Sunteți pe pagina 1din 5

LABORATOR NR.

9 [IMUNOLOGIE I IMUNOPATOLOGIE, ANUL III, MV ]

REACIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI


Micro R.F.C.
Reacia de fixare a complementului este utilizat ca i test de confirmare n diagnosticul bolilor
infecioase bacteriene sau parazitare, la diferite specii de animale i la om. Micro-RFCul este o metod
care permite utilizarea unor cantiti mult mai mici de reactivi, comparatic cu RFC-ul realizat n eprubete.
Principiul metodei
Reacia se bazeaz pe proprietatea complementului de a se fixa numai pe anticorpii
sensibilizai din complexele de tip antigen-anticorp. Complexele imune fixeaz ireversibil
complementul. Deoarece reaciile pozitive nu pot fi vizualizate dac interacioneaz doar un antigen cu
anticorpii din serul de testat n prezena complementului, este necesar utilizarea unui revelator sub
forma unui sistem hemolitic preparat din eritrocite de berbec i ser hemolitic anti-oaie. n concluzie,
reacia presupune utilizarea a 2 complexe de tip antigen anticorp (din care doar unul este sigur prezent)
i complementul (alexina) care se va fixa pe unul din cele 2.

Materialele necesare
Antigene preparate i standardizate (n stare lichid sau liofilizate) care se dilueaz conform
intruciunilor productorului.
Ser de cercetat
Complement de cobai (alexin) liofilizat sau congelat la -400C
o Din cauza labilitii accentuate a complementului, acesta trebuie titrat la fiecare utilizare
n RFC.
Eritrocite de berbec diluate 2,5 % n tampon veronal
Ser hemolitic ser de iepure cu anticorpi anti-hematie de berbec (hemolizin)
o se dilueaz n funcie de titru
o n reacie se utilizeaz 2UH
Ser de control pozitiv omologat (cu titru cunoscut i etalonat)
Ser de control negativ omologat
Soluie fiziologic (diliuant) 0,85% clorur de sodiu, pH 7,0-7,2.

Materiale supuse examinrii - probe de ser sanguin fr urme de hemoliz sau de contaminare
bacterien sau fungic i fr eritrocite n suspensie, n volum de 100-500 l.

1.

2.
3.
4.
5.
6.
7.

Reacia propriu - zis:


Serurile de cercetat (suspecte), n care se suspicioneaz prezena unor anticorpi specifici, precum
i serurile martor se trateaz termic, 30 minute la temperaturi cuprinse ntre 56-60C, pentru
inactivarea complementului propriu;
serul de testat inactivat se pune n contact cu o suspensie de antigen corespunztor anticorpilor
suspicionai;
se adaug o anumit cantitate de complement (ser de cobai);
se incubeaz la termostat sau pe baie de ap pentru a se forma complexele antigen anticorp;
se adaug sistemul indicator (revelator) al reaciei - sistemul hemolitic format din hematii de oaie
(atg) i ser hemolitic anti- hematii de oaie (atc);
se incubeaz la termostat sau pe baie de ap
se interpreteaz rezultatele.
1

LABORATOR NR. 9 [IMUNOLOGIE I IMUNOPATOLOGIE, ANUL III, MV ]


n cazul n care n serul de cercetat exist anticorpii specifici suspectai (Reacie +),
complementul se va fixa pe anticorpii sensibilizai din complexele imune microbiene i nu va mai fi
disponibil a se fixa de alte complexe atg/ atc prezente n sistemul de reacie (sistemul hemolitic).
Fixarea complementului pe complexele imune este urmat de liza celulelor bacteriene, n timp ce
hematiile din sistemul hemolitic rmn integre.
n concluzie, n reacia pozitiv, hemoliza este absent.

n cazul n care n serul de cercetat nu exist anticorpii specifici suspectai (Reacie -), n
prima etap nu se formeaz complexe imune. Complementul, adugat tot n prima etap, va rmne liber
i se va fixa pe anticorpii sensibilizai sistemul hemolitic.
Fixarea complementului pe aceste complexele imune este urmat de liza hematiilor.
n concluzie, n reacia negativ, hemoliza este prezent.

Interpretarea rezultatelor:
Reacie pozitiv
4
lips complet a hemolizei
3
hemoliz (25%)
Reacie dubioas
2
hemoliz (50%)
1
hemoliz (75%)
Reacie negativ
hemoliz complet(100%)

LABORATOR NR. 9 [IMUNOLOGIE I IMUNOPATOLOGIE, ANUL III, MV ]

LABORATOR NR. 9 [IMUNOLOGIE I IMUNOPATOLOGIE, ANUL III, MV ]


Modul de lucru bruceloz
Titrarea complementului se efectueaz n tuburi cu fundul n U cu volum de 4 ml.
Titrul complementului (unitatea exact de complement) este reprezentat de cea mai mic doz
care produce hemoliz complet.
Martori
hemoliz
H0
H100
0
0,400

Tuburi
Complement
1/100 (ml)
Tampon
veronal (ml)
Antigen diluat
(1 unitate) (ml)
Sistem
hemolitic

1
0,04

2
0,05

3
0,06

4
0,07

5
0,08

6
0,09

7
0,10

8
0,11

9
0,12

10
0,13

11
0,14

12
0,15

13
0,16

0,36

0,35

0,34

0,33

0,32

0,31

0,30

0,29

0,28

0,27

0,26

0,25

0,24

0,400

0,20

0,20

0,20

0,20

0,20

0,20

0,20

0,20

0,20

0,20

0,20

0,20

0,20

0,20

0,20

Se agit tuburile i se incubeaz pe baie de ap la 37C, 30 minute


0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40

0,40

0,40

0,40

0,40

Se agit tuburile i se incubeaz pe baie de ap la 37C, 30 minute

Prepararea sistemului hemolitic se realizeaz prin amestecul n pri egale de hemolizin i


suspensie 2,5% eritrocite de berbec.
Inactivarea serurilor de cercetat i a martorilor:
Nediluate 30 minute la baie marin la 6020C
Diluate - 50 minute la baie marin la 5820C (sau n funcie de specie)
Condiiile de inactivare a serurilor sanguine ale unor specii de animalex
Specia
Taurine, iepure, cobai, porumbel
Ovine-caprine
Ecvine
Suine
Cine

Timpul (min.)
30
60-75
30
30-45
30 (20)

Temperatura (C)
56
60
62
60
60-65

Diluarea serurilor de cercetat i a martorilor


se ulilizeaz diluia (50l ser de testat + 150 l tampon veronal), apoi se inactiveaz.
Desfurarea reaciei:
Diluia
serului
Ser diluat
(l)
Antigen (l)
Complement
(l)
Tampon
veronal (l)
SH (l)

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128

1/256

1/512

M
Ac

MC1

MC2

MC3

MC4

M
SH

M
Ag

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

75

25

50

50

Se agit placa, se acoper i se incubeaz peste noapte la 4C


50
50
50
50
50
50
50
50
50
Se agit placa, se acoper i se incubeaz la 37C, 30 minute

50

50

50

50

Validarea, citirea i interpretarea rezultatelor


Se centrifugheaz placa la 1600 rpm timp de 5 minute pentru a sedimenta rapid hematiile nelizate
n timpul reaciei i interpretarea gradului de hemoliz.
Validarea:
martor atg hemoliz 100%
4

LABORATOR NR. 9 [IMUNOLOGIE I IMUNOPATOLOGIE, ANUL III, MV ]


martor SH 0% hemoliz
martor negativ - hemoliz 100%
martor pozitiv titru specificat de productor
Interpretarea:
Diluia de ser

1/8
1/16
1/32
1/64
1/128
1/256

25% (+)
8,3
16,6
33,3
66,6
133
266
532
1065

Gradul de reinere al hemolizei


50% (++)
75% (+++)
10
11,6
20
23,3
40
46,6
80
93,3
160
187
320
373
640
746
1280
1492

Un rezultat mai mare sau egal cu 20 este considerat pozitiv.

100% (++++)
13,3
26,6
53,3
107
213
426
852
1705