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MPMI Vol.12, n 8, 1999, pp. 720-727. Publicacin no. M-1999-0524-01R.

La resistencia sistmica en Arabidopsis


inducida por Ethylene-Dependent
Rhizobacteria requiere la sealizacin en el
lugar de la aplicacin
Marga Corn Knoester,1 M. J. Pieterse,1 Juan F. Bol,2 y Leendert C. Van Loon1
1Instituto de Biologa, Seccin fitopatologa de la Universidad de Utrecht, P.O. Box 80084, 3508 TB, Utrecht.

Los Pases Bajos; 2Instituto de Ciencias Molecular Vegetal, laboratorios Gorlaeus, Leiden University,
nivel de resistencia frente a un amplio espectro de
P.O. Box 9502, 2300 RA Leiden, Pases Bajos
agentes patgenos. La forma clsica de obtener
aceptaron el 23 de abril de 1999.
La colonizacin radicular de Arabidopsis thaliana no
patgenas, por la rizosfera-colonizar, biocontrol
bacteria Pseudomonas fluorescens WCS417R se ha
mostrado para obtener la resistencia sistmica
inducida
(ISR)
contra Pseudomonas
syringae pv. Tomate (PST). La respuesta de ISR
difiere del patgeno-inducible de la resistencia
sistmica adquirida (SAR) en respuesta que el ISR es
independiente del cido saliclico y no asociados con
protenas relacionadas con la patognesis. Varios de
etileno-respuesta mutantes fueron probados y
demostraron esencialmente normales los sntomas de
infeccin de PST. ISR qued abolida en el etilenomutante insensible etr1-1, mientras que el SAR no fue
afectado. Se obtuvieron resultados similares con el
etileno-insensible mutantes ein2 por ein7, indicando
que la expresin de ISR requiere la va de
transduccin de seal completa de etileno conocida
hasta el momento. La induccin de ISR por WCS417r
no fue acompaada por un aumento de la produccin
de etileno en races u hojas, ni por los aumentos en la
expresin de los genes que codifican para las enzimas
de biosntesis de etileno 1-aminocyclopropane1carboxlico sintasa (CAC) y la ACC-oxidasa.
La EIR1 mutante, mostrando insensibilidad de
etileno en las races slo, no expresan el ISR, previa
solicitud de la CMC417r a las races, pero no exhiben
ISR cuando las bacterias que provocan se infiltraron
en las hojas. Estos resultados demuestran que, para la
induccin de ISR, el etileno se requiere flexibilidad en
el lugar de la aplicacin de inducir rhizobacteria.
Palabras clave adicionales: la mancha
enfermedad, respuesta de etileno mutantes.

bacteriana

Resistencia inducida es el fenmeno por el cual una


planta, tras la estimulacin adecuada, adquiere un mayor
Autor: L. C. Van Loon; Telfono: +31-30-2536862 Fax: +31-302518366;; E-mail: L.C.Vanloon@Bio.uu.nl

720 / Plant-Microbe Interacciones moleculares

resistencia inducida se logra por la infeccin con un


patgeno necrotizante, sobre la cual la planta se vuelve
ms resistente al ataque de patgenos posteriores, tanto
en el plano local y sistmica. Este tipo de resistencia
inducida se denomina resistencia sistmica adquirida
(SAR) y primero fue caracterizado en tabaco
infectados con el virus del mosaico del tabaco (TMV)
( Ross 1961 a, 1961b). Inducida por el patgeno SAR
est acompaado por un pronto aumento de cido
saliclico (SA) (Malamy et al. 1990 ; Mtraux et al.
1990). Acumulacin de sa es esencial para el desarrollo
de la RAE, desde plantas transgnicas que son capaces
de acumular SA han perdido su capacidad de expresar el
SAR (Gaffney et al. 1993). Infeccin de una planta por
un patgeno necrotizante tambin est acompaada por
una rfaga de produccin de etileno (Ross y Williamson,
1951; de Laat y Van Loon 1982; Mauch et al. 1984;
Spanu y espectrgrafo Boller, 1989). El papel del etileno
en la RAE parece ser dependientes de las especies
vegetales. En la Arabidopsis, Lawton et al. (1995)
mostraron que el etileno-insensible etr1-1 mutantes es
plenamente capaz de montar una respuesta de SAR. En
contraste, en plantas de tabaco transgnicas que expresan
el gen mutante de Arabidopsis etr1-1, una reduccin
sustancial de la SAR se observ respuesta Knoester
(1998). SAR est asociada con la expresin de los
llamados genes SAR (Ward et al. 1991), incluidos los
genes que codifican para las protenas relacionadas con
la patognesis (PRs) (Van Loon Linthorst 1985; 1991),
que a menudo se utilizan como marcadores para el estado
inducido. Aplicacin exgena de los qumicos SA, 2,6cido
dichloroisonicotinic
(INA),
o
imitar
benzothiadiazole SAR inducida por el patgeno,
induciendo el mismo conjunto de genes SAR (Ward et al.
1991; Uknes et al. 1992; Friedrich et al. 1996; Grlach et
al. 1996; Lawton et al. 1996).
Otro tipo de resistencia inducida fue reportado en 1991,
cuando se seleccionaron cepas no patgenas, de razcolonizador, promotores del crecimiento vegetal (PGPR
rhizobacteria) fueron mostrados para inducir resistencia
sistmica en clavel (Van Peer et al. 1991)
Direccin actual de Marga Knoester: DLO-Centro de cra y
reproduccin de la planta de investigacin (CPRO-DLO), P.O. Box
16, 6700 AA Wageningen, Pases Bajos.

Este artculo est en el dominio pblico y no copyrightable. Puede ser


libremente reproducido con acreditacin habitual de la fuente. La
Sociedad Americana de Fitopatologa, 1999.

Y pepino (Wei et al. 1991). Para distinguir esta mayor


capacidad defensiva de SAR, inducida por el patgeno de
la proteccin inducida se denomin rhizobacteria
inducida mediada por la resistencia sistmica (ISR)
(Pieterse et al. 1996; Van Loon, 1997; Van Loon et al.
1998). Investigaciones previas sobre PGPR ha
demostrado su capacidad para el control de patgenos del
suelo por la competencia por nutrientes siderophore
competencia mediada por el hierro, o antibiosis (Bakker
et al. 1991; 1992 ; Thomashow Schippers y Weller,
1996). ISR fue encontrado para constituir un nuevo
mecanismo por el cual estos rhizobacteria puede suprimir
las enfermedades de las plantas. Mayor resistencia a las
enfermedades es inducido independientemente de si el
rhizobacteria se aplican a las races o las hojas (Hoffland
et al. 1995; Pieterse et al. 1996).
Mediada Rhizobacteria ISR difiere del SAR inducida
por el patgeno en varias maneras. Al contrario de lo que
ocurre con el SAR, el ISR no es acompaada por la
acumulacin de PRs (Hoffland et al. 1995; Pieterse et al.
1996; Van Wees et al. 1997). Adems, se demostr por
Pieterse et al. (1996) que en la Arabidopsis ISR es
independiente de sa acumulacin. Cuando la respuesta de
etileno mutante de etr1-1 fue utilizado, se constat que
esta mutante haba perdido la capacidad de ser inducida
por rhizobacteria (Pieterse et al. 1998), mientras que
todava era capaz de expresar SAR (Lawton et al. 1994;
Pieterse et al. 1998). Por lo tanto, la capacidad de
respuesta a etileno parece ser necesario para la induccin
de ISR. Por el contrario, el tratamiento de la Arabidopsis
con el precursor de etileno 1-aminocyclopropane-1carboxlico
(ACC)
resistencia
inducida
contra Pseudomonas
syringae pv. Tomate (PST),
indicativa de un papel de etileno en la va de transduccin
de seal de ISR.
Sealizacin de etileno se ha estudiado extensivamente
en Arabidopsis con mutantes que se encuentran alterados
en la triple respuesta fenotipo de oscuro plntulas
cultivadas en la presencia de etileno. Caractersticas de la
triple respuesta inducida por etileno incluyen la
inhibicin de la raz y el hipoctilo alargamiento, radial
hinchazn del hipocotilo y raz, y la exageracin de la
curvatura del gancho apical. Varios mutantes estaban
aisladas que no responden al etileno exgeno, o
constitutivamente mostrar la respuesta en ausencia de la
hormona (Guzmn y Ecker, 1990). Esto result en la
identificacin de varios genes que constituyen una va de
transduccin de la seal que se asemeja a la osmolaridad
respuesta va en levaduras (Ota y Varshavsky 1993;
Maeda et al. 1994). Los primeros pasos en el camino son
definidos por el tipo de receptor de etileno ETR1, EIN4,
ETR2, y ERS (Chang et al. 1993; Hua et al. 1997).
Mostrar todos los mutantes del receptor de etileno
dominante de insensibilidad, lo que indica que tienen
funciones similares o superpuestas en el etileno
percepcin y transduccin de seal. Aguas abajo de los
receptores es el CTR1 , gen que se cree que es un
regulador negativo de la respuesta de etileno, ya que
el CTR1-1 muestra mutante completar la activacin de

721 / Plant-Microbe Interacciones moleculares

todos los fenotipos inducidos por etileno conocido en


ausencia de etileno (Kieber et al. 1993). CTR1 es seguido
por EIN2, que muestra la insensibilidad de etileno cuando
mutado. CTR1 est pensado para regular negativamente
EIN2, posiblemente a travs de una cascada de quinasas
MAP (Ecker, 1995). El ein3 gen ha sido clonado, y
caracterizado como codificacin para un regulador de
respuestas positivas de etileno, actuando posterior de
Ein2 (Chao et al. 1997). Las posiciones de Ein5, EIN6 y
EIN7 todava no se conocen.

Mutant

Fenotipo

Etr1-1
El etileno insensible, dominante
Ein2-1
El etileno insensible recesivos
Ein3-1
El etileno insensible recesivos
Ein4-1
El etileno insensible, dominante
Ein5-1
El etileno insensible recesivos
Ein6
El etileno insensible recesivos
Ein7
El etileno insensible, semidominant
Eto1-1
El etileno overproducer recesivos
Eir1-1
El etileno insensible recesivos raz
Axr1-12
Etileno y auxina insensible recesivos raz
Ctr1-1
Triple respuesta constitutiva recesivos
Tabla 1. Mutantes de etileno utilizado en bioensayos

Sin embargo, todos ellos parecen actuar posterior del


CTR1. Las mutaciones adicionales para abolir (algunas)
respuestas de etileno estn menos bien caracterizados.
Para dilucidar qu partes de la va de transduccin de la
seal de etileno son necesarios para rhizobacteria
mediada-ISR, analizamos una serie de estos mutantes
respuesta de etileno por su capacidad de expresar el ISR.
En comparacin, los mutantes fueron igualmente
analizados
por su
potencial
para
expresar
pathogeninduced SAR.
Resultados
El desarrollo de la enfermedad en el etileno mutantes.
Para investigar la participacin de etileno en resistencia
inducida contra PST, es importante que los sntomas de
una infeccin en la PST mutantes de etileno no se desvan
de las plantas de tipo salvaje a cualquier medida en bruto.
Debido a que el etileno juega un papel importante en la
regulacin de la senescencia foliar, insensibilidad a
etileno podra interferir con el envejecimiento acelerado
inducida por el patgeno, resultando en la prdida de
clorofila y coloracin amarillenta de los sntomas. La
respuesta de etileno mutantes analizados estn
enumerados en la Tabla 1. Etr1-1 plantas mutantes han
mejorado los niveles de clorofila en comparacin con
wild-type Col-0 (Bleecker et al. 1988), pero despus de
que las plantas se sumergen en una solucin que contenga
2,5 107 UFC ml-1 de Pst virulentas, sntomas tpicos de
la enfermedad de la mancha bacteriana, compuesto de
amplias clorosis progresa en difundir necrosis, fueron
observadas. Por ein2-1, dobladas et al. (1992) describi
que estas plantas slo mostraban sntomas mnimos
despus de la infiltracin de vaco con 105 UFC ml-1 de
virulentos de PST. En nuestros experimentos, ein21 desarrollado sntomas claros, despus de que las plantas
se sumergen en una suspensin de 2,5 107 UFC ml-

Ecotipo
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Ler
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0

1 de virulentos de PST. Aunque la aparicin de los


sntomas es diferente de las de Col-0 que deja carecan de
la caracterstica coloracin amarillenta, claramente
visible empapado de agua eran lesiones aparentes.
El ein3-1 plantas tambin mostraron lesiones empapado
de agua, aunque menos evidentes que aquellas en ein21 plantas, con ms de amarillamiento. La otra respuesta
de etileno mutantes probado, excepto ein6, axr112, y ctr1-1, mostr sntomas similares a la enfermedad
extensa Col-0 y etr11 plantas. Mutantes ein6 y axr112 apenas desarrollado sntomas incluso despus de la
inoculacin con 1,25 108 UFC ml-1 de virulentos de
PST.
Ctr mutante1-1 constitutivamente muestra respuestas
de etileno. En esta mutante, Pst infeccin no tuvo como
resultado la formacin del sntoma. Para analizar si la
falta de formacin de los sntomas fue causado por una
incapacidad de PST para entrar y se multiplican en
el CTR1-1 deja el nmero de bacterias se determin
inmediatamente despus del desafo de la inoculacin
mediante inmersin y 4 das ms tarde. En wild-type-0
Col, Pst aument de 1,75 105 UFC G-1 peso fresco (t =
0) a 1,2 107 UFC G-1 (t = 4 das). En ctr1-1, estos
valores fueron de 4,9 x 105 y 4,7 x 107 UFC G-1,
respectivamente, lo que representa un aumento del mismo
orden de magnitud que en Col-0 plantas, indicando que la
falta de sntomas en plantas ctr1-1 no fue causado por la
reduccin de la entrada o crecimiento de PST en las
hojas. Adems de la falta de sntomas, el fenotipo
extremadamente pequea de ctr1-1, debido a su triple
respuesta constitutiva, dict esta mutante inadecuados
para ensayos adicionales.

y plantas mutantes. La colonizacin radicular de plantas


de tipo salvaje variaba entre 3 y 6 106 107 UFC G1 peso fresco. La colonizacin radicular del etileno
mutantes nunca mostr una diferencia significativa de
que las plantas de tipo salvaje (datos no mostrados).
Mediada Rhizobacteria ISR requiere sensibilidad de
etileno en la zona de aplicacin.
Eir1-1 y axr1-12 son dos mutantes que son insensibles
al etileno en las races solamente. Para investigar si la
incapacidad de la ein mutantes para expresar ISR
resultados a partir de una incapacidad para reaccionar
ante el etileno en la raz o en el rodaje, la EIR1-1 y axr112 mutantes fueron probados mediante la aplicacin de
WCS417r o bien en el suelo, a trasplantar, o las hojas, por
infiltracin de presin, 3 das antes de la inoculacin de
desafo.
Cuando WCS417r fue aplicado a las races, tanto
mutantes se comportaron como el ein mutantes, en que no
se expres de ISR, mientras que el SAR podra ser
inducido normalmente en estas mutantes (Fig. 2A). Al
reto de la inoculacin, las plantas de control del axr112 mutante mostraron un bajo porcentaje de las hojas
enfermas, mientras que la EIR1-1 las plantas de control
eran como enfermas como Col-0 controles. Por lo
tanto, se realizaron anlisis adicionales sobre la EIR11 mutantes solamente.
Para comprobar la capacidad de respuesta de etileno de
la EIR1-1 mutante de las hojas, la expresin del gen de
etileno-receptivo hel fue analizada mediante tratamiento
con un rango de concentracin del CAC, y en
comparacin con hel la expresin gnica en Col-0, ein2-

Anlisis de ISR y SAR en el etileno mutantes.


Para investigar qu partes de la ruta signaltransduction
de etileno son necesarios para la resistencia inducida, la
expresin de ISR y SAR fue probado en etr1-1, la
ethyleneinsensitive ein mutantes, y el etileno eto
overproducer1-1.
Para wild-type-0 Col, induccin de ISR por WCS417R
se tradujo en entre el 20 y el 30% menos de las hojas
enfermas. La induccin de la RAE fue ms efectivo que
el de ISR, resultando en una reduccin de la proporcin
de las hojas enfermas en un 50%. Ninguno de los
mutantes insensibles de etileno etr1-1, ein2-1, ein31, ein4-1, ein5-1 y ein7 expres ISR en respuesta al
tratamiento con CMC417r. En contraste, su respuesta fue
SAR irreprochable, y tan fuerte como el observado en las
plantas de col-0 (Fig. 1). Tambin, por ein6, en el
ler teln de fondo, la capacidad de expresar el ISR fue
abolida, mientras que el SAR se mantiene. El etileno eto
overproducer1-1 desarrollaron sntomas en la misma
medida como wild-type-0 COL. A pesar de su carcter
constitutivo la produccin de etileno, tampoco muestran
una respuesta de ISR, mientras que el SAR respuesta fue
normal.
Como la induccin de ISR es establecido por la
colonizacin de la rizosfera, analizamos si la ausencia de
ISR en la respuesta de etileno mutantes fue debida a una
incapacidad de la CMC417r para colonizar las races de
estos mutantes. En el bioensayo, raz de colonizacin por
WCS417R se determin por tanto el virus de tipo salvaje

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Fig. 1. La cuantificacin de la resistencia sistmica inducida


contra Pseudomonas syringae pv. tomato infeccin en Col-0 y
etileno mutantes cultivadas en suelo modificada con 10 mM
MgSO4 (Ctrl) o P. fluorescens WCS417R (417r), o la presin
infiltrado
en
las
hojas
con
el
avirulent
P.
syringae pv. Tomate (avrPST). Cuatro das despus de la
inoculacin
con
desafo
virulentos
de P.
syringae pv. tomato, severidad de la enfermedad fue anotado por
determinar por ciento las hojas enfermas por planta. La enfermedad
es la media de ndice (n = 20) del porcentaje de hojas enfermas por
planta con relacin al control del tratamiento. Valores absolutos de
los porcentajes de las hojas enfermas en controles: Col-0
(52,3), ETR1-1 (64,9), ein2-1 (62,5), ein3-1 (55,8), ein4-1 (58,5), ei
n5-1 (71,3), ein6 (31.1), ein7 (76,4) y eto11 (53.0). Dentro de cada
fotograma, letras diferentes indican diferencias estadsticamente
significativas entre los tratamientos con la mnima diferencia
significativa de Fisher Test ( = 0,05).

1, y eto1-1 (Fig. 3). Como era de esperarse, noninduced


Col-O y eir1-1 las plantas mostraron un mayor nivel
basal de hel la expresin gnica de etilenoinsensible ein2-1. Expresin aument significativamente
a solicitud del CAC a col-0 y eir1-1, pero

No en ein2-1, demostrando que la EIR1-1 hojas son


similares a wild-type-0 Col de hojas en la sensibilidad al
etileno. Eto Ethyleneoverproducing1-1 plantas mostraron
un elevado nivel de fondo de hel la expresin gnica, lo
cual no fue aumentado ms
Fig. 2. Una, la cuantificacin de la resistencia sistmica inducida
contra Pseudomonas syringae pv. Infeccin de tomate en eir11 y axr1-12 las plantas que crecen en suelos modificada con 10 mM
MgSO4 (Crtl) o P. fluorescens WCS417R (417r), o la presin
infiltrado en las hojas con el patgeno avirulent P.
syringae pv. Tomate (AVR) (avrPst RPT2). B, la cuantificacin de la
resistencia sistmica inducida contra P. syringae pv. Infeccin de
tomate en Col-oh, eir1-1, y etr1-1 tras la infiltracin de tres hojas
por planta con 10 mM MgSO 4 (Ctrl) o 107 UFC ml-1 P.
fluorescens WCS417R (417r) 3 das antes de la inoculacin de
desafo. Para los bioensayos se muestra en A y B, 4 das despus de
la inoculacin con desafo virulentos de P. syringae pv. Tomate, la
severidad de la enfermedad fue anotado por determinar por ciento
las hojas enfermas por planta. La enfermedad es la media de ndice
(n = 20) el porcentaje de hojas enfermas por planta con relacin al
control del tratamiento. Valores absolutos de los porcentajes de las
hojas enfermas en controles de eir1-1 y axr1-12: 56,6% y 24,8%,
respectivamente (A). En el B, con valores absolutos de los

723 / Plant-Microbe Interacciones moleculares

porcentajes de las hojas enfermas por planta en controles de Coloh, eir1-1, y etr1-1: 57,4, 59,9 y 64,4%, respectivamente. Letras
diferentes indican diferencias estadsticamente significativas entre
los tratamientos con la mnima diferencia significativa de Fisher
Test ( = 0,05). Los experimentos se realizaron dos veces con
resultados similares.

A solicitud del CAC.


La figura 2b muestra el porcentaje de hojas enfermas
en la CMC417R-plantas tratadas en relacin a las plantas
de control al ISR fue inducida por la rhizobacteria
infiltrante en la hoja. El nivel de resistencia inducida por
la infiltracin de hojas fue algo inferior al que resulta de
la aplicacin de las bacterias a las races. No obstante,
Col-0 tratados con WCS417r mostraron una reduccin
significativa en el porcentaje de hojas enfermas del 20%,
en comparacin con las plantas control noninduced.

La EIR1-1 igualmente mutantes mostraron una reduccin


de hasta el 25 %, mientras que el ISR no significativa fue
visto en el etr ethyleneinsensitive1-1 de plantas. Mientras
que la EIR1-1 mutante no desarrollar ISR en aplicacin
de WCS417r a sus races, expres ISR al menos as como
wild-type Col-0 cuando la bacteria se infiltr en el
etileno-responsive hojas. El ISR respuesta no fue
inducida en el etileno-insensitive deja de etr1-1. Estos
resultados demuestran claramente que, para ISR a
desarrollar, etileno-dependientes se requiere la
sealizacin en el lugar de la aplicacin de las bacterias
que provocan ISR.
P. fluorescens WCS417r no inducir la biosntesis de
etileno en Col-0.
Para ISR expresin, etileno, tiene que actuar en el sitio
de aplicacin de ISR de inducir a las bacterias. Adems,
nuestros resultados con el etileno-insensitive mutantes
demuestran que el ISR respuesta requiere todos los
componentes conocidos de la ethylenesignaling sendero.
Se ha demostrado recientemente que el CAC induce una
resistencia contra la infeccin Pst similares a WCS417Rmediada ISR (Pieterse et al. 1998). Las similitudes en el
CAC-resistencia inducida y WCS417R-mediada ISR
plante la cuestin de si la aplicacin de WCS417r a las
races se traduce en elevados niveles de etileno
localmente. Tal aumento de los niveles de etileno puede
ser instrumental en la generacin de la sealizacin
sistmica compuesto que hace que la planta sea ms
resistente a la impugnacin de los patgenos. Otras
preguntas son si la expresin de ISR tambin requiere
etileno y si, previa solicitud de la CMC417r a las races,
las hojas son tambin elevados niveles de etileno.
Se realizaron mediciones de etileno en races de
plantas en maceta de Col-0 en el suelo con o sin

significativas en la produccin de etileno se observ entre


control y WCS417R-plantas tratadas.
Examinar la posibilidad de que bacterization de races
est acompaado por una pronta, aumento transitorio en
la produccin de etileno, la expresin de los genes de
biosntesis de etileno ACCsynthase (AEC) y ACCoxidasa (ACO) fue analizado en la primera semana
despus de races de plntulas fueron expuestos a la
rhizobacteria. La familia de genes de Arabidopsis ACS
consta de cinco miembros, de los cuales el ACS3 es un
pseudogene de acs1 (Liang et al. 1992). ACS1,
ACS4 y acs5 fueron probados pero no mostraron
expresin en races en el nivel de deteccin. En
contraste, ACS2 fue expresado claramente (Fig. 4). Sin
embargo, ACS2 revel patrones de expresin similares
para el control y la WCS417r tratados con races. Para
ambos tratamientos, expresin de acs2 aumentaron entre
1 y 3 das despus de la aplicacin de la bacteria y se
mantuvo elevada u ocasionalmente disminuy en 7
das. aco la expresin gnica mostraron una pauta
bastante parecida con diferencias aparentes entre el
control y el WCS417r tratados con races. Por lo tanto, no
hubo alteraciones en la expresin de genes de biosntesis
de etileno producido asociado con la induccin de ISR.
Discusin
ISR es el mecanismo por el cual el P.
fluorescens WCS417r
ha
demostrado reducir
la
enfermedad causada por el Pst en Arabidopsis (Pieterse et
al. 1996, 1998; Van Wees et al. 1997). El camino por el
cual se induce ISR es pobremente entendido. Se
observaron claras diferencias cuando se compar con el
ISR bien establecida, en la cual la respuesta SAR SA

Fig. 3. Anlisis de la expresin gnica de Hel en hojas de col-0, eir1-1, ein2-1, y eto1-1 de plantas. Hel se analiz la expresin gnica 2 das despus
del tratamiento con 0,01% Silwet L-77 (0), o de 0,5, 1 y 2,5 mM ACC (1-aminocyclopropane-1-cido carboxlico) + 0,01% Silwet L-77. Para
comprobar la igualdad de las cargas, Blot fue desnudado y se hibridaron con un proble para - tubulina (hidromasaje ).

WCS417r. Resultados de un
Experimento tpico se muestran en la Tabla 2. Durante el
perodo de 3 semanas entre el trasplante de las plntulas
en el suelo bacterized y desafo de inoculacin, cuando
las bacterias estn presentes en las races en niveles
desencadenando ISR, una diferencia estadsticamente
significativa en los niveles de etileno de races de control
y WCS417rtreated plantas nunca fue encontrado. Las
hojas fueron analizados de manera similar pero,
igualmente, no existen diferencias estadsticamente

acumulacin PR y la induccin de la expresin gnica


que se asocian con la respuesta de la resistencia. Tampoco
ocurre durante el desarrollo de la ISR y marcadores para
ISR de respuesta son an no identificado. Sin embargo, la
capacidad de respuesta tanto a cido jasmonic (JA) y el
etileno es necesaria para la expresin de ISR, y la
aplicacin de cualquiera de bromuro jasmonate (MeJA) o
ACC induce una resistencia en Arabidopsis similares a
ISR (Pieterse et al. 1998). Aplicacin de MeJA a etr11 plantas no resultar en la proteccin. Sin embargo, el

Vol. 12, No. 9, 1999 / 724

tratamiento de la JA- jar mutante no responden1 con el


CAC hizo inducir resistencia, indicando que ja y la
capacidad de respuesta de etileno sucesivamente
contratados en la transduccin de la seal. Ambos SAR y

1
2

ISR son dependientes de NPR1, sugiriendo que al menos


algunos de los pasos posteriores conducentes al estado
resistente son compartidos por los dos tipos de resistencia
inducida
Tabla 2. La produccin de etileno (pmol G-1 H-1) de races y hojas
Si el etileno se requiere sensibilidad tambin en el sitio
de col0 las plantas control (Ctrl) o WCS417r plantas tratadas con 1,
donde
la resistencia se expresa no puede ser evaluado en
1
2 3 semanas despus de rellenado
el presente. Sin embargo, esto parece poco probable,
Raz de tiempo
Leaf
porque el SAR puede ser expresado en el etileno
semanas
(
)
Ctrl
Ctrl R417WCS WCS417r
insensitive Arabidopsis. Por lo tanto, expresin de la
resistencia al desafo de la inoculacin no es afectada
138 38129 23 abc 136 41 c 102 39 cd
cuando el etileno se puede percibir. El etileno-mutante
103 29 cd
122 30 abc
175

20
ab
184 15 3 75 9 de 66 7 e 144 10 c 155 16 a.c.
overproducing eto1-1 constitutivamente muestra niveles
( Pieterse et al. 1998).
altos de etileno, pero no expresan una mayor resistencia.
Porque hel transcripcin gnica acumulacin no aument
Hemos intentado profundizar en el camino que lleva a
en respuesta al CAC en el eto1-1 mutante, parece que la
la ISR mediante la realizacin de un anlisis ms amplio
va de sealizacin de etileno en cierto modo estaba
de la participacin de la va de transduccin de la seal de
saturado y que la aplicacin de bacterias ISRinducing no
etileno en la expresin de ISR. Varios pasos en el camino
ofrecer incentivos adicionales para la induccin de ISR.
signaltransduction etileno han sido identificados (Ecker,
1995). La respuesta de etileno mutantes etr1-1, ein2-1,
Aplicacin de ISR de inducir el WCS417r no altera la
ein3-1, ein4-1, ein51, ein6 y ein7 fueron probados para el
produccin de etileno o la expresin gnica de genes de
WCS417R-mediada de ISR de respuesta y la respuesta
biosntesis de etileno en races u hojas. Por lo tanto, no
SAR inducida por el patgeno. WCS417rmediated ISR
hay indicios de que la CMC417r inducida ISR en
qued abolida en todos los mutantes probados, mientras
Arabidopsis induciendo genes de biosntesis de etileno o
que todos los mutantes pudieron expresar SAR inducida
de produccin de etileno. Algunas Pseudomonas spp. son
por el patgeno. Estas observaciones confirman hallazgos
capaces de producir etileno (Weingart y Vlksch 1997), y
anteriores por Lawton et al. (1994, 1995) que en la
cabra pensar que no la planta, pero WCS417r en s
Arabidopsis induccin de SAR es independiente de
misma est produciendo el etileno por que la
etileno. En contraste, ISR requiere una respuesta de
transduccin de seales de etileno en la planta est
etileno intacto y, aunque las ubicaciones exactas de Ein5,
activado. No hay pruebas concluyentes sobre la
EIN6 y EIN7 en la va de transduccin de la seal de
produccin de etileno por WCS417R ha sido obtenido
etileno no son conocidos, esto indica que todos los
hasta el momento (P. A. H. M. Bakker, comunicacin
conocidos ein en el camino de los genes son necesarios
personal). Sin embargo, los genes que responden de
para la expresin de ISR.
etileno hel (Potter et al. 1993) y pdf1.2 (Penninckx et al.
1996) no son inducidas en races bacterized con
Porque la va de transduccin de la seal de etileno es
WCS417R, por lo que es improbable que la CMC417r
necesaria para la plena expresin de la respuesta de ISR,
produce cantidades biolgicamente activos de etileno
la implicacin del etileno en la induccin de la ISR fue
( Pieterse et al. 1998).
investigado ms a fondo. Bioensayos con el EIR11 mutante, mostrando insensibilidad de etileno en las
As, la induccin de ISR requiere todos los
races slo, arroja nueva luz sobre el camino por el cual
componentes conocidos de la va de sealizacin de
se induce ISR. En este mutante, aplicacin de WCS417r a
etileno en la ausencia de un aumento en la produccin de
las races no resultan en una respuesta de ISR en las
etileno. Esta situacin se asemeja a la interaccin
hojas. En contraste, la infiltracin de bacterias en las
compatible
de
arroz
con
la
piricularia
hojas dio como resultado una respuesta de ISR. La EIR1hongo Magnaporthe grisea (Hebert) Barr., en la cual JA1 hojas son normalmente sensibles a etileno, en contraste
inducible de genes son activados sin un aumento
con la ETR1-1 y ein mutantes, que muestran la completa
concomitante de JA endgena (Schweizer et al. 1997). En
insensibilidad de etileno. Esto demuestra que el etilenola JA-promovi la senescencia de desprendimiento de
dependientes se requiere la sealizacin en el lugar de la
hojas de arroz, el etileno es la hormona responsable de la
aplicacin de bacterias que provocan, ya sean races u
prdida de la clorofila. Sin embargo, niveles de etileno
hojas, para obtener una respuesta de ISR.
disminuy en lugar de aumentar, pero aparentemente JA
aument la sensibilidad al etileno (Tsai et al. 1996).
Porque la induccin de ISR por WCS417r es igualmente
dependa tanto de JA y etileno, pero ningn aumento en la
1 Letras
diferentes
indican
diferencias
estadsticamente
produccin de etileno es evidente, tambin puede
significativas entre los tratamientos con la mnima diferencia
preverse que ja aumenta la sensibilidad al etileno. JA
significativa de Fisher Test ( = 0,05). Los experimentos se
parece actuar antes de etileno en la va de sealizacin de
realizaron tres veces con resultados similares.
ISR (Pieterse et al. 1998). Si la aplicacin de ISR-recabar
Fig. 4. Anlisis de acs2 y aco de la expresin gnica en las races de
rhizobacteria aumenta los niveles de JA en la planta an
las plantas de col-0. En cubos de lana de roca, Col-0 races fueron
est por determinarse. Sin embargo, puede concluirse que
tratados con 10 mM MgSO4 mezclado con polvo de talco como
para expresin de ISR en Arabidopsis, etilenoportador (C), o con Pseudomonas fluorescens WCS417r aplicarse de
la misma manera (417r). Acs2 y aco se analizaron la expresin
dependientes se requiere la sealizacin en el lugar de la
gnica 1, 3 y 7 das despus del tratamiento, en comparacin con
aplicacin de inducir rhizobacteria, y que la induccin de
patrones de rRNA teidos con bromuro de etidio.
ISR no est acompaada por elevados niveles de etileno
en la planta.
725 / Plant-Microbe Interacciones moleculares

Materiales y Mtodos
Los cultivos bacterianos.
A RIFAMPICINA mutante resistente de la cepa de
biocontrol bacteriano Pseudomonas fluorescens WCS417
(WCS417R), eficaz en la induccin de la resistencia
sistmica en clavel (Van Peer et al. 1991), rbano
(Hoffland et al. 1995), y la Arabidopsis (Pieterse et al.
1996), fue utilizado como induciendo rhizobacterium.
WCS417r fue crecido en medio del rey B (KB) placas de
agar (King et al. 1954) durante 24 horas a 28C. Las
bacterias fueron recolectadas y resuspendido en 10 mM
MgSO4.
El
virulento
patgeno
foliar
bacteriano Pseudomonas
syringae pv. Tomate (PST)
(DC3000 Whalen et al. 1991) fue aumentado a 28C
durante la noche en forma lquida en KB. Las
clulas fueron colectadas por centrifugacin y
resuspendido en 10 mM MgSO4. Su avirulent derivativo
dc3000 (avrRPT2), llevando el plsmido pLAFR3 que
contenga el gen avirulence avrRPT2 (Whalen et al.
1991), fue igualmente cultivadas en KB sin lquido
MgSO4, complementado con tetraciclina (40 g/ml).
El cultivo de plantas.
Semillas de Arabidopsis thaliana ecotipos de Columbia
(Col-0) y Landsberg erecta (ler) y sus mutantes fueron
sembradas en arena. Las plntulas fueron cultivadas en
una cmara de crecimiento con un 9h luz (200 E m s-12 a 24C) y 15-h oscuro perodo (20C) a 70% de
humedad relativa. 10- a 14 das de edad fueron
trasplantados plantas individualmente en potes de 60 ml
que contenga 12:5 ( vol/vol) macetas de suelo/arena,
autoclavar dos veces durante 1 h, y se complementa con
10 mM MgSO4 o una suspensin de la CMC417R de 10
mM MgSO4, tal como se describe para el bioensayo de
ISR.
Las plantas se regaron con regularidad y suministra una
vez a la semana con la mitad de la fuerza de la solucin
Hoagland (KNO3 de 2 mM, 5 mM Ca[N3]2, 1 mM de
KH2PO4, 1 mM MgSO4 y oligoelementos, pH 7)
(Hoagland y Arnon, 1938), que contiene 10 M
Sequestreen (Fe-etilendiamina-di[o-hydroxyphenylacetic
acid]; CIBA-GEIGY, Basilea, Suiza).
ISR y SAR la induccin.
Plantas para el ISR y SAR los bioensayos fueron
aleatorizados. Para cada tratamiento, 20 plantas fueron
utilizados. Para la induccin de la ISR a travs de la
colonizacin de las races, plantas germinadas en la arena
fueron trasplantados en las macetas de suelo/arena
complementado con 50 ml de 10 mM MgSO4, que
contena 109 UFC ml-1 WCS417r por kg de suelo, o una
cantidad equivalente de 10 mM MgSO4 como
tratamiento de control. Para la induccin de la ISR a
travs de la infiltracin de hoja, 5 semanas de edad se
utilizaron plantas. Un da antes del tratamiento, las
plantas fueron puestas al 100% de humedad relativa. Tres
hojas por planta inferior se haban infiltrado con una
solucin que contenga 107 UFC ml-1 de WCS417R,
usando una jeringa sin aguja (Swanson et al. 1988). Para
la induccin de la SAR el procedimiento utilizado para la

induccin de la ISR fue seguida, con 107 UFC ml-1 de


Pst avirulent (avrRPT2).
Desafo de la inoculacin y evaluacin de la
enfermedad.
Las plantas fueron sometidas a impugnar la inoculacin
3 semanas despus de trasplantar en suelos que contengan
rhizobacteria mezcla o 3 das despus de la infiltracin
con hoja avirulent PST. Un da antes del reto, la humedad
relativa se elev a 100%, y mantuvo al 100% durante la
inoculacin. Desafo de la inoculacin se realiza
sumergiendo las hojas en una suspensin de 2,5 107
UFC ml-1 de Pst virulenta en 10 mM MgSO4,
complementado con un 0,01% del surfactante Silwet L77. Cuatro das ms tarde, la proporcin de las hojas
enfermas por planta fue determinada (Pieterse et al. 1996,
1998). El nmero de bacterias Pst en las hojas inoculadas
se determin en tres conjuntos de 20 hojas seleccionadas
aleatoriamente por tratamiento. Las hojas fueron pesados,
bien enjuagados en agua esterilizada y homogeneizada en
10 mM MgSO4. Posteriormente, diluciones apropiadas se
chape hacia KB agar suplementado con 50 mg L-1 y
rifampicina 100 mg L-1 de cicloheximida. Despus de 48
h de incubacin a 28 C, el nmero de rifampicinaresistant UFC G-1 tejido foliar infectado fue determinada.
Los datos fueron analizados estadsticamente con el
anlisis de la varianza, seguido por el test de Fisher para
menos diferencias significativas a = 0,05.
Rizosfera colonizacin.
Races (0,5 a 1,0 g de peso fresco) de tres a cuatro
plantas fueron cosechadas en duplicado, y agitar
enrgicamente durante 30 s en 10 mM MgSO4 (10 ml por
cada 1 g de races), conteniendo 0.5 g de microesferas de
vidrio (0,17 mm). Diluciones seriadas fueron sembradas
en agar KB complementado con cicloheximida (100 mg
L-1), ampicilina (50 mg L-1), cloranfenicol (13 mg L-1)
y rifampicina (150 mg L-1), el cual es selectivo para
rifampicinresistant, fluorescente Pseudomonas spp. Y
Schippers Geels (1983). Despus de 2 das de incubacin
a 28 C, el nmero de rifampicina-resistant UFC G-1 se
determin el peso fresco de raz.
Determinacin de etileno.
Uno, 2, y 3 semanas despus de rellenado de las
plantas, races y hojas se cosechan y encerrados en
frascos de 30 ml (n = 10). Despus de un perodo de
incubacin de 3 das bajo condiciones de la cmara de
crecimiento, la acumulacin de etileno se midi por
cromatografa de gases como se describe anteriormente
(de Laat y Van Loon 1983).
Anlisis de ARN.
Para el estudio de la expresin del gen de etilenoinducible hel, 5 semanas de edad, las plantas estaban
impregnadas con una solucin que contenga varias
concentraciones del CAC, el 0,01% Silwet L-77, o 0,01%
Silwet L-77 como control. Dos das despus del
tratamiento, el material foliar fue cosechada, congelados
en nitrgeno lquido y se almacena a -80 C hasta que el
ARN fue aislado.

Vol. 12, No. 9, 1999 / 726

Una vez supuesto experimento para analizar ISRrelacionados y acs aco la expresin gnica en races de
plntulas se realiza colocando 2 semanas de edad, Col-0
plntulas horizontalmente en cubos de lana de roca
empapada en la mitad de la fuerza de la solucin
Hoagland (Pieterse et al. 1996). Una suspensin de 5
108 UFC ml-1 WCS417R de 10 mM MgSO4 o 10 mM
MgSO4 solos, fue mezclado 1:1 (vol/wt) con polvos de
talco y aplicado a las races, que luego fueron cubiertos
con cubos de lana de roca. A las 1, 3 y 7 das despus del
tratamiento, las races fueron cosechadas y talco mix fue
quitado lavando las races en el agua. Despus del secado,
las races fueron congelados en nitrgeno lquido y se
almacena a -80C para el aislamiento de ARN.
Se aisl el ARN como se describe anteriormente
(Linthorst et al. 1993). RNA total (20 g) se separan en
un gel de agarosa al 1% en 15 mM fosfato de sodio de pH
6.5, y trasladado a Hybond N+ filtros (Amersham, 'sHertogenbosch, Pases Bajos). La hibridacin se realiz a
los 65C en 250 mM fosfato de sodio pH 7,0, 1 mM de
EDTA, 7% de dodecil sulfato de sodio, 1% de albmina
srica
bovina,
con
sondas
marcadas
con
aleatoriamente de acs1, -2, -4, y -5 (Liang
et
al.
1992), Aco (GmezLim et al. 1993), y hel. La plantilla
del hel sonda fue preparado por reaccin en cadena de la
polimerasa con cebadores basados en la secuencia de
adnc publicada (Potter et al. 1993).
Agradecimientos
Agradecemos al Centro de Recursos Biolgicos de Arabidopsis
(Columbus, OH) para el suministro de semillas de los mutantes de
etileno. A. Theologis es reconocida por brindar la
Arabidopsis acs1, -2, -4, y -5 Adnc y M. A. Gmez-Lim para
el aco clon. Estamos ms endeudados a Hans van Pelt para
asistencia tcnica de expertos. Esta investigacin fue apoyada por la
Fundacin Ciencias de la vida (SLW), que est subvencionado por
la Organizacin Neerlandesa para la Investigacin Cientfica
(NWO).

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