que se pueden dividir en tres categoras
principales. Estn, en el orden que disminuyen las membranas del tamao, de la microfiltracin, de
la ultrafiltracin y de la smosis inversa del poro. La suspensin que se filtrar se bombea a travs
de la membrana, esto retarda ensuciar la membrana por los materiales de las partculas. Las
partculas que su tamao es menor que el de la membrana pasarn a travs de la membrana, mientras
que el resto se conserva. Mientras que progresa la filtracin, el flujo a travs de la membrana se
puede retardar debido a que se ensucia la membrana. Esto puede ser causado por la acumulacin de
una capa de molculas del soluto en la superficie de la membrana. La presencia de los
antiespumantes del silicio puede tener un efecto negativo similar. (8)
Mtodo contracorriente
Se emplea principalmente para reducir la tendencia a las obstrucciones. La solucin se bombea en
contracorriente a travs de la membrana y la biomasa se separa del filtro y se transfiere con el
material que se tiene. (8)
Ventajas:
Se obtiene un aumento de la velocidad de filtracin de 100 veces en comparacin
con la filtracin esttica.
Sedimentacin
La sedimentacin se utiliza extensivamente para la separacin primaria de la levadura en la
produccin de bebidas alcohlicas, y en el tratamiento de aguas residuales. Esta tecnologa barata es
relativamente lenta y es conveniente solamente para los flculos grandes. El ndice de la
sedimentacin de la partcula es una funcin del tamao y densidad. (8)
5.1.3 CENTRIFUGACIN
Si en vez simplemente de usar la fuerza gravitacional para separar partculas suspendidas, se aplica
un campo centrfugo, el ndice de la separacin del slido-lquido se aumenta perceptiblemente y
partculas mucho ms pequeas pueden ser separadas. La centrifugacin se puede utilizar para
separar las partculas tan pequeas como dimetro de 0.1 micras y es tambin conveniente para
algunas separaciones del lquido-lquido. Su eficacia, depende tambin del tamao de partcula,
diferencia de la densidad entre las clulas y el medio, y la viscosidad media. La opcin de la
centrifugadora depende del tamao y de la densidad de partcula, y de la viscosidad del medio. Las
centrifugadoras de alta-velocidad se requieren para la separacin de microorganismos ms pequeos,
tales como bacterias, comparadas con levaduras. La centrifugacin relativamente lenta recupera con
eficacia las clulas residuales de la levadura restantes en cerveza despus de que el bulto halla
sedimentado hacia fuera. (8)
Se utiliza para separar slidos-lquidos, fluido-fluido y fluido-partcula. En el caso de fluidopartcula se debe de considerar la pureza necesaria del fluido y la concentracin; en el caso de
UNIDAD V RECUPERACIN DE PRODUCTOS 130

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fluido - fluido se debe de considerar la pureza del lquido deseado y la recuperacin que se requiera
de la fase ms ligera ms pesada. (8)
Las ventajas de la centrifugacin incluyen la disponibilidad de los sistemas completamente
continuos que pueden procesar rpidamente volmenes grandes en centrifugadoras pequeas del
volumen. Las centrifugadoras pueden ser esterilizadas por vapor, permitiendo el proceso asptico, y
no hay costos de los materiales consumibles para las membranas, los productos qumicos o las
ayudas del filtro. Sin embargo, las desventajas de la centrifugacin son los altos costos de capital
inicial, el ruido generado durante la operacin y el costo de electricidad, tambin, la ruptura fsica de
clulas puede ocurrir debido al alto esquileo y la temperatura puede no ser del todo controlable
pudiendo afectar productos termo-sensibles. La generacin de bioaerosol es otra desventaja
importante, particularmente cuando las centrifugadoras se utilizan para ciertos organismos o
patgenos recombinados del ADN. (8)
Se emplean dos tipos de centrfuga:

Con filtro o tamiz: la separacin se produce a medida que las partculas son reforzadas
contra la pared filtrante. (8)

De deflectores: la separacin se debe a la diferencia de densidades entre las partculas y el

lquido. (8)

Factores a considerar:
1.
2.
3.
4.

Pureza necesaria de la fase fluida.

La recuperacin que se necesite de la fase fluida.
La recuperacin que se necesite de la fase particulada.
El contenido de la humedad de la partcula.

Fig. 122 Detalles de

la construccin de un
decantador(1-corriente
que fluye hacia el
interior,2-eliminacin
de partculas,3-zona de
bajo contenido en
agua,4-sedimentacin
de partculas,5-espiral
del decantador,6-nivel
de
fluido,7-efluente
lquido claro,8-eje de
direccin.)

UNIDAD V RECUPERACIN DE PRODUCTOS 131

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Centrifugadoras industriales
Las centrifugadoras se pueden dividir en unidades en reducida escala del laboratorio y
centrifugadoras ms grandes del piloto y a nivel industrial. Las centrifugadoras de escala del
laboratorio incluyen, en la orden ascendente de la velocidad alcanzable: banco-tapa, alta velocidad y
ultracentrifugadoras, capaces de aplicar RCFs de 5,000500,000 g. Las centrifugadoras
semicontinuas y continuas se requieren para procesar grandes volmenes implicados. Sin embargo,
los RCFs alcanzados son relativamente bajos. (8)

Cuatro tipos principales de centrfugas industriales se utilizan:

1. Las centrifugadoras tubulares que producen generalmente la fuerza centrfuga ms alta de
13,000-17,000 g. Tienen tazones de fuente tubulares huecos del rotor que proporcionan una
trayectoria larga de flujo para la suspensin, que se bombea dentro en el fondo y fluye para
arriba a travs del rotor. El material de partculas se lanza al lado del tazn de fuente, y los
lquidos clarificados hacia fuera en la tapa para la coleccin continua. Mientras que el
material de partculas se acumula en el interior del tazn de fuente, el dimetro de
funcionamiento se reduce. Por lo tanto, debe haber retiro peridico de slidos. (40)
2. Las centrifugadoras del tazn de fuente consisten en un tazn de fuente que esta montado
verticalmente y se interconecta a los cilindros y es capaz del funcionamiento en 5,000-10,000
g. La alimentacin pasa del centro a travs de cada compartimiento alternadamente, y las
partculas ms pequeas son recogidas en los compartimientos externos. (40)
3. Las centrifugadoras de apilado de disco pueden funcionar en 5,000-13,000 g. El tazn de
fuente de la centrifugadora contiene un apilado de discos cnicos. Mientras que el lquido
entra, el material de partculas de la centrifugadora se lanza hacia fuera, afectando a la
superficie inferior de los discos del cono. Las partculas entonces viajan hacia fuera a la
pared del tazn de fuente donde acumulan. Estas centrifugadoras tienen generalmente la
facilidad para descargar el material recogido peridicamente durante la operacin. (40)
4. Las centrifugadoras de Tornillo-jarra funcionan continuamente en 1,500-5,000 g y son
convenientes para desecar los materiales slidos gruesos en altas concentraciones. Se utilizan
en los sistemas de aguas residuales para la separacin del lodo, y para cosechar levaduras y
hongos. (40)
5.1.4 DESINTEGRACIN DE LOS MICROORGANISMOS
En ocasiones la recuperacin requiere que los microorganismos sean fragmentados por
procedimientos qumicos, fsicos biolgicos. La seleccin del mtodo depende principalmente de
la naturaleza de las clulas, es importante al seleccionar el mtodo de desintegracin que la
biomolcula de inters no sea destruida. (8)

La seleccin de un mtodo va a depender principalmente de la naturaleza de las clulas. (8)

Aunque las membranas celulares no ofrecen especial resistencia a la ruptura, las paredes
celulares varan ampliamente en lo rpidamente que puedan ser rotas. (8)
UNIDAD V RECUPERACIN DE PRODUCTOS 132

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Cuando se seleccione un mtodo de desintegracin, es importante que la biomolcula diana

no se destruya. (8)

Los mtodos de desintegracin de microorganismos son:

Autlisis: para clulas de levadura, con adicin de cloruro sdico, acetato de etilo
Cloroformo. (8)

Plasmlisis: con una adicin de cloruro sdico. (8)

Ultrasonidos: no empleada industrialmente por su alto costo. (8)

Molinos de bolas: realizan la ruptura mediante la accin de bolas de vidrio. (8)

Homogenizadores: el material se coloca bajo fuerte presin hidrosttica que se libera

bruscamente permitiendo que el lquido salga por una vlvula. (8)

Mtodos fsicos (8):

1. Descongelacin

2. Medio lquido:
Ultrasonidos.
Molinos Dino
y
Coloidal
(Fig.123).
Prensas
de
French
y
Manton.

Fig. 123 Molino coloidal.

UNIDAD V RECUPERACIN DE PRODUCTOS 133

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3.Medio slido:
Molino coloidal.
Molino de bolas (Fig.124).
Prensa de
Hughes.

Fig. 124 Molino de bolas,

vista interior

Mtodos qumicos (8):

Liofilizacin.
Cambio en la presin osmtica.
Detergentes.
Tratamiento con cidos.
Extraccin con acetona/tolueno.

Mtodos biolgicos:

Enzimas que digieren la pared celular.

Fagos.
Agentes que inhiben la pared celular.

UNIDAD V RECUPERACIN DE PRODUCTOS 134

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Fig.125
5.1.5 CROMATOGRAFA
Esta es una de las etapas ms caras de recuperacin, se lleva a cabo principalmente en materiales
farmacuticos, reactivos de diagnstico y para investigacin. En muchos casos deben utilizarse
varios mtodos cromatogrficos, uno despus de otro. (8)
La separacin se produce en una columna (fase estacionaria, generalmente una resina) se utiliza
para adsorber el producto que luego es eluido en una fase mvil (lquida), este lquido puede tener
una densidad nica o utilizarse con un cambio gradual de densidad (gradiente de densidad). Por
medio de un detector se detectan las fracciones fluidas que contienen el producto deseado,
utilizando luz visible o UV. (8)
Segn su mecanismo de separacin se clasifican en:
Filtracin en gel (peso molecular):
las molculas de diferentes tamaos pueden ser separados mediante el paso a travs de geles con
diferente tamao de poro. En el caso de molculas grandes, no penetran el gel; y en el de
molculas pequeas, penetran ms o menos profundamente en el gel y su movilidad por lo tanto
resulta retardada. A escala industrial, se utiliza principalmente para separar las sales e impurezas
de bajo peso molecular. A escala ms pequea, se utiliza para fraccionar y purificar molculas de
protena por ejemplo insulina o interfern. (8)
Cromatografa de adsorcin (interacciones hidrofbicas):
La separacin supone interacciones hidroflicas o hidrofbicas (fuerzas de Van der Waals) entre el
portador y el material biolgico. La elucin y el fraccionamiento se consiguen mediante soluciones
de mayor o menor polaridad o fuerza inica. (8)
UNIDAD V RECUPERACIN DE PRODUCTOS 135

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Materiales de adsorcin (8):

Silicatos.
Albmina.
Carbn activado.
Dextranos entrecruzados.
Hidroxiapalita.

Cromatografa de intercambio inico (carga):

La separacin se realiza para macromolculas con grupos inicos, la macromolcula se adsorbe al
portador y se eluye mediante una solucin de fuerza inica definida. Se usa principalmente en
purificacin de antibiticos a partir de caldos de fermentacin, en la purificacin a gran escala de
protenas. (8)
Cromatografa de afinidad (actividad biolgica):
El material deseado se une especfica y reversiblemente a un ligando que ha sido fijado a un
portador inerte. Por ejemplo, un nucletido de adenina puede ser purificado permitiendo que se una
a un portador que contiene una deshidrogenasa. (8)
Isoelectroenfoque (punto isoelctrico):
Pueden ser purificadas las protenas utilizando gradientes de pH en asociacin con intercambio
inico en geles. Se produce un gradiente lineal de pH y las protenas se separan de acuerdo con su
punto isoelctrico. Solo pueden manejarse volmenes pequeos.(8)
Mtodos de purificacin para cromatografa
5.1.6 EXTRACCIN
Extraccin con solventes(8)

Se establece un sistema de dos fases usando un solvente inmiscible en el caldo acuoso de

fermentacin.

Idealmente el producto deber ser transferido cuantitativamente a la fase solvente.

Una vez que se encuentra el producto deseado en la fase solvente puede ser adicionalmente
purificado.

Este mtodo es ampliamente utilizado en la industria de los antibiticos.

Para la purificacin de enzimas en estado activo no pueden utilizarse solventes orgnicos;

deben utilizarse sistemas acuosos de dos fases.

Las clulas permanecen en una de las fases y la enzima es transferida a la otra fase sin
prdida de la actividad.

Una variante de este mtodo es la extraccin con soluciones supercrticas.

UNIDAD V RECUPERACIN DE PRODUCTOS 136

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En la extraccin de antibiticos como la penicilina, se utiliza el caldo de amilo o butilo. En la
purificacin de enzimas en estado activo, se utilizan soluciones de sales con polmeros
hidroflicos, donde el polmero separa por coeficiente de densidad y afinidad la enzima de los
restos celulares en un mismo medio acuoso. (8)

5.1.7 CRISTALIZACIN Y PRECIPITACIN

Una vez extrado el metabolito puede concentrarse y/o purificarse, por cristalizacin, evaporacin o
por transferencia a baja temperatura. (8)

Una vez extrado un metabolito puede ser adicionalmente concentrado y purificado por
cristalizacin, por evaporacin o transferencia a baja temperatura. (8)

La cristalizacin a baja temperatura es una forma muy suave de purificacin. (8)

En caso de purificacin se aade a

veces un agente qumico para facilitar
la reaccin de concentracin. (8)

Desecacin

Para materiales biolgicos es esencial

secar el producto final con la finalidad
de que su actividad no se pierda. (8)

La desecacin implica: Transferencia

de calor al producto hmedo y el
desprendimiento de la humedad con
una corriente de gas. (8)
Fig. 126 Cmara de desecacin.

Los mecanismos para la transferencia de calor pueden ser por:

Directo.

Conveccin.

Radiacin.

Aparatos utilizados para la desecacin:

1. Secadores de conveccin: pulverizacin, rotatorios y de bandas.
2. Secadores por contacto: capa fina o de cmara.
UNIDAD V RECUPERACIN DE PRODUCTOS 137

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5.2 RENDIMIENTO

Las prdidas en la recuperacin dependen de la sensibilidad de las substancias al proceso y

del nmero de etapas de purificacin. El rendimiento final es solamente un factor, ya que el
costo de los productos qumicos, el equipo y los salarios deben ser considerados en el
clculo global. (8)

La fraccin total atribuida a la purificacin esta en un promedio de alrededor del 20% pero
en casos extremos, con cierto tipo de metabolitos intracelulares puede ser tanto como el
90%.(8)

Para obtener un mejor rendimiento pueden ser combinados y optimizados los procesos de
separacin El rendimiento final es solamente un factor, ya que el costo de los productos
qumicos, el equipo y los salarios deben ser tambin considerados en el clculo global. (8)

UNIDAD V RECUPERACIN DE PRODUCTOS 138