Mémoire de M1 SIMS (2014)

2013-2014
Master 1
SIMS
Implication de la voie du
TNF- dans les effets de
microparticules
macrophagiques sur la
contractilit de cellules
cardiaques isoles de
souris adultes
Grimaud Joaquim
Sous la direction du Dr. Noireaud Jacques,

Directeur de Recherche Inserm
Membres du jury
Nom/Prnom 1 | Fonction
Soutenu le :
19 juin 2014
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autorise le partager, reproduire,
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REMERCIEMENTS
Je tiens remercier en premier lieu le Dr. Jacques Noireaud pour ses nombreux conseils, les
connaissances et expriences quil ma transmis, la confiance quil ma accorde, son accessibilit, sa
disponibilit, sa bonne humeur et sa gentillesse.
Je tiens aussi remercier le Dr. Ramaroson Andriantsitohaina de mavoir accueilli au sein de son unit et
sans qui loccasion de dcouvrir le monde de la recherche ne maurait pas t donne.
Jadresse galement mes remerciements Badreddine Lahouel et Edward Milbank pour leurs nombreux
conseils et remarques
Je tiens enfin remercier lensemble des membres de lunit Inserm U1063 pour leur aide et leur
disponibilit tout au long de ces 2 mois de stage.
Sommaire
INTRODUCTION : ........................................................................................................................ 1
1.
2.
3.
4.
5.
Contexte gnral .................................................................................................................... 1

Lathrosclrose ..................................................................................................................... 1
Les microparticules ................................................................................................................. 2
Le couplage excitation-contraction ........................................................................................ 2
Objectif de ltude .................................................................................................................. 3
MATERIEL ET METHODES ............................................................................................................ 4

1.
Culture des macrophages RAW 264.7 et obtention des microparticules
macrophagiques .................................................................................................................................... 4
1.1.
Culture cellulaire de la ligne RAW 264.7 ..................................................................................... 4
1.2.
Obtention des microparticules ..................................................................................................... 4
2.
Isolement des cardiomyocytes ............................................................................................... 4
2.1.
Prlvement des curs de souris C57BL/6 adultes ........................................................................ 4
2.2.
Montage Langendorff et digestion enzymatique ............................................................................. 4
3.
Analyse fonctionnelle : Mesure de la contraction et du transitoire calcique des
cardiomyocytes isols ........................................................................................................................... 5
3.1.
Marquage des cardiomyocytes par la sonde Fura-2AM ................................................................... 5
3.2.
Systmes denregistrement ......................................................................................................... 6
4.
Analyse molculaire ................................................................................................................ 6
4.1.
Dosage des protines ................................................................................................................. 6
4.2.
Western-Blot ............................................................................................................................. 6
5.
Analyses statistiques .............................................................................................................. 7
RESULTATS .................................................................................................................................. 7
1.
2.
3.
4.
5.
Le TNFest prsent dans les MPs macrophagiques ................................................................ 7

TNF per se induit un effet inotrope ngatif ........................................................................... 7
Le TNF- na pas deffet sur les transitoires calciques ........................................................... 8
Les MPS induisent un effet inotrope ngatif ........................................................................... 9
Le SPD-304 inhibe leffet des MPs macrophagiques ............................................................... 9
DISCUSSION ............................................................................................................................. 10
CONCLUSION............................................................................................................................. 10
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................................... 11
Liste des abrviations:

Act D : Actinomycine D
Apo B : Apolipoprotine B
ATP : Adnosine-5-Triphosphate
BSA : Bovine Serum Albumine (Srum dalbumine bovine)
Ca2+: Calcium
CICR : Calcium-Induced Calcium Release
DMSO: Dimthyl sulfoxyde
ESM : Erreur standard la moyenne
HRP : Horseradish peroxydase (Peroxydase de raifort)
I-CAM : Intercellular Adhesion Molecule (Protine dadhsion intercellulaire)
ICaL : Canaux calciques potentiel-dpendants de type L (Long Lasting)
IFN-: Interfron gamma
IL-1: Interleukine 1
IL-8 : Interleukine 8
LDL : Low Density Lipoprotein (Lipoprotine de basse densit)
M-CSF : Macrophage colony-stimulating Factor
MCP-1: Monocyte Chemoattractant Protein 1 (Protine chimioattractante pour les monocytes)
MPs : Microparticules
NCX : Echangeur Sodium/Calcium
OMS: Organisation Mondiale de la Sant
oxLDL : Oxidized Low-Density Lipoprotein (Lipoprotine de basse densit oxyde)
RPE : Rsonance Paramagntique Electronique
RS : Rticulum sarcoplasmique
RYR : Rcepteur sensible la ryanodine
SERCA : Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase
SVF: Srum de veau foetal
TACE: TNF--converting enzyme (Enzyme de conversion du TNF-)
TBS-Tween : Tris-buffered saline and Tween 20
TNF- : Tumor necrosis factor alpha (Facteur de ncrose de tumeur alpha)
TNF-R1/2 : Rcepteurs au TNF- de type 1 et 2
V-CAM 1 : Vascular Cell Adhesion Protein 1 (Protine-1 dadhsion vasculaire)
RSUM
Dans le cas de lathrosclrose, linflammation au niveau des artres coronaires implique lactivation des
monocytes/macrophages et la libration de microparticules (MPs) dans la circulation sanguine, qui
peuvent ainsi venir proximit des cardiomyocytes myocardique. Par ailleurs, une expression importante
du facteur de ncrose tumoral (TNF)- par les macrophages de la plaque dathrome a t mise en
vidence, ce qui rend fortement probable que les MPs issues de ces derniers puissent porter cette
cytokine et activer ainsi les rcepteurs TNF de type 1 et 2 ports par les cardiomyocytes. Une tude
prliminaire ralise dans des cardiomyocytes isols de souris adulte, a permis de montrer que des MPs
macrophagiques issues de la ligne RAW 264.7, ont pour effet de diminuer et de ralentir le
raccourcissement des sarcomres (effet inotrope ngatif), sans affecter les transitoires calciques (i.e. la
libration de Ca2+ du rticulum sarcoplasmique). Lobjectif de cette tude a donc t de dterminer si le
TNF- est effectivement port par les MPs et si oui, sil joue un rle dans les effets observs des MPs sur
la performance contractile des cardiomyocytes murins adultes. Lapproche exprimentale utilise combine
une mthode dtude fonctionnelle, i.e. lanalyse concomitante de la contraction des sarcomres et des
transitoires calciques, ainsi quune mthode de biologie molculaire (i.e. western-blot) permettant de
dtecter la prsence ventuelle de TNF- dans les MPs. Les rsultats obtenus montrent tout dabord la
prsence de TNF- dans les MPs macrophagiques et que le TNF- a un effet inotrope ngatif sur la
contraction des cardiomyocytes. De plus, leffet inotrope ngatif des MPs macrophagiques sur la
contractilit cardiomyocytaire est supprim suite un prtraitement par le SPD-304 (10 M), inhibiteur
spcifique et irrversible des rcepteurs au TNF-. La voie du TNF- pourrait donc bien tre implique
dans leffet des MPs macrophagiques sur la contractilit des cardiomyocytes. Il serait maintenant
intressant de confirmer limplication du TNF- port par ces MPs en explorant divers voies de
signalisation du TNF-, comme les voies NO/cGMP/PKG, phospholipase A2/acide arachidonique,
sphingosines.
ABSTRACT
mots-cls : Athrosclrose, macrophage, microparticule, TNF-, cardiomyocyte, souris adulte
In case of atherosclerosis, inflammation in the coronary arteries involves the activation of monocytes/
macrophages and the release of microparticles (MPs) in the bloodstream. Thus, these MPs can come
close to myocardial cardiomyocytes. Moreover, an important expression of tumor necrosis factor (TNF)-
by macrophages of atherosclerotic plaque was highlighted, which makes possible that these MPs carry
this cytokine and thus are able to activate the TNF receptors of type 1 and 2 on the cardiomyocytes. A
preliminary study in cardiomyocytes isolated from adult mice, demonstrated that MPs from the
macrophage RAW 264.7 have the effect of reducing and slowing the shortening of sarcomeres (negative
inotropic effect) without affecting calcium transients (i.e. the release of Ca2+ from the sarcoplasmic
reticulum). The objective of this study was to determine whether TNF- is actually carried by MPs and if
so, if he plays a role in the observed effects of MPs on the contractile performance of adult mouse
cardiomyocytes. The experimental approach combines a method of functional analysis, i.e. the
simultaneous analysis of sarcomeres contraction and calcium transients, and a method of molecular
biology (i.e. Western blot) to detect the presence of TNF- in the MPs. The results show the presence of
TNF- in the MPs from the macrophages and that TNF- has a negative inotropic effect on the contraction
of cardiomyocytes. Moreover, the negative inotropic effect of MPs from macrophages on cardiomyocyte
contractility is removed after a pretreatment with SPD-304 (10 M), a specific and irreversible inhibitor of
TNF- receptors. Thus, the TNF- pathway could be involved in the effect of MPs from macrophages on
contractility of cardiomyocytes. Now, it would be interesting to confirm the involvement of TNF- carried by
these MPs by studying various signaling pathways of TNF-, such as NO/ cGMP / PKG, phospholipase
A2/arachidonic acid and sphingosines pathway.
Keywords : Atherosclerosis, microparticle, TNF-, cardiomyocyte, adult mouse.
Prsidence de l'universit
40 rue de rennes BP 73532
49035 Angers cedex
Tl. 02 41 96 23 23 | Fax 02 41 96 23 00
de la paroi artrielle (Lusis, 2000). LOMS la dfinie
INTRODUCTION :
comme
tant
une
association
variable
de
remaniements de lintima des artres de moyen et de
1. Contexte gnral
gros calibre, consistant en une accumulation locale
Depuis ces 40 dernires annes, de nombreux

progrs ont t raliss dans la prvention, le
diagnostic
et
le
traitement
des
maladies
cardiovasculaires (Braunwald et Bristow, 2000).

Toutefois, malgr ces grandes avances, les
maladies cardiovasculaires continuent de reprsenter
aujourdhui une des principales causes de mortalit
dans le monde (World Health Organization, 2007).
LOrganisation Mondiale de la Sant (OMS) a estim
que 17 millions de dcs en 2008 taient imputables
aux pathologies cardiovasculaires, soit environ un
tiers de la mortalit mondiale totale (World Health
Organization, 2011). Le diagnostic et la prise en
charge de ces pathologies sont difficiles et ces
dernires ont un impact conomique important
(Bloom
et
al.,
pidmiologistes
2011).
indiquent
Les
projections
que
les
des
maladies
cardiovasculaires, notamment dorigine ischmique,

devraient rester lune des principales causes de
mortalit au moins jusqu 2030 (Beaglehole et
de lipides, de glucides complexes, de sang et de

produits sanguins, de tissus fibreux et de dpts
calcaires. Le tout saccompagne de modifications de
la mdia. Cette pathologie a longtemps t
considre uniquement comme un dpt passif de
lipides,
mais
aujourdhui
lathrosclrose
est
galement dfinie comme une maladie inflammatoire

chronique entrane par les lipides, en particulier les
LDLs
( low
density
lipoproteins )
contenant
lapolipoprotine (Apo) B, et les leucocytes (Swirski

et Nahrendorf, 2013). Lathrosclrose peut aussi
toucher des artres de plus petites tailles, comme les
artres coronaires (Libby et al., 2002).
Laccumulation de lipides, et notamment de LDL
oxyds (oxLDL) dans les artres entre lendothlium
et la lame lastique interne induit une augmentation
de lexpression de certaines molcules dadhsion
sur la surface endothliale des vaisseaux, dont la VCAM 1 ( Vascular Cell Adhesion Protein 1 ), lICAM
( Intercellular Adhesion Molecule ) et la P-Slectine
Bonita, 2008).
(Poston et Johnson-Tidey, 1996). Ces molcules

permettent ladhsion de
2. Lathrosclrose
circulants
qui
dordinaire
monocytes sanguins
ne
se
fixent
pas
(Blankenberg et al., 2003). Ensuite, sous leffet de
Il sagit dune pathologie cardiovasculaire chronique
facteurs chimiotactiques, dont la MCP-1 ( Monocyte
trs rpandue qui samplifie avec lge. Elle est sous-
Chemoattractant Protein 1 ) et linterleukine 8 (IL-8),
jacente des vnements ischmiques coronariens
les monocytes adhrents pntrent lintima travers
(infarctus
et crbrovasculaires
les jonctions inter-endothliales. Ces facteurs sont
(accident vasculaire crbral). Elle est caractrise
fortement exprims par les cellules endothliales de
par le dpt, dans les artres, dune plaque
la plaque dathrome. Les monocytes se diffrencient
dathrome essentiellement compose de lipides
ensuite en macrophages sous laction du M-CSF
riches en cholestrol enveloppe dans une sclrose,
( Macrophage colony-stimulating factor ) scrt
i.e. une gaine fibreuse forme par lpaississement
par les cellules endothliales. Ces derniers expriment
du
myocarde)
Grimaud Joaquim | Implication de la voie du TNF- dans les effets de microparticules macrophagiques sur la
contractilit de cellules cardiaques isoles de souris adultes
1
le rcepteur Apo B/E et jouent un rle dboueurs
les plus utiliss pour leur tude sont ceux qui sont le
( scavenger ) en phagocytant les oxLDL accumuls
plus facilement collectables, c'est--dire les cellules
dans lespace sous-endothlial. Les macrophages se
sanguines circulantes telles que les plaquettes, les
chargent donc en cholestrol, ce qui conduit leur
lymphocytes et les monocytes. La scrtion de MPs
transformation en cellules dites spumeuses qui
est souvent lie une apoptose dclenche soit par
saccumulent. Cette accumulation engendre une
un stress oxydatif important, de grandes forces de
raction inflammatoire chronique et des lymphocytes
cisaillement shear stress ou des lsions.
T sont leur tour recruts dans lintima. Les
Toutefois, la scrtion de MPs peut aussi tre
lymphocytes T librent de linterfron (IFN)- et du
dclenche par une activation de la cellule. Cest par
TNF ( tumor necrosis factor )-/ qui stimulent les
exemple le cas des plaquettes et des cellules
cellules spumeuses qui vont leur tour librer des
endothliales (Jenkins et al., 2013). Une fois
cytokines pro-inflammatoires et/ou pro-apoptotiques
libres, elles pourront soit intragir avec diffrents
telles que le TNF- et lIL-1. Ces cytokines
ligands ports par leurs cellules cibles et ainsi activer
renforcent le caractre pro-inflammatoire de la plaque
diffrentes cascades de signalisation, soit transfrer
dathrome et ont une action autocrine sur les
certains de leurs constituants via des phnomnes
macrophages transforms en cellules spumeuses.
dinternalisation ou de fusion membranaire (Hugel et
Elles les activent et induisent la libration de
al., 2005). Les MPs permettent ainsi leurs cellules
microparticules (MPs) (Spagnoli et al., 2007).
cibles dacqurir de nouvelles proprits et fontions

biologiques. Leur implication a t dmontre dans
de nombreux processus physiopathologiques tels que
3. Les microparticules
la
Les MPs sont drives de fragments de membrane

plasmique issue de la cellule qui les scrte. Leur
thrombose,
langiogense,
les
le
diabtes,
processus
linflammation,
tumoral
et
lathrosclrose (Freyssinet, 2003 ; Piccin, 2007).
taille varie de 0,1 1m de diamtre. Elles peuvent

se retrouver libres dans le milieu extracellulaire
apoptotique (Biro et al., 2007; Sewify et al., 2013).
4. Le couplage excitationcontraction
Au
dchets
Le couplage excitation-contraction cardiaque est un
cellulaires , platelet dust (Wolf, 1967), elles sont
processus qui englobe la stimulation lectrique des
aujourdhui
vritables
cardiomyocytes ventriculaires (i.e. du myocarde) et
vecteurs biologiques. En effet, elles portent aussi
ainsi la contraction du cur permettant dassurer une
bien des marqueurs membranaires que diffrents
distribution sanguine dans tout lorganisme. Les
constitutants du cytoplasme ou du noyau (ADN,
cardiomyocytes
ARNm ou miRNA). Les stimuli lorigine de la
protines myofibrillaires longitudinales regroupes en
production de microparticules sont multiples et leur
sarcomres, donnant cet aspect stri la cellule
contenu est trs vari (Budaj et al., 2012; Cocucci
cardiaque observe en microscopie optique. Le
et al., 2009; Distler et al., 2005). En thorie, toutes
raccourcissement simultan de ces sarcomres au
les cellules peuvent en produire, mais les modles
niveau
suite une activation cellulaire ou un phnomne
dpart
dcrites
considres
comme
comme
des
de
cellulaire
ventriculaires
entrane
contiennent
le
phnomne
des
de
2
contraction myocardique. Le calcium (Ca2+) est le
MPs issues de ces derniers puisse porter cette
messager ubiquitaire essentiel pour cette activit
cytokine (Martinez et al., 2005 ; Tedgui et Mallat,
contractile. La propagation dun potentiel daction,
2006). TNF- est une protine implique dans
initi au niveau sinusal auriculaire cardiaque, le long
linflammation systmique et appartient un groupe
du sarcolemme et du systme tubulaire transverse
de cytokines qui stimulent la raction inflammatoire
des cardiomyocytes induit une entre de Ca2+ dans le
aigu. Il existe deux formes de TNF-, une forme
cardiomyocyte via louverture des canaux calciques
transmembranaire et une forme libre (Horiuchi et al.,
potentiel-dpendants de type L (Long Lasting) (ICaL).
2010). Le TNF- transmembranaire (26 kDa) est un
Cette entre dions Ca2+ va activer des rcepteurs-
prcurseur de la forme soluble du TNF- (17 kDa), on
canaux sensibles la ryanodine (RYR) qui vont
le retrouve exprim par les macrophages activs et il
2+
permettre une sortie massive de Ca du RS, i.e. le

transitoire calcique. Cette sortie de Ca
2+
peut-tre cliv sous laction dune TNF--converting
du RS est
enzyme (TACE) pour gnrer la forme soluble du
amplifie par un rtrocontrle positif autocatalytique,
TNF-. Cette forme soluble libre est capable de se
le mcanisme de CICR ( Calcium-induced Calcium
lier aux rcepteurs TNF de type 1 et 2 (TNF-R1 et
Release ) (Lee et Keener, 2008). La concentration
TNF-R2) ports par les cardiomyocytes.
calcique passe de 10
lactivation
des
-8
10
-6
myofibrilles
M. Le Ca
et
2+
ainsi
induit
le
Une tude prliminaire ralise dans des
raccourcissement sarcomrique, i.e. la contraction.
cardiomyocytes isols de souris adulte, a permis de
2+
cytosolique doit ensuite
montrer que des MPs macrophagiques issues de la
diminuer pour permettre la relaxation de lappareil
ligne RAW 264.7, ont pour effet de diminuer et de
contractile. Le Ca2+ est ainsi principalement (chez la
ralentir le raccourcissement des sarcomres (effet
souris 93%) repomp par la pompe ATPasique
inotrope ngatif), sans affecter les transitoires
La concentration de Ca
SERCA
( Sarco/Endoplasmic
Reticulum
2+
Ca -
calciques (Milbank et al., 2014). Lobjectif de cette
ATPase ) du RS, et aussi (7%) expuls par
tude a donc t de dterminer si le TNF- est
lchangeur Sodium/Calcium NCX et la Ca 2+ ATPase
effectivement port par les MPs et si oui, sil joue un
du sarcolemme vers le milieu extracellulaire (Bers,
rle dans les effets observs des MPs sur la
2002).
performance contractile des cardiomyocytes murins

adultes. Un inhibiteur spcifique et irrversible des
5. Objectif de ltude
Dans le cas de lathrosclrose, linflammation au
rcepteurs aux TNF-, le SPD-304 (10M ;

Calbiochem) a t utilis afin de vrifier cette
implication du TNF-.
niveau des artres coronaires implique lactivation

des monocytes/macrophages et la libration de MPs
dans la circulation sanguine, qui ainsi peuvent venir
proximit des cardiomyocytes myocardique. Par
ailleurs, une expression importante du TNF- par les
macrophages de la plaque dathrome a t mise en
vidence, ce qui rend fortement probable que les
3
Matriel et mthodes
produites selon le type de stimulation. Un surnageant

a t obtenu par deux centrifugations de 750 g
1. Culture des macrophages

RAW 264.7 et obtention
des microparticules
macrophagiques
pendant 15 minutes, et de 1500 g pendant 5 minutes
1.1.
deux fois 45 min 13 000 g. Les MPs contenues
Culture cellulaire de la
ligne RAW 264.7
afin dliminer les cellules et les diffrents dbris

cellulaires. Les MPs contenues dans le surnageant
ont t isoles grce deux centrifugations
successives pendant 30 minutes 13 000 g, puis
dans le surnageant ont t rcupres dans du NaCl
RAW 264.7 est une ligne de macrophages obtenue
0,9 % et conserves 4C jusqu leur utilisation.
partir de souris (Mus Musculus) BALB/c (American

Type Culture Collection, Manasses, VA, USA). Ces
cellules ont t par la suite mises en culture dans un
milieu DMEM (Lonza), additionn de 10% de srum
de veau ftal (SVF) dcomplment, de 1% de
2. Isolement des
cardiomyocytes
2.1.
Pnicilline/Streptomycine, et de 1% de L-gluthamine.
Les cellules ont t places dans une atmosphre
humidifie 5% de CO2 et 37C. Le milieu a t
chang toutes les 48 heures, lorsque les cellules
taient
90%
de
confluence
environ.
Les
macrophages RAW 264.7 utiliss dans cette tude
Les
Prlvement des curs

de souris C57BL/6
adultes
souris
utilises
pour
lisolement
des
cardiomyocytes ventriculaires sont des mles de

souche C57BL/6. Elles ont t soumises un rgime
standard et furent utilises lge de 14 semaines.
pour produire des microparticules lont t entre des

repiquages R3 et R10.
1.2.
Obtention des
microparticules
Les cardiomyocytes ventriculaires ont t isols par

dissociation mcanique comme dcrit prcdemment
(Pinz et al, 2011). Les souris sont soumises un
prtraitement par de lhparine (Hparine Choay,
La ligne cellulaire de macrophages RAW 264.7 a
Sanofi
donc t utilise pour la production de MPs. Les
intrapritonale). Lhparine permet dviter toute
cellules ont t rensemences une densit de
coagulation sanguine et ventuel infarctus. Aprs
Aventis,
Paris,
0,05
ml
par
voie
2.10 cellules/mL puis mises en culture comme dcrit
vingt minutes, les animaux sont sacrifis dans une
ci-dessus. La production de MPs a t dclenche
cuve CO2. Une incision thoracique est ensuite
par traitement durant 24 heures avec soit avec de
ralise, afin dexposer le cur.
lactinomycine D (ActD, 1g/mL), soit avec de

linterleukine-1 (IL-1 ; 10ng/mL) seul, soit du TNF-
(5ng/mL) seul, soit du TNF- et de lIL-1 combins.
Le traitement le plus efficace pour induire la
production de MPs est lActD, qui induit lapoptose
des macrophages. Quatre types de MPs sont ainsi
2.2.
Montage Langendorff et
digestion enzymatique
Une fois dtach, le cur est canul par laorte et

plac sur le montage Langendorff. Les artres
coronaires du ventricule gauche sont donc perfuses
4
de faon rtrograde par une solution tampon HANKS-
concentration calcique du milieu est alors augmente
HEPES sans Ca2+ ajout, dite de lavage, 37C
durant une phase de rpltion en 4 tapes
(NaCl : 113 mM, KCl : 4,7 mM, KH2PO4: 0,6 mM,
successives de 5 min jusqu atteindre 1 mM.
KHCO3 : 10 mM, Na2HPO4 : 0,6 mM, NaHCO3 : 12

mM, HEPES : 10 mM, MgCl2 :1,2 mM, glucose : 5,5
Pour les tudes par Western-Blot, les cardiomyocytes
mM, taurine : 29 mM, pH ajust 7,4 avec du NaOH
sont ensuite dposs dans des boites de Ptri (35
5N) ce qui permet denlever toutes traces sanguines
mm de diamtre) prtraites avec de la laminine (20
dans les artres coronaires. Du 2,3-Butanedione
mg/mL) en prsence dune solution de Tyrode (NaCl :
monoxime (BDM, 10 mM) est ajout dans cette
113mM, KCl :4,7mM, MgCl2 : 1,2 mM, Na2HPO4 : 0,6
solution de lavage. Il sagit dune substance
mM, NaHCO3 : 4,4 mM, HEPES : 20 mM, glucose :
cardioplgique qui dinhibe lATPase de la myosine et
10 mM, taurine : 20 mM, Na pyruvate : 3 mM, CaCl2 :
empche rapidement et rversiblement la formation
1,25mM, pH : 7,35) pendant 2-3 heures.
des ponts entre actine et myosine. Cela permet au

cur de rester en permanence relax et prvient les
Pour les tudes fonctionnelles, ce nest pas la boite
dommages dus aux contractions terminales,
de Ptri qui est prtraite avec de la laminine (20
lischmie et la reperfusion (Louch et al, 2011).
mg/mL) mais une lamelle de verre (Corning, 25x25
Toutefois, lutilisation de ce milieu trs rduit en Ca 2+
mm) place lintrieur de la boite de Ptri (35 mm)
entrane une fragilisation du sarcolemme qui peut
en prsence de la mme solution de Tyrode pendant
induire une accumulation de sodium (Na ). Si bien

que lors de la rintroduction du Ca
2+
2-3 heures.
extracellulaire,
lchange Na+/Ca2+ est dans le sens dune entre de

Ca2+, ce qui va induire une surcharge en Ca 2+
intracellulaire dramatique pour la survie de la cellule.
Cest pourquoi la solution de lavage contient aussi de
la taurine (3 mM) qui permet de protger les cellules
contre ce phnomne appel paradoxe calcique .
Il existe en effet un symport taurine/Na + permettant
de vider la cellule dune surcharge de sodium.
3. Analyse fonctionnelle :
Mesure de la contraction
et du transitoire calcique
des cardiomyocytes
isols
3.1.
Ensuite, une solution de lavage contenant de la
Marquage des
cardiomyocytes par la
sonde Fura-2AM
Liberase (Solution commerciale contenant diffrents

types de collagnases ; Roche, 10 ml/mL) est
Les cardiomyocytes sont chargs ou non avec du
perfuse jusqu ce quune augmentation du dbit
Fura-2AM
dcoulement soit observe (6-9 min), ce qui
Molecular Probes, 1M dans du DMSO [dimthyl
tmoigne dune bonne digestion des connections
sulfoxide]) temprature ambiante et obscurit
intercellulaires. Une fois digr, le cur est dtach
pendant 20 minutes, puis lavs durant 5 minutes
par coupure au niveau des oreillettes. Puis, les
avec la solution de Tyrode afin de permettre la
cellules sont dissocies par sparation mcanique,
(ester
actoxymthyl
permant,
dsestrification du Fura-2 intracellulaire.
filtres et mises sdimenter pendant 10 minutes. La

5
3.2.
Systmes
denregistrement
en duplicate sur une plaque 96 puits. 25 L de ractif

A (BioRad), contenant des ions Cu2+, sont ensuite
Les raccourcissements des sarcomres et les

transitoires
calciques
ont
enregistrs
simultanment en imposant une stimulation lectrique

de champ (0,5 Hz, 0,1 ms, 7-15 V) laide du
systme IonOptix (Myocyte Calcium and Contractility
Recording System, Dublin, Irlande) coupl un
microscope fluorescence inverse (Episcopic
fluorescence
attachment
ef-inv-II ;
Inverted
microscope AE30-31). La contraction des sarcomres

est enregistre une frquence de 500 Hz tandis que
les transitoires calciques sont enregistrs une
frquence de 250 Hz. Les rponses sont analyses
avec le logiciel IonWizard 6.3 (IonOptix).
ajouts. Les atomes dazote contenus dans les

liaisons peptidiques des protines rduisent ces ions
Cu2+ en ions Cu+. Puis, 200 L dun ractif B
(BioRad) sont ajouts. Ce dernier va former un
complexe de couleur bleu avec les ions Cu+. La
plaque est laisse incuber 10 minutes labri de la
lumire puis labsorbance est mesure 570 nm
grce un lecteur de microplaques (Mithras LB 940,
Berthold technologies). La dtermination de la
concentration
se
fait
par
comparaison
avec
labsorbance mesure dune gamme talon de BSA

( Bovine serum albumine ) 5%.
4.2.
Western-Blot
Les protines sont spares sur un gel de poly-
4. Analyse molculaire
Suite aux diffrentes stimulations, les cardiomyocytes
sont dtachs par grattage, puis les protines en sont
extraites. Pour cela, les cellules sont rcupres
dans des tubes eppendorf et centrifugs 500g
pendant 5 minutes 20C. Le culot est repris dans du
PBS, puis centrifug 1500g pendant 5 minutes. Le
surnageant est ensuite limin et le culot plong dans
lazote liquide. Dans un premier temps, le dosage des
protines est ralis selon la mthode de Lowry. Ce
dosage permet dorienter la manire dont il est
possible dexploiter lchantillon par la suite et
notamment de savoir si la quantit de protines est
suffisante pour une dtection par Western-Blot. Le
reste de lchantillon est ensuite utilis pour raliser
des Western-Blot.
4.1.
Dosage des protines
acrylamide (Novex Protein from Life technologies,

NuPAGE 4-12% Bis-Tri Gel ; 1,0 mm X 12 well ou 1,5
mm X 10 well) pendant 90 minutes 150 V, puis
transfres sur une membrane de nitrocellulose
pendant 90 minutes 110 V 4C. La membrane est
alors colore au rouge Ponceau puis sature avec
une solution de srum dalbumine bovine (BSA) 5%
pendant 90 minutes temprature ambiante afin
dliminer les sites de fixation non spcifiques.
Ensuite, la membrane est mise incuber avec
lanticorps
primaire
pendant
90
minutes
temprature ambiante, ou 4C durant la nuit. Le

lendemain, 3 lavages de 10 minutes au TBS-Tween
(Tris buffered saline and Tween) (20 mM Tris ;
61,5mM NaCl ; 0,1% Tween) sont effectus afin
dliminer
lanticorps
en
excs.
Lanticorps
secondaire coupl la peroxydase est alors mis

incuber avec la membrane pendant 90 minutes
temprature ambiante, puis une autre srie de
Le dosage des protines a t ralis en suivant le

protocole de Lowry. 5 L dchantillons sont dposs
lavages, 3 fois 10 minutes, avec du TBS-Tween est

effectue.
Les
protines
sont
rvles
par
6
chemiluminescence soit avec du luminol (Santa Cruz)
Rsultats
pendant 1 minute, soit grce au kit de rvlation

SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity
Substrate (ThermoScientific, Fischer) pendant 3
minutes. La rvlation seffectue grce un systme
1. Le TNFest prsent dans

les MPs macrophagiques
dacquisition en chambre noire (ChemiSmart 500,
Le TNF- a t dtect par Western-blot sur des
Vilbert Lourmat) et du logiciel Chemi-Capt 5.0. Les
extraits protiques de MPs issues de macrophages
diffrents anticorps qui ont t utiliss sont lanticorps
RAW 264.7 traites avec de lActD (figure 1). Sur les
polyclonal anti-TNF- (Santa Cruz, 1/500) produit
membranes de nitrocellulose, on peut notamment
chez la chvre, lanticorps polyclonal anti--tubuline
distinguer les bandes correspondant aux deux formes
(Santa Cruz, 1/500) produit chez la chvre et lanti-
de TNF-, libre (17kDa) et transmembranaire
IgG de chvre conjugu HRP (Santa Cruz, 1/5000)
(26kDa).
produit chez lne.
5. Analyses statistiques
Les diffrentes bandes dintrt des Western Blot
sont quantifies relativement laide du logiciel BIO1D. Ces rsultats sont exprims en moyenne erreur
Figure 1 : Western-blot montrant la prsence de
standard la moyenne (ESM) de n expriences, i.e.
TNF- dans les MPs
le nombre de souris tudies. Les diffrences entre
Expression du TNF- (n=3)
les groupes de donnes ont t compares laide

dun Mann-Whitney non paramtrique laide du
logiciel Prism 5.0. Une valeur de P infrieur 0,05 a
t admise pour que les diffrences entre les
donnes soient considres comme significatives.
Les rsultats des analyes fonctionnelles sont

exprims en moyenne ESM de n expriences,
i.e. le nombre de cellules tudies. Les diffrences
entre les groupes de donnes ont t compares sur
le logiciel Prism 5.0 laide du test t (test de Student)
2. TNF per se induit un

effet inotrope ngatif
Ltude de leffet du TNF- per se (800 U/mL) sur la
contractilit des cardiomyocytes (figure 2) indique
que le TNF- a un effet inotrope ngatif sur les
cardiomyocytes
ds
15
min
et
induit
un
ralentissement des cintiques de raccourcissement et

de relaxation sarcomrique.
non appari et par la mthode statistique ANOVA,

suivie dun test de comparaisons multiples de
Bonferroni, pour les expriences utilisant les MPs.
Une valeur de P infrieure 0,05 a t admise pour
que les diffrences entre les donnes soient
considres comme significatives.
7
3. Le TNF- na pas deffet

sur les transitoires
calciques
Ltude de leffet du TNF- (800 U/mL) sur les
transitoires calciques des cardiomyocytes (figure 3)
indique quil ny a pas deffets significatifs du TNF-
sur les diffrents paramtres du transitoire calcique.
Figure 2: Effet du TNF- per se (800 U/mL) sur la

contractilit des cardiomyocytes
A : Amplitude maximale de raccourcissement (% de
variation de la longueur basale de sarcomre)
B : Vitesse maximale de raccourcissement (-dL/dt, en
m/sec)
C : Vitesse maximale de rallongement (+dL/dt, en
m/sec)
Les valeurs reprsentent les moyennes ESM; n=2428 cellules par groupe, *P<0.05 vs. Contrle (CTRL).
Figure 3: Effets contrles du TNF- (800 U/mL)

sur les transitoires calciques des cardiomyocytes
A : Pourcentage de variation du rapport de
fluorescence F340/F380
B : Vitesse maximale de sortie de Ca2+ lextrieur

du RS (depV)
C : Temps au pic depuis t0 (milliseconde) (peak T)
D : Vitesse maximale de repompage du Ca 2+ (retV)
E : Constante de tps de repompage calcique (en
milliseconde) (TAU)
Les valeurs reprsentent les moyennes ESM; n=2428 cellules par groupe, *P<0.05 vs. Contrle (CTRL).
8
4. Les MPS induisent un

effet inotrope ngatif
5. Le SPD-304 inhibe leffet

des MPs macrophagiques
Ltude de leffet des MPs sur la contractilit des
Ltude de leffet du SPD-304 (10 M) sur leffet
cardiomyocytes (figure 4) indique que les MPs ont un
inotrope ngatif des MPs (figure 5) indique que Le
effet inotrope ngatif rapide sur les cardiomyocytes
SPD-30 empche leffet inotrope ngatif des MPs.
car
ils
induisent
une
diminution
des
raccourcissements sarcomriques.
Figure 4 : Effet des MPs 1 et 10 g/ml sur la

contractilit des cardiomyocytes
A : Enregistrement typique des raccourcissements

sarcomrique
B : Enregistrement typique des transitoires calciques
C : histogramme prsentant leffet des MPs 1 et 10
g/ml sur le pourcentage de raccourcissement
sarcomrique.
Les
valeurs
reprsentent
les
Figure 5: Effet du SPD-304 (10 M) sur leffet
moyennes ESM; n=28-50 cellules par groupe,

*P<0,05 vs. contrle (CTRL).
inotrope ngatif des MPs

A:
Pourcentages
des
raccourcissements
sarcomriques des cardiomyocytes tudis par

9
vido-imaging en prsence ou non de MPs et de
dexpression de protines impliques dans le
SPD-304
couplage excitation-contraction.
B : Vitesse maximale de contraction sarcomrique

(depV, m/sec)
Les
C : Vitesse maximale de relaxation sarcomrique
transmembranaire est port par les MPs issues des
(retV, m/sec)
macrophages RAW 264.7 traits avec de lAct D. De
Les valeurs reprsentent les moyennes ESM; n=16-
plus, il a t montr que le TNF- transmembranaire
50 cellules par groupe, *P<0,05 vs. contrle (CTRL).
est capable dintragir avec le TNF-R1 et le TNF-R2
rsultats
indiquent
que
le
TNF-
(Horiuchi et al., 2010). Ces rcepteurs TNF-R1 et

TNF-R2 se retrouvent exprims la surface des
Discussion
cardiomyocytes (Higuchi et al., 2004).
Lors de cette tude, la prsence de TNF- a bien t

confirme dans les MPs. De plus le TNF- a un effet
Il ny a pas eu deffet observ des MPs sur le
inotrope ngatif sur la contraction, i.e. provoque une
transitoire calcique. Il est nanmoins possible quil y
diminution de la contractilit des cardiomyocytes.

Cependant, cette diminution de la contractilit ne
saccompagne pas dune modification des transitoires
ait un effet et que cet effet ne soit pas dtectable

avec la technique utilise ou que la libration de Ca 2+
partir du RS cache la diminution ventuelle de
calciques. Nous avons confirm que les MPs
lentre de Ca2+ par ICaL. Cependant, dautres
induisent un effet inotrope ngatif. Linhibition de la
travaux indiquent que le TNF- aurait plutt un effet
voie du TNF- par son inhibiteur SPD-304 rtablie la
sur la sensibilit des protines contractiles au Ca 2+
contractilit normale. Lensemble de ces rsultats
(Goldhaber et al., 1996). En prsence de TNF-, la
suggre que le TNF- est impliqu dans leffet
sensibilit des protines contractiles, comme lactine,
inotrope ngatif des MPs issues de macrophages sur
la myosine ou la troponine I au Ca2+ serait diminue.
la contractilit des cardiomyocytes.

Il existe un autre mcanisme dintraction potentiel
Conclusion
entre MPs et cardiomyocytes diffrent de lintraction
La voie du TNF- pourrait donc bien tre implique
linternalisation.
processus
dans leffet des MPs macrophagiques sur la
dinternalisation des MPs sur des cardiomyocytes a
contractilit des cardiomyocytes. Il serait maintenant
dj t tudi (Milbank et al., 2014). Il a ainsi t
intressant de confirmer limplication du TNF- port
montr que les MPs commencent tre internalises
par ces MPs en explorant diverses voies de
ligand-rcepteur,
seulement
aprs
heure
au
Ce
contact
dun
signalisation
du
TNF-,
comme
la
voie
du
cardiomyocyte, tandis que leffet inotrope ngatif des
NO/cGMP/PKG, la voie phospholipase A2/acide
MPs est observ seulement aprs 5 minutes.
arachidonique et la voie sphingosines. Diffrents
Limplication de ce mode daction est donc carte.
inhibiteurs pharmacologiques pourraient tre utiliss
Le temps de traitement avec les MPs est galement
comme la L-Nitroarginine (LNA) qui est un inhibiteur
trop
de la nitric oxide synthase (NOS), lODQ (1H-
court
pour
entraner
des
modifications
[1,2,4]oxadiazolo-[4, 3-a]quinoxalin-1-one) qui est un

10
inhibiteur de la guanylate cyclase soluble (GCs), le
KT 5823 qui est un inhibiteur de la protine kinase G

(PKG),
lAACOCF3
(Arachidonyl
Shedding microvesicles: artefacts no more.
trifluoromethyl
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12
ENGAGEMENT
DE NON PLAGIAT
Je, soussign(e) ......................................................................
dclare tre pleinement conscient(e) que le plagiat de documents ou dune
partie dun document publie sur toutes formes de support, y compris linternet,
constitue une violation des droits dauteur ainsi quune fraude caractrise.
En consquence, je mengage citer toutes les sources que jai utilises
pour crire ce rapport ou mmoire.
sign par l'tudiant(e) le 31 / 05 / 2014
Cet engagement de non plagiat doit tre sign et joint

tous les rapports, dossiers, mmoires.
Prsidence de l'universit
40 rue de rennes BP 73532
49035 Angers cedex
Tl. 02 41 96 23 23 | Fax 02 41 96 23 00

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2013-2014

Sous la direction du Dr. Noireaud Jacques,

Lauteur du prsent document vous

Ces conditions dutilisation (attribution, pas dutilisation

Contexte gnral .................................................................................................................... 1

MATERIEL ET METHODES ............................................................................................................ 4

Le TNFest prsent dans les MPs macrophagiques ................................................................ 7

Liste des abrviations:

mots-cls : Athrosclrose, macrophage, microparticule, TNF-, cardiomyocyte, souris adulte

de la paroi artrielle (Lusis, 2000). LOMS la dfinie

remaniements de lintima des artres de moyen et de

gros calibre, consistant en une accumulation locale

Depuis ces 40 dernires annes, de nombreux

cardiovasculaires (Braunwald et Bristow, 2000).

cardiovasculaires, notamment dorigine ischmique,

de lipides, de glucides complexes, de sang et de

galement dfinie comme une maladie inflammatoire

lapolipoprotine (Apo) B, et les leucocytes (Swirski

(Poston et Johnson-Tidey, 1996). Ces molcules

(Blankenberg et al., 2003). Ensuite, sous leffet de

Il sagit dune pathologie cardiovasculaire chronique

facteurs chimiotactiques, dont la MCP-1 ( Monocyte

trs rpandue qui samplifie avec lge. Elle est sous-

Chemoattractant Protein 1 ) et linterleukine 8 (IL-8),

jacente des vnements ischmiques coronariens

les monocytes adhrents pntrent lintima travers

les jonctions inter-endothliales. Ces facteurs sont

(accident vasculaire crbral). Elle est caractrise

fortement exprims par les cellules endothliales de

par le dpt, dans les artres, dune plaque

la plaque dathrome. Les monocytes se diffrencient

dathrome essentiellement compose de lipides

ensuite en macrophages sous laction du M-CSF

riches en cholestrol enveloppe dans une sclrose,

( Macrophage colony-stimulating factor ) scrt

i.e. une gaine fibreuse forme par lpaississement

par les cellules endothliales. Ces derniers expriment

le rcepteur Apo B/E et jouent un rle dboueurs

( scavenger ) en phagocytant les oxLDL accumuls

plus facilement collectables, c'est--dire les cellules

dans lespace sous-endothlial. Les macrophages se

sanguines circulantes telles que les plaquettes, les

chargent donc en cholestrol, ce qui conduit leur

lymphocytes et les monocytes. La scrtion de MPs

transformation en cellules dites spumeuses qui

est souvent lie une apoptose dclenche soit par

saccumulent. Cette accumulation engendre une

un stress oxydatif important, de grandes forces de

raction inflammatoire chronique et des lymphocytes

cisaillement shear stress ou des lsions.

T sont leur tour recruts dans lintima. Les

Toutefois, la scrtion de MPs peut aussi tre

lymphocytes T librent de linterfron (IFN)- et du

dclenche par une activation de la cellule. Cest par

TNF ( tumor necrosis factor )-/ qui stimulent les

exemple le cas des plaquettes et des cellules

cellules spumeuses qui vont leur tour librer des

endothliales (Jenkins et al., 2013). Une fois

cytokines pro-inflammatoires et/ou pro-apoptotiques

libres, elles pourront soit intragir avec diffrents

telles que le TNF- et lIL-1. Ces cytokines

ligands ports par leurs cellules cibles et ainsi activer

renforcent le caractre pro-inflammatoire de la plaque

diffrentes cascades de signalisation, soit transfrer