UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO ENGENHARIA QUMICA

ENCAPSULAMENTO SIMULTNEO DE NANOPARTCULAS

MAGNTICAS (NPMS) COM FTALOCIANINA DE ZINCO
(ZNPC) VIA POLIMERIZAO EM MINIEMULSO

PAULO EMILIO FEUSER

Florianpolis
2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO ENGENHARIA QUMICA

Paulo Emilio Feuser

ENCAPSULAMENTO SIMULTNEO DE NANOPARTCULAS

MAGNTICAS (NPMS) COM FTALOCIANINA DE ZINCO
(ZNPC) VIA POLIMERIZAO EM MINIEMULSO

Dissertao submetida ao Programa de

Ps Graduao em Engenharia Qumica
da Universidade Federal de Santa
Catarina para a obteno do Grau de
Mestre em Engenharia Qumica.
Orientador: Prof. Dr. Pedro Henrique
Hermes de Arajo
Co-orientadora: Profa. Dra Claudia Sayer;
Co-orientador: Prof. Dr. Marcio Nele de
Souza

Florianpolis
2012

Paulo Emilio Feuser

ENCAPSULAMENTO SIMULTNEO DE
NANOPARTCULAS MAGNTICAS (NPMS) COM
FTALOCIANINA DE ZINCO (ZNPC) VIA POLIMERIZAO
EM MINIEMULSO
Dissertao julgada para obteno do ttulo de Mestre em
Engenharia Qumica, rea de concentrao de Desenvolvimento de
Processos Qumicos e Biotecnolgicos e aprovada em sua forma final
pelo Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica da
Universidade Federal de Santa Catarina
Florianpolis, 15 de maro de 2012.
Prof. Leonel Teixeira Pinto, Dr.
Coordenador do Curso
Banca Examinadora:
Prof. Pedro Henrique Hermes de Arajo, Dr.
Universidade Federal de Santa Catarina UFSC
Orientador
Prof. Claudia Sayer, Dra.
Universidade Federal de Santa Catarina UFSC
Co-Orientadora
Marcio Nele Souza, Dr.
Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ
Co-Orientador
Eduardo Ricci Jnior, Dr.
Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ
Alexandre Cas Viegas, Dr.
Universidade Federal de Santa Catarina - UFSC
Dbora de Oliveira, Dra.
Universidade Federal de Santa Catarina- UFSC

A minha famlia,
minhas maiores referncias.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente queria agradecer meus pais e irms pelo carinho e

apoio em todos os momentos, obrigado por tudo, hoje e sempre.
Agradeo tambm minha esposa, Karla pelo apoio incondicional,
carinho, ateno e mesmo estando longe em alguns momentos, obrigado
por tudo. Obrigado tambm por ter me dado a coisa mais preciosa da
minha vida, meu filho Vitor. Filho este trabalho pra voc, o pai Te
ama muito!!!
Ao meu orientador, Pedro Henrique Hermes de Arajo, por todo
apoio, compreenso e amizade. A minha co-orientadora, Claudia Sayer,
carinho e ateno em todos os momentos. Ao Prof. Eduardo Ricci pelo
apoio, amizade e ateno. Ao meu co-orientador Marcio Nele ao apoio e
que mesmo a distncia sempre me auxiliou e contribuiu para o
desenvolvimento deste trabalho. Tenho orgulho em ter vocs do meu
lado.
Ao Prof. Jos Carlos Pinto pelo apoio e ateno.
Agradeo tambm Universidade Federal de Santa Catarina, ao
Programa de Ps-Graduao Engenharia Qumica, e a Universidade
Federal do Rio de Janeiro - COPPE, por todos os recursos que
permitiram a elaborao deste trabalho. Em especial ao Laboratrio de
Controle de Processos da UFSC e o Laboratrio de Modelagem,
Simulao e Controle de Processos da UFRJ, pela disponibilidade dos
recursos fsicos e pela oportunidade do desenvolvimento das atividades
necessrias para a realizao deste trabalho. Aos todos do LCP e
LMSCP que sempre me apoiaram e me ajudaram na construo deste
trabalho.
Ao Prof. Alexandre Cas Viegas pela ateno e pela possibilidade
de realizar anlises de magnetizao e de Raio-x.
Agradeo ainda ao LCME - Laboratrio Central de Microscopia
Eletrnica pela disponibilidade da estrutura fsica do laboratrio e
microscpios, que me propuseram a oportunidade do desenvolvimento
das atividades necessrias para a realizao deste trabalho
Ao apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento
Cientfico e Tecnolgico (CNPq), a Coordenao de Aperfeioamento
de Pessoal de Nivel de Superior (CAPES).

A mente que se abre a uma nova idia jamais

voltara ao seu tamanho original
(Albert Einsten)

RESUMO

Uma das alternativas mais promissoras para o tratamento do cncer a

Terapia Fotodinmica (TFD). A Ftalocianina de Zinco (ZnPc) um
fotossensibilizante de segunda gerao com carter hidrofbico e
necessita ser incorporado em um sistema de liberao adequado para ser
injetado sistemicamente. Nanopartculas magnticas, NPMs, constituda
principalmente de magnetita (Fe3O4) apresentam alto valor de
magnetizao com grande potencial de aplicao no tratamento do
cncer por hipertermia. O encapsulamento simultneo de frmacos com
NPMs tem sido reconhecido como uma tcnica promissora para o
tratamento do cncer por possibilitar a ao sinergtica dos diferentes
tipos de tratamento. O objetivo deste trabalho foi a sntese,
caracterizao e avaliao da toxicidade e fototoxicidade das NPMs, do
encapsulamento da NPMs e ZnPc e o encapsulamento simultneo de
ZnPc com NPMs via polimerizao em miniemulso. As NPMs com
cido olico (AO) foram preparadas pelo mtodo de co-precipitao em
meio aquoso e a anlise de DRX mostrou picos caractersticos da
magnetita (Fe3O4) com dimetro mdio de nanopartculas de 13nm. As
NPMs apresentaram um alto valor de magnetizao de saturao (Ms)
(64 emu/g xido de ferro). O encapsulamento das NPMs foi realizado
via polimerizao em miniemulso com metacrilato de metila (MMA).
As NPMs encapsuladas apresentaram um dimetro aproximado de
100nm com valor de Ms de 34 emu/g de xido de ferro. Para o
encapsulamento da ZnPc utilizou-se duas tcnicas de encapsulamento. A
primeira foi a tcnica de miniemulso com auxlio da tcnica de
nanoprecipitao (PMMA/ZnPc)(FA)) e a segunda utilizou-se apenas a
tcnica de miniemulso direta (PMMA/ZnPc(FO)). O teor de ZnPc nas
nanopartculas polimricas foi um pouco superior na amostra
PMMA/ZnPc(FA) (3,7g/mg) do que na amostra de PMMA/ZnPc(FO)
(3,0 g/mg). Ambas as tcnicas resultaram em um tamanho mdio de
aproximadamente 100nm. Ao encapsular a ZnPc simultaneamente com
as NPMs (PMMA/ZnPc/NPMs) no alterao em relao ao tamanho
das nanopartculas (100nm), concentrao de ZnPc (3,6 g/mg) e
propriedades magnticas (31 emu/g de xido de ferro) em relao ao
encapsulamento em separado da ZnPc e NPMs. A liberao da ZnPc das
nanopartculas polimricas foi sustentada e lenta. Nas primeiras 20
horas cerca de 5-10% do ZnPc contida nas nanopartculas polimricas
foi liberada em todas as amostras. No ensaio de toxicidade (ausncia de
luz), as nanopartculas encapsuladas mostraram baixa toxicidade. No

ensaio de atividade fotobiolgica, observou-se, que a luz isoladamente

(sem nanopartculas contendo ZnPc) no foi capaz de induzir efeito
citotxico sobre a cultura de clulas. Ao utilizar nanopartculas
contendo ZnPc observou-se uma reduo acentuada da viabilidade
celular para 22% (PMMA/ZnPc(FA)) e 30% (PMMA/ZnPc/NPMs).
Palavras-chave: Ftalocianina de Zinco, nanopartculas magnticas,
magnetita, poli(metacriato de metila), Terapia Fotodinmica.

ABSTRACT

Photodynamic therapy (TFD) is one of the most promising alternatives

for the treatment of the cancer. Zinc phtalocyanine (ZnPc) is a second
generation photosensitizer with hydrophobic character that should be
incorporated in a suitable delivery system to be injected systemically.
Magnetics nanoparticles (NPMs) consisting mainly of magnetite (Fe3O4)
present high value of magnetization with great potential of application
in the treatment of the cancer by hyperthermia. The simultaneous
encapsulation of drugs with NPMs has been recognized as one
promising technique for the treatment of the cancer making possible a
synergetic action of the different types of treatment. The objective of
this work was the synthesis, characterization and evaluation of the
toxicity and phototoxicity of the NPMs, the encapsulation of the NPMs
and ZnPc and the simultaneous encapsulation of ZnPc with NPMs by
miniemulsion polymerization. The NPMs with oleic acid (AO) had been
prepared by the co-precipitation method in aqueous solution. DRX
analysis showed characteristic peaks of magnetite (Fe3O4) with average
particle diameter of 13nm. The NPMs had presented high value of
magnetization of saturation (Ms) (61 emu/g of iron oxide). The
encapsulation of the NPMs was carried through methyl methacrylate
(MMA) miniemulsion polymerization. The polymeric particles with
NPMs encapsulated presented an average diameter of 100nm with value
of Ms of 34 emu/g of iron oxide. Two techniques of encapsulation were
employed for the encapsulation of ZnPc. The first one was the
miniemulsion polymerization with the nanoprecipitation technique
(PMMA/ZnPc) (FAN)) and second one used only the miniemulsion
polymerization technique (PMMA/ZnPc (FO)). The amount of ZnPc in
polymeric nanoparticles was higher in PMMA/ZnPc(FA) sample
(3,7g/mg) when compared to the sample of PMMA/ZnPc (FO) (3,0
g/mg). Both techniques resulted in polymeric nanoparticles with an
average diameter of approximately 100nm. The simultaneous
encapsulation of ZnPc with NPMs (PMMA/ZnPc/NPMs) presented very
similar values of average particle size (100nm), concentration of ZnPc
(3,6 g/mg) and magnetic properties (31 emu/g of iron oxide) when
compared to the single encapsulation of ZnPc and NPMs. The release of
the encapsulated ZnPc was supported and slow. In the first 20 hours
approximately 5-10% of the encapsulated ZnPc was released in all
samples. In the toxicity assay (light absence), the encapsulated
nanoparticles had shown low toxicity. In the assay of phototoxicity

activity, it was observed that the light (without polymeric nanoparticles

containing ZnPc) was not able to induce cytotoxic effect on the culture
of cells. When using polymeric nanoparticles with encapsulated ZnPc an
accentuated reduction of the cellular viability of 22% (PMMA/ZnPc
(FA)) and 30% (PMMA/ZnPc/NPMs) was observed.
Keywords: Zinc phtalocyanine, magnetic nanoparticles, magnetite,
poly(methacrylate-methyl), Photodynamic Therapy.

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1 Ilustrao do tratamento do cncer por hipertermia .......... 38

Figura 2.2 Estrutura Cristalina da y-Fe2O3 (a) e Fe3O4 (b) (TEJA
e KOHN, 2009) ..................................................................................... 39
Figura 2.3 Comportamento magntico de nanopartculas
ferromagnticas e superparamagntica, quando expostos a um
campo magntico externo (DAVE e GAO, 2009)................................. 40
Figura 2.4 Representao de uma partcula multi-domnio e monodomnio. (COUTO, 2006) .................................................................... 41
Figura 2.5 Curva de histereses (RIBEIRO, 2000) .............................. 41
Figura 2.6 Curva de um material superparamagntico
(SINNEKER, 2000) .............................................................................. 42
Figura 2.7 As Figuras a e b mostra um esquema de nanocapsulas.
e as Figuras c e d apresentam um esquema de nanoesferas
(SCHAFFAZICK e GUTERRES, 2003)............................................... 45
Figura 2.8 Mtodos usuais para preparao de nanopartculas
polimricas (SCHAFFAZICK et al, 2003)............................................ 46
Figura 2.9 Esquema de uma polimerizao interfacial (ODIAN,
2004) ..................................................................................................... 47
Figura 2.10 Etapas da Polimerizao em emulso (SAYER, 1999) .. 49
Figura 2.11 Etapas da Polimerizao em miniemulso (ASUA,
2002) ..................................................................................................... 49
Figura 2.12 Ftalocianina de Zinco (KOVALSKAYA et al, 2000) ..... 52
Figura 2.13 Principais etapas da TFD (Henderson et al, 1992) .......... 53
Figura 2.14 Mecanismos da TFD (RICCI-JNIOR, 2005) ............... 54
Figura 2.15 Mecanismos de ao nos tumores na TFD (Adaptado
de CASTANO et al, 2006). ................................................................... 56
Figura 3.1 Homogeneizador Fisher Scientific, Sonic
Dismembrator Model 500, utilizado no processo de ultrasonificao .. 60
Figura 3.2 Preparao das NPMs estabilizadas com AO por coprecipitao em meio aquoso ................................................................ 61
Figura 3.3 Encapsulamento simultneo da ZnPc e NPMs com
PMMA via polimerizao em miniemulso com auxlio da tcnica
de nanoprecipitao (PMMA/ZnPc/NPMs) .......................................... 63

Figura 3.4 Encapsulamento da ZnPc com MMA via polimerizao

em miniemulso com auxlio da tcnica de nanoprecipitao
(PMMA/ZnPc(FA)) .............................................................................. 64
Figura 3.5 Encapsulamento da ZnPc com MMA via miniemulso
(PMMA/ZnPc(FO)) .............................................................................. 65
Figura 4.1 Difratograma de raio-X das NPMs com AO .................... 74
Figura 4.2 Microscopia Eletrnica de transmisso das NPMs
revestidas com cido olico (A) e NPMs puras (B) .............................. 75
Figura 4.3 Anlise termogravimtrica das NPMs com AO................ 76
Figura 4.4 Curva de magnetizao obtida por MAV das NPMs
com AO, campo magntico de 20KOe (A) e campo magntico em
maior escala 1,2KOe (B)....................................................................... 78
Figura 4.5 MET das nanopartculas polimricas com NPMs............. 79
Figura 4.6 Difratograma de raio-X das nanopartculas polimrica
de PMMA (A) e PMMA/NPMs (B) ..................................................... 81
Figura 4.7 Anlise de TGA das nanopartculas polimricas de
PMMA/NPMs ....................................................................................... 81
Figura 4.8 Propriedades magnticas das NPMs com AO e das
NPMs encapsuladas com PMMA, campo magntico de 20KOe (A)
e campo magntico em maior escala 4KOe (B). ................................... 83
Figura 4.9 Propriedades magnticas obtidas das NPMs com AO e
para as nanopartculas polimricas com diferentes concentraes de
xido de ferro (7% e 13,6%), campo magntico de 20KOe (A) e
campo magntico em maior escala 4KOe (B)....................................... 84
Figura 4.10 Encapsulamento da ZnPc via polimerizao em
miniemulso com auxlio da tcnica de nanoprecipitao
(PMMA/ZnPc(FA) ................................................................................ 86
Figura 4.11 Identificao da ZnPc utilizando a tcnica de UV-Vis ... 87
Figura 4.12 MET das nanopartculas polimricas com ZnPc A)
PMMA/ZnPc(FA) e B) PMMA/ZnPc(FO) ........................................... 88
Figura 4.13 Espectros de absoro do UV-Vis da Sol.1,
PMMA/ZnPc(FO) e PMMA/ZnPc(FA) ................................................ 89
Figura 4.14 Difratograma de Raio-X das nanopartculas
polimricas contendo aproximadamente 0,3% em massa de ZnPc.
As amostras analisadas foram ZnPc livre (A), mistura fsica da ZnPc
com
PMMA (B), PMMA sem ZnPc (C), PMMA/ZnPc(FA) (D)
e PMMA/ZnPc(FO) (E). ....................................................................... 91

Figura 4.15 Difratograma de Raio-x da mistura fsica de PMMA

com ZnPc na razo mssica de 1:1........................................................ 92
Figura 4.16 MET das nanopartculas polimricas contendo ZnPc e
NPMs (PMMA/ZnPc/NPMs) ................................................................ 93
Figura 4.17 Espectros de absoro no UV-Vis da Sol.1 e
PMMA/ZnPc/NPMs .............................................................................. 94
Figura 4.18 Comparao dos espectros de absoro no UV-Vis da
PMMA/ZnPc (FA), PMMA/ZnPc (FO) e PMMA/ZnPc/NPMs ........... 94
Figura 4.19 Difratograma de Raio-X das nanopartculas
polimricas contendo ZnPc. As amostras analisadas foram PMMA
(A), PMMA/NPMs (B), PMMA/ZnPc/NPMs (C). ............................... 95
Figura 4.20 Anlise de TGA das nanopartculas polimricas
contendo ZnPc e NPMs ......................................................................... 96
Figura 4.21 Propriedades magnticas obtidas das nanopartculas
polimricas contendo ZnPc e NPMs, campo magntico de 20KOe
(A) e campo magntico em maior escala 4KOe (B).............................. 97
Figura 4.22 Converso gravimtrica das amostras de
PMMA/NPMs, PMMA/ZnPc/NPMs (A) e PMMA/ZnPc(FA),
PMMA/ZnPc(FO) (B) ........................................................................... 99
Figura 4.23 Perfil de liberao do encapsulamento da
PMMA/ZnPc(FO), PMMA/ZnPc(FA) e PMMA/ZnPc/NPMs ........... 101
Figura 4.24 Modelos matemticos que descrevem a cintica de
liberao do frmaco: ordem zero (A) e Higuchi (B).......................... 103
Figura 4.25 Estudos de toxicidade (ausncia de luz) e de atividade
fotobiolgica (irradiao de luz: 40 J/cm2) em cultura de clulas
A549 das nanopartculas de PMMA contendo ou no ZnPc. Dose
por poo: 5 g ZnPc e tempo de incubao de 4 horas. Mdia
desvio padro de seis experimentos independentes.
*Significativamente menor do que o controle na ausncia de luz (p <
0,05 ANOVA) ..................................................................................... 105

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Frmacos encapsulados com materiais polimricos

disponveis no mercado ......................................................................... 45
Tabela 2 Sntese das NPMs estabilizada com AO.............................. 61
Tabela 3 Preparao das solues 1 e 2 ............................................. 62
Tabela 4 Formulaes utilizadas para a preparao das
miniemulses......................................................................................... 63
Tabela 5 Propriedades magnticas das NPMs com AO ..................... 77
Tabela 6 Distribuio de tamanho de partculas e ndice de
polidispersidade das nanopartculas polimricas com NPMs................ 80
Tabela 7 Propriedades magnticas das NPMs revestidas com cido
olico e das NPMs encapsuladas com MMA ........................................ 82
Tabela 8 Distribuio de tamanho de gotas e partculas e ndice de
polidispersidade das nanopartculas polimricas com ZnPc ................. 88
Tabela 9 Rendimento do processo e concentrao mssica de
ZnPc nas nanopartculas polimricas .................................................... 90
Tabela 10 Rendimento do processo e concentrao mssica de
ZnPc nas nanopartculas polimricas com NPMs ................................. 95
Tabela 11 Propriedades magnticas das nanopartculas polimricas
contendo ZnPc e NPMs ......................................................................... 98
Tabela 12 Estudo da cintica de liberao das amostras de
PMMA/ZnPc(FO), PMMA/ZnPc(FA) e PMMA/ZnPc/NPMs. .......... 104

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AIBN - azobisisobutironitrilo
ANOVA anlise estatstica
ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
AO cido olico
DHE hematoporfirina
DMEN Meio Dulbecos Modificado
DMSO Dimetilsulfxido
DRX Difratmetro de Raio-X
INCA Instituto Nacional do Cncer
IPD ndice de Polidispersividade
LCME Laboratrio Central de Microscopia Eletrnica
MET Microscopia Eletrnica de Transmisso
MMA Metacrilato de metila
MTT - Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
NPMs Nanopartculas Magnticas
OMS Organizao Mundial de Sude
PLGA poli(cido lactico-co-gliclico)
PMMA poli (metacrilato de metila)
R Rendimento de Processo
SDS Dodecil Sulfato de Sdio
TFD Terapia Fotodinmica
TFS SDS Tampo fosfato Salino contendo 2% de Dodecil sulfato de
Sdio
TFS Tampo Fosfato Salino
TGA Termogravimetria
TV Temperatura de Verwey
UV Ultravioleta
Vis Visvel
MAV Magnetmetria de Amostra Vibrante
ZnPc Ftalocianina de Zinco

LISTA DE SMBOLOS
ClFe3 Cloreto Frrico
C18H34O2 cido Olico
DPG Dimetro mdio das gotas
DPT Dimetro mdio das partculas
Fe3O4 Magnetita
-Fe2O3 Hematita
y-Fe2O3 Maghemita
H2O gua
H2SO4 Sulfato Ferroso
Hc Campo coercivo ou coercividade
KH constante de liberao de Higuchi
log logaritmo
Mr Magnetizao remanescente
Ms Magnetizao de saturao
NH4OH Hidrxido de Amnia
Pc Ftalocianina
Qt quantidade de frmaco liberado no tempo
Q0 quantidade inicial do frmaco na soluo
Kt constante de liberao de primeira ordem
Zn Zinco

SUMRIO

1. INTRODUO ............................................................................... 31
1.1 OBJETIVOS ............................................................................... 32
2. REVISO DE LITERATURA....................................................... 35
2.1 CNCER .................................................................................... 35
2.1.1 Tratamento do Cncer.......................................................... 36
2.2 NANOPARTCULAS MAGNTICAS (NPMs) ....................... 36
2.2.1 Estudo das NPMs................................................................. 36
2.2.2 Aplicaes das NPMs .......................................................... 37
2.2.3 Estabilidades das NPMs ...................................................... 38
2.2.4 Propriedades Magnticas das NPMs.................................... 39
2.2.5 Mtodos de preparao das NPMs....................................... 43
2.3 NANOPARTCULAS POLIMRICAS ..................................... 44
2.4 MTODOS MAIS UTILIZADOS NA PREPARAO DE
NANOPARTCULAS POLIMRICAS ..................................... 46
2.4.1 Polimerizao Interfacial (in situ)........................................ 47
2.4.2 Polimerizao em miniemulso (in situ) ............................. 48
2.4.3 Nanoprecipitao (polmero pronto) ................................... 50
2.5 POLMEROS UTILIZADOS NO
NANOENCAPSULAMENTO DE FRMACOS ...................... 51
2.6 FTALOCIANINA DE ZINCO (ZNPC) PARA O
TRATAMENTO FOTODINMICA ......................................... 52
2.7 ATIVIDADE FOTOBIOLGICA ............................................. 54
2.8 ENCAPSULAMENTO SIMULTNEO DE
MEDICAMENTOS ANTICNCER E NPMS .......................... 56
3. MATERIAIS E MTODOS ........................................................... 59
3.1 REAGENTES ............................................................................. 59
3.2 UNIDADES EXPERIMENTAIS ............................................... 59

3.2.1 Preparo da NPMs estabilizadas com AO............................. 59

3.2.2 Preparao das Miniemulses ............................................. 60
3.3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS .................................. 60
3.3.1 Sntese das NPMs estabilizadas com AO ............................ 60
3.3.2 Encapsulamento simultneo da ZnPc com NPMs via
polimerizao em miniemulso com auxlio da tcnica de
nanoprecipitao ................................................................. 61
3.3.3 Encapsulamento da ZnPc via polimerizao em
miniemulso com auxlio da tcnica de nanoprecipitao .. 64
3.3.4 Encapsulamento das NPMs via polimerizao em
miniemulso ........................................................................ 65
3.4 MTODOS DE CARACTERIZAO ..................................... 66
3.4.1 Dimetro Mdio das Nanopartculas ................................... 66
3.4.2 Clculo do Rendimento do Processo (R%) ......................... 66
3.4.3 Microscopia Eletrnica de Transmisso (TEM) .................. 67
3.4.4 Termogravimetria (TGA) .................................................... 67
3.4.5 Cromatografia Gasosa (CG) ................................................ 68
3.4.6 Gravimetria .......................................................................... 68
3.4.7 Difrao de Raio X ........................................................... 68
3.4.8 Magnetmetria de Amostra Vibrante (MAV) ..................... 69
3.4.9 Espectrofotmetro UV/Vis .................................................. 69
3.4.10 Perfil de Liberao in vitro ................................................ 70
3.4.11 Avaliao da Toxicidade e atividade Fotobiolgica das
nanopartculas polimricas em cultura de clulas
tumorais............................................................................. 71
4. RESULTADO E DISCUSSO ...................................................... 73
4.1 OBTENO E CARACTERIZAO DAS NPMS
ESTABILIZADAS COM AO .................................................... 73
4.1.1 Difrao de RaioX - DRX ................................................. 73
4.1.2 Microscopia Eletrnica de Transmisso MET ................. 74
4.1.3 Anlise termogravimtrica TGA ...................................... 76
4.1.4 Propriedade Magnticas das NPMs MAV........................ 76

4.2 ENCAPSULAMENTO DAS NPMS VIA

POLIMERIZAO EM MINIEMULSO COM MMA........... 79
4.2.1 Microscopia Eletrnica de Transmisso MET e
Distribuio de tamanho por espalhamento de luz .............. 79
4.2.2 Difrao de Raio-X .............................................................. 80
4.2.3 Anlise Termogravimtrica TGA ..................................... 81
4.2.4 Propriedades Magnticas MAV ........................................ 82
4.3 ENCAPSULAMENTO DA ZnPc VIA POLIMERIZAO
EM MINIEMULSO ................................................................. 85
4.3.1 Caracterizao da ZnPc pela tcnica do UV-Vis ................. 86
4.3.2 Morfologia e distribuio de tamanho de partculas ............ 87
4.3.3 Caracterizao espectromtrica e rendimento do
processos das nanopartculas polimricas com ZnPc .......... 89
4.3.4 Difrao de Raio-X .............................................................. 90
4.4 OBTENO E CARACTERIZAO DAS
NANOPARTCULAS POLIMRICAS MAGNTICAS
COM ZNPC ................................................................................ 92
4.4.1 Morfologia e distribuio de tamanho das nanopartculas... 92
4.4.2 Caracterizao espectromtricas e rendimento do
processo das nanopartculas polimricas contendo ZnPc e
NPMs ................................................................................... 93
4.4.3 Difrao de Raio-X .............................................................. 95
4.4.4 Anlise Termogravimtrica TGA ..................................... 96
4.4.5 Propriedades magnticas das nanopartculas polimricas
contendo ZnPc e NPMs ....................................................... 96
4.5 CONVERSO GRAVIMTRICA............................................. 98
4.6 TESTE IN VITRO ..................................................................... 100
4.6.1 Perfil de dissoluo ............................................................ 100
4.6.2 Avaliao da toxicidade e da atividade fotobiolgica das
nanopartculas polimricas em cultura de clulas
tumorais ............................................................................. 104
5. CONCLUSES ............................................................................. 109
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................ 111

CAPTULO 1
INTRODUO

A liberao controlada (prolongada e/ou modulada) de frmacos

vem sendo alvo de estudos h algumas dcadas, sendo que estes estudos
ganharam impulso na dcada passada com o aprimoramento das tcnicas
de micro e nanoencapsulamento. Uma das reas mais promissoras de
vetorizao de frmacos. Dentre os vetores, incluem-se as
micropartculas e os sistemas coloidais (lipossomas e nanopartculas
polimricas). H algumas dcadas atrs o uso de lipossomas como
carreadores de frmacos era muito utilizado, devido suas propriedades
de elevada rea superficial (SOPPIMATH et al, 2000; KONERACKA et
al, 2008). No entanto, o uso de lipossomas vem se tornando cada vez
mais escasso devido a sua baixa eficincia de encapsulamento, sua
rpida liberao de drogas solveis em gua na presena de
componentes de sangue e tambm pela sua baixa estabilidade nos
fludos biolgicos e durante o armazenamento (SCHAFFAZICK et al,
2003). O encapsulamento do frmaco em nanopartculas polimricas
ajuda a aumentar a estabilidade e melhora o controle de liberao do
frmaco, apresentando assim vantagens acentuadas em relao aos
lipossomas (SOPPIMATH et al, 2000).
O cncer uma das principais causas de morte em todo o mundo
e hoje existem muitas pesquisas para o desenvolvimento de novos
tratamentos para cncer, sendo estes mais seletivos e menos agressivos
ao paciente, diminuindo assim os efeitos colaterais dos tratamentos
convencionais (ZAVISOV et al, 2008). Uma das alternativas mais
promissoras para o tratamento do cncer a Terapia Fotodinmica
(TFD). A TFD est baseada na administrao de frmacos conhecidos
como fotossensibilizadores, que so preferencialmente absorvidos e/ou
retidos pelos tecidos neoplsicos (SOARES et al, 2010). A ftalocianina
de zinco (ZnPc) um fotossensibilizador de segunda gerao, que
apresenta uma elevada absortividade molar na regio do espectro
eletromagntico correspondente a luz vermelha, sendo esta a regio que
apresenta a mxima transmitncia de luz atravs dos tecidos, e portanto,
a mais utilizado no tratamento de tumores. Entretanto, assim como a
ZnPc, a maior parte dos fotossensibilizantes possui caractersticas

32

hidrofbicas, o que constitui outro desafio. Pois, sendo pouco solveis

em gua so difceis de serem administradas em veculos
fisiologicamente aceitveis, podendo tambm ter a tendncia de se
agregar sendo este outro efeito negativo (STORPIRTIS et al, 2009). A
baixa seletividade e a baixa solubilidade em gua podem ser resolvidas
com o desenvolvimento de tcnicas de liberao apropriadas e com o
encapsulamento do frmaco.
Nanopartculas de xidos de ferro so estudados h algumas
dcadas. Desde o primeiro trabalho publicado por STONER e
WOLHFARTH (1948) muitos outros foram desenvolvidos. O interesse
nestas nanopartculas magnticas (NPMs) aumentou quando na dcada
de 60 evidenciou-se que estes xidos de ferro poderiam ser muito teis
para aplicaes biomdicas. Hoje as NPMs so usadas na ressonncia
magntica por Imagem (MRI), que tem aplicaes bem conhecidas na
rea de diagnsticos (ZHANG et al, 2003); na liberao de drogas
(GUPTA, 2004); e na hipertermia, que utilizada para queimar
clulas cancerosas muitas vezes em combinao com a quimioterapia
(LANDFESTER e RAMRES, 2003). O encapsulamento simultneo de
NPMs com um frmaco especifico desperta grande interesse pelo
potencial de um efeito sinergtico de atuao. Pode-se mencionar o
trabalho de ZAVISOVA et al (2007) que encapsularam a Indometacina,
um agente antinflamatrio, e nanopartculas de magnetita (Fe3O4) com
poli (cido - latico) (PLA) via nanoprecipitao e KONERACK et al
(2008) que encapsularam o taxol, um agente quimioterpico, e
nanopartculas de Fe3O4 com poli(cido-lactico-co-gliclico) (PLGA)
via nanoprecipitao. Vale destacar que no foi encontrado na literatura
nenhum trabalho que tenha realizado o encapsulamento simultneo de
frmacos e NPMs via a tcnica de polimerizao em miniemulso.
Sabendo que ZnPc um frmaco eficaz no tratamento de clulas
cancergenas e as NPMs podem ser utilizadas para destruir as clulas
cancergenas por hipertemia, h uma grande possibilidade que o
encapsulamento simultneo destes compostos apresente um efeito
sinergtico no tratamento do cncer, que possa representar um grande
avano teraputico.
1.1 OBJETIVOS
Este trabalho tem como objetivo principal o encapsulamento
simultneo de NPMs (nanopartculas de magnetita) e ftalocianina de
zinco (ZnPc) via polimerizao do metacrilato de metila (MMA) em

33

miniemulso permitindo a obteno de nanopartculas de PMMA

contendo ZnPc e NPMs.
Como objetivos secundrios pode-se destacar a:
Sntese e caracterizao das NPMs (nanopartculas de
magnetita), bem como o encapsulamento destas nanopartculas
via a tcnica de polimerizao em miniemulso com a
conseqente caracterizao das nanopartculas aps a
encapsulamento.
Encapsulamento da ZnPc via polimerizao do MMA em
miniemulso. Esta etapa tem o desafio adicional da baixa
solubilidade da ZnPc em gua e tambm no monmero, MMA,
utilizado nas reaes de polimerizao. Esta etapa inclui a
determinao de teor de ZnPc encapsulado.
Encapsulamento simultneo da ZnPC e NPMs via polimerizao
de MMA em miniemulso. Caracterizao das nanopartculas de
PMMA contendo ZnPC e NPMs.
Realizao de testes in vitro para avaliar a toxicidade das
nanopartculas, fototoxicidade das nanopartculas em clulas
tumorais A549 e ensaios de liberao do frmaco.

CAPTULO 2
REVISO DE LITERATURA

Neste capitulo ser apresentada uma breve reviso de literatura

acerca dos assuntos tratados neste trabalho. Primeiramente ser
apresentada uma breve introduo referente ao cncer e seus tratamentos
disponveis. Na seqncia ir ser comentado um pouco sobre as NPMs,
suas propriedades qumicas e fsicas e suas aplicaes na rea
biomdica. Em seguida sero apresentadas algumas tcnicas para
preparao das nanopartculas polimricas e por fim ser apresentada
uma reviso da ftalocianina de zinco (ZnPc) e da terapia fotodinmica
(TFD).
2.1 CNCER
Segundo o Instituto Nacional do Cncer (INCA), o cncer o
nome dado a um conjunto de mais de 100 doenas que tm em comum o
crescimento desordenado de clulas, que invadem tecidos e rgos.
Dividindo-se rapidamente, estas clulas tendem a ser muito agressivas e
incontrolveis, determinando a formao de tumores malignos, que
podem espalhar-se para outras regies do corpo.
Dados da Organizao Mundial de Sade (OMS), mostram que o
cncer a segunda principal causa de mortes em todo o mundo,
perdendo apenas para doenas cardiovasculares. Segundo o relatrio, os
casos de cncer dobraram entre 1975 e 2000, e devem duplicar
novamente entre 2000 e 2020. Em 2030, o cncer poder matar 17
milhes de pessoas, contra os 7,6 milhes de bitos que provocou em
2007, adverte o relatrio. Os maiores ndices de bito ocorrem nos
casos de cncer de pulmo, estmago fgado, clon e mama. O cncer
de pulmo o mais comum de todos os tumores malignos e permanece
como uma doena altamente letal. No Brasil, o INCA estima 500 mil
novos casos de cncer neste ano de 2011.

36

2.1.1 Tratamento do Cncer

O tratamento clssico do cncer envolve diversas terapias como a
quimioterapia, a cirurgia e a radioterapia. Os objetivos da quimioterapia
e da radioterapia so impedir proliferao celular e promover a
destruio das clulas tumorais, que so mais susceptveis morte por
possurem uma maior velocidade de crescimento do que as clulas
sadias (SOARES, 2009). No entanto estes tratamentos convencionais
tambm interferem nas clulas sadias e por isso existe um grande
esforo para o desenvolvimento de novos tratamentos para o cancr,
sendo estes mais seletivos que os tratamentos convencionais. O
Tratamento com NPMs e a TFD so considerados tratamentos
promissores para o combate do cncer por apresentar alta seletividade,
ou seja, a droga atua diretamente nas clulas tumorais no danificando
assim as clulas sadias.
Nos prximos captulos ser discutido um pouco mais sobre estas
novas tecnologias para o combate do cncer, tendo como nfase o
tratamento com NPMs e o tratamento com frmaco fotodinmico
(ZnPc).
2.2 NANOPARTCULAS MAGNTICAS (NPMS)
2.2.1 Estudo das NPMs
xidos de Ferro vm sendo alvo de estudos na escala nano mais
do que qualquer outro material h algumas dcadas. xidos de ferro
existem em muitas formas na natureza como magnetita (Fe3O4),
maghemita (Fe2O3), e hematita (-Fe2O3), sendo esta provavelmente a
mais comum (TEJA e KOHN, 2009).
O primeiro trabalho publicado foi por Stoner e Wolhfarth (1948)
e logo em seguida muitos outros trabalhos envolvendo NPMs foram
publicados. At os anos 60, muitas tcnicas de preparao de xido de
ferro na escala nanomtrica tinham sido desenvolvidas. Com este grande
interesse neste material, levou-se a especulao que estes xidos de
ferro poderiam ter aplicaes tambm na rea de biologia e mdica
(GRADY, 2002). A partir destes trabalhos muito outros foram
desenvolvidos e muitos mtodos para a preparao de xidos de ferro
foram descritos. Para uma determinada aplicao, sendo ela tecnolgica
ou biomdica, os mtodos de preparao podem influenciar na

37

caracterstica final do material, sendo assim, cada mtodo de preparao

pode ser especifico para uma determinada aplicao (GRADY, 2002).
2.2.2 Aplicaes das NPMs
As propriedades magnticas dos xidos de ferro tm sido
exploradas em uma ampla gama de aplicaes incluindo selos
magnticos, tintas, gravao magntica, catalisadores e ferrofluidos,
mostrando assim o grande interesse neste material, como comentado
anteriormente (TEJA e KOHN, 2009). Para determinadas aplicaes
como nas aplicaes biomdica importante sempre lembrar que as
NPMs tm que apresentar caractersticas bem definidas.
As NPMs para aplicaes na rea biomdica se enquadram em
duas categorias: as que envolvem o uso in vivo e o uso in vitro. Como
exemplo de aplicaes biomdicas in vitro e in vivo pode-se citar a
Ressonncia Magntica por Imagem (MRI), que tem aplicaes bem
conhecidas na rea de diagnsticos, como contrataste para MRI
(ZHANG et al, 2003); liberao de drogas, que alm de seu tamanho
reduzido e baixa toxicidade para o homem, as NPMs podem ser
transportadas atravs de um campo magntico, penetrando
profundamente no tecido humano (GUPTA, 2004); A Hipertermia
(Figura 2.1) utilizada para queimar clulas cancerosas, muitas vezes
em combinao com quimioterapia (LANDFESTER e RAMRES,
2003), sendo que fato conhecido que as clulas cancergenas so mais
sensveis a temperaturas superiores a 41 C do que os seus homlogos
normais. Isolamento Celular onde NPMs quando exposta a um campo
magntico externo permite a separao de uma grande variedade de
entidades biolgicas, como exemplos pode-se citar, o isolamento das
clulas cancerosas em amostras de sangue ou de clulas estaminais de
medula ssea para permitir a melhoria do diagnstico e eliminao de
toxinas do corpo humano (GRADY, 2002).

38

Figura 2.1 Ilustrao do tratamento do cncer por hipertermia

Apesar deste vasto leque de aplicaes na rea biomdica

algumas destas aplicaes podem apresentar riscos, sendo de
fundamental importncia a compreenso de suas propriedades e
interaes com clulas, tecidos e rgos do homem, sendo este,
considerado mais um desafio cientfico que deve ser abordado para
verificar a viabilidade da utilizao da nanobiotecnologia em aplicaes
biomdicas (LANDFEST e RAMIRES, 2003).
2.2.3 Estabilidades das NPMs
Nanopartculas dispersas em fluidos magnticos tendem a se
aglomerar espontaneamente para reduzir a grande energia livre de
superfcie. Como essa agregao ocorre por meio de processos lentos, o
fluido pode apresentar propriedades inalteradas por longos perodos de
tempo. No entanto no se trata de uma situao de estabilidade
termodinmica, mas apenas de uma transformao muito lenta. Este tipo
de situao recebe o nome de estabilidade coloidal que , portanto, uma
estabilidade cintica (DURN et al, 2006).
Para promover a estabilidade coloidal necessria a introduo
de fatores que se contraponham as interaes atrativas de Van de Waals,
que, embora sejam de curto alcance, so suficientemente fortes para
provocar a agregao irreversvel das nanopartculas (ROSENSWEIG,
1985). Entender as propriedades magnticas um tema central no
estudo de colides magnticos. As propriedades de NPMs resultam

39

tanto de caractersticas intrnsecas quanto das interaes entre as

nanopartculas. Assim as propriedades macroscpicas so largamente
afetadas pela sua estrutura microscpica.
A Fe3O4 apresenta uma estrutura octadrica e tetradrica com os
ons de Fe(III) ligados s duas estruturas. Desta forma a Fe3O4 apresenta
uma forma cristalina de maior qualidade quando comparado a outros
xidos de ferro como, por exemplo, a Fe2O3 que apresenta os ons de Fe
(III) apenas na estrutura octadrica (Figura 2.2) (ZHANG e KOHLER,
2002).
Os ons de Fe (II) na Fe3O4 esto ligados na estrutura Octadrica
tendo o stio todo preenchido e organizado. Enquanto que na y-Fe2O3
dois teros (2/3) dos stios esta preenchidos e os outros vagos. Haneda e
Morrish (1977), afirmam que partculas menores que 20 nanmetros
(nn) apresentam em sua estrutura, stios cada vez mais vagos,
diminuindo ainda mais sua qualidade cristalina (TEJA e KOHN, 2009).

Figura 2.2 Estrutura Cristalina da y-Fe2O3 (a) e Fe3O4 (b) (TEJA e

KOHN, 2009)

2.2.4 Propriedades Magnticas das NPMs

Segundo Rezende (1996), dependendo da origem microscpica
de sua magnetizao e das interaes internas, os materiais so
comumente classificados em uma das seguintes categorias:
Diamagnetismo
Paramagnetismo
Ferromagnetismo
Ferrimagnetismo
Antiferromagnetismo

40

Quando se fala em propriedades magnticas de xidos de ferro

dependendo da temperatura e volume, estas podem apresentar-se com
propriedades paramagntico, ferromagntico, ferrimagntico e
superparamagntico. Como um exemplo de um xido de ferro podemos
citar a Fe3O4, que apresenta propriedades ferromagnticas na escala
micromtrica e propriedades superparamagntica na escala nanomtrica
(10-20nm) (DAVE, GAO, 2009; ROSENSWEIG, 1985). Na Figura 2.3
pode-se observar o comportamento magntico de um material
ferromagntico e superparamagntico.

Figura 2.3 Comportamento magntico de nanopartculas

ferromagnticas e superparamagntica, quando expostos a um campo
magntico externo (DAVE e GAO, 2009)

Materiais ferromagnticos quando desmagnetizadas so divididos

em pequenas regies, denominadas domnios onde todos os momentos
magnticos esto ordenados. Quando a amostra colocada em um
campo magntico externo os domnios tendem a se alinhar com o campo
(Figura 2.3) alcanando um valor de magnetizao mximo (Grau de
Saturao) (SINNERKER, 2000). Quando o material apresenta um
tamanho bastante reduzido os domnios se fundem em um nico,
gerando uma partcula mono-domnio. O tamanho para o qual um
material nanoestruturado passa de multi-domnio para mono-domnio
depende de cada material, sendo conhecido como tamanho crtico. Caso
a partcula formada seja esfrica, chama-se dimetro crtico. Quando o
material apresenta o dimetro maior que o dimetro crtico, este se
apresenta como multi-domnio; se o dimetro for menor que o crtico a
partcula se apresenta mono-domnio. A Figura 2.4 traz a representao
de partculas multi e mono-domnio dependentes do dimetro crtico que
o material apresenta (COUTO, 2006).

41

Figura 2.4 Representao de uma partcula multi-domnio e monodomnio. (COUTO, 2006)

Na Figura 2.5 pode-se observar o comportamento da

magnetizao (M) em funo do campo magntico (H) sendo este
caracterstico de um material magneticamente duro como o ao
temperado (preparado por aquecimento, seguido de resfriamento
brusco). Aplicando-se um campo no material inicialmente
desmagnetizado, este seguira uma curva at atingir um patamar
constante chamado de magnetizao de saturao (Ms). Diminuindo o
campo a partir deste valor a Ms decresce mais lentamente seguindo o
sentido dado pela seta, at um valor residual da magnetizao para um
campo nulo chamado de magnetizao remanescente (Mr). O material
permanece magnetizado sem aplicao de campo como os ims de
geladeira. Invertendo o sentido do campo seguindo no mesmo sentido da
curva para valores de M menores que Mr at que a magnetizao se
anule para um determinado valor de campo chamado de campo coercivo
(Hc) (SINNEKER, 2000).

Figura 2.5 Curva de histereses (RIBEIRO, 2000)

42

Neste caso se continuar a variar o mdulo de campo, chega-se

novamente a uma regio de saturao e repetindo o ciclo no sentido
inverso obtemos uma curva fechada que chamada de ciclo de
histerese. No entanto materiais com dimenses extremamente pequenas
como as NPMs de Fe3O4 apresentam um nico domnio, tambm
denominado de mono domnio magntico. Neste contexto cada tomo
de uma partcula faz parte de um arranjo magneticamente alinhado em
uma nica direo e portanto, o momento magntico total a soma de
todos os momentos atmicos da partcula (CULLITY, 1972).
Quando uma partcula de mono-dominio uniformemente
magnetizada com spins apontados em uma nica direo, a
magnetizao vai ser revertida por rotaes dos spins, j que no tem
parede para impedi-la. Assim como o Hc necessrio para reduzir a
magnetizao para zero, ser alto, as nanopartculas de mono-dominio
apresentaro alta Hc. Esse efeito inicia quando as partculas comeam a
diminuir e a energia trmica comea a se equiparar a energia necessria
para reverter a direo do spin e formando um estado
superparamagntico. Diz-se que uma partcula superparamagntica a
uma dada temperatura se o seu tempo caracterstico, ou tempo de
relaxao, for menor que o tempo necessrio para realizar a medida.
importante destacar aqui que ento a definio se uma partcula
superparamagnetica ou no vai depender do tempo necessrio para
realizar as medidas. A figura 2.6 ilustra uma curva de um material que
no manifesta histerese no processo de magnetizao, tpico de um
material superparamagntico. (KNOBEL, 2000)

Figura 2.6 Curva de um material superparamagntico (SINNEKER,

2000)

43

A Fe3O4 apresenta uma magnetizao de saturao MS = 480

kA/m na temperatura ambiente e sua variao com a temperatura (Ms x
T), que define a temperatura de Curie da Fe3O4 como sendo de
aproximadamente 580C. A Fe3O4 apresenta uma transio quando
submetida baixas temperaturas. Abaixo de 120 K h um ordenamento
dos ons de Fe2+e Fe3+ na sub-rede octadrica e a unidade de cela
ligeiramente distorcida da simetria cbica para monoclnica (DUNLOP
e OSDEMIR, 1997).
Acima de 120 K o ordenamento se quebra, havendo um pulo
contnuo de um eltron de um Fe2+ para o seu vizinho Fe3+, convertendo
o Fe2+ para Fe3+ e vice-versa. Todas as direes sero equivalentes e a
rede perfeitamente cbica. Esta transio denominada de Transio
de Verwey (TV) e a mobilidade do eltron converte a Fe3O4 de um
isolante eltrico a um semicondutor. Acima da TV quebra-se a
ordenao do Fe3+, de tal modo que podem associ-la a uma populao
Fe2,5+, isto , cada stio ocupado pela metade do tempo por Fe2+ e outra
metade do tempo, por Fe3+. A constante de anisotropia
magnetocristalina da Fe3O4 negativa e tem o valor de 1,35x104J/m3 a
temperatura ambiente. Durante o resfriamento em baixas temperaturas, a
constante anisotrpica aumenta e zero a 135 K. A temperatura onde
isto ocorre (15C acima da temperatura de Verwey) chamada de ponto
isotrpico. As propriedades magnticas dependentes da anisotropia
magnetocristalina (magnetizao remanente, suscetibilidade magntica,
coercividade) mudam abruptamente em torno da TV (DUNLOP;
OSDEMIR, 1997).
O desenvolvimento de uma grande variedade de disperses
coloidais de NPMs de xidos de ferro superparamagnticos, devido as
posies de seus SPINs (Figura 2.3), que so capazes de atravessar a
barreira por um transporte direto ou at mesmo utilizando uma via
indireta e tambm para documentar leses ativas no crebro, como por
exemplo, a IMR como comentado anteriormente (CENGELLI et al,
2006).
2.2.5 Mtodos de preparao das NPMs
O Avano no uso de NPMs para aplicaes biomdicas depende
do mtodo de sntese com um controle da distribuio do tamanho das
nanopartculas, propriedades magnticas e as caractersticas superficiais
das nanopartculas (GUPTA, 2004). Nanopartculas de Fe3O4 podem ser
preparadas por uma variedade de mtodos fsicos e qumicos. Entre os
mtodos fsicos destacam-se o mtodo de sis coloidais por

44

desagregao, por deposio por vapor e do arco de Carbono (DURN

et al, 2006). Entre os procedimentos qumicos destacam-se o mtodo por
Co-precipitao em microemulso (micela reversa); decomposio de
compostos por coordenao; Decomposio por sonificao; Reduo
de ons metlicos e Co-precipitao em meio aquoso (TARTAJ et al,
2003).
O mtodo por co-precipitao em meio aquoso o mais utilizado
para preparao das nanopartculas de Fe3O4. Com este mtodo fcil
regular o valor do pH e o tamanho das nanopartculas, fatores que so de
extrema importncia para a qualidade final das NPMs (ZHU e WU,
2003). A preparao das NPMs consiste na co-precipitao dos ons
metlicos em solues aquosas atravs de reaes de hidrolise alcalina
(DURN et al, 2006). A partir deste mtodo possvel produzir
nanopartculas de Fe3O4 com a adio de cido olico que permite a
suspenso e a estabilizao das mesmas como comentado anteriormente
(ZHANG et al, 2003).
2.3 NANOPARTCULAS POLIMRICAS
As nanopartculas polimricas so sistemas carreadores de
frmacos que apresentam dimetro inferior a 1 m, podendo variar de
tamanho dependendo do campo de aplicao (SCHAFFAZICK e
GUTERRES, 2003). Quando se fala em nanopartculas pode-se falar de
nanoesferas ou nanocapsulas como mostra a Figura 2.7. Nas nanoesferas
o frmaco esta homogeneamente disperso ou solubilizado na matriz
polimrica, obtendo assim um sistema monoltico, onde no possvel
identificar um ncleo diferenciado. Nanocapsulas so sistemas
vesiculares na qual o frmaco esta confinado em uma cavidade,
consistindo em um interior ncleo-liquido rodeado por uma matriz
polimrica (REIS et al, 2005).

45

Figura 2.7 As Figuras a e b mostra um esquema de

nanocapsulas. e as Figuras c e d apresentam um esquema de
nanoesferas (SCHAFFAZICK e GUTERRES, 2003)
A vetorizao de frmacos uma operao que visa modular e, se
possvel, direcionar totalmente a distribuio de uma substncia,
associando-a a um sistema apropriado, denominado vetor. Os vetores
podem ser classificados em trs grupos principais: primeira gerao (
necessria empregar um modo de administrao especial, exemplo:
Quimiembolizao), segunda gerao (no necessrio empregar um
modo de administrao, exemplo: nanoesferas e nanocpsulas), terceira
gerao (so capazes de reconhecer o alvo visado, exemplo: anticorpos)
(PUISIEUX e TREUTEL, 1988).
Uma das aplicaes mais promissoras para a utilizao de
nanopartculas polimricas quando falamos em vetorizao de frmacos
o tratamento de cncer, onde podemos encontrar muitos estudos
relacionados ha vetorizao de frmacos anticancergenos. A Tabela 1
mostra alguns frmacos disponveis no mercado, encapsulados com
materiais polimricos.
Tabela 1 Frmacos encapsulados com materiais polimricos
disponveis no mercado
Medicamentos

Disponibilidade

Tratamento

Adagen
Zinostatin Stimaler
Oncaspar
PEG-INTRONTM
PEGASYS
PEGvisomant

No mercado
No mercado
No mercado
No mercado
No mercado
No mercado

SCDI Sndrome
Cncer
Cncer
Cncer
Hepatite C
Acromegalia

46

2.4 MTODOS MAIS UTILIZADOS NA PREPARAO DE

NANOPARTCULAS POLIMRICAS
Existem vrios mtodos relatados na literatura para a preparao
de nanopartculas polimricas, os quais podem ser, de uma forma geral,
classificados em mtodos baseados na polimerizao in situ de
monmeros dispersos ou na precipitao de polmeros pr-formados
como mostra a Figura 2.8. (SCHAFFAZICK et al 2003). Entre os
principais mtodos para preparao nanopartculas polimrica in situ
podemos destacar a polimerizao interfacial, polimerizao em
emulso e miniemulso. J na tcnica de polimerizao com polmero
pr-formados pode-se destacar o mtodo de nanoprecipitao e
emulsificao e evaporao de solvente.

Figura 2.8 Mtodos usuais para preparao de nanopartculas

polimricas (SCHAFFAZICK et al, 2003)

Muitos dos monmeros adequados para um processo de

polimerizao micelar em uma fase aquosa, podem apresentar uma
baixa biodegradao ou no serem polmeros biodegradveis. Alm

47

disso, as molculas residuais no meio da polimerizao (monmero,

oligmero, surfactante etc) podem ser txicas, necessitando de
purificao meticulosa do material coloidal. Para evitar essas limitaes,
mtodos que utilizam polmeros pr-formados, em vez de monmeros,
polimeros prontos tm sido propostos na literatura (REIS et al, 2005). A
partir de agora ser apresntado os principais mtodos aplicados na
preparao de nanopartculas polimricas.
2.4.1 Polimerizao Interfacial (in situ)
Muitos dos polmeros produzidos comercialmente a altas
temperaturas podem ser obtidos tambm a baixas temperaturas
utilizando-se as reaes de Schotten-Baumann a partir do uso de cido
clordrico (ODIAN, 2004). A tcnica de utilizao destes reagentes a
baixas temperaturas denomina-se polimerizao interfacial. Na tcnica
da polimerizao interfacial (Figura 2.9), como o prprio nome sugere a
reao de polimerizao entre dois reagentes realizada na interface
entre duas fases lquidas, cada uma contendo um dos reagentes. A
reao de poliamidao realizada em temperatura ambiente utilizandose uma soluo aquosa de diamina no topo de uma fase orgnica
contendo o cido clordrico. O mecanismo desta tcnica composto pela
etapa de difuso dos reagentes at a interface das fases, seguida pela
reao de polimerizao. O polmero formado na interface
continuamente removido na forma de um filme ou filamento, conforme
a Figura abaixo. Se o sistema for agitado, o polmero produzido
apresenta a forma de partculas fibrosas (NOGUEIRA et al, 2002).

Figura 2.9 Esquema de uma polimerizao interfacial (ODIAN, 2004)

48

2.4.2 Polimerizao em miniemulso (in situ)

Miniemulses so classicamente definidas como disperses
aquosas de gotculas de leo relativamente estveis, dentro de uma faixa
de tamanhos de 50-500 nm, preparadas por um sistema contendo leo,
gua, surfactante e um co-estabilizador (LANDFESTER et al, 2009).
Nos ltimos 25 anos, a tcnica de polimerizao em miniemulso tem
crescido muito e vem sendo o foco de uma grande quantidade de
trabalhos acadmicos. Durante este tempo alguns produtos baseados
nesta tecnologia foram comercializados e, nos prximos anos uma srie
de novos produtos ser comercializado utilizando esta tcnica de
polimerizao (SCHORK et al, 2005).
A tcnica de polimerizao convencional em emulso e a tcnica
de polimerizao em miniemulso so diferentes. Na polimerizao em
emulso o monmero sai das gotas, e vai formando oligmero na fase
aquosa pela reao com radicais oriundas da decomposio do iniciador
hidroflico, e quando se torna hidrofbico pelo aumento da cadeia
apolar, entra nas micelas, como mostra a Figura 2.10. Na polimerizao
em miniemulso (Figura 2.11) as gotas so sub-micromtricas. Na
primeira etapa do processo de polimerizao, pequenas gotas de 50-500
nm so formadas pela disperso de um sistema contendo a fase dispersa
(monmero, co-estabilizador) sendo que o iniciador pode ser hidroflico
ou hidrofbico, a fase contnua (gua e surfactante). O sistema obtido
atravs de um equipamento de alto cisalhamento, como por exemplo,
sonda de ultra-som. Na segunda etapa, estas gotas so polimerizadas
pela adio de iniciador e/ou aumento da temperatura. O tamanho das
gotas, diretamente depois do preparo da miniemulso, depende
principalmente das quantidades e tipos de surfactante e co-estabilizador
e das condies de disperso (LANDFESTER, 2006).
A degradao difusional (Ostwald ripening) e a coalescncia
podem levar a desestabilizao e subseqente perda da miniemulso
(CAPEK, 2004). Para criar uma miniemulso estvel, as gotas devem
ser estabilizadas contra a degradao de Ostwald causada por processos
difusionais e contra a coalescncia por colises (ASUA, 2002). O coestabilizador aumenta a estabilidade da miniemulso consideravelmente,
pois este impede eficientemente a degradao das gotas menores.

49

Fase I

Fase II

Fase III

Figura 2.10 Etapas da Polimerizao em emulso (SAYER, 1999)

Figura 2.11 Etapas da Polimerizao em miniemulso (ASUA, 2002)

50

A miniemulso pode apresentar algumas vantagens sobre a

emulso convencional. Por exemplo, se a polimerizao envolve um
ingrediente muito insolvel, este apresenta dificuldade para passar pela
fase aquosa em emulso convencional, mas pode ser posto diretamente
nas gotas da miniemulso que so o lcus de polimerizao. O ltex
formado por miniemulso tambm pode apresentar uma viscosidade e
estabilidade coloidal diferente da emulso convencional. O dimetro
tpico de uma partcula polimrica formada por miniemulso est entre
30 660 nm. Um problema da polimerizao em miniemulso que o
co-estabilizador permanece nas nanopartculas polimricas depois da
polimerizao e pode ter um efeito negativo nas propriedades do
polmero (ASUA, 2002).
2.4.3 Nanoprecipitao (polmero pronto)
A tcnica de nanoprecipitao para a preparao de
nanopartculas polimricas, foi desenvolvida e patenteada por Fessi et al
(1989). Esta tcnica apresenta inmeras vantagens quando comparadas a
outras tcnicas, sendo uma tcnica simples, rpida e fcil de executar.
A nanoprecipitao ocorre por uma rpida dessolvatao do
polmero quando a fase orgnica adicionada, sob agitao, fase
aquosa (no-solvente) contendo surfactante. A precipitao do polmero
resultado de uma rpida difuso do solvente para o meio aquoso. O
frmaco imediatamente aprisionado ao polmero durante a
precipitao. Esta tcnica de nanoprecipitao nos permite a produo
de nanopartculas pequenas (100-300 nm) com distribuio unimodal
estreitas e uma grande variedade de polmeros pr-formados podem ser
utilizados, dependendo da aplicao de cada material preparado. Este
mtodo no necessita de um alto cisalhamento e nem de altas
temperaturas. Alm disso, os surfactantes muitas vezes nem so
necessario e os solventes txicos geralmente so excludos deste
processo (BILATI et al, 2004; FESSI et al, 1989; REIS et al, 2006).
YOO et al (2001) realizou experimento para encapsular lisozima.
Resumidamente YOO et al 2001, realizaram com sucesso a difuso de
uma soluo de dimetilsulfxido (DMSO), contendo ambas protenas e
o polmero (PLGA) em uma soluo aquosa com poloxamer 407. Este
trabalho evidenciou que a tcnica de nanoprecipitao pode ocorrer
mesmo com outros solventes,e
pode levar a formao de
nanopartculas, utilizando frmacos hidroflicas.

51

2.5 POLMEROS UTILIZADOS NO NANOENCAPSULAMENTO

DE FRMACOS
Polmeros so a classe mais verstil de biomateriais, sendo
amplamente aplicada nas diversas reas mdicas tais como a engenharia
de tecidos, implantes artificiais rgos, aparelhos mdicos, prteses,
lentes de contato, materiais odontolgicos e farmacuticos. Os recentes
progressos no domnio das nanotecnologias, bem como a investigao
activa na interface da qumica dos polmeros e da biomedicina abriu
oportunidades de usar novos sistemas polimricos nanomtricos em
biologia, engenharia biolgica molecular, diagnstico e teraputica
(BRIEN et al, 2010). Polmeros naturais so abundantes, geralmente
biodegradvel e oferecem boa biocompatibilidade. A maioria dos
sistemas de distribuio de drogas tm sido base de protenas (por
exemplo, colgeno, gelatina e albumina) e polissacardeos. Por exemplo,
a quitosana e seus derivados tm mostrado excelente
biocompatibilidade, biodegradabilidade, baixa imunogenicidade e
atividades biolgicas. No entanto a principal desvantagem de polmeros
naturais est associada sua complexidade estrutura. Ja os polmeros
sintticos vem ganhando espao em funo de sua estabilidade,
solubilidade e biocompatibilidade permitindo direcionamento seletivo
de drogas com um adequado perfil de liberao de farmacos (BRIEN et
al, 2010).
Muitos polmeros sintticos vm sendo testados para uso em
humanos. Alguns dos materiais que esto sendo usados comercialmente
em sistemas de liberao controlada de frmacos so: Poli (2-hidroxi etil
metacrilato), poli(N-vinil pirrolidona), poli(metil methacrilato),
poliacrilamida, polilactdeos (PLA), poliglicosdeos (PGA), poli(lactatoco-glicolato) (PLGA), poli(anidridos). (SOPPIMATH et al, 2000). No
entanto outros polmeros vm sendo testados como o poli(metacrilato de
metila) (PMMA), poli-(acetato de vinila) (PVAc), poli(uretano) (PU)
entre outros. importante sempre lembrar que para determinadas
aplicaes o polmero deve que apresentar biocompatibilidade, ser
biodegradvel e ainda apresenta baixa toxicidade (MUSYANOVYCH et
al, 2008).
Os polmeros, por dcadas, desempenharam uma funo
importante como excipientes em comprimidos e formulaes em
cpsula, agiram na area parenteral como potencializadores do tempo de
circulao no sangue, e agora so capazes de oferecer funes
sofisticadas (como liberao de frmacos no sitio especifico) aos
medicamentos. Os polmeros possuem propriedades nicas que no so

52

encontrados em compostos de baixo peso molecular gerando materiais

ricos com amplo espectro de aplicaes tanto na rea tecnolgia como
na rea biomdica (UCHEGBU e SHALTZLEIN, 2006).
2.6 FTALOCIANINA DE ZINCO (ZNPC) PARA O TRATAMENTO
FOTODINMICA
Ftalocianinas so compostos macrocclicos altamente conjugados
que apresentam propriedades como alta estabilidade trmica e qumica,
propriedades semicondutoras, reatividade fotoqumica, entre outras,
despertando assim o interesse para aplicaes em diversas reas (PERES
et al 2006). A ZnPc (Figura 2.12) um fotossensibilizador de segunda
gerao, que apresenta uma elevada absortividade molar na regio do
espectro eletromagntico correspondente luz vermelha, sendo esta a
regio que apresenta a mxima transmitncia de luz atravs dos tecidos,
e portanto, a mais utilizada no tratamento de tumores. Sua lipofilicidade
contribui para sua localizao nas membranas plasmticas, nos
microssomos e nas mitocndrias.

Figura 2.12 Ftalocianina de Zinco (KOVALSKAYA et al, 2000)

Para quem no conhece o procedimento, TFD parece ter

elementos mgicos. Um frmaco administrado sistmica ou
topicamente, acumula-se nos tecidos neoplsicos e, quando estes tecidos
so irradiados com uma luz no comprimento de onda visvel ocorre
erradicao do tumor. A Figura 2.13 traz as principais etapas da TFD
administrada intravenosa. A ZnPc tem sido muito estudada, entre outras
coisas, pelo fato de apresentar espectro de absoro muito menos

53

complexo que ftalocianinas com outros metais de transio (OLIVEIRA

et al 2004). A TFD consiste em modalidade teraputica que envolve a
ativao de substncias fotossensveis, fonte de luz e a gerao de
espcies citotxicas de oxignio e de radicais livres para promover a
destruio seletiva dos tecidos-alvos (RICCI-JNIOR e MARCHETTI,
2006; SOARES, 2009).

1- O Fotossensibilizante injetado na corrente sangunea;

2- Acumula-se preferencialmente no tumor;
3- Uma sonda de fibra ptica conduz luz at o tumor;
4- A luz ativa o frmaco, liberando espcies txicas que destroem as clulas.

Figura 2.13 Principais etapas da TFD (Henderson et al, 1992)

Os trabalhos clnicos pioneiros de Dougherty et al (1978), com o

uso sistmico do derivado de hematoporfirina (DHE) em TFD e a
posterior aprovao de seu derivado purificado (porfimer sodium) para
tratamento de certos tipos de tumores consistiram em avanos e
ampliaram as perspectivas da incluso da TFD no arsenal da teraputica
ontolgica (TOMAZINI et al, 2007). As nanopartculas de polmeros
biodegradveis podem oferecer uma soluo ideal para liberao
sustentada de agentes anti-cncer, porque eles so facilmente fabricados
e representam uma alternativa atraente que melhora a modulao da
entrega da droga, devido ao seu pequeno dimetro (< 1000 nn), podendo
ser usadas como transportadoras de drogas injetveis (TOMAZINI et al,
2007).
Estudos mais recentes tm comprovado a eficincia das
ftalocianinas como agentes fotossensveis para uso em TFD que j tem
seu emprego clnico aprovado na Rssia.

54

2.7 ATIVIDADE FOTOBIOLGICA

A atividade fotodinmica inicia-se quando o fotossensibilizante
absorve um fton de luz e sofre decaimentos que resultam em reaes
de transferncia de energia intramolecular. As principais classes de
reaes so foto-oxidao por radicais (Tipo I), foto-oxidao por
oxignio singlete (Tipo II) e fotorreao sem envolvimento do oxignio
(Tipo III) (SIBATA et al, 2000). As principais reaes esto
representadas na Figura 2.14 e a explicao de cada etapa est descrita a
seguir.

Figura 2.14 Mecanismos da TFD (RICCI-JNIOR, 2005)

h absoro de luz
S0 estado singlete fundamental
S1 estado singlete excitado
Tn segundo estado triplete excitado
T1 primeiro estado triplete excitado
Kf constante de velocidade de fluorescncia
Kp constante de velocidade de fosforescncia
ic converso intersistema
cis cruzamento intersistema
ks e kt constantes de decaimento no radioativo
R, X, R+ produtos de reao qumica (radicais livres)
H2O2, O2-, HO espcies reativas de oxignio
1
O2 oxignio no estado excitado singlete
3
O2 oxignio no estado fundamental (estado triplete)

Aps a absoro de um fton de luz, o fotossensibilizante no

estado fundamental (S0) ativado para um estado singlete excitado (S1).
Molculas nesse estado decaem rapidamente de volta ao estado
fundamental (S0) com a emisso de luz (fluorescncia) (Kf) ou calor

55

(Ks), ou podem ir ao estado triplete por cruzamento intersistema (cis). O

fotossensibilizante no estado triplete excitado (T1) pode decair para o
estado fundamental por fosforescncia (Kp) ou reagir de trs formas
(RICCI-JNIOR 2005): Reao de Tipo I: o fotossensibilizante no
estado triplete excitado (T1) reage diretamente com o substrato (3O2) e
transfere o tomo de hidrognio ou eltrons para gerar radicais livres
(R, X, R+). Essas espcies de radicais livres so geralmente altamente
reativas e podem rapidamente interagir com o oxignio molecular para
gerar espcies reativas do oxignio, como nions superxidos ou
radicais hidroxila, causando dano biolgico irreparvel; Reao de Tipo
II: o fotossensibilizante no estado triplete excitado (T1) transfere energia
diretamente para o oxignio molecular (3O2) para formar oxignio
singlete (1O2). O oxignio singlete extremamente reativo e pode
interagir com um largo nmero de substratos biolgicos, induzindo dano
oxidativo e morte celular; Reao de Tipo III: o fotossensibilizante no
estado triplete (T1) excitado absorve luz e gera radicais livres (RICCIJNIOR, 2005).
A reao de tipo II predominante no caso da ftalocianina de
zinco. A TFD induz a produo de agentes citotxicos que rapidamente
destrem as clulas neoplsicas; esta resposta afetada in vivo pela
complexidade dos sistemas biolgicos. Diversos alvos celulares podem
ser afetados durante a TFD, incluindo mitocndria, lisossomos,
membranas plasmticas, retculo endoplasmtico, aparelho de Golgi e
ncleo, e a morte celular pode ocorrer por necrose ou apoptose (RICCIJNIOR, 2005). A eficcia da TFD depende do tipo e concentrao do
fotossensibilizante, da sua localizao intra- e extracelular, da dose de
luz, do tempo entre a administrao do frmaco e a exposio luz e da
disponibilidade de oxignio (TRIESSCHEIJN et al., 2006).
Esses fatores podem modular trs processos independentes, mas
possivelmente relacionados, que contribuem para a eficincia da
destruio do tumor pela TFD: morte celular tumoral direta por necrose
ou apoptose; destruio da vasculatura no tumor e ativao da resposta
imune contra as clulas tumorais remanescentes (Figura 2.15)
(CASTANO et al, 2006). Inicialmente, a combinao de
fotossensibilizante e luz gera as espcies reativas de oxignio, como o
oxignio singlete (1O2), responsveis pela morte celular direta das
clulas tumorais, que pode ocorrer por necrose ou apoptose. O colapso
da microvascultura tambm observado logo aps a TFD. A destruio
da vasculatura associada ao tumor faz com que haja a privao local de
oxignio e nutrientes, resultando em hipxia severa e persistente, que
culmina com o infarto do tumor. Alm disso, a TFD capaz de ativar a

56

resposta imune contra as clulas tumorais. Essa resposta envolve a

atividade antitumoral das clulas inflamatrias induzidas pela TFD e a
gerao de uma resposta imunolgica antitumoral prolongada
(CASTANO et al, 2005a e 2005b).

PS: fotossensibilizante
1

O2: oxignio singlete

O2: oxignio triplete

Figura 2.15 Mecanismos de ao nos tumores na TFD (Adaptado de

CASTANO et al, 2006).

2.8 ENCAPSULAMENTO SIMULTNEO DE MEDICAMENTOS

ANTICNCER E NPMS
Nos ltimos anos a nanotecnologia vem estimulando o
desenvolvimento de novos medicamentos e tratamentos clnicos. Hoje
possvel sintetizar, caracterizar de modo especfico as propriedades
funcionais de nanopartculas, para aplicaes diversas, bem como de
diagnstico. Alm disso, nanoformulaes de drogas pequenas
entregues sistemicamente so mais eficazes e menos txicas do que o
mesmo medicamento entregue na forma livre. Esta eficcia de
nanopartculas com sistemas de liberao de drogas atribuda ao seu
pequeno tamanho, modificao da farmacocintica e sua
biodistribuio (SAIYED et al, 2010).
Nanopartculas polimricas magnticas tem sido consideradas um
sistema eficaz para o tratamento do cncer. Nanopartculas magnticas
contribuem para a entrega precisa do frmaco no sitio desejado. A
possibilidade de entregar a droga com uma alta concentrao no stio

57

especifico por influncia de um campo magntico pode reduzir

sensivelmente os efeitos colaterais e aumentar a eficcia teraputica
(KONERACKA
et al, 2008). Alguns trabalhos vm sendo
desenvolvidos com o encapsulamento simultneo de frmacos e NPMs
onde pode-se citar o encapsulamento da indometacina com NPMs
(ZAVISOVA et al, 2006) e o encapsulamento do Taxol com NPMs
(agente anticncer) (KONERACKA et al, 2008), sendo que ambos
utilizam a tcnica de nanoprecipitao.
No foi encontrado nenhum trabalho na literatura referente ao
encapsulamento simultneo de frmacos anticncer com NPMs,
utilizando a tcnica de polimerizao in situ. O presente estudo introduz
uma nova classe de material que permite combinar o tratamento do
cncer com a ao da TFD e Hipertemia, funcionando de forma
sinergtica.

CAPTULO 3
MATERIAIS E MTODOS

Com o objetivo de facilitar a compreenso da metodologia sero

descritos a seguir os equipamentos, reagentes e procedimentos
experimentais utilizados neste trabalho.
3.1 REAGENTES
Para a preparao das NPMs utilizou-se os seguintes reagentes:
gua destilada (H2O) cloreto frrico (ClFe3.5H2O), sulfato ferroso
(FeSO47H2O), hidrxido de amnia (NH4OH), cido olico (C18H34O2)
e acetona todos provenientes da VETEC Qumica. No encapsulamento
simultneo utilizou-se os seguintes reagentes: como monmero o
metacrilato de metila (MMA) da ARINOS Qumica, como iniciador o
AIBN (2,2azo bis-isobutironitrila) (VETEC qumica), como surfactante
a lecitina (Alfa Aesar), como co-surfactante o miglyol 82 (Sazol), como
frmaco a ftolacianina de zinco (ZnPc), como solvente a N-metilpirrolidona, ambos provenientes da Sigma Aldrich e gua destilada.
3.2 UNIDADES EXPERIMENTAIS
3.2.1 Preparo da NPMs estabilizadas com AO
Para o preparo das NPMs estabilizadas com AO utilizou-se um
agitador mecnico da marca IKA RW20 Digital, com um impelidor tipo
hlice com quatro ps constituindo um sistema de cisalhamento
produzindo um fluxo turbulento com uma velocidade de rotao de
aproximadamente 700 rpm. Tambm foi necessrio a utilizao de um
pHmetro da marca Hanna e de uma ultracentrfuga da marca BeckmamCoulter.

60

3.2.2 Preparao das Miniemulses

Para o preparo da miniemulso utilizou-se o homogenizador
Fisher Scientific, Sonic Dismembrator Model 500. Este equipamento
constitudo de um gerador, um conversor e uma sonda, atravs da qual
so emitidos ondas produzindo uma cavitao no sistema que resulta no
rompimento das gotas. A Figura 3.1 mostra o equipamento utilizado
para o processo de ultrasonificao antes das reaes de polimerizao
em miniemulso.

Figura 3.1 Homogeneizador Fisher Scientific, Sonic Dismembrator

Model 500, utilizado no processo de ultrasonificao

3.3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

3.3.1 Sntese das NPMs estabilizadas com AO
Para a preparao das NPMs utilizou-se o mtodo de coprecipitao em meio aquoso com a adio de FeSO47H2O e
ClFe3.6H2O na proporo molar 1:1 e logo em seguida adicionou-se
NH4OH controlando o pH inicial (1) e final (10) da reao, utilizando
uma temperatura ambiente e uma velocidade de agitao de 700 rpm.
Na segunda etapa adicionou-se o AO para estabilizar as NPMs. Depois
de estabilizadas o material foi lavado com acetona para retirar o excesso
de AO e logo em seguida a amostra centrifugada e lavada vrias vezes,
at que o excesso de AO seja removido totalmente. Na Tabela 2 pode-se
verificar o mtodo de preparao das NPMs estabilizadas com AO e a
Figura 3.2 ilustra o mtodo utilizado para a preparao das NPMs.

61

Tabela 2 Sntese das NPMs estabilizada com AO

Sntese

FeSO47H2O
(mol)

ClFe3.6H2O
(mol)

NH4OH
(ml)

C18H34O2
(ml)

NPMs com AO

0,030

0,031

10

25

Figura 3.2 Preparao das NPMs estabilizadas com AO por coprecipitao em meio aquoso

3.3.2 Encapsulamento simultneo da ZnPc com NPMs via

polimerizao em miniemulso com auxlio da tcnica de
nanoprecipitao
Para o encapsulamento simultneo da ZnPc com as NPMs foram
preparadas duas solues (Tabela 3). A primeira soluo contendo o
ZnPc com a N-metil-pirrolidona (NMP) numa concentrao de 0,3% de
massa da ZnPc em relao a NMP (RICCI-JNIOR e MARCHETTI,
2006) e a segunda soluo contendo as NPMs com o monmero (MMA)
com concentrao de 13,6% em massa das NPMs em relao ao
monmero. Enfatiza-se que quando se utiliza concentraes diferentes,
esta ser mencionada no decorrer do texto.

62

Tabela 3 Preparao das solues 1 e 2

Solues

NMP*

NPMs**

ZnPc***

MMA****

1 (0,3%)

2g

0,006g

2 (13,6%)

0,6g

2,2ml

* N-metil-Pirrolidona
** Nanopartculas Magnticas
*** Ftalocianina de Zinco
**** Metacrilato de Metila

A preparao destas solues importante para a seqncia da

reao, sendo que, a ZnPc como as NPMs precisam estar bem dispersas.
Para obter uma disperso homognea da soluo 1 e 2 utiliza-se um
banho de ultrassom at sua completa homogenizao. Na primeira etapa
em um bquer de 100 mL adiciona-se a fase aquosa (apenas a gua). O
dispersor ligado (etapa 1) e adiciona-se com um conta gotas a soluo
1 bem lentamente (ZnPc/N-metil-pirrolidona) (etapa 2). Na seqncia
adiciona-se a fase orgnica (soluo 2, MMA, lecitina, miglyol e AIBN)
(etapa 3) bem lentamente, com o auxlio de um conta gotas. O tempo de
sonicao de 5 minutos sem pausa com uma amplitude de 70%. O
dispersor ultrassnico emite ondas ultrassnicas de alta energia e para
evitar o aumento da temperatura e conseqentemente o inicio precoce da
reao, utiliza-se um banho de gelo.
A prxima etapa do encapsulamento o processo de
homopolimerizao, onde utilizou-se um banho termocriosttico uma
temperatura de 75 C por um perodo de 4hrs aproximadamente at a sua
completa polimerizao (etapa 4). Em seguida o material resfriado,
centrifugado e lavado vrias vezes com gua destilada (etapa 5). Na
prxima etapa o material seco e nesta etapa utiliza-se uma estufa com
uma temperatura pr-definida (60 C) por 24hrs aproximadamente
(etapa 6). Na Tabela 4 esto s formulaes utilizadas para a preparao
das miniemulses (ROMIO, 2007) e na Figura 3.3 pode-se observar
uma ilustrao da preparao das nanopartculas polimricas contendo
ZnPc e NPMs. Para o encapsulamento simultneo da ZnPc e NPMs a
concentrao mssica de xido de ferro foi de ~8%.

63

Tabela 4 Formulaes utilizadas para a preparao das miniemulses

Reagentes

A1

A2

A3

A4

A5

Soluo 1 0,3% (g)

2,006

2,006

2,006

Soluo 2 13,6% (g)

2,2

1,2

MMA(g)

Lecitina (g)

0,080

0,081

0,080

0,082

0,081

Miglyol (g)

0,090

0,091

0,090

0,090

0,091

AIBN (g)

0,041

0,041

0,042

0,042

0,041

gua destilada (g)

20,02

20,01

20,01

20,02

20,016

A1 PMMA
A2 PMMA/ZnPc(FA) polimerizao em miniemulso com auxlio da tcnica
de nanoprecipitao
A3 PMMA/ZnPc(FO) polimerizao em miniemulso
A4 PMMA/NPMs polimerizao em minemulso
A5 PMMA/ZnPc/NPMs polimerizao em miniemulso com auxlio da
tcnica de nanoprecipitao

Figura 3.3 Encapsulamento simultneo da ZnPc e NPMs com PMMA

via polimerizao em miniemulso com auxlio da tcnica de
nanoprecipitao (PMMA/ZnPc/NPMs)

64

3.3.3 Encapsulamento da ZnPc via polimerizao em miniemulso

com auxlio da tcnica de nanoprecipitao
Para o encapsulamento da ZnPc com MMA via polimerizao em
miniemulso com auxlio da tcnica de nanoprecipitao utiliza-se
apenas a soluo 1. Em um bquer de 100 mL adiciona-se a fase aquosa
(apenas a gua). O dispersor ligado (etapa 1) e adicionamos com um
conta gotas a soluo 1 bem lentamente (ZnPc/N-metil-pirrolidona)
(etapa 2). Na seqncia adiciona-se a fase orgnica (MMA, lecitina,
miglyol e AIBN) bem lentamente com auxlio de um conta gotas,
preparando assim uma miniemulso (etapa 3). Para o encapsulamento da
ZnPc o tempo de sonicao de 5 minutos sem pausa com uma
amplitude de 70%. A prxima etapa do encapsulamento o processo de
homopolimerizao, onde utilizou-se um banho termocriosttico a uma
temperatura de 75 C por 4hrs, ou seja, at a sua completa polimerizao
(etapa 4). Em seguida, o material resfriado, centrifugado e lavado
vrias vezes com gua destilada (etapa 5). Na prxima etapa o material
seco e nesta etapa utiliza-se uma estufa com uma temperatura prdefinida (60 C) por 24hrs aproximadamente (etapa 6). A Figura 3.4
ilustra o procedimento de encapsulamento da ZnPc.

Figura 3.4 Encapsulamento da ZnPc com MMA via polimerizao em

miniemulso com auxlio da tcnica de nanoprecipitao
(PMMA/ZnPc(FA))

65

Outro procedimento utilizado para o encapsulamento da ZnPc

com MMA a tcnica de miniemulso direta sem o auxlio da tcnica
de nanoprecipitao (Figura 3.5). Neste mtodo de encapsulamento a
soluo 1 dispersa na fase orgnica (MMA, lecitina, miglyol e AIBN).
A etapa de homopolimerizao, centrifugao e secagem a mesma
comentada anteriormente.

Figura 3.5 Encapsulamento da ZnPc com MMA via miniemulso

(PMMA/ZnPc(FO))

3.3.4 Encapsulamento das NPMs via polimerizao em miniemulso

No encapsulamento das NPMs via polimerizao em
miniemulso com MMA, utiliza-se apenas a soluo 2. Em um bquer
de 100 mL adiciona-se a fase aquosa (apenas a gua) e o dispersor
ultrassnico ligado (etapa 1) e adiciona-se a fase orgnica (soluo 2,
lecitina, miglyol e AIBN) bem lentamente com o auxlio de um conta
gotas (etapa 3). O tempo de sonicao de 5 minutos sem pausa, utilizase uma amplitude de 70%. A prxima etapa do encapsulamento das
NPMs o processo de homopolimerizao, onde o material colocado
dentro de um banho termocriosttico a uma temperatura de 75 C por
um perodo de 4hrs aproximadamente, at a sua completa polimerizao
(etapa 4). Em seguida o material resfriado, centrifugado e lavado
vrias vezes (etapa 5). Depois o material seco utilizando uma estufa a
vcuo com uma temperatura pr-definida (60 C) por 24hrs (etapa 6).

66

3.4 MTODOS DE CARACTERIZAO

3.4.1 Dimetro Mdio das Nanopartculas
O tamanho mdio das nanopartculas polimricas foram
determinados utilizando o equipamento Malvern Instruments Zeta Sizer
Nano S, que utiliza a tcnica de espalhamento dinmico de luz.
Conforme descrito no trabalho de Romio (2006), a amostra iluminada
por um feixe de laser e a luz espalhada pelas nanopartculas captada
por um cabo de fibra tica colocado em um determinado ngulo e
transmitida
para
o
tubo
fotomultiplicador
e
pulso
amplificador/discriminador, onde transformada em um sinal eltrico.
Como as partculas mudam de posio no fluido e em respeito s demais
devido ao movimento Browniano, estas interferem na intensidade de luz
captada pelo detector. As partculas maiores mudam de posio mais
devagar, e causam uma lenta flutuao de intensidade, ao contrrio das
menores, que se movem mais rapidamente e causam rpidas flutuaes
de intensidade. Estas flutuaes na intensidade contm informaes
sobre a taxa de difuso das partculas. Conhecendo-se o coeficiente de
difuso com a equao de Stokes-Einstein, obtm-se o tamanho de
partcula.
As amostras de ltex das reaes de MMA com ZnPc e NPMs
para a anlise do dimetro mdio das gotas e das partculas, foram
diludas em gua (3g/L) e desta forma evitar a difuso do monmero das
gotas para o meio. Aps cada anlise foi verificada a qualidade da
medida atravs do critrio de qualidade do equipamento. As amostras
com tamanhos fora da faixa de medida do equipamento (0,6 nm a 6 m)
e amostras muito polidispersas no apresentam critrio de qualidade.
3.4.2 Clculo do Rendimento do Processo (R%)
As nanopartculas polimricas depois de secas foram pesadas
para o calculo do rendimento do processo, avaliando assim o rendimento
final do processo de preparao das nanopartculas polimricas. O
clculo de rendimento do processo (R) podem ser realizados atravs da
Eq. 3.1.

67

M assa das nanopartculas rec.

aps a secagem x 100%
R(%)
M assa de M M A+
M assa de ZnPc da formulao

(Eq. 3.1)

3.4.3 Microscopia Eletrnica de Transmisso (TEM)

Para anlise da morfologia das NPMs e das nanopartculas
polimricas utilizou-se a tcnica Microscopia Eletrnica Transmisso
utilizando um equipamento da marca JEOL, modelo JEM 2100F de
100kV, que se encontra alocado no Laboratrio Central de Microscopia
Eletrnica LCME, da Universidade Federal de Santa Catarina
UFSC.
Na preparao das nanopartculas polimricas foi colocada uma
gota de ltex diludo em gua destilada (1 g de ltex para 10g de gua
destilada) em uma grade contendo parldio. Depois de 24hrs as grades
foram recobertas com carbono. O mesmo procedimento foi realizado
para as anlises do material magntico.
3.4.4 Termogravimetria (TGA)
A termogravimetria baseia-se no acompanhamento da mudana
de massa em funo da variao de temperatura de programao
controlada. A amostra slida pode sofrer uma taxa de aquecimento em
geral, na faixa de 1 a 50C/min. O equipamento composto basicamente
de uma micro-balana, um forno, termopares e um sistema de fluxo de
gs (inerte ou oxidante) (WENDHAUSEN et al, 2002).
As anlises termogravimtricas nos permitem obter informao
trmica sobre a estabilidade do material inicial e de qualquer material
intermedirio que possa ser formado at o composto qumico residual,
obtido at o final do processo de aquecimento. Estas anlises podem ser
usadas em uma variedade de investigaes como decomposio de
argilas a altas temperaturas e identificao de polmeros atravs de seus
parmetros de degradao (temperatura, resduos carbonceos, gases
envolvidos). Para a anlise utilizou-se um equipamento da marca Perkin
Elmer, Modelo TGA Pyris 1, utilizando 5mg de amostra seca, com
uma taxa de aquecimento de 10C/min.

68

3.4.5 Cromatografia Gasosa (CG)

A determinao da concentrao de monmero residual aps a
reao de polimerizao em miniemulso foi feita por Cromatografia
Gasosa (CG, Shimadzu GC2010AF), sendo elaborada uma curva de
calibrao com diferentes concentraes de metacrilato de metila
(MMA) em funo da rea do pico referente ao mesmo.
3.4.6 Gravimetria
A converso foi obtida atravs de dados gravimtricos, onde uma
alquota da amostra retirada periodicamente e a reao interrompida
imediatamente com a adio de uma soluo de 1% em massa de
hidroquinona em cpsulas previamente pesadas de alumnio.
A converso obtida por gravimetria (Xgrav) a razo entre a
massa do polmero presente no reator e a massa de monmero
alimentada. A massa de polmero calculada a partir do resduo seco
obtido pela evaporao de uma amostra de ltex em uma estufa com
conveco forada que se encontra a temperatura constante de 70C.
Para calcular a massa de polmero necessrio subtrair a massa de
hidroquinona adicionada e a frao de slidos no polimricos, tais
como iniciador, surfactante e co-estabilizador, presentes no resduo
seco.
3.4.7 Difrao de Raio X
A difrao de raios-X (DRX) uma ferramenta til para a medida
do grau de cristalinidade de polmeros e outros materiais. A informao
primria geralmente obtida das anlises a estrutura de polmeros
semicristalinos. A cristalinidade do polmero pode ser obtida atravs da
medida de intensidade relativa dos picos de difrao nas partes cristalina
e amorfa. Quando a estrutura ordenada, a interferncia das radiaes
com os segmentos da cadeia polimrica mais acentuada, permitindo
distinguir essas estruturas das regies amorfas, desordenadas. A
intensidade de tais interferncias suscetvel de determinao
experimental, uma vez que os comprimentos de onda dessas radiaes
tm dimenses comparveis s distncias interatmicas encontradas nos
cristais (0.5-2.5 ) (MANO e MENDES, 1999; SANDLER et al, 1998).
A fase cristalina das nanopartculas polimricas foi identificada
por medidas de difrao de Raios-X utilizando uma radiao cobre K
(1,54056 ) a 45 kV/40 mA em um difratmetro de Raios-X, modelo

69

Xpert-Pro, numa velocidade de varredura angular de 2 e com um

tempo de passo de 1 segundo. Esta anlise foi realizada no
Departamento de Fsica (LFFS) da Universidade Federal de Santa
Catarina.
3.4.8 Magnetmetria de Amostra Vibrante (MAV)
O MAV nos permite obter informaes a respeito das
propriedades magnticas de um determinado material e classific-lo de
acordo com sua propriedade magnticas, seja ela, ferrimagntica,
ferromagntica ou superparamagntica. As medidas de magnetizao
foram realizadas utilizando um magnetmetro de amostra vibrante
(MAV), modelo EV9 da marca microsense,.
As anlises das propriedades magnticas das nanopartculas foi
realizado com a cooperao do Prof. Alexandre Cas Viegas do Instituto
de Fsica, do Laboratrio Multiusurio de Caracterizao Magntica de
Materiais, da Universidade Federal de Santa Catarina. As amostras
analisadas no MAV foram preparadas colocando-se uma pequena
quantidade de amostra com uma massa conhecida no interior de uma
cpsula de vidro e esta cpsula foi presa por um tubo de quartzo e fixada
verticalmente sobre duas bobinas. O campo magntico aplicado foi
variado entre 20 a -20 KOe e as medidas realizadas a temperatura
ambiente.
3.4.9 Espectrofotmetro UV/Vis
As anlises de espectrofotometria de absoro na faixa do Visvel
foram utilizada para identificao e quantificao da ZnPc puro e no
material polimrico.
3.4.9.1 Determinao dos espectros de absoro na faixa do UV/Vis
Na determinao do comprimento de onda de excitao da ZnPc,
efetuou-se uma varredura em espectrofotmetro da marca Hitachi
modelo 1900, na faixa de 500 a 800 nm (soluo de 1 g/ml de ZnPc em
N-metil-pirrolidona). O espectro de absoro obtido auxliou na fixao
do comprimento de onda de excitao (ex) do fotossensibilizante. Esses
experimentos foram efetuados utilizando-se cubeta de vidro de 1 cm de
caminho ptico. Os experimentos foram realizados a temperatura
ambiente.

70

3.4.9.2 Obteno da Curva de analtica da ZnPc

Para quantificar a concentrao da ZnPc na amostra, uma curva
de calibrao foi previamente elaborada, onde solues padres de Nmetil-pirrolidona contendo concentraes conhecidas de ZnPc, foram
analisadas no comprimento de onda de excitao (ex) de 670nm. A
curva analtica foi obtida relacionando-se os valores da concentrao da
ZnPc (g/ml), no eixo das abscissas (x), com os valores de emisso de
fluorescncia obtidos para cada concentrao, no eixo das ordenadas (y).
Os dados esto apresentados na Eq. 3.2.
Abs = 0,491x[ZnPC] + 0,099
R2=0,999

(Eq. 3.2)

A partir da Eq 3.3 pode-se determinar o teor de ZnPc nas

nanopartculas polimricas. Alguns autores determinam o contedo de
frmaco nas nanopartculas, como a relao da quantidade de frmaco
encapsulado com o rendimento de nanopartculas obtido no processo
(SOARES, 2009). A concentrao de ZnPc nas nanopartculas foi
calculado de acordo com a equao:
Massa da ZnPc obtida
ZnPc (g/mg) = nas nanoparticulas x 100%
Massa de rendimento
das nanoparticulas

(Eq. 3.3)

3.4.10 Perfil de Liberao in vitro

O estudo do perfil de liberao foi realizado de acordo com as
condies experimentais descritas por Feng & Huang (2001), Chawla &
Amiji (2002) e Ricci Junior & Marchetti (2006a, 2006b). Para a
realizao das anlises de liberao da ZnPc, foi utilizado um banho
termostatizado com temperatura controlada a 37oC, onde foram imersos
bqueres contendo o meio receptor e o sistema de liberao estudado
sob agitao magntica. Foram utilizados 40 ml de tampo fosfato
salino, pH 7,4, contendo 2% de dodecil sulfato de sdio (TFS-SDS)
como meio receptor e amostras de 5mg de nanopartculas liofilizadas
foram adicionadas a essa soluo receptora. O sistema foi mantido sob
proteo da luz. Em intervalos de tempo pr-estabelecidos, alquotas de

71

3 ml foram retiradas e transferidas para o bquer para a continuao do

teste de liberao. O sobrenadante foi analisado pelo mtodo de emisso
de fluorescncia anteriormente padronizado para a quantificao de
ZnPc liberada. As concentraes obtidas foram utilizadas para a
elaborao do grfico do perfil de liberao in vitro da ZnPc das
nanopartculas. O experimento foi realizado em triplicata para cada
mtodo de encapsulamento.
3.4.11 Avaliao da Toxicidade e atividade Fotobiolgica das
nanopartculas polimricas em cultura de clulas tumorais
A linhagem de clulas escolhida para a realizao dos ensaios de
toxicidade e atividade fotobiolgica foi a A549 (clulas de carcinoma de
pulmo humano) (LIEBER et al., 1976). Para a utilizao das clulas, a
linhagem foi descongelada at atingir a temperatura de 37oC e
acondicionada em frasco de cultura de 25 ml contendo 7 ml de meio
(Meio Dulbecos Modificado) DMEM suplementado com 10% de soro
fetal bovino. A este meio foram acrescidos 100 U/ml de penicilina e 100
g/ml de estreptomicina. O frasco de cultura foi mantido em estufa
temperatura de 37oC com 5% de CO2 durante 48 h. A concentrao de
clulas foi medida pelo mtodo de azul de tripan baseado na capacidade
das clulas viveis em eliminar o corante. As clulas no coradas so
contadas utilizando uma cmara de Neubauer. A suspenso celular foi
distribuda na concentrao de 1 x 105 clulas/ml em placa de 96 poos
(250 L) contendo meio de cultura DMEM enriquecido. As placas
foram incubadas em estufa por 24 h para a adeso das clulas. A
avaliao de toxicidade e da atividade fotobiolgica das nanopartculas
polimricas em cultura de clulas foi realizada com base em estudos j
descritos na literatura (RICCI-JNIOR e MARCHETTI, 2006).
O fotossensibilizante livre e o encapsulado em nanopartculas
polimricas foram incubados com as clulas na presena e ausncia de
luz para avaliar a toxidade no escuro e atividade fotobiolgica. Em
todos os ensaios a concentrao da ftalocianina de zinco livre (soluo
em meio de cultura) e da encapsulada em nanopartculas polimricas
(suspenso meio de cultura) foi de 5 g. As amostras foram incubadas
juntamente com aproximadamente 1 x 105 clulas/ml. Aps 4 horas de
incubao em estufa a 37oC, o meio foi removido, as clulas foram
lavadas com tampo fosfato salino (TFS) e acrescidas de novo meio de
cultura. As clulas submetidas ao ensaio de toxicidade na ausncia de
luz foram novamente mantidas na estufa a 37oC por 24 horas. As clulas
correspondentes ao ensaio de atividade fotofiolgica foram submetidas

72

irradiao com luz vermelha ( = 660 nm) na dose de 40 J/cm2 (Photon

Laser I, DMC), posteriormente, mantidas em estufa a 37oC por 24 horas.
Aps o perodo de incubao, foi realizada a viabilidade celular pelo
teste do MTT.
A viabilidade das clulas foi avaliada pelo mtodo MTT. Este
um mtodo rpido e preciso que pode ser utilizado para medir a
citotoxicidade, a proliferao e a atividade das clulas. Trata-se de um
ensaio colorimtrico, cujo componente principal o sal brometo de 3(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2-5-difeniltetrazolium (MTT). O MTT
reduzido pela enzima desidrogenase mitocondrial presente nas clulas
viveis formando cristais de formazan de cor prpura. A absoro do
formazan dissolvido na regio do visvel correlaciona-se com o nmero
de clulas viveis. Assim, alteraes na atividade mitocondrial celular
resultam em mudanas na quantidade de formazan produzido e,
conseqentemente, na absorbncia, o que permite quantificar a
citotoxicidade do tratamento de maneira indireta (MOSMANN, 1983).
Os compostos citotxicos so capazes de danificar ou destruir as clulas,
o que diminui a reduo do MTT.
Na determinao da viabilidade das clulas, as clulas foram
incubadas com 230 l de meio DMEM e 20 l de soluo de MTT (5
mg/ml em TFS) por 3 horas em estufa a 37oC, na ausncia de luz. Em
seguida, a placa foi centrifugada por 3 minutos, o meio contendo o MTT
foi retirado, e os cristais de formazan ressuspensos em 200 l de DMSO
para solubilizao.
A absorbncia foi medida em uma leitora de placas do tipo
ELISA (THERMOPLATE) nos comprimentos de onda de 540 nm e 630
nm e comparada com aquela obtida com as clulas sem tratamento
(controle) por meio de anlise estatstica (ANOVA) utilizando com
significncia p < 0,05.

CAPTULO 4
RESULTADO E DISCUSSO

4.1 OBTENO E CARACTERIZAO DAS NPMS

ESTABILIZADAS COM AO
4.1.1 Difrao de RaioX - DRX
A identificao das NPMs pode ser feita utilizando a tcnica de
difrao de raio-X, comparando seu espectro com os dados j
conhecidos. As anlises dos espectros obtidos por esta tcnica nos
fornece informaes sobre a sua estrutura e o dimetro mdio das
nanopartculas. O dimetro mdio das nanopartculas pode ser calculado
a partir da largura a meia altura do pico de difrao, atravs da equao
de Scherrer:

cos

(Eq. 4.1)

onde k a constante de apartculas esferica (0,9), o comprimento de

onda do raio-x incidente (1,54 A), a largura a meia altura em radiano
e o ngulo do pico mais intenso, que neste caso refere-se ao 311. A
Figura 4.1 mostra o difratograma das NPMs com AO. Os picos indicam
a formao de uma estrutura cristalina, caracterstica da Fe3O4. Os picos
observados para a Fe3O4 so (220), (311), (400), (422), (511) e (440)
(GNANAPRAKASH et al, 2006 e HONG et al, 2008). O dimetro
mdio estimado das nanopartculas foi d 13 nm, calculado a partir da
largura a meia altura do pico de difrao (311), atravs da equao de
Scherrer como comentado anteriormente.

74

1200
311

1000

NPMs com AO
440

800
intens idade

511
400

600

422

220

400
200

0
10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

2 teta

Figura 4.1 Difratograma de raio-X das NPMs com AO

A identificao exata da estrutura das nanopartculas possvel a

partir de espectroscopia Mossbauer, no entanto, em misturas de Fe3O4 e
Fe2O3, o espectroscopia Mossbauer ainda apenas semi-quantitativa
(TEJA; KOH, 2009). Quando se trata de aplicaes tecnolgicas de
nanopartculas de xidos de ferro tanto a Fe3O4 quanto a Fe2O3 so
adequadas. Entretanto, quando comparadas em relao saturao de
magnetizao, a Fe3O4 ligeiramente superior a outros xidos de ferro
(TEJA e KOH, 2009).
4.1.2 Microscopia Eletrnica de Transmisso MET
Utilizando a tcnica de microscopia eletrnica de transmisso
pode-se obter com clareza o tamanho e a morfologia das NPMs. A
Figura 4.2 mostra as NPMs com um tamanho mdio de
aproximadamente 10 nm, o que corrobora o resultado de DRX. A adio
do cido olico, alm de hidrofobizar a superfcie das NPMs, previne a
aglomerao destas nanopartculas, aumentando a estabilidade das
mesmas mantendo assim um alto grau de saturao da magnetizao,
como pode-se observar mais adiante (Figura 4.4).

75

(A)

(B)
Figura 4.2 Microscopia Eletrnica de transmisso das NPMs
revestidas com cido olico (A) e NPMs puras (B)

Quando o material magntico sintetizado, essencial que este

apresente um tamanho de partcula na faixa de 5-18 nm, pois nesta
faixa de tamanho que o material apresenta propriedade
superparamagntica
(LANDFESTER;
RAMIRES,
2003;
GNANAPRAKASH et al, 2006; TEJA; KOH, 2009 ).

76

4.1.3 Anlise termogravimtrica TGA

Na anlise termogravimtrica pode-se quantificar a gua e o
cido olico presente nas NPMs. A Figura 4.3 mostra a presena de
gua (20 150C) e dois picos referentes ao AO. A massa residual
corresponde ao xido de ferro puro. O primeiro pico est localizado
entre 200 e 280C (AO livre) e o segundo pico est localizado entre 290
e 380C (AO ligado as NPMs). A presena destes dois picos indica duas
espcies de AO presente na amostra (LANDFESTER; RAMIRES, 2003
e ZHANG; HE; GU, (2006), o que significa um provvel excesso de
AO.

100
NPMs com AO

massa (%)

80

60

40

20

0
0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

Temperatura (C)

Figura 4.3 Anlise termogravimtrica das NPMs com AO

A concentrao mssica de xido de ferro foi de 48% sendo o

teor de gua residual de 2% e de AO de 40%. Esta anlise importante
para quantificar o AO e tambm para determinar as propriedades
magnticas das nanopartculas polimricas.
4.1.4 Propriedade Magnticas das NPMs MAV
As propriedades magnticas das NPMs foram medidas utilizando
o MAV. A magnetizao de saturao (Ms) por grama da amostra,
magnetizao remanescente (mr=Mr/Ms), e a coercividade (Hc), so
apresentado na Tabela 5.

77

Tabela 5 Propriedades magnticas das NPMs com AO

Amostras
NPMs com AO

Ms (emu/g)

mr=Mr/Ms (x10-6)

Hc (Oe)

64

5,8

2,0

As NPMs mostraram comportamento superparamagntico

(Figura 4.4), quando expostos h temperatura ambiente, ou seja, sem a
presena da curva de histereses e com um alto valor de Ms. Pode-se
observar que a amostra no esta totalmente saturada, por isso pode haver
um erro no valor de Ms de aproximadamente 5%. Segundo ZHENG et
al (2005), o comportamento superparamagntico das NPMs tambm esta
relacionado com o baixo valor da Mr e Hc, como vimos na Tabela 5.
Este comportamento predominante de NPMs com propriedades
superparamagntica j era esperado devido s dimenses das NPMs
inferiores a 18nm, como mostrado anteriormente nas anlises do TEM.
As NPMs revestidas com cido olico apresentaram um valor de Ms de
84emu/g, sendo que este valor esta muito prximo do valor de Ms da
Fe3O4 pura que de 89emu/g (HOLZAPFEL et al, 2006 e
LANDFESTER; RAMIRES, 2003). A partir desses valores pode-se
determinar que as NPMs revestidas com cido olico sejam compostas
basicamente por Fe3O4.

78

(A)

(B)
Figura 4.4 Curva de magnetizao obtida por MAV das NPMs com
AO, campo magntico de 20KOe (A) e campo magntico em maior
escala 1,2KOe (B).

79

4.2 ENCAPSULAMENTO DAS NPMS VIA POLIMERIZAO EM

MINIEMULSO COM MMA
Para a obteno de nanopartculas polimricas magnticas
utilizou-se a tcnica de miniemulso direta. Como comentado
anteriormente as NPMs revestidas com AO foram preparadas pelo
mtodo de co-precipitao em meio aquoso. Neste processo de
encapsulamento as NPMs com AO foram dispersas diretamente no
monmero, ou seja, no foi utilizada qualquer solvente para dispersar o
material magntico.
4.2.1 Microscopia Eletrnica de Transmisso MET e Distribuio
de tamanho por espalhamento de luz
As nanopartculas polimricas magnticas obtidas pelo processo
de miniemulso direta sem a adio de qualquer solvente foram
caracterizadas pela tcnica de microscopia eletrnica de transmisso
com o intuito de avaliar o tipo de estrutura e as caractersticas
morfolgicas das mesmas. Esta anlise muito importante para verificar
a presena de nucleaes secundrias e mecanismos de degradao,
principalmente quando o material final utilizado na rea biomdica. A
Figura 4.5 apresenta as imagens obtidas das nanopartculas polimricas
com NPMs.

Figura 4.5 MET das nanopartculas polimricas com NPMs

possvel observar algumas regies mais escuras, a qual

atribuda ao ncleo formado pelas NPMs. A partir da Figura 4.5 podemse estimar o tamanho das nanopartculas polimricas com NPMs num

80

valor aproximado de 100 nm apresentando uma forma esfrica com uma

distribuio de tamanho de partculas relativamente estreito, como pode
ser observado na Tabela 6.
Tabela 6 Distribuio de tamanho de partculas e ndice de
polidispersidade das nanopartculas polimricas com NPMs
Amostras

DTG*
(nm)

IPD

DTP***
(nm)

IPD

PMMA

74

0,142

76

0,186

PMMA/NPMs (13,6%)

91

0,162

98

0,198

*DTG Distribuio de tamanho de gotas (antes da homopolimerizao)

**DTP - Distribuio de tamanho de partculas (final)
IPD Indice de polidispersidade

4.2.2 Difrao de Raio-X

A Figura 4.6 mostra o difratograma de raio-X do PMMA e das
nanopartculas polimricas magnticas. Como vimos anteriormente as
NPMs com AO apresentam alguns picos caractersticos de uma estrutura
cristalina, quando sintetizados pelo mtodo de co-precipitao em meio
aquoso. Segundo LANDFESTER; RAMIRES, (2006) e ZHENG; GAO;
GU, (2005) o material magntico pode perder algumas de suas
propriedades quando exposto a alta temperatura por um longo perodo
de tempo, neste caso a homopolimerizao, sendo assim, esta anlise
de extrema importncia para a identificao das nanopartculas
polimricas. Como pode-se observar na Figura 4.6 o difratograma de
raio-x mostrou uma estrutura cristalina das NPMs encapsuladas com
PMMA, no entanto, a perda das intensidades de picos pode ser referente
a baixa concentrao de NPMs, quando comparado com a Figura 4.1
que nos mostra o difratograma de raio-x das NPMs com AO puro
(HONG et al, 2008). Sendo assim pode-se afirmar que a sntese no
alterou a cristalinidade das NPMs, mostrando-se um mtodo eficiente
para o encapsulamento das NPMs com AO, como j confirmado por
outros trabalhos citados anteriormente.

81

Figura 4.6 Difratograma de raio-X das nanopartculas polimrica de

PMMA (A) e PMMA/NPMs (B)

4.2.3 Anlise Termogravimtrica TGA

A anlise termogravimtrica mostra a interao das NPMs com o
polmero (PMMA). Na Figura 4.7 pode-se observar que a quantidade de
NPMs de aproximadamente 22% em massa.

100

80

massa (%)

PMMA/NPMs
60

40

20

0
0

100

200

300

400

500

600

700

800

Temperatura (C)

Figura 4.7 Anlise de TGA das nanopartculas polimricas de

PMMA/NPMs

82

Como visto na Figura 4.3 o AO tem sua decomposio total a

400C. Na Figura 4.7 pode-se observar que no h nenhuma perda de
massa no intervalo de temperatura de 0 a 150C, sendo assim, pode-se
dizer que o material est ausente de impurezas (HONG et al; ZHENG,
GAO; GU, 2008; 2004). No caso das NPMs encapsuladas com PMMA a
perda de massa gradual e claramente observado que o PMMA se
degrada totalmente a aproximadamente 410C. A concentrao residual
de 22% e corresponde ao xido de ferro presente nas NPMs. Os outros
78% correspondem ao polmero, ou seja, PMMA e AO presentes nas
NPMs (HONG et al, 2008). A concentrao final de xido de ferro
maior do que seria esperado pela formulao original. Isto se deve a
evaporao parcial do AO na estufa, alm da possvel evaporao de
parte do monmero durante a prpria reao.
4.2.4 Propriedades Magnticas MAV
As propriedades magnticas do material foram medidas
utilizando o MAV. A magnetizao de saturao (Ms) por grama da
amostra, magnetizao remanescente (mr=Mr/Ms), e a coercividade
(Hc), so dados na Tabela abaixo.
Tabela 7 Propriedades magnticas das NPMs revestidas com cido
olico e das NPMs encapsuladas com MMA
Amostras

Ms (emu/g)

Mr (x10-6)

Hc (Oe)

NPMs com cido olico

64

5,8

2,0

NPMs encapsuladas

34

1,3

0,1

As NPMs predominantemente encapsuladas com PMMA

mostraram comportamento superparamagntico, ou seja, sem a presena
da curva de histereses (Figura 4.8), quando expostos a temperatura
ambiente. O comportamento superparamagntico tambm se equivale
no baixo valor da magnetizao remanescente e nos pequenos valores de
Hc, como visto anteriormente. Ao analisar a Tabela acima, verifica-se
um decrscimo no valor de Ms, sendo que este decrscimo pode estar
relacionado com a oxidao do material magntico ou seja, a converso
de outros xidos de ferros no magnticos durante o processo de
sonicao e homopolimerizao (LANDFESTER; RAMIRES, 2006 e
HONG et al, 2008).

83

(A)

(B)
Figura 4.8 Propriedades magnticas das NPMs com AO e das NPMs
encapsuladas com PMMA, campo magntico de 20KOe (A) e campo
magntico em maior escala 4KOe (B).

Outro ponto importante a ser observado no encapsulamento de

NPMs utilizando a tcnica de polimerizao in situ, o fato de que a
quantidade de NPMs com AO no interfere no valor de Ms como
mostrado na Figura 4.9. Nos dois casos de PMMA/NPMs com
diferentes concentraes de xido de ferro, 7% e 13,6% em massa, o
valor de Ms praticamente o mesmo. Sendo assim, quando exposto ao

84

um campo magntico externo, as NPMs encapsuladas podem se mover

com a mesma velocidade. Este valor de Ms suficiente para que a
nanopartculas encapsuladas se movam com rapidez, e possam ser
separadas da fase aquosa facilmente pela ao de umgradiente de campo
magntico externo (ZHENG, GAO; GU, 2005).

(A)

(B)
Figura 4.9 Propriedades magnticas obtidas das NPMs com AO e
para as nanopartculas polimricas com diferentes concentraes de
xido de ferro (7% e 13,6%), campo magntico de 20KOe (A) e campo
magntico em maior escala 4KOe (B).

85

4.3 ENCAPSULAMENTO DA ZNPC VIA POLIMERIZAO EM

MINIEMULSO
Nesta parte do trabalho sero discutido os mtodos utilizados
para o encapsulamento da ZnPc, utilizando a tcnica de miniemulso
com auxlio da tcnica de nanoprecipitao.
A ZnPC um frmaco que apresenta caractersticas hidroflicas
intermedirias, ou seja, tem baixa afinidade pela gua e por compostos
apolares. Isto cria uma dificuldade adicional ao se tentar a miniemulso
direta, pois o monmero apolar e no consegue solubilizar a ZnPC
diretamente na fase orgnica. A solubilidade da ZnPC em solventes
orgnicos polares relativamente elevada, o que torna possvel a
utilizao da tcnica de nanoprecipitao para dispersar este composto
na fase aquosa sob a forma de nanopartculas. Para isso, necessrio
que este solvente orgnico polar seja solvel na fase aquosa, como, por
exemplo, a n-metil pirrolidona, NMP (GOVENDER et al, 1998). Outros
solventes podem ser utilizados, como o DMSO. No entanto,
importante que este solvente possa ser facilmente retirado do meio
contnuo por evaporao, desta forma, d-se a preferncia pela
utilizao de solventes volteis.
Na primeira etapa do processo de encapsulamento, a
nanoprecipitao, utilizou-se a soluo de ZnPC com solvente orgnico
polar, como mencionado anteriormente. Ao adicionar esta soluo na
fase aquosa sob alto cisalhamento, o solvente, neste caso a NMP, tende
a migrar para a fase aquosa, enquanto que a ZnPc (no estabilizada)
ficar dispersa na fase aquosa sob a forma de nanopartculas.
Rapidamente, passa-se 2 etapa do processo, que a adio do
monmero ao sistema. Ao adicionar a fase orgnica contendo
monmero e surfactante de baixo HLB, a ZnPc tende a ir para interface
das gotas de monmero e da fase aquosa e eventualmente entram nas
gotas de monmeros estabilizadas com o surfactante. A Figura 4.10
ilustra a tcnica citada para o encapsulamento da ZnPC.
A utilizao de um surfactante na fase orgnica essencial nesta
tcnica de polimerizao. Se o surfactante estiver na fase aquosa, o
frmaco ao ser disperso na gua ser estabilizado por este surfactante.
Devido a diminuio da tenso interfacial com a gua estas
nanopartculas de frmaco se tornaro estveis o que diminuir a
migrao do frmaco para as gotas de monmero. Testes realizados no
laboratrio comprovaram que ao utilizar um surfactante de elevado
HLB, como o SDS, disperso na fase aquosa no ocorreu a migrao do
frmaco para as gotas de monmero, no ocorrendo, portanto, a

86

encapsulao do frmaco pelo polmero formado durante a reao de

polimerizao.

Figura 4.10 Encapsulamento da ZnPc via polimerizao em

miniemulso com auxlio da tcnica de nanoprecipitao
(PMMA/ZnPc(FA)

Outro mtodo proposto neste trabalho para o encapsulamento da

ZnPc, foi a polimerizao em miniemulso sem o auxlio da tcnica de
nanoprecipitao (PMMA/ZnPc(FO)). Neste mtodo mistura-se a soluo
1 (NMP e ZnPc) com MMA, lecitina, miglyol e AIBN. Como meio
contnuo utiliza-se apenas a gua.
4.3.1 Caracterizao da ZnPc pela tcnica do UV-Vis
A ZnPc apresenta uma elevada absortividade molar na regio do
espectro eletromagntico correspondente luz vermelha, o que
possibilita a utilizao da tcnica de UV-Vis para a identificao da
ZnPc. O espectro de absoro no UV-Vis foi registrado na faixa de 500
a 800nm, como pode ser observado na Figura 4.11.

87

intensidade (absorbncia)

ZnPc

500

600

700

800

comprimento de onda (nm)

Figura 4.11 Identificao da ZnPc utilizando a tcnica de UV-Vis

Os espectros de absoro de UV-Vis apresentadas na Figura 4.11

foram os mesmos apresentados por RICCI-JNIOR e MARCHETTI
(2006a, 2006b). O pico de maior absorbncia foi observado no
comprimento de onda de 670nm para a ZnPC solubilizada em NMP. O
comprimento de onda onde ocorre absoro mxima no UV-Vis
usualmente utilizado como comprimento de onda de excitao nas
anlises de fluorimetria. Sendo este empregado para quantificar a
concentrao do frmaco em soluo.
4.3.2 Morfologia e distribuio de tamanho de partculas
Para anlise da morfologia e da distribuio de tamanho das
partculas utilizou-se o MET. Esta anlise muito importante para
verificar se a presena de nucleaes secundarias, que poderia promover
a formao de novas partculas sem a presena de frmaco, alm de
causar um alargamento da DTP que nem sempre pode ser evidenciada
pela anlise de DLS. A Figura 4.12 apresenta as micrografias das
amostras PMMA/ZnPc(FA) e PMMA/ZnPc(FO), onde pode-se observar
que o mtodo de encapsulamento da ZnPc no afetou a morfologia e a
distribuio de tamanho das partculas (DTP). Pelas micrografias podese dizer que a DTP unimodal e estimar o tamanho mdio em
aproximadamente 100 nm. Como a DTP unimodal, provvel que o
mecanismo de nucleao predominante tenha sido o da polimerizao

88

das gotas de monmero em detrimento a outros mecanismos de

polimerizao possveis tais como nucleao micelar ou homognea.

(A)
(B)
Figura 4.12 MET das nanopartculas polimricas com ZnPc A)
PMMA/ZnPc(FA) e B) PMMA/ZnPc(FO)

Para as anlises de tamanho mdio de partcula e do ndice de

polidisperso utilizou-se a tcnica de espalhamento dinmico de luz,
DLS. Os valores so apresentados na Tabela abaixo e apresentam
valores prximos aos observados por MET.
Tabela 8 Distribuio de tamanho de gotas e partculas e ndice de
polidispersidade das nanopartculas polimricas com ZnPc
Amostras

DTG
(nm)*

IPD

DTP
(nm)**

IPD

PMMA/ZnPc(FA)

92 0,4

0,175

102 0,5

0,201

PMMA/ZnPc(FO)

93 0,6

0,177

101 0,4

0,211

A anlise da distribuio de tamanho das partculas muito

importante neste trabalho. As amostras obtidas apresentam tamanho
nanomtricos e, portanto podem ser aplicadas endovenosamente. Podese observar na Tabela 8 que ambos os mtodos de encapsulamento da
ZnPc levaram a tamanhos mdios e distribuio de tamanho das
partculas muito semelhantes, corroborando os dados das anlises de
DLS e MET. Ao comparar o tamanho mdio das nanopartculas de
PMMA sem ZnPc (Tabela 6) e com ZnPc, pode-se notar um aumento de

89

aproximadamente 20 nm. Esta diferena de tamanho pode ser devido a

presena de parte do frmaco na interface das nanopartculas o que
desloca o surfactante diminuindo ligeiramente a eficincia de
estabilizao das gotas de monmeros resultando em tamanhos de
partcula maiores.
4.3.3 Caracterizao espectromtrica e rendimento do processos das
nanopartculas polimricas com ZnPc
Como apresentado anteriormente, a ZnPc solubilizada em NMP
apresenta um pico de absoro no UV-vis no comprimento de onda de
670nm. A partir da Figura 4.13 pode-se observar que a ZnPc
encapsulada com PMMA apresenta o pico de absoro no mesmo
comprimento de onda, 670nm, que o ZnPc livre (sem polmero). A
diferena na intensidade observada nas amostras de ZnPc encapsulada
indica a diferena de concentrao da ZnPc nas amostras, conforme
mostrado na Tabela 9.

intensidade (absorbncia)

ZnPc
PMMA/ZnPc (FO)
PMMA/ZnPc (FA)

500

600

700

800

comprimento de onda (nm)

Figura 4.13 Espectros de absoro do UV-Vis da Sol.1,

PMMA/ZnPc(FO) e PMMA/ZnPc(FA)

90

Tabela 9 Rendimento do processo e concentrao mssica de ZnPc

nas nanopartculas polimricas
Amostras

Rendimento do Processo
(%)

[ZnPc]
(g/mg)

PMMA/ZnPc(FO)

82 0,5

3,0

PMMA/ZnPc(FA)

84 0,6

3,7

Na preparao das amostras de PMMA/ZnPc(FO) o rendimento

do processo obtido foi de 82 0,5% e a concentrao de ZnPc nas
nanopartculas polimricas foi de 3,0 g/mg de partcula polimrica.
Para a amostra PMMA/ZnPc(FA) o rendimento do processo foi de 84
0,6% e o teor de ZnPc foi de 3,7 g/mg de partcula polimrica. Neste
caso pode-se observar que o teor de ZnPc maior na amostra
PMMA/ZnPc(FA),quando
comparada
com
a
amostra
PMMA/ZnPc(FO). Os dois mtodos de encapsulamento da ZnPc podem
ser adequados, sendo que ambos apresentaram valores satisfatrio
(ZHANG et al, 2004).
4.3.4 Difrao de Raio-X
A determinao dessas caractersticas importante no apenas
por permitir o conhecimento da cristalinidade e das possveis interaes
entre frmaco e polmero, mas tambm devido a influncia das mesmas
na liberao in vitro e in vivo do frmaco (VERGER et al, 1998). A
Figura 4.14 apresenta os padres de DRX da ZnPc livre (A), mistura
fsica da ZnPc com PMMA (B) na concentrao de 0,3% de frmaco em
relao ao polmero, PMMA vazio (C), PMMA/ZnPc(FA) (D) e
PMMA/ZnPc(FO) (E).

91

Figura 4.14 Difratograma de Raio-X das nanopartculas polimricas

contendo aproximadamente 0,3% em massa de ZnPc. As amostras
analisadas foram ZnPc livre (A), mistura fsica da ZnPc com
PMMA (B), PMMA sem ZnPc (C), PMMA/ZnPc(FA) (D) e
PMMA/ZnPc(FO) (E).

O difratograma da ZnPc livre (A) mostrou picos correspondentes

de uma estrutura cristalina do frmaco (PEREZ, 2006). O PMMA (C)
apresentou difratograma tpico de um material amorfo, mesmo
comportamento observado para as demais amostras que continham uma
baixa concentrao de ZnPc (0,3% em massa). Esta baixa concentrao
de ZnPc impede a observao de qualquer interao do frmaco com o
polmero por DRX devido falta de sensibilidade desta anlise para
baixas concentraes. Como se pode observar na Figura 15, quando h
um aumento na concentrao de frmaco em relao ao polmero notase o aparecimento dos picos correspondentes da estrutura cristalina do
frmaco.

intensidade

92

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

2 teta

Figura 4.15 Difratograma de Raio-x da mistura fsica de PMMA com

ZnPc na razo mssica de 1:1.

4.4 OBTENO E CARACTERIZAO DAS NANOPARTCULAS

POLIMRICAS MAGNTICAS COM ZNPC
4.4.1 Morfologia e distribuio de tamanho das nanopartculas
Na Figura 4.16 pode-se ver a morfologia e a distribuio de
tamanho das nanopartculas polimricas contendo ZnPc e NPMs, sendo
possvel observar que no houve alteraes considerveis na
distribuio do tamanho das partculas e na morfologia quando
comparado com as nanopartculas obtidas somente com ZnPc ou NPMs
em separado. O tamanho mdio das nanopartculas de
PMMA/ZnPc/NPMs foi de aproximadamente 100nm. Cabe ressaltar que
o percentual mssico de xido ferro de aproximadamente 8% nas
nanopartculas polimricas. Como o xido de ferro possui uma massa
especfica em torno de 5,2g/cm3, muito superior, portanto, ao do
polmero (~1,1 g/cm3), a sua frao volumtrica nas nanopartculas
muito reduzida (~3% em volume). Desta forma, nem todas as

93

nanopartculas de polmero iro conter NPMs, mesmo porque as NPMs

tendem a se agregar. Desta forma, algumas nanopartculas iro conter
diversas NPMs enquanto outras no tero nenhuma NPM.

Figura 4.16 MET das nanopartculas polimricas contendo ZnPc e

NPMs (PMMA/ZnPc/NPMs)

4.4.2 Caracterizao espectromtricas e rendimento do processo das

nanopartculas polimricas contendo ZnPc e NPMs
A partir das Figuras 4.17 e 4.18 pode-se observar que a ZnPc
encapsulada com NPMs e PMMA apresentou o pico de absoro no
mesmo comprimento de onda, 670nm, que a ZnPC livre e encapsulada.
Ou seja, a introduo de NPMs no encapsulamento da ZnPc no
influenciou o comportamento espectroscpico das nanopartculas
polimricas. Segundo OLIVEIRA et al, (2004) este um ponto muito
importante para o desenvolvimento de uma nova estrutura contendo
ZnPc e NPMs, pois indica que no h interao do frmaco com as
NPMs.

94

intensidade (absorbncia)

ZnPc
PMMA/ZnPc/NPMs

500

600

700

800

comprimento de onda (nm)

Figura 4.17 Espectros de absoro no UV-Vis da Sol.1 e

PMMA/ZnPc/NPMs

intensidade (absorbncia)

PMMA/ZnPc/NPMs
PMMA/ZnPc (FO)
PMMA/ZnPc (FA)

500

600

700

800

comprimento de onda (nm)

Figura 4.18 Comparao dos espectros de absoro no UV-Vis da

PMMA/ZnPc (FA), PMMA/ZnPc (FO) e PMMA/ZnPc/NPMs

A partir das anlises espectromtricas pode-se obter a

concentrao de ZnPc nas nanopartculas polimricas, mostrada na
Tabela abaixo.

95

Tabela 10 Rendimento do processo e concentrao mssica de ZnPc

nas nanopartculas polimricas com NPMs
Amostras

Rendimento do Processo
(%)

Teor de ZnPc
(g/mg)

PMMA/ZnPc/NPMs

79 0,5

3,6

O rendimento do processo ligeiramente inferior ao comparar as

amostras de PMMA/ZnPc(FA) e PMMA/ZnPc(FO) com a amostra de
frmaco encapsulada simultaneamente com as NPMs.
4.4.3 Difrao de Raio-X
A partir da Figura 4.19 pode-se observar que a ZnPc no altera a
estrutura cristalina das NPMs. Desta forma, pode-se afirmar que a
estrutura cristalina das NPMs no foram afetadas pela presena da ZnPc.

Figura 4.19 Difratograma de Raio-X das nanopartculas polimricas

contendo ZnPc. As amostras analisadas foram PMMA (A),
PMMA/NPMs (B), PMMA/ZnPc/NPMs (C).

96

4.4.4 Anlise Termogravimtrica TGA

A Figura 4.20 apresenta o resultado de TGA da amostra de NPMs
encapsuladas simultaneamente com ZnPc. Vale frisar que o teor de
NPM nestas partculas inferior ao teor de NPMs encapsuladas
isoladamente, pois ao acrescentar a ZnPc acrescenta-se tambm NMP, o
que promove uma certa desestabilizao das NPMs no interior das
nanogotas de monmero. A concentrao residual de 12% e
corresponde ao xido de ferro presente nas NPMs. Os outros 88%
correspondem ao polmero, ou seja, PMMA e AO presente nas NPMs
(HONG et al, 2008). Como comentado anteriormente, a concentrao
final de xido de ferro um pouco superior ao da formulao original.
Isto se deve a evaporao parcial do AO na estufa, alm da possvel
evaporao de parte do monmero durante a prpria reao.

100

80

massa (%)

PMMA/ZnPc/NPMs
60

40

20

0
0

100

200

300

400

500

600

700

800

Temperatura (C)

Figura 4.20 Anlise de TGA das nanopartculas polimricas contendo

ZnPc e NPMs

4.4.5 Propriedades magnticas das nanopartculas polimricas

contendo ZnPc e NPMs
Na Figura 4.21 pode-se observar o comportamento
superparamagntico das nanopartculas polimricas contendo ZnPc e
NPMs quando expostos a uma temperatura ambiente. O comportamento
superparamagntico tambm se equivale ao baixo valor da Mr e nos
pequenos valores de Hc que pode ser visto na Tabela 11.

97

(A)

(B)
Figura 4.21 Propriedades magnticas obtidas das nanopartculas
polimricas contendo ZnPc e NPMs, campo magntico de 20KOe (A) e
campo magntico em maior escala 4KOe (B).

Observa-se na Tabela abaixo que o valor de Ms quando

comparado com os resultados obtidos no encapsulamento das NPMs
sem a ZnPc muito prximo. Por fim pode-se dizer que a adio de
ZnPc no interfere nas propriedades magnticas das NPMs e com isso

98

podemos obter nanopartculas polimricas contendo ZnPc e NPMs com

alto valor de Ms e propriedades superparamagntica, possibilitando a
liberao do frmaco num alvo especifico quando se utiliza um campo
magntico externo (ZAVISOVA et al 2007).
Tabela 11 Propriedades magnticas das nanopartculas polimricas
contendo ZnPc e NPMs
Amostras

Ms (emu/g)

Mr
(x10-6)

Hc (Oe)

Encapsulamento de ZnPc
com NPMs

31

1,3

0,1

4.5 CONVERSO GRAVIMTRICA

Os resultados das medidas de gravimetria durante as reaes de
polimerizao indicam que a converso atinge uma converso limite
com aproximadamente 2 horas de reao (Figuras 4.22 (A) e (B)). A
converso final ficou um pouco abaixo de 100% devido, provavelmente,
a evaporao parcial do cido oleico durante a etapa de secagem das
amostras para gravimetria, que no foi considerada nos clculos. Outro
fator que pode ter levado a menor converso gravimtrica a perda de
monmero (MMA) por evaporao durante a etapa de
miniemulsificao e durante a etapa de reao. Esta evaporao do
monmero pode ocorrer devido elevada presso de vapor do MMA e
pela vedao deficiente do reator. De fato, a converso final ficou
sempre muito prxima a 100%, fato este comprovado por anlises de
monmero residual por cromatografia gasosa.
O estudo da cintica das reaes importante para analisar a
converso total do monmero em relao ao tempo e para saber se o
material incorporado pode afetar a velocidade de reao.
Adicionalmente, importante frisar que para estudos com finalidade de
aplicao na rea biomdica essencial a converso total do monmero
para evitar possveis efeitos txicos do monmero residual.
Atravs das Figuras 4.22 (A) e (B) pode-se verificar que a
evoluo da converso das reaes apresentou um comportamento
semelhante ao adicionar a ZnPC, indicando que este composto no afeta
a cintica e provavelmente no reage com os radicais livre presentes no
meio reacional.

99

Ao adicionar NPMs no meio reacional notou-se uma reduo da

velocidade de reao em relao s reaes sem NPMs. Essa diminuio
da taxa de reao pode ser devido reao do iniciador com o ferro
presente no meio reacional formando xido de ferro, tal como Fe2O3,
reduzindo a concentrao de radicais livre do meio reacional (HONG et
al, (2004). Outra possibilidade a reao dos radicais livre com o cido
oleico que recobre as nanopartculas de xido de ferro gerando radicais
com baixa reatividade.

100
90
80

Converso (%)

70
60
50
40

PMMA/NPMs

30

PMMA

20

PMMA/ZnPc/NPMs

10
0
0

50

100

150

200

250

300

350

Tempo (hrs)

(A)

100
90
80

Converso (%)

70
60
50

PMMA/ZnPc(FO)
PMMA/ZnPc(FA)
PMMA

40
30
20
10
0
0

50

100

150

200

250

300

350

Tempo (hrs)

(B)
Figura 4.22 Converso gravimtrica das amostras de PMMA/NPMs,
PMMA/ZnPc/NPMs (A) e PMMA/ZnPc(FA), PMMA/ZnPc(FO) (B)

100

4.6 TESTE IN VITRO

Com o controle cada vez mais rigoroso em relao ao uso de
animais de laboratrio, h a necessidade de desenvolver e padronizar
testes in vitro que possam detectar a toxicidade de dispositivos para uso
em seres humanos, principalmente aqueles de aplicao clnica, como os
biomateriais que no devem causar reaes adversas e nem lesar o
organismo do paciente. A seguir sero mostrados alguns resultados
relacionados ao perfil de dissoluo e de fototoxicidade em clulas
tumorais A549.
4.6.1 Perfil de dissoluo
O teste de dissoluo in vitro um elemento importante no
desenvolvimento de novas formulaes (COSTA e LOBO, 2000). O
perfil de dissoluo de um frmaco avalia a quantidade de frmaco
liberada ao longo do tempo. necessrio delinear ensaios de dissoluo
que possam predizer, de forma mais eficaz, o comportamento in vivo das
formas farmacuticas. Para que o teste in vitro seja eficaz necessrio
que este apresente as mesmas condies in vivo, como temperatura e o
meio de dissoluo (AMIDON et al, 2007; NERY et al, 2005). Para
frmacos insolveis em gua, como a ZnPc, o meio de dissoluo um
parmetro relevante para a realizao do estudo, j que pode ser
necessrio um grande volume de meio receptor. Nesses casos, a
abordagem atual que parece mais apropriada e a utilizao de
surfactante. A escolha do surfactante uma etapa importante e o dodecil
sulfato de sdio (SDS), utilizado nesse estudo, apropriado na maioria
dos casos (AMIDON et al, 2005). O SDS foi utilizado para aumentar a
solubilidade da ZnPc no meio aquoso e tambm preveniu a sua adsoro
nas superfcies do sistema utilizado, motivos pelos quais Chawla e
Amiji (2002) tambm utilizaram o SDS no estudo de liberao do
tamoxifeno de nanopartculas.
O estudo do perfil de liberao das nanopartculas polimricas
contendo ZnPc foi obtida para avaliar como ocorre a liberao do
fotossensibilizante das nanopartculas polimricas. Os perfis de
liberao das nanopartculas polimricas contendo ZnPc esto
apresentados na Figura 4.23.

101

100
90

PMMA/ZnPc (FO)
PMMA/ZnPc (FA)
PMMA/ZnPc/NPMs

80

ZnPc Liberada (%)

70
60
50
40
30
20
10
0
0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Tempo (hrs)

Figura 4.23 Perfil de liberao do encapsulamento da

PMMA/ZnPc(FO), PMMA/ZnPc(FA) e PMMA/ZnPc/NPMs

A liberao das nanopartculas contendo ZnPc foi de modo

sustentado e lento como pode ser observado na Figura 21 A e B. Nas
primeiras horas apenas 2% da ZnPc foi liberada, e em 20 horas cerca de
10% do ZnPc contido nas nanopartculas foram liberada nas amostras
PMMA/ZnPc(FO) e PMMA/ZnPc/NPMs. Enquanto que na amostra de
PMMA/ZnPc(FA) apenas 5-10% da ZnPc foi liberada. Depois de
aproximadamente 7 dias de experimento as amostras PMMA/ZnPc(FO)
e PMMA/ZnPc/NPMs liberaram cerca de 50% da ZnPc, enquanto que a
amostra PMMA/ZnPc(FA) liberou cerca de 35% do frmaco. Nos perfis
de liberao nenhuma das amostras apresentou efeito burst, ou seja,
nenhuma das amostras apresentou altas taxas de frmacos liberadas
rapidamente. Esta ausncia do efeito burst pode ser um indicativo que
a ZnPc esteja homogeneamente dispersa na matriz polimrica das
nanopartculas e de que o processo seja por difuso (nanocapsulas) e no
por desoro (nanoesferas) do frmaco. Outro ponto importante na
liberao sustentada e lenta do frmaco se deve a utilizao de um
polmero que no se degrada rapidamente em meio aquoso.
Existem algumas teorias e modelos matemticos que descrevem a
cintica de liberao do frmaco de sua forma farmacutica. Os modelos
de liberao mais aplicados e que melhor descrevem o fenmeno de
liberao de frmacos so, em geral, os modelos de Higuchi, de cintica
de ordem zero, de Weibull e de Korsmeyer-Peppas (COSTA e LOBO,
2001). Os modelos de ordem zero, Higuchi e de primeira ordem foram
os modelos propostos neste trabalho. A cintica de ordem zero

102

aplicada a formas farmacuticas que no sofrem desagregao e liberam

a mesma quantidade de frmaco por unidade de tempo; trata-se de um
modo ideal de liberao de frmaco para atingir uma ao farmacolgica
prolongada, j que a liberao lenta (COSTA e LOBO, 2001). Este
modelo pode ser representado pela equao 4.2 a seguir:
Qt = Q0 + K0t

(Eq. 4.2)

onde:
Qt = quantidade de frmaco liberado no tempo t;
Q0 = quantidade inicial do frmaco na soluo;
K0 = constante cintica.
A cintica de primeira ordem, por sua vez, caracterstica de
formas farmacuticas cuja liberao do frmaco proporcional a
quantidade de frmaco que permanece no seu interior, de modo que a
quantidade de frmaco liberada por unidade de tempo diminui com o
passar do tempo (COSTA e LOBO, 2001). A equao 4.3 representa
esse modelo:
ln Qt = ln Q0 + Ktt

(Eq. 4.3)

onde:
Qt = quantidade de frmaco liberado no tempo t;
Q0 = quantidade inicial do frmaco na soluo;
Kt = constante de liberao de primeira ordem.
Higuchi desenvolveu alguns modelos tericos para estudar a
liberao de frmacos hidrossolveis e pouco solveis em matrizes
semi-solidas e slidas e descreveu a liberao de um frmaco como um
processo de difuso baseado na Lei de Fick, dependente da raiz
quadrada do tempo (COSTA e LOBO, 2001). O modelo de Higuchi
pode ser apresentado pela equao 4.4.
Qt = KH x t
onde:
Qt = quantidade de frmaco liberado no tempo t;
KH = constante de liberao de Higuchi.

(Eq. 4.4)

103

A escolha do melhor modelo foi feito atravs da correlao linear

(r) obtido em cada perfil de liberao proposto neste trabalho (Figura
4.24). Os resultados esto apresentados na Tabela 12.
100
PMMA/ZnPc (FO)

ZnPc Liberada (%)

90

Linear (PMMA/ZnPc (FO))

80

PMMA/ZnPc (FA)

70

Linear (PMMA/ZnPc (FA))

PMMA/ZnPc/NPMs

60

Linear (PMMA/ZnPc/NPMs)

50
40
30
20
10
0
0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Tempo (hrs)

(A)

60
Amostra (06/12/2010 PMMA/ZnPc)
Linear (Amostra
(06/12/2010 PMMA/ZnPc))

50

Amostra (29/09/2011)*
PMMA/ZnPc)

ZnPc liberada (%)

40

Linear (Amostra
(29/09/2011)*
PMMA/ZnPc))
Amostra (16/01/2011)
PMMA/ZnPc/NPMs)

30

Linear (Amostra
(16/01/2011)
PMMA/ZnPc/NPMs))

20

10

0
0

10

12

14

Tempo (hrs)

(B)
Figura 4.24 Modelos matemticos que descrevem a cintica de
liberao do frmaco: ordem zero (A) e Higuchi (B)

104

Tabela 12 Estudo da cintica de liberao das amostras de

PMMA/ZnPc(FO), PMMA/ZnPc(FA) e PMMA/ZnPc/NPMs.
Correlao linear (r)
AMOSTRAS

Higuchi

Ordem zero

1 Ordem

PMMA/ZnPc(FO)

0,893

0,854

0,648

PMMA/ZnPc(FA)

0,807

0,939

0,781

PMMA/ZnPc/NPMs

0,978

0,951

0,694

A partir da aplicao dos modelos matemticos (Higuchi, ordem

zero e primeira ordem) e da determinao dos valores de r, o modelo de
Higuchi apresentou os maiores valores de r para as amostras
PMMA/ZnPc(FO) e PMMA/ZnPc/NPMs, enquanto que o modelo de
ordem zero apresentou o maior valor de para amostra
PMMA/ZnPc(FA). As amostras que apresentaram os maiores r no
modelo de Higuchi mais um forte indicativo que o frmaco foi
liberado no meio pelo processo de difuso, como j comentando
anteriormente. Para amostra que apresentou o maior valor de r no
modelo de ordem zero a nanopartcula que tem ao mais prolongada
e sustentada como vimos na Figura 4.23 (A).
Os testes de perfil de dissoluo e os modelos matemticos
aplicados neste trabalho foram teis para mostrar que as nanopartculas
polimricas mostradas apresentam uma liberao sustentada e lenta,
podendo assim ser aplicadas a TFD como um sistema de liberao
desenvolvido.
4.6.2 Avaliao da toxicidade e da atividade fotobiolgica das
nanopartculas polimricas em cultura de clulas tumorais
A avaliao da toxicidade e da fototoxicidade dos sistemas foram
realizadas pelo mtodo MTT, que determina a viabilidade celular por
meio da anlise da atividade mitocondrial. A viabilidade celular (%) de
todos os grupos analisados (atividade fotobiolgica com luz) foi
comparada a do grupo controle (clulas incubadas na ausncia de luz).
Os ensaios independentes foram feitos em sextuplicata para cada
grupo e a significncia dos resultados (p < 0,05) foi avaliada pelo teste
ANOVA. Os estudos foram feitos com ZnPc livre soluo e encapsulada
em nanopartculas. A ZnPc foi dissolvida em DMSO 1 mg/ml e diluda
com meio de cultura para ser adicionada as clulas (5 g/poo). As

105

nanopartculas polimricas contendo ZnPc e NPMs foram adicionadas

ao meio de cultura para o preparo de uma suspenso.
Os resultados da toxicidade e atividade fotobiolgica esto
descritas na Figura 4.25.

Figura 4.25 Estudos de toxicidade (ausncia de luz) e de atividade

fotobiolgica (irradiao de luz: 40 J/cm2) em cultura de clulas A549
das nanopartculas de PMMA contendo ou no ZnPc. Dose por poo: 5
g ZnPc e tempo de incubao de 4 horas. Mdia desvio padro de
seis experimentos independentes. *Significativamente menor do que o
controle na ausncia de luz (p < 0,05 ANOVA)

No ensaio de toxicidade (ausncia de luz), as nanopartculas

mostraram baixa toxicidade como pode ser visto nas barras em azul da
Figura 4.25. Esse efeito citotxico no foi estatisticamente significativo
em relao ao controle (p > 0,05), confirmando a baixa toxicidade dos
sistemas de liberao estudados. O pequeno aumento na toxicidade das
nanopartculas contendo ZnPc, em relao s nanopartculas vazias (p >
0,05), pode ser atribudo presena do fotossensibilizante, que
apresenta baixa toxicidade na ausncia de luz, mas pode causar a
inativao de uma parte das clulas.
Esses resultados esto de acordo com resultados j descritos na
literatura. Konan et al. (2003) analisaram a toxicidade e a atividade
fotobiolgica de nanopartculas vazias ou contendo porfirina mesotetra(4-hidroxifenil) encapsulada aps a incubao em cultura de clulas

106

EMT-6 (clulas tumorais mamrias de camundongos) e no observaram

citotoxicidade significativa no escuro em nenhuma das condies
analisadas. A ausncia de efeito citotxico significativo aps a
incubao com nanopartculas de PMMA vazias consistente com a
biocompatibilidade e segurana relatados na literatura. Segundo a
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria a ANVISA (2011), o PMMA
uma matria-prima de implantes, inclusive ortopdicos, que so
usados para fins de reparao mdica. Alm disso, a substncia
utilizada nas tcnicas de preenchimento esttico, mais popularmente
conhecidas como bioplastias.
No ensaio de atividade fotobiolgica, observou-se, inicialmente,
que a luz isoladamente no foi capaz de induzir efeito citotxico sobre a
cultura de clulas (p > 0,05), uma vez que a viabilidade celular foi
mantida em 90% aps a irradiao das clulas com dose de 40 J/cm2.
Kolrov et al. (2003) irradiaram clulas de melanoma humano (G361)
com luz visvel e observaram que a viabilidade das clulas permanecia
acima de 90% aps irradiao de luz em doses de 0,5 a 150 J/cm2. As
nanopartculas de PMMA vazias tambm apresentaram baixa toxicidade
na presena de luz (p > 0,05). Por outro lado, as nanopartculas contendo
ZnPc induziram efeito citotxico nas clulas A549 aps a irradiao
com luz. Houve uma reduo significativa da viabilidade celular para
22% no caso das nanopartculas contendo ZnPc e (p < 0,05; em relao
o controle) e reduo para 30% no caso das nanopartculas contendo
ZnPc e NPMs encapsuladas com nanopartculas polimricas (p < 0,05;
em relao ao grupo controle). Os estudos de toxicidade e de atividade
fotobiolgica foram importantes para confirmar que a toxicidade das
nanopartculas vazias e contendo ZnPc baixa na ausncia de luz.
A localizao do fotossensibilizante nas clulas tumorais pode
influenciar a atividade fotodinmica (RCK et al., 1996). O caminho
pelo qual o fotossensibilizante ser interiorizado pelas clulas tumorais
ser definido pelas suas propriedades qumicas, tamanho, carga, carter
hidroflico-lipoflico. Alm disso, a distribuio celular determinada
pelo mecanismo de internalizao, que pode ser influenciado pela
composio do meio e pelo tipo de sistemas carreadores utilizados para
a liberao do fotossensibilizante nas clulas (RCK et al., 1996;
KONAN et al., 2003). Assim, comparando-se a atividade fotobiolgica
da ZnPc livre e encapsulada, a livre menos citotxica do que a
encapsulada com diferena estatisticamente significativa (p < 0,05). A
ZnPc livre em soluo, por ser hidrofbica, pode localizar-se no interior
da membrana plasmtica (bicamada de fosfolipdios) onde menos
citotxica. As nanopartculas podem se adsorver na superfcie celular ou

107

podem ser captadas pelas clulas por endocitose. Aps internalizao

por endocitose, nanopartculas podem liberar a ZnPc no citoplasma da
clula onde ela mais citotxica. A prpria partcula contendo
molculas de ZnPc na sua superfcie pode funcionar como um ncleo
gerador de oxignio singlete durante o processo de irradiao por TFD.

CAPTULO 5
CONCLUSES

Foram sintetizadas nanopartculas magnticas, NPMs, com cido

oleico, AO, com dimetro mdio de 13nm utilizando o mtodo de coprecipitao em meio aquoso a temperatura ambiente. Estas NPMs so
compostas majoritariamente de magnetita (Fe3O4) com alto valor de
magnetizao de saturao (Ms) e propriedades superparamagntica. O
encapsulamento destas NPMs via polimerizao de MMA em
miniemulso foi eficaz como se pode observar nas anlises de MET.
No encapsulamento da ZnPc via polimerizao de MMA em
miniemulso com ou sem auxlio da tcnica de nanoprecipitao podese obter resultados satisfatrios. Utilizando a tcnica de UV-Vs
verificou-se que as propriedades espectromtricas da ZnPc no foram
alteradas e o rendimento do processo de encapsulao da ZnPc nas
nanopartculas polimricas foi superior a 80% em ambos os mtodos. O
mtodo de encapsulamento com auxlio da tcnica de nanoprecipitao
se mostrou mais eficaz para encapsulamento da ZnPc resultando em
uma concentrao mais elevada de ZnPc nas nanopartculas polimricas
(3,7 contra 3,0 g/mg).
No encapsulamento simultneo de NPMs com ZnPc no ocorreu
alterao das propriedades espectromtricas da ZnPc e nem das
propriedades magnticas das NPMs. A incorporao das NPMs foi
comprovada atravs das anlises do MET.
Atravs do estudo de liberao in vitro pode-se verificar que o
perfil de liberao da ZnPc foi lenta e sustentada em ambas
nanopartculas polimricas (com ou sem NPMs). O estudo de
fototoxicidade mostrou que a ZnPc liberada das nanopartculas
polimricas sem e com NPMs foi capaz de reduzir em mais de 70% a
viabilidade de clulas neoplsicas da linhagem A549 aps exposio
luz com comprimento de onda de 660nm.
Como sugestes para trabalhos futuros, pode-se citar:
Estudar o efeito das NPMs encapsuladas no tratamento por
hipertermia de vrias clulas tumorais;

110

Estudar o efeito da terapia fotodinmica com ZnPc encapsulada

em nanopartculas polimricas em clulas tumorais;
Realizar o estudo do efeito do tratamento simultneo por terapia
fotodinmica e hipertermia utilizando as nanopartculas
polimricas com NPM e ZnPc.

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