Principios de instrumentacin.

Metodologas

nboratorio en el diagnstico clnico.

6n;2005.
re

instrumentales en el laboratorio clnico, Seleccin,

L Bioqumica Clnica. Barcanova,.

evaluacin y compamcin de mtodos

l-Davidsohn. Diagirstico y tratarspor el laboratorio. Salvaf 19gg.

Ilo C, Guerrero Gmez C. procedicrobiologa Cl"nica. Recogid4 tansracin de las muestras. SEMC;2003.
rla A, Garca SnchezJE, Gmez-Lus
Rodguez Lpez I, Toeblanca Gil
rtos en Microbiologa Clnica. Recote y conservacin de las muestras.

l.INTRODUCCIN
Hoy en da, el laboratorio dnico dispone de
una amplia variedad de tcnicas instrumentales
que utilizan distintos mtodos para la medicin
de una gran variedad de analitos.
El obietivo de este tema es explicar, de forma
breve, los principios fisicos y quimicos de los mtodos analticos.
2. PRINCIPIOS DE INSTRUMENTACIN
2.1. Tcnicas espectrales

Espectrofotometra de absorcin
La absorcin espectrofotomtrica en las regiones visible y ultravioleta del espectro electromagntico es un mtodo cuantitativo habitualmente empleado para sustancias orgnicas e
inorgnicas. Con esta tcnica se mide la absorbancia o transmitancia de una solucin, antes
y despus de hacerla reaccionar con un reactivo
(Figura 1).
La espectofotomeha de absorcin de inftanoios es adecuada para el anlisis de sustancias or-

Esparcimiento

2.L. 1.

gnicas, ya que los enlaces en alquenos, steres,

alcoholes y otros grupos funcionales, absorben la
radicacin infrarroja en una gran diversidad de
frecuencias, refleindose sta en el espectrgrafo
en foima de picos.

Figura

2. 1.

1-.

1..

lumini{cenca
Fundamento de la espechofotometra,

1. F otmetros y espectrlfltmetros

denominan fotmetros o colormetros a los

instrumentos que ulizan filtros para aislar una
regin o parte del espectro mientras que los insSe

truments que emplean redes de difraccin o prismas son llamados espectrofotmetros.

2.1.1.2. Absorcin de luz y

lE

de Beer

La radiacin electromagntica est caracteri"

zadapor mediode.la longitud de onda (1,) y de
la ftecuencia (u). La relacin entre la energa de

los fotones y la frecuencia est representada en

11

12.

Bioqumica clnica: de ia patologa al laboratorio

Fuente de

luz

Filtro o monocomador

Muestra

Detector/fotomultiplicador

dectms

rrrrn

lt

r*r:r

I-----1--' >l

L>('-t\_/^--)

Luz monocromtica

lftu

de

de lo

b l6qgl

por medio

sm dispoti

rnsolomataial,

hhngitrd&ond

Luz monocromca

&tongiardes.

transmitida

hhmmmomdon
Qlma por una red r

Figura 2. Esquema de un

tfurenmespecroyla
la ecuacin: E = hu, donde h es la constante de
Plank. La frecuencia est relacionada con la longitud de onda por medio de la siguiente ecuacin:
u = c/L.
El ojo humano es sensible a luz de longitud de
onda entre 380 y 750 nmr pero los instrumentos
actuales permiten realizar medidas, tanto < 380
nm (ultravioleta, UV) como a > 750 nm (infra-

noio,IR).
fotomtricos o colorimtricos determinan la concentracin de una sustancia en
solucin a partir de la medida de la luz absorbida
a una determinada longitud de onda.
La ley de Lambert-Beer establece que la concentracin del analito es directamente proporcional a la cantidad de luz absorbida (absorbancia)
o inversamente proporcional a la candad de luz
transmitida (transmitancia) hasta un detector.
A = abc = Iog 100/T. A es la absorbancia, a es el
coeficiente de absorcin, b es el paso de luz en
cm, c es la concentracin del analito y T la transmitancia en 0/o (definida como la relacin en porcentaje entre la intensidad de luz transmitida I e
incidente Io). Hay que tener en cuenta que la absorbancia no es directamente cuantificable, sino
que es calculada por la frmula matemtica anteriormente expuesta.
Esta ley tiene varias limitaciones. Las desviaciones de Ia misma son variaciones en la linealidad de la absorbancia contra la concentracin
y ocurren cuando:
Se miden concentraciones muy elevadas.
La radiacin incidente ilo es monocromtica.
La absorcin dei solyente es significativa.
Los mtodos

.
.'

.
.

*rida
Existencia de fenmenos de luz enca (energa radiante que alcanza al detector a longitudes de ondas distintas a las establecidas por el

por medio de

Cmscepcin de lo,

n lr luz obtenida por u

monocromador).

&mde
GEes

Los lados de la celda no son paralelos.

Ge causa, se hafi definid

2.1.1.3 . Componentes de un espectrofltmetrl

La radiacin es emitida por una fuente de adiacin, el monocromador selecciona una deter-

minada longitud de onda que incidir sobre la

cubeta de anlisis, donde se producir Ia absorcin de parte de la radiacin, el resto de Ia misma
alcanzar el detecto donde se transforma enuna
seal elctrica cuantificable (Figura

2).

no

es monocro,
un intervalo de I

*nchodebanda(eselr

de onda que salen de r

de longitudes de onda

Lmgitud de onda no
onda donde se produc
hrminosa del haz de h
titr-o selector de longin

Fxisten diferentes disp

nes de lentes y espejos

tfis atravesar la cubeta dr

2.I.1.3.7. Fuentes de radiacin

La fuente de luz ms empleada en el espectro
visible es la lmpara de tungsteno.
La lmpara de cuarzo halgeno se caracteriza
porque el filamento se encuentra en una atmsfera de vapor de yodo o bromo a baia presin, que aumenta la da til de la misma y

.
.

.
.
.

proporciona una intensidad adecuada en el espectro visible.

Las lmparas de hidrgeno o deuterio emiten un espectro continuo, siendo utilizadas
para realizar determinaciones en la regin ultravioleta (220 a 360 nm).
Las lmparas de vapores de mercurio producen un espectro discontinuo o de lneas (313,
365, 405, 436 y 546 nm).
Las fuentes lseq por su parte, permiten disponer de radiacin monocromtica y cohereilte e la regin visible-IR.

{ (habituaknente,

de

pl

finalmente el detector.
[,os espectrofotmeto

cionan una mayor calida

miten la correccin autor

deficiencias pticas (Figui

2-1.1.3.3. Detectores
L,os detectores comn
. [s celdas con capa de

o fotoclulas). Estan
mina de cobre o hierrc
locado una lmina sen

cuproso o selenio. Esta

una lmina de metal t

como electrod colectr
resistentes, relativamer
sibles desde la regin
1.000 nm.

Principios de instrumentacin. Metodoiogias instrumentales en el laboratorio clnico...

2.1.1.3.2. Selectores de longitud de onda

La seleccin de la longitud de onda deseada se
puede realizar por medio de filtros o monocromadores.
Los filtros son dispositivos sencillos, compuestos por un solo material, que transmite selectivamente la longitud de onda deseada, absorbiendo
el resto de longitudes.
En los monocromadores, la energa radiante es
:.:;

.:i

Ir

=r:tica
a

(ener-

longitupor el

:e:i"Jos.

r-.r fuente

de ra-

una deter-=ddir sobre la

la absor-

=so

de la misma

:.

enuna
tJ
1

:1

{
t

el espectro

caracteriza
if,? en una at:r--{tro a baja preJe la misma y

e:ada

en el es-

: Jeuterio emi=--..do utilizadas

:e la regin ul-

-rario produ-

de lneas (313,

permiten dis-

:'rtica y cohe-

dispersada por una red de difraccin o por un

prisma en un espectuo y la longitud de onda deseada se asla por medio de hendiduras mecnicas.
Con excepcin de los disposivos pticos lse la luz obtenida por un selector de longitud
de onda no es monocromtica, sino que realmente es un intervalo de longitudes de onda. Por
esta causa, se han definido diferentes trminos:
. Ancho de banda (es el intervalo de longitudes
de onda que salen de un dispositivo selector
de Iongitudes de onda).
. Longitud de onda nominal (es la longitud de
onda donde se produce el pico de intensidad
luminosa del haz de luz que sale del dispositivo selector de longitud de onda).
Existen diferentes dispositivos y confi guraciones de lentes y espejos para asegurar que Ia luz,
tras ahavesar la cubeta donde se realiza el anlisis (habitualmente, de plstico o cuarzo), alcance
finalmente el detector.
Los espectrofotmetros de doble haz proporcionan una mayor calidad analtica ya que permiten la correccin automtica de los errores o
deficiencias pticas (Figura 3).

,'

I
I
I

2.1.1.3.3. Detectores
Los detectores comnmente utilizados son:
. Las celdas con capa de barrera (fotovoitaicas
o fotoclulas). Estn constituidos por una lmina de cobre o hierro sobre el que se ha colocado una imina semiconductora de xido
cuproso o seienio. Esta capa est cubierta por
una lmina de metal transparente que acta
como eiectrodo colector. Estos detectores son
resistentes, relativamente econmicos y sensibles desde la regin ultravioleta hasta los
1.000 nm.

l/

ffi^)_1

Lampara
(fuente de luz)

13

'ffi+,i
Muestra

E
ffi

F =
tf

_Absorcin

de la muestra

Muestra Referencia
Figura 3. Esquema de espectrofotmetro de doble haz.

Los clsicos tubos fotomultiplicadores. Es un

tubo electrnico capaz de ampiificar la corriente, Presentan un tiempo muy corto de

respuesta.

Fotodiodos: son semiconductores que

cam-

bian su voltae de carga cuando les incide la

",

luz. Los cambios de voltaje se transforman en li

corriente y la corriente es cuantificada. Un fotodiodo est compuesto por una mah'iz bidi-;i
mensional de cientos de finos semiconducto-';
res colocados muy cercanos entre s.
La seal elctrica producida por el detector
es analizada en

un microprocesador y regis-

trada.
A la hora de establecer cul es la longitud de
onda idnea para medir un analito, hay que tener en cuenta que, si encontramos en el espectro de absorcin (absorbancia frente a longitud
de onda), un pico bien definido, es meior utilizar la longitud de onda a la cual se obtiene la
absorbancia mxima de ese analito, ya que el
anlisis, realizado en esta longitud de onda es
ms sensibie y especfico que para otras longitudes de onda. Para corregir Ias interferencias
de fondo se puede utilizar la coreccin de Allen,
que consiste en determinar la absorbancia ala
Iongitud de onda mxima y a otras dos longitudes de onda habitualmente equidistantes, calculndose Ia media de las dos ltimas para obtener una lnea base balo el pico que puede
sustraerse de la absobancia mxima.

14

Bioqumica clnica: de la patologa al laboratorio

?,.1.3.1.2. Quemador
La muestra debe Pasar i
ser utilizada en el esPecfiof
atmica. La muestra se co

Sincronizados

rosol mientras se introdu

Droceso se le denomina n
Lmpara de

ctodo hueco

,/

Choppet

giratorio

Registrador

dose Partculas

producir tomos. El ace

Monocromador
Muestra

Figura 4. Esquema de un espectrofotmetro de absorcin atmica-

ms usado en el quemadr
En las muestras clnica
tipos de mecheros:

Mecheros de Premezt
tra es asPirada, volatil
Mecheros de consur

.
2.1.2. Espectrofotometra de reflectancia
Es una variante de la espectrofotomea de absorcin, la nica variacin consiste en que la luz

remanente es refleiada y esta luz refleiada es Ia

que se mide. En este caso se utiliza el trmino de
densidad de reflaccin o de refleccin para describir la absorcin de luz por los cromforos.
La densidad de refleccin est relacionada con
la intensidad de luz reflejada por una muestra. La
ecuacin que relaciona esto es la siguiente:
Dn =

micrr

desintegradas baio la inl

Combustible
oxrdate

,udor se considera Parte d

terior de la llama, el solvet

log Go/Rr)

Siendo Du la densidad de refleccin; Ro, la luz

refleiada por un material estndar (usualmente,
sulfato de bario) y R1, la luz reflejada por la mues'
tra estudiada.
2.1.3. Espectrofotometra de absorcin qtmica
La espectrofotometra de absorcin atmica es
usada en el laboratorio clnico para la determinacin de calcio, litio, plomo, cinc y otros metales.
Los elementos a estudiar son tomos disociados
en estado basal (no excitados y no ionizados) en
el que pueden absorber radiacin en un estrecho
paso de banda. Estos tomos vaporizados en estado basal absorben luz en intervalos de longitud
de onda definidos muy estrechos. La energa de
stos es similar a la que el elemento emitira si
fuese previamente excitado. Las bandas de absc.,r-

cin son de 0,001 a 0,01 nm de ancho, por lo que

el espectro completo del elemento a estudiar se
denomina espectro de lnea. La espectrofotometra de absorcin atmica se diferencia de la emi
sin en que todos los tomos disociados pueden
absorber radiacin mientras que, en el de emisin, slo una pequea proporcin de tomos resultan excitados y son los que pueden emitir.'
2 .1

.3.1. Espectrofotmetros de absorcin stmica

Bsicamente est constituido por una fuente

un mechero, un filtro monocromtico y un detector (Figura 4).

de radiacin,

2.1.3.L.1. Fuente de radiacin

La Impara de ctodo hueco es la forma ms
prctica de generar un espectro de Inea. Las Imparas tienen un ctodo hueco o en forma de copa,
que est recubierto con el metal puro del elemento a estudiar o de una aleacin apropiada. Se
utiliza una lmpara diferente para cada elemento,
excepto en algunos casos en que el ctodo est
fabricado de forma que sirve para dos o tres elementos diferentes. Cuando se aplica una corriente
entre los electrodos situados en una atmsfera de
un gas inette, como nen o argn a baia presin,
se produce una radiacin de longitud de onda especfica del metal o aleacin de que est formado
ei ctodo.

muestra es asPirada al
un fluio de gas de all

tel
Porcionan mayor
aseguran la comPleta

son
Puestos aunque

primeros.
Como alternativa al

desarrollado oos Proce

mar la muestra en vaPo
plazada la llama Por

ot

cin:
Uno de estos Procesc
el mercurio en vapol

de reacciones qumi

En otra tcnica emPl

en un tubo o Plataf'
cla se vaPoriza en un
una corriente elcil
Para crear instantn

lo suficientemente t

zar el comPuesto ar
En estos equiPos sir
un mtodo de conecci

basada en el efecto Ze
se melora la
de
determinacin
la

mientos

as muestras de sangt
F,l

filtro monoor

nar la radiacin Pro<

Principios de instrumentacin. lvfetodologas instrumentales en el laboratorio clnico...

Ll.3.l.Z. Quemador
l muestra debe pasar al estado gaseoso para
sutilizada en el especrrofotmetro de absorcin
tmica. La muestra se conYierte en un fino aeintroduce en la llama. A este

rcsol mientras
proceso se Ie denomina nebulizacin. EI nebulise

Registrador

zador se considera parte del quemador. En el intsior de la llama, el solvente se evapora, Iibern-

dose partculas microscpicas que

son
para
del
calor
desintegradas bajo la influencia
producir tomos. El acetileno es el combustible
ms usado en el quemador.
En las muestras clnicas se sueien emplear dos
tipos de mecheros:

Mecheros de premezcla en los que la muestra es aspirada, volatilizada y quemada.

Mecheros de consumo total en los que la
muestra es aspirada al interior de la llama por
un fluio de gas de alta velocidad. Estos proporcionan mayor temperatura y, por tanto,
aseguran la completa disociacin de los compuestos aunque son menos sensibles que Ios
primeros.
Como alternativa al empleo de llamas se han
desarrollado otros procedimientos para transformar ia muestra en vapor atmico, siendo reemplazada Ia llama por otros procesos de atomizacin:
uno de estos procesos consiste en transformar
el mercurio en vapor atmico mediante el uso

.
a 0,01 nm de ancho, por lo que
leto del elemento a estudiar se
o de lnea. La espectrofotomertmica se diferencia de Ia emilos tomos disociados pueden

n mientras que, en el de emiuea proporcin de tomos re'son los que pueden emitir.,
lmetros de absorcin atmica

t constituido por una fuente

rechero, un filtro monocrom(Figura 4).

radiacin
:todo hueco es la forma ms
:un espectro de lnea. Las lmle

odo hueco o en forma de copa,

Lo

con el metal puro del ele-

una aleacin apropiada. Se

diferente para cada elemento,
rs casos en que el ctodo est
r que sirve para dos o tres eleCuando se aplica una corriente
;situados en una atmsfera de
nen o argn a baia presin,
iacin de longitud de onda es, aleacin de que
est formado
de

.
.

de reacciones qumicas.
En otra tcnica empleada, Ia muestra se deseca
en un tubo o plataforma de carbn. La mezcla se vaporiza en una atmsfera inerte cuando
una corriente elctrica pasa a travs del soporte
para crear instantneamente una temperatura
lo suficientemente elevada como para vaporizar el compuesto analizado.

En estos equipos sin llama se ha introducido

un mtodo de correccin de fondo de absorcin
basada en el efecto Zeeman. Con estos procedimientos se mejora Ia sensibilidad, y es posible
la determinacin de trazas de metales en pequeas muestras de sangre o de tejido.
El filtro monocromtico se utiliza para eliminar la radiacin procedente de la llama en los

'

15

equipos que utilizan mecheros. Como detector

se usa un tubo fotomulplicador.
1.3.2. Interferencias en ab sorcin atmica
Existen tres tipos generales de interferencias:
1. Interferencias qumicas, producidas por la
incapacidad para disociarse la muestra en
tomos neutros por la presencia de ciertos
aniones, como ocurre con los fosfatos, que
pueden interferir en l determinacin del cal-

2.

cio.

2. Interferencias por ionizacin, que se producen cuando los tomos son ionizados y, a1 disociarse, en lugar de permanecer en el estado
basal, emiten en la misma longitud de onda
en Ia que se va a determinar la absorbancia. Es
habituai intoducir una sustancia fcilmente
ionizable que absorba parte del exceso de energa de la llama.
3. Interferencia de matriz. Los tomos pueden
absorber ms radiacin cuando la muestra se
encuentra en un disolvente

orgnico.

,;'

masas

il
2.7.4. Espectrometrq de
La espectrometra de masas utiLiza la formai
cin y anlisis de iones para el estudio de una

gran variedad de molculas

Los espectrmetros de masas son instrumentos que emplean el principio de que las partculas ionizadas que se mueven a travs de un campo
elctrico o magntico se pueden separar de otras
partculas ionizadas segn sus relaciones masacarga.

Cuando las molculas no estn ionizadas,

se

les induce la misma. Las molculas ionizadas no

son estables y pueden perder la carga al interactuar con otras superficies o molculas. En esta espectrometra se asume que los productos ioniza-

dos se forman de manera reproducible si

,.

se

mantienen constantes las condiciones de separacin inica y de deteccin.

Cada in resultante ene una carga y una masa
molecular especfica. La separacin resultantg se
presenta en forma de lneas espectrales de iniensidad, que es proporcional al nmero de iones de
ese tipo que aicanzan el detector (Figura 5).

16

Bioqumica cinica: de la patologa al iaboratorio

10070

90
80
70

i6A
50
40

nE6-

Fmme*o de

lkr

30

Xfumelra

20

de

ltrn

rledeteminacin

10
0

(o

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

m/seg

Figura 5. Espectro de masas.

Todos los espectrmetros de masas tienen un

sistema para hacer y mantener el vaco, un dispositivo de introduccin de muestras, una cmara
de ionizacin, un filtro de masas o analizador
donde las partculas ionizadas son separadas de
acuerdo a sus relaciones masa-carga y dispositivos para la recoleccin, amplificacin y deteccin
de iones.
La separacin de los iones'en el filtro de masas se puede hace mediante separacin electrnica o magntica.
Aparte de poder elucidar la estructura de molculas orgnicas y biolgicas, Ia espectrometra
de masas (EM, nos permite la determinacin del
peso molecular de pptidos, protenas y de oligonucletidos, la identificacin de compuestos
obtenidos por cromatografa en capa fina y papel, preparativa, la determinacin de secuencias
de aminocidos en muestras de polipptidos y
protenas, la deteccin e identificacin de especies separadas por cromatografa y electroforesis capilar, el controi de gases en enfermos res-

piratorios durante

1os procesos quirrgicos,

pruebas para confirmar la presencia de drogas

sdb y potasio, ya
lb,rn rna llamaye
fudereftrencia p

hhtfuetro & Ilen

rEpmrmatomi
mrr-OmrtOsimil

en sangre en atletas y caballos de carreras, datacin arqueolgica, anlisis de aerosoles, determinacin de pesticidas en alimentos, control de
compuestos orgnicos voltiles en el agua de
red, o en el campo de la Microbiologa, el apprte

importante al conocimiento y clasificacin taxonmica de ciertas bacterias, por la identifica-

*esEm

filErrfurlEgunt
BErIlelPlEo
dEio, r & rrfur
l mnirnl
dela Ilrrn

hmnsu'r

cin de componentes parietales, entre otras aplicaciones.

,eFr
2.L.5. Fotometra de llama
La fotometra de llama se basa en la excitacin de los electrones de un tomo mediante Ia
energa trmica obtenida de una llama. Los electrones excitados, al volver a su estado inicial, ceden el exceso de energa en forma de radiacin
luminosa de longitudes de onda discretas, dando

Iugar a un espectro caracterstico para cada elemento.

En condiciones controladas, la intensidad de
luz a una deteminada longitud de onda tpica,
resulta proporcional al nmero de tomos que
emite energa y, por tanto, a la concentracin de
la sustancia de inters en ia muestra.

srtzri

-dryefir
+Pfxrr

le

nprhd

EFOFF

-h&

-q
&tu

Principios de instnmentacin. Metodologas instrumentales en ei laboratorio clnico...

17

Llama

Registrador

Combustible
+
oxrdante
Monocromador
Muesta

Egura 6. Fotmetro de llama.

la fotometra

de llama ha sido muy empleada

para la determinacin de iones alcalinos, sobre

todo sodio y potasio, ya que son fcilmente ex160

as

citables en una llama y es considerado un procedimiento de referencia para los mismos.

Un fotmetro de llama est constituido bsiczmente por; un atomizador y una llama, un filtro monocromtico similar a los utilizados en los
espectrofotmetros y un detector que, en la ac-

170 180

y caballos de carreras, data-

anlisis de aerosoles, deterrcidas en alimentos, control de

rnicos voltiles en el agua de
I de la Microbiologa, el aporte
nocimiento y clasificacin tatas bacterias, por la identificantes parietales, entre otras aplia,

de

llama

de llama se basa en la excita)nes de un tomo mediante la

btenida de una llama. Los elecal

volver

a su estado

inicial,

ce-

energa en forma de radiacin

itudes de onda discretas, dando
ro caracterstico para cada eles

controladas, Ia intensidad de

inada longitud de onda tpica,

rnal al nmero de tomos que
or tanto, a la concentracin de
ters en la muestra.

t'

tualidad, suele estar constituido por un tubo fo-

tomultiplicadot (Figuta 6),

Es habitual el empleo de un estndar interno,
como el litio, y de varios detectores, 1o que permite reducir al mnimo los errores debidos a las
fluctuaciones de la llama o de Ia velocidad de aspiracin de Ia muestra.

2.1.6. Fluoromeffia
La fluorescencia se produce cuando las molculas de ciertas substancias absorben luz, pueden
pasar a un nivel superior de energa y emitir a un
aivel de energa ligeramente ms alto que el original. Como resultado la radiacin reemida (fluorescencia), tras un peodo de 108-10-4 segundos,
tiene menor energa y, por tanto, una mayor iongitud de onda que ia absorbida.
2.1.6.1. Fluormetros
Las partes esenciales de un fluormetro son
simiiares a los de un espectrofotmetro de absorcin y consta de fuente de energa, monocromadores, la cubeta de anlisis y el detector.
La

principal diferencia

es

la infroduccin de un

,i

iil
Detector

Figura 7. Esquema de un fluormetro.

grupo de filtros o monocromadores antes y despus de la celda para aislar la luz emitida (Figura 7).
2.1.6.1.7. Fuente de energa
Las ms habituales son las lmparas de arco
de mecurio o de xenn (fuente continua), que
producen radiacin suficientemente energtica
para excitar los electrones de las molculas fluorescente.

2.L.6.1.2. Ivf onocromadores

Seleccionan la iongitud de onda incidente y
eliminan las radiaciones no deseadas antes de que
stas puedan incidir en el detector.
Los fluormetros se disean con un monocromador secundario.

IS . ll-rg:rc r*;z

dE X

-rd

al

lororio

2-1.6.1.3. Detector
Normalmente en ngulo recto respecto del haz
de luz incidente para impedir que la luz de la lmpara llegue al detector.
2.1,6.L.4. Limitaciones
La seal fluorescente se ve afectada por muchas varlables, que:
., Dependen del solvente.
Del pH de la solucin.
De la temperatura.
De la absorbancia.
De la presencia de sustancias interferentes.
Adems, la fluorescencia vaa dependiendo
de la intensidad de la luz incidente sobre la muestra, la cantidad de luz interceptada por el detecto, del ancho de banda de lalluz analizada y de
la eficiencia del detector.

.
.
.

2.7,6.7.5. Aplicaciones
Muy pocas molculas son fluorescentes directamente y, por ello, se suele emplear la formacin
de complejos fluorescentes para poder medir las
sustancias aanallzal
La ventaia de la fluorometra estriba en su
enorme sensibilidad del orden de 1.000 veces superior a Ia de los mtodos colorimtricos.
2.1.6.2. Fluorimetrs de polarizacin
La luz puede polarizarse (el campo elctico vibra en un solo plano) al atravesar algunas substancias cristalinas denominadas polarizadores.
Cuando una molcula fluorescente absorbe
luz, excita un cromforo que tiene una orientacin especfica, produciendo la transicin de un
electrn a un nivel de energa superior. La molcula excitada emite luz a medida que el electrn regresa al nivel de energa inferior.
Las mediciones de la fluorescencia polarizada
requieren un colorante con una orientacin eiectrnica. Como ejemplo de este tipo de molculas tenemos: la fluorescena. Si se utiliza luz polarizada para excitar las molculas de tluorescena,
la fluorescencia reemitida estar polarizacla. Sin
embargo, cuando la molcula de fluorescena se

une a otra de gran tamao (inmunoglobulina),

L
l

la capacidad de despolarizar Ia luz desaparece.

Este principio se ha aplicado en los instrumentos
que utilizan luz fluorescente polarizada y cuantifican el cambio en la despolarizacin que se produce tras una reaccin inmunolgica.
2.1.6.3. Fluorescencia de resolucin tards
Es una aproximacin que puede usarse para
mejorar la sensibilidad de ias tcnicas de fluorescencia.
El tiempo de emisin de la fluorescencia en
muchas molculas fluorescentes, como la fluorescena, est en el rango de nanosegundos. Algunos
compuestos, como el quelato metlico dicetonaeuropio, tienen una da media de fluorescencia
muy larga (10-1.000 microsegundos).
Los instrumentos que usan esta tcnica iluminan la muestra por un perodo de tiempo, luego
detienen la iluminacin y despus miden la fluorescencia emida en un tiempo especificado despus de la iluminacin.

Un gran inconveniente de esta tcnica

es la

necesidad de pasos intermedios de separacin, ya

que los compuestos quelados no pueden medirse

directamente en los lquidos

2. 1. 6.4. Quimi

biolgicos.

hk que incide sobre la r

hodryosada (a) egaa
t&h diftrencia entre h l
dpor ta muestra-

Ll

-6 5 -

Ek-bolwninisra

Se derencia de la q

pe

las sustancias que

cie on generadas electr

&

precursores estables el

tlodo.

pueden utilizar ([
tanismos como la xidr
Se

tID

tra (dipirilo) y tripr

cst proceso es la meiorz

Eactivos y Ia gran sensi

rrede obtener.

luminiscencia

Quimioluminiscencia es cualquier reaccin

qumica en Ia cual, uno de los productos es el
productor de luz. La enzima peroxidasa puede
reaccionar con molculas como el luminol (5amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazindiona) o steres
de acridinium para producir luz como uno de los
productos de Ia reaccin.
La del luminol produce emisin de fotones en
el intervalo de 40G450 nm. Esta reaccin implica
la oxidacin de un agente como el isoluminol o
los steres de acridinium por un oxidante (perxido de hidrgeno) en presencia de una enzima
(fosfatasa alcaiina o la peroxidasa).
Esta tcnica presenta el inconveniente de su
limitada sensibilidad, debido a la baja produccin de fotones. Para corregir esta limitacin, se

pueden adicionar molculas reforzadoras, como

el 6-hidroxibenzotiazol para aumentar la emisin
de fotones.

Z7-7. Turbidirnetra y t
Cuando un haz de lu
en suspensin, parte de

oarte dispersada, parte

tra[smitida.

Pueden ocurrir tres tir

relacin entre el tamat
la longitud de onda de l;
la

longitud de onda
tamao de la partcuft
persar simtricamen
Si la

oria, ocurriendo un n

de dispersin a 90 gra
cidente, como fue des
Si la longitud de ond

iguai al tamao de la

rece ms luz dispersad

hacia atrs, segn lo d
Si la longitud de ond,
el tamao de las part
parte de luz aparecer r

Principios de instrumentacin. )!fetodologas instrumentales en el Iaboratorio clnico...

[espolarizar la luz desaparece.

La aplicado en los instrumentos
luorescente polarizada y cuann la despolarizacin que se pro-

:cin inrnunolgica.
,cia de resolucin tarda

nacin que puede usarse para

lidad de las tcnicas de fluores-

/-\)/ .'
*q)-

: l\-/-

l/

--rura 8.Turbidimetra. El emisor (1) emite un haz de

. - , 2) que incide sobre 1a muestra (3), la atraviesa y la
.. - no dispersada (4) Ilega al detector (5) donde se cuanla diferencia entre ia luz incidente y la no disper,.::a por la muestra.

--e son generadas electroqumicamente a partir

-: precursores estabies en la superficie de un elec-

::odo.
Se

pueden utilizar diferentes molculas y me-

:nismos como ia xido-reduccin con rutenio

ll) tris (dipirilo) y triptolamina. La ventaja de
=jte proceso es la mejora en la estabilidad de los
:activos y la gran sensibilidad de fmol/l que se
:uede obtener.

)7

t>
.,

F#FJ

t*@e
Flf+r'.isaJ
TEffi

A
r\
(")

4t
F-\
4

Figura 9. Nefelometa. El emisor (1) emite un haz de

luz (2) que incide sobe 1a muestra (3), la atraviesa y la
luz dispersada (4) llega al detector (5) donde se cuantifica la diJerencia entre la Iuz incidente y la dispersada
por la muestra.

por causa de una retrodispersin destructiva

fuera de fase, tal como describe Ia teora de
Mie.
La luz dispersada de acuerdo a estos modelos
va a depender del ngulo de medida y de otros
factores, como la concentracin de las partculas,
el ndice de refraccin y la intensidad de la luz
incidente.

lquidos biolgicos.

niniscenciq

scencia es cualquier reaccin

al, uno de los productos es el
La enzima peroxidasa puede
Lolculas como el luminol (5o-

-. 1 .6. 5. Electroluminiscencia
5e diferencia de la quimioluminiscencia en
:'-ie las sustancias que producen la luminiscen-

19

\.-/

-a

os

1 l\

;-

misin de la fluorescencia en
fluoescentes, como la fluoresngo de nanosegundos. Aigunos
c el queiato metlico dicetonana da media de fluorescencia
00 microsegundos).
:os que usan esta tcnica ilumirr un perodo de tiempo, luego
racin y despus miden la fluoen un tiempo especificado desacin.
Lveniente de esta tcnica es la
s intermedios de separacin, ya
ls quelados no pueden medirse

ffi:)_1

r-->....

i,4-ftalazindiona) o steres

producir luz como uno de los

laccin.
produce emisin de fotones en
t-450 nm. Esta reaccin impiica
r agente como el isoluminol o
dinium por un oxidante (pero) en presencia de una enzima
o la peroxidasa).
esenta el inconveniente de su
dad, debido a la baia produca

'ara corregir esta iimitacin, se

molcu1as reforzadoras, como
:iazol para aumentar la emisin

l. 1.7. Turbidimetra y nefelometra

Cuando un haz de luz incide sobre partcuias

:n suspensin, parte de la misma ser refleiada,

:arte dispersada, parte transmitida y parte no
:lansmitida.
Pueden ocurir tres tipos de dispersin segn
-a elacin entre el tamao de las partculas (d) y
-a longitud de onda de Ia luz incidente (),):
. Si la longitud de onda es mucho rnayor que el
tamao de la partcula (d < 0,1 ),), 1a luz se dispersar simtricamente alrededor de la parti

cula, ocurriendo un mnimo en la intensidad

de dispersin a 90 grados respecto a1 rayo incidente, como fue descrito por Rayleigh.
Si la longitud de onda es aproximadamente
igrrai al tamao de las partculas (d = ),), aparece ms 1uz dispersada ms hacla delante que
hacia atrs, segn io describe Rayleigh-Debye.
Si la longitud de onda es mucho menor que
el tamao de las partculas (d > ).), Ia mavor
parte de luz aparecer dispersada hacia delante

2.

.7

1. Turbidimetra

Mide la turbidez o disminucin de intensidad

que se produce en la radiacin que atraviesa una
suspensin de partculas (Figura 8).
El detector se situa en la direccin de Ia luz in-

cidente. La turbidez es directamente proporcional a ia concentracin de partculas dispersantes

y es inversamente proporcional a la longitud de
onda elevada que, a su vez, depende de la relacin entre ei tamao y forma de la partcula.
2.1.7.2. Nefelometra
En nefelometra se cuantifica la intensidad de
radiacin dispersada en un cierto ngulo respecto
a la direccin de la luz incidente (Iigura 9). En
este caso, los tratamientos matemticos de Rayleigh o de Rayleigh-)vfie permiten relacionar la
intensidad de luz dispersada con Ia concentracin del agente dispersante.
La sensibilidad de la nefelometa es teri"
camente superior a la alcanzable en tubidime-

20

Bioqumica clnica: de la patologa al iaboratorio

tria,ya que en ella Ia cuantificacin de la luz dispersada se produce frente a una dbil seal de
fondo.
2.1.7.3. Otros procedimientos
Actualmente existen sistemas que ulizan ambos tipos de seal: dispersin y transmisin de
luz, coro es el utilizado en la denominada: medida de la turbidez en una esfera integrada. Otro
procedimiento basado en la determinacin de la
constante de difusin de las partculas en suspensin a partir de las fluctuaciones de la luz dispersada por las mismas en varios ngulos es la llamada dispersin de luz cuasi-elstica.

2.2. Mtodos electroqumicos

La electroqumica consiste en la medicin de
las seales elctricas'asociadas con los sistemas
qumicos que estn dentro de una celda electroqumica. La electroqumica analtica hace uso de
la electroqumica para realizar los anlisis. Las
mediciones se pueden realizar en volmenes de
muestra muy pequeos, del orden de microlitros.
En el laboratorio clnico es utilizado rutinariamente para la determinacin de iones, drogas,
hormonas, metales y gases.
Existen varios tipos de procedimientos analcos que se basan en el fenmeno electroqumico
como:

2.2.1. Potenciometra
Los mtodos potenciomtricos estn basados
en la medida de la diferencia de potencial (voltaie) existente entre dos electrodos, un electrodo
indicador y otro de referencia, en una solucin
de una deteminada sustancia.
El electrodo de referencia estndar es el electrodo estndar de hidrgeno, pero es muy poco
utilizado, ya que existen otros electrodos de eferencia ms fciles de fabricar y usar. Los electrodos de referencia ms utilizados son el electrodo de calomelanos saturado y el electodo de
plata/cloruro de plata.
Los eleclrodos indicadores estn formados por

varillas metlicas (platino) o de carbn. La ecuacin de Nernst permite relacionar el potencial

con la concentracin: E = Eo + 0,059/n log Ox/Re,

en donde Eo es el potencial estndar, n es el nmero de electrones implicados, y Ox/Red es la relacin entre las concentraciones de las formas
oxidada y reducida.
La potenciometra es utilizada para:
7. La medicn del pH, ul.lizando un electrodo indicador de vidrio.
2. La medicin de ionesmediante la utilizacin de
electrodos selectivos. Algunos estn basados
en ia medicin de la diferencia de potenciai
originado por la difusin del in que queremos medir (Na*, H., NH*+) a travs de una

membrana selectiva hidratada de drio. El potencial generado es proporcional a la concentracin del in que queremos medir. Otros es-

tn

constituidos

por

membranas

de

intercambio inico lquido en los que un solvente inerte e insoluble en agua contiene un
portador selectivo de iones, como vaiinomicina (para medida de K-) o dioctil-fosfato (para
la medida de Ca2').
3. Lamedicin especfica de gases utilizando electrodos, como la medicin de dixido de carbono mediante la medicin del pH en una solucin de bicarbonato que acepta el CO2 que
atraviesa una membrana permeable al mismo

ard

nrmero de electrone

rriorr

eleclroqumica; I

rdryyli

ffi

es el

amerc d

enlamuestra.

f,remrodo

se

ha usa

t&ruos empleando e
2.2,iXtE*tneac
Leamperimetra emP

qrrf

demnienteqrle

IEIrImicacuando

ffietrfuelos

se aP

electrodo:

[.m *nsores de ampa

lilen la corriente genet

&icamente

activoen

fiio.
Ura aplicacin tpica

-rral
6m

(dectrodo de Cladt),

r elda electroqumic
ptr un pequeo disco d
^

y
"rrno ctodo, un electr

&enrmampnft
fuoqunica

est sep

membrana permeab
ce de oxgeno, la irite-n
Fxima a cero pues el c

desde la muestra.

cn presencia de oxgeno,
c proporcional a la pOz.

2.2.2. Culombimetra

Omopametoquep
olmna por amperimti

La culombimetra es un mtodo til para el

anlisis cuantitativo. Las aplicaciones clnicas
que emplea esta tcnica se basan en la utilizacin de una corriente constante para generar un
agente valorante. En principio, se mide el tiempo
necesario para titular una muestra a corriente
constante. Este tiempo est relacionado con Ia
concentracin del compuesto analizado en la
muestra.
La relacin entre la carga en culombios y la
concentracin se obtiene a partir de la ley de Faruday.

Q= it = nFN
donde Q es la carga que pasa en un tiernpo determinado; t: tiempo; i: la corriente constante; n

ufutrodo

amperimt

Eo66 rrriliza la glucosa o.

trdffimembranas.

Esta

fomadelamuffia,ge
gmo y cido gluconic
cs

permeable al perxid
amperim

&minada

uodo de platino.

?J:l- Conductimetra

La conductimeEa eu
ent

&corriente

elffic

hizadm, cuando entre

rrx.il electrico- [ intsr

mporcional a la condu

&la

concentracin de

I,