La biologa molecular del cncer colorrectal (CCR) abarca una amplsima
variedad de aspectos que van desde la conocida teora de las etapas mltiples del desarrollo del tumor y los sndromes hereditarios hasta la aplicacin al tra tamiento de determinantes moleculares de sensibilidad y resistencia a citostticos. En el cncer hereditario cabe destacar las dos vas de la herencia, la va supresora mediada por el gen supresor APC de la poliposis mltiple familiar y la va mutadora mediada por la mutacin en genes reparadores y conocida como sndrome de Lynch. No cabe duda del inters de los aspectos de la carcinognesis y la herencia, pero donde mayor importancia alcanza la biologa molecular del CCR en el momento actual es en su aportacin al pronstico y tratamiento de los pacientes. Genes tan importantes como el oncogn k-ras nos proporcionarn informacin pronstica sobre la agresividad y capacidad de recada y metstasis, informacin que podemos completar con el anlisis de la inestabilidad allica (chromosomyc imbalance) en determinados cromosomas como 8p y 18q, y tambin con la determinacin de los ttulos de expresin de timidilato sintetasa. A nuestro entender, todava es ms importante la aportacin que hace al tratamiento el anlisis de la expresin de genes implicados en los mecanismos de reparacin del ADN, como ERCC1, y en los mecanismos de accin de citostticos y el conocimiento de determinados polimorfismos genticos tales como TS, UGT1A1, XRCC1, XPD, que van a modificar la sensibilidad o resistencia a determinados frmacos y que sern tratados ampliamente en esta revisin. Introduccin La biologa molecular del cncer colorrectal (CCR) abarca una amplsima variedad de aspectos que van desde la carcinognesis del tumor hasta la aplicacin al tratamiento de esta neoplasia. Es de sobra conocida la teora de las etapas mltiples del desarrollo del tumor desde el plipo hasta el cncer invasivo debido a la acumulacin de alteraciones genticas, metilaciones, mutaciones, deleciones, que se inician en la mutacin del gen APC de la poliposis mltiple familiar, igual en el cncer hereditario ligado a la poliposis, caso en el que se nace con un alelo mutado, como en el cncer de colon y recto espordico, en el que la mutacin se adquiere durante la vida para los dos alelos. En este caso el gen responsable, APC, es un gen supresor, mientras que en el caso del otro sndrome hereditario, el sndrome de Lynch, el cncer de colon hereditario no ligado a la poliposis, est relacionado con la mutacin de un gen de una familia de genes reparadores de los que los ms frecuentes son el MSH2 y MLH1. El conjunto de cnceres hereditarios representa menos del 15% de los cnceres de colon y recto, siendo el tipo APC menor del 2% (fig. 1). Otro gen de gran importancia es el oncogn k-ras. Las mutaciones de este oncogn estimulador del crecimiento son de relevante importancia en el desarrollo del carcter invasivo del CCR e imprimen adems distintos grados
de agresividad al tumor que, como veremos, tienen valor pronstico.
Finalmente, los diferentes genes implicados en la reparacin del ADN, as como otros relacionados con el metabolismo o las dianas de los diferentes frmacos citostticos activos en el CCR, son actualmente de mximo inters ante las posibilidades que abren para poder seleccionar el tratamiento para cada paciente. La determinacin en el tumor de los ttulos de expresin de estos genes o la determinacin en suero de determinados polimorfismos presentes en algunos de ellos permite tener una aproximacin a la sensibilidad o resistencia que va a presentar el paciente (el tumor) a determinado tratamiento. Es evidente la imposibilidad de tratar todos estos temas con profundidad en el corto espacio de que se dispone en un captulo de revisin, por lo que, dada la trascendental importancia que puede tener la seleccin del tratamiento y que, por otra parte, es un tema menos conocido, y en pleno desarrollo, vamos a centrar nuestro captulo en los datos de biologa molecular y el pronstico y tratamiento de los pacientes afectados de CCR. Biologa molecular y tratamiento adyuvante Si bien el tratamiento adyuvante del estadio III est perfectamente establecido, no existen datos definitivos sobre la indicacin de tratamiento en el estadio II de colon y todava menos en el I. El estudio de determinados genes aporta datos sobre el pronstico de este grupo de pacientes, que permiten seleccionar el subgrupo de riesgo que debera ser tratado en rgimen adyuvante. En 1998 se publicaron ya los resultados referentes al valor pronstico de las mutaciones del gen k-ras que se analizan en un gran metaanlisis en el estudio RASCAL1. Este estudio incluye a 2.721 pacientes procedentes de 22 trabajos de 13 pases diferentes, lo que lo convierte en una muestra ampliamente representativa. Los resultados de este metaanlisis demuestran un riesgo de recurrencia y muerte significativamente ms alto para los pacientes que presentan mutaciones del k-ras. Para la existencia de cualquier mutacin el riesgo de recurrencia presenta una significacin de p = 0,001 y de p = 0,004 para el riesgo de muerte. La mutacin especfica de la valina en el codn 12 empeora el pronstico respecto a otras mutaciones tambin de manera significativa (p < 0,007). En nuestra experiencia, aunque existe diferencia, sta no llega a ser significativa (p = 0,07) para cualquier mutacin, aunque s existe diferencia significativa para el estadio II respecto a no tener mutacin o tener mutacin en asprtico o serina (p = 0,03)2. Tambin el desequilibrio cromosmico, las prdidas de heterocigosidad (LOH) en 18q, ha demostrado ser un factor diferencial en diversos estudios. Los tres con mayor nmero de pacientes demuestran, aunque con porcentajes de LOH diferentes, que la LOH en el estadio II empeora la supervivencia a los 5 aos de manera significativa35. Recientemente se ha publicado un estudio de gran trascendencia6 en el que se analiza el desequilibrio cromosmico (allelic imbalance) en 8p y 18q. El estudio incluye a 180 pacientes sin afectacin ganglionar ni metstasis en el
momento de la ciruga; por tanto, en estadios I y II de cncer de colon. Se
analiza el desequilibrio allico de los cromosomas 8p y 18q mediante SNP (single-nucleotide polymorphism) y se clasifica a los pacientes segn presenten desequilibrio en ninguno, uno o ambos constituyendo los grupos L (dos desequilibrios), L/R (un desequilibrio) y R (ningn desequilibrio). La supervivencia libre de enfermedad a los 5 aos es significativamente peor para los pacientes con desequilibrio cromosmico (del 58% para los pacientes del grupo L, del 74% para el grupo L/R y del 100% para los pacientes del grupo R; p < 0,0001) (tabla 1). Es de destacar que los pacientes en estadio I del grupo L tienen un pronstico peor que los pacientes en estadio II del grupo R y se concluye que, en los pacientes sin metstasis, el desequilibrio cromosmico es mejor predictor pronstico que la clasificacin anatomopatolgica. A nuestro entender, este estudio da la clave para seleccionar qu pacientes en estadio I o II de cncer de colon deben ser tratados con quimioterapia adyuvante, aunque desgraciadamente esto est todava lejos de ser introducido en la prctica habitual. Otro aspecto es el de la seleccin del tratamiento ms adecuado. Los ttulos de expresin de la timidilato sintasa (TS) se han sealado desde hace aos como un factor de mal pronstico en el CCR y recientemente se ha demostrado su efecto sobre la sensibilidad a 5-FU. Ms adelante veremos cmo afecta este factor en la seleccin del tratamiento de los pacientes afectados de CCR metasttico. Su influencia pronstica en los pacientes tratados con intencin curativa y sometidos a tratamiento adyuvante est demostrada. Citamos dos artculos de reciente publicacin que vienen a ilustrar el estado actual del tema. Uno con relacin al cncer de recto analiza la importancia del polimorfismo del gen de la TS (vase en el apartado dedicado al cncer metasttico) en el downstaging del cncer de recto tratado con quimiorradioterapia preoperatoria basada en 5-FU, y el otro investiga el valor pronstico de los ttulos de TS en pacientes tratados con quimioterapia adyuvante tambin basada en 5-FU. En el primer estudio, que incluye a 65 pacientes, se demuestra que los valores altos de TS hacen que el tratamiento preoperatorio no consiga bajar el estadio de la enfermedad (22 frente al 60%), demostrando resistencia a 5-FU7 . El segundo estudio incluye a 862 pacientes afectados de CCR en estadios B y C de Dukes procedentes de ensayos de quimioterapia adyuvante basada en 5-FU. Los ttulos de TS se determinaron por inmunohistoqumica en las muestras de tejido de los tumores. Los resultados demuestran un mejor pronstico global para los pacientes con valores bajos de TS y se mantiene para los pacientes tratados con ciruga sola (p < 0,001 para el intervalo libre y p = 0,001 para la supervivencia a los 5 aos)8. Hoy por hoy el tratamiento adyuvante del cncer de colon es estndar y uniforme para todos los pacientes con el esquema de la Clnica Mayo de 5-FU bolos con modulacin bioqumica con cido folnico. La superioridad de la poliquimioterapia en el cncer avanzado ha de demostrarse tambin en los estudios de quimioterapia adyuvante actualmente en curso. Si esto es as, la seleccin del tratamiento sobre la base de determinantes moleculares
individuales que desarrollaremos a continuacin ser tambin aplicable al
tratamiento adyuvante. Biologa molecular y tratamiento individualizado en la enfermedad metastsica En los ltimos 15 aos se ha producido un gran avance en el tratamiento del CCR, debido fundamentalmente a tres puntos clave en el desarrollo de la quimioterapia en este tumor: la introduccin de la modulacin bioqumica; la infusin continua (IC) con altas dosis de 5-FU y la demostracin de su superioridad frente al bolos, y sobre todo la introduccin de nuevos agentes activos en este tumor, bsicamente el oxaliplatino (OXA) y el CPT-11, que han permitido la introduccin de la poliquimioterapia y de la segunda lnea de tratamiento. Dejando aparte los excelentes resultados de la ciruga de las metstasis hepticas, en los pacientes con enfermedad diseminada no resecable podemos hablar actualmente de un 40-50% de respuestas con otro tanto de estabilizaciones y una supervivencia de 16-22 meses de mediana con cualquiera de los esquemas de combinacin de IC de 5-FU, ya sea con OXA o CPT-11. La optimizacin del tratamiento para mejorar estos resultados es difcil, y en este sentido la posibilidad de seleccionar el tratamiento segn las caractersticas del paciente es de gran inters. En la figura 2 se esquematizan los mecanismos de accin de 5-FU, OXA y CPT-11 con las vas metablicas ms importantes y los genes implicados en ellas. En el caso del 5-FU el mecanismo ms relevante es la inhibicin de la TS y en ello estn implicadas la propia TS y la dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD), que acta en la catabolizacin de las pirimidinas y es la causa del 85% de la desactivacin del metabolito activo de 5-FU (FdUMP). Otras enzimas como la dihidrofolatorreductasa (DHFR) o la timidinfosforilasa (TP) tambin intervienen en la actividad de 5-FU. Variaciones en la expresin o actividad de los genes relacionados originarn distinta respuesta a 5-FU y a los agentes inhibidores de la TS en general. El CPT-11 es un inhibidor de topoisomerasa I (TOPO-I). Su accin la realiza mediante su activacin a un metabolito activo, el SN-38. SN-38, a su vez, se inactiva por glucorunidacin mediante la accin de la UGT1A1, de la familia de las UDPglucoronosiltransferasas (UGT), encargadas de la metabolizacin de la mayora de los frmacos. Un dficit de UGT1A1 conduce a una disminucin en la inactivacin de SN-38 y, por tanto, a una exposicin ms prolongada, lo que lleva a una respuesta distinta de la accin de CPT-11, bsicamente un incremento de toxicidad, como veremos ms adelante. El OXA, como todos los derivados platinados, acta en el ADN produciendo aductos que impedirn la duplicacin. En este caso van a competir todas las vas de reparacin de ADN a travs de la activacin de diversos genes: el ERCC1 (excision repair crosscomplementing 1), que acta por la va del NER (nucleotide excision repair) y que constituye el eje de la preservacin de ADN ante el ataque de los derivados platinados y cualquier otro agente txico; el XPD (xeroderma pigmentosum clase D) o ERCC2 y XPF son de gran inters; el XRCC1, que acta por la va del BER (base excision repair) y que se relaciona muy directamente
con la actividad de OXA, y el XRCC3, que acta en la va de DSBR (double
strand break repair). Todos ellos van a actuar reparando el dao inducido por los agentes txicos e induciendo la apoptosis celular si no son capaces de repararlo. Una alteracin en su funcionamiento lleva a una mayor actividad del agente txico, los derivados platinados en el caso que nos ocupa. Se sabe que los individuos con dficit en los sistemas de reparacin de la ADN son ms susceptibles a padecer cncer mientras que, cuando lo padecen, son ms sensibles al tratamiento. Todos estos genes conforman un conjunto de factores que modifican la actividad de los citostticos activos en el CCR. Determinantes individuales de sensibilidad/toxicidad o resistencia a citostticos en el cncer colorrectal En el apartado anterior hemos descrito las vas ms importantes por las que actan los citostticos con indicacin en el CCR y los genes implicados en ellas. Con ello podemos configurar una serie de factores genticos o moleculares que pueden permitir una seleccin del frmaco con ms actividad de manera individualizada para cada paciente en razn del estado de dichos genes. Para ello disponemos del anlisis de la expresin de genes y de la determinacin de los llamados polimorfismos gen- ticos. Un polimorfismo gentico consiste en una variante gentica frecuente en la poblacin (> 1%) que, a diferencia de la mutacin, que es muy poco frecuente (< 1%), no constituye patologa, pero puede modificar la funcin de la protena para la que el gen est codificando. La existencia de polimorfismos genticos en los genes implicados en la actividad de 5-FU y otros inhibidores de la TS, el CPT-11 y el OXA abre un interesante campo para la seleccin del tratamiento. As, se puede distinguir dos tipos de determinantes individuales relacionados espec- ficamente con los citostticos en el CCR: la sobreexpresin de determinados genes y la existencia de polimorfismos genticos (tabla 2). Expresin de genes. La relacin entre los ttulos de expresin de la TS tumoral y la respuesta al tratamiento con 5-FU ha sido ampliamente demostrada. Lenz et al9 demostraron en 57 pacientes afectados de adenocarcinoma gstrico que la respuesta al tratamiento con 5FU y la supervivencia estn relacionadas con los ttulos de expresin del ARNm de la TS. La mediana del ARNm de la TS en los tumores de pacientes que respondan era de 2,3 103, mientras que en enfermos que no respondan la mediana era de 6,8 103, diferencia que era estadsticamente significativa. Estos mismos autores han estudiado los valores de ARNm de la TS en el CCR avanzado en tratamiento de infusin continua de 5-FU demostrando, al igual que en el caso anterior, la relacin entre los ttulos de expresin y la respuesta al tratamiento10,11. Otros estudios se han centrado en el grado de actividad y expresin del gen dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD). En un estudio realizado por el grupo de Lenz12 se analizaron al mismo tiempo los valores del ARNm de la TS y DPD en enfermos afectados de neoplasia colorrectal. Se demostr que todos los que respondieron al tratamiento con 5-FU presentaban ttulos bajos de TS o DPD, de manera que estos dos factores tienen un valor
predictivo de respuesta a este tipo de tratamiento. Tambin es de gran
importancia la demostracin del incremento de la toxicidad a 5-FU generado por el dficit de DPD y que explica los casos de toxicidad grave con la administracin de este frmaco13. La expresin de ERCC1 est en relacin con la respuesta al tratamiento con derivados platinados como el OXA. Ya se ha comentado la importancia que tiene este gen en la reparacin del dao inducido al ADN. La resistencia al cisplatino originada por la sobreexpresin de este gen ya fue demostrada en cncer gstrico por el grupo de Lenz14. En un reciente trabajo, tambin del mismo grupo15, se analiza la expresin de ERCC1 y TS, as como la respuesta al tratamiento en 50 pacientes afectados de CCR metasttico tratados con 5-FU y OXA en segunda lnea de tratamiento al fallo a 5-FU + CPT-11. Se demuestra que los valores bajos de TS van ligados a una mejor respuesta y supervivencia, con un 75% de respuesta objetiva (RO) frente al 25% (p = 0,02) y 10,2 frente a 1,5 meses de supervivencia mediana (p < 0,001). Respecto a ERCC1 se demuestra diferencia nicamente en la supervivencia, que es superponible a la obtenida segn la TS (p < 0,001). Cuando se realiza el anlisis combinando de los dos factores moleculares, existe diferencia significativa en la supervivencia respecto a tener los dos bajos frente a las otras posibles combinaciones. Polimorfismos genticos. Los polimorfismos genticos son, como ya se ha dicho, variaciones en la estructura del gen, generalmente en la zona promotora. Se trata de variaciones germinales y, por tanto, forman parte de la estructura gentica del individuo, de manera que no se modifican a lo largo de la vida ni por efecto de los tratamientos. Al ser cambios en el ADN genmico, su anlisis se puede realizar a partir de una muestra de sangre con extraccin de ADN de los linfocitos, lo que simplifica muchsimo la metodologa de la obtencin de muestras y se desprende de la necesidad de realizar biopsias. En la mayora de los casos se correlacionan con la expresin del gen y sobre todo con la conservacin de la funcin o no de la protena. Es por ello que consideramos que representan un campo de sumo inters en el camino de la seleccin del tratamiento por paciente. Polimorfismos de TS. El gen de la TS presenta un polimorfismo en la zona promotora consistente en doble o triple tndem de repeticin de 28 pares de bases. Los individuos pueden tener doble repeticin en los dos alelos y ser homocigotos para dos repeticiones; triple repeticin en los dos alelos y ser homocigotos para tres repeticiones, o tener dos y tres repeticiones y ser heterocigotos. Dado el elevado nmero de repeticiones que hacen que el peso molecular (PM) sea notablemente distinto, la separacin de las distintas formas de polimorfismo se puede hacer mediante electroforesis (fig. 3). Estudios in vitro han demostrado que la triple repeticin en los dos alelos comporta valores de hasta 2,6 ms altos de TS que para los homocigotos para dos repeticiones16. Segn el polimorfismo de la TS, pues, los pacientes homocigotos para dos repeticiones seran ms sensibles a 5-FU, mientras que los homocigotos para tres repeticiones seran resistentes. Este hecho se ha demostrado en estudios clnicos. Tambin el grupo de Lenz desarroll un
estudio cuyos resultados17,18 prueban que, in vivo, las concentraciones de TS
para los pacientes homocigotos para tres repeticiones (3/3) alcanzan cifras 3,6 veces superiores a las de los homocigotos para dos repeticiones (2/2). Esto se traduce en un ndice de respuestas del 9% para los 3/3 frente al 50% para los 2/2; las respuestas para los heterocigotos es de 15% (p = 0,04). Estos resultados son similares a los de Marsh et al, quienes con 24 pacientes refieren fallo de respuesta en el 40% de los 3/3 frente al 22% para los 2/2, con diferencia tambin en la supervivencia de dos meses sin alcanzar diferencias significativas19. El mismo grupo analiza la relacin del polimorfismo de la TS y la respuesta al tratamiento con otro inhibidor de la TS, la capecitabina, en 22 pacientes y obtienen un 80% de respuestas para los 2/2 y tan slo el 14% para los 3/3 (p = 0,02)20. En nuestra experiencia en un grupo de pacientes que recibieron tratamiento de segunda lnea con 5-FU + CPT-11, no encontramos diferencias en la respuesta al tratamiento respecto al polimorfismo de TS con tres respuestas y una progresin para los 3/3 y una respuesta y una progresin para los 2/2 en un total de 5 respuestas de los 21 pacientes (24%)21. Al tratarse de segunda lnea de tratamiento y poliquimioterapia es posible que el factor molecular con relacin a la respuesta a 5- FU pierda potencia. De los resultados obtenidos hasta ahora, el polimorfismo del gen de la TS parece asociado a la respuesta al tratamiento con 5-FU de manera significativa. Polimorfismo de UGT1A1. Como ya se ha dicho, CPT- 11 se metaboliza a SN-38 para actuar inhibiendo a TOPO-I. El SN-38 es desactivado por glucorunidacin y excrecin por accin de UGT1A1. El dficit en la actividad de UGT1A1 ir ligado a una mayor exposicin de SN-38. Se ha descrito tambin un polimorfismo en la zona promotora, la regin llamada TATA box del gen de UGT1A1. Este polimorfismo consiste en una variacin en el nmero de repeticiones del dinucletido TA que vara de 5 a 8. En la poblacin caucsica se limitan a 6 o 7, y la forma normal es la homocigota para 6 repeticiones (6/6). Basndose en estudios funcionales se ha demostrado que la actividad del gen es inversamente proporcional al nmero de repeticiones. La presencia de 7 repeticiones en uno de los dos alelos se asocia a una disminucin de la actividad de UGT1A1. En este caso, debido al pequeo nmero de repeticiones, las diferentes formas del gen no pueden separarse por electroforesis y es necesaria la secuenciacin para determinar el tipo de polimorfismo (fig. 4). La frecuencia en la poblacin espa- ola es del 43% de homocigotos para 6 repeticiones (6/6), del 49% para los heterocigotos y de slo el 8% para homocigotos con 7 repeticiones (7/7) (Martnez E, Abad A, et al, comunicacin personal, 2000). La relacin de este polimorfismo con la aparicin de toxicidad en pacientes tratados con CPT-11 se ha demostrado en la cl- nica. El estudio ms importante22 incluye a 118 pacientes afectados de CCR avanzado tratados con CPT-11. La toxicidad grados 3-4 tanto hematolgica como de diarreas fue significativamente ms alta para los pacientes con dficit de UGT1A1, los homocigotos para 7 repeticiones y tambin para los heterocigotos, con un 54 y un 31% de los 26 pacientes que la presentaron, frente al 15% para
los homocigotos 6/6 (p = 0,001). En nuestra experiencia (Abad et al,
Perspectives in colorectal cancer, Dubln 2001), aunque sin alcanzar significacin estadstica, la toxicidad grados 3-4 en un grupo de 21 pacientes tratados con 5-FU + CPT-11 fue ms elevada, con un 55% de diarreas para los pacientes con 7 repeticiones en algn alelo (5 de 9) frente al 33% para los homocigotos 6/6 (4 de 12). Los resultados hasta el momento indican claramente un riesgo de toxicidad grave con relacin al polimorfismo 7/7 de UGT1A1 en los pacientes tratados con CPT-11, sin que existan datos respecto a su influencia en los resultados del tratamiento. Polimorfismo XRCC1. El OXA, al igual que todos los derivados platinados, ejerce su accin citotxica daando al ADN. En los mecanismos de reparacin de ADN interviene el gen XRCC1, perteneciente al sistema BER, descrito anteriormente. Se ha descrito en este gen un polimorfismo que modifica la eficiencia reparadora de XRCC1. En este caso, el polimorfismo consiste en un cambio de una base en el codn 399 del exn 10 del gen. Se considera normal y por tanto, con la funcin reparadora correcta el polimorfismo arginina/arginina. El cambio consiste en la sustitucin de una o las dos guaninas por adenina (ag), de manera que tendremos glutamina/arginina o adenina en los dos alelos (aa) glutamina/glutamina. Recordemos que la accin de XRCC1 es reparar el dao producido en el ADN y la induccin de apoptosis si no puede repararlo. El dao inducido por OXA no es reparable y en condiciones de normalidad de XRCC1 se induce la apoptosis y la clula muere, lo que se traduce en sensibilidad a OXA. Cuando la funcin est disminuida por la existencia de alguno de los polimorfismos, el dao no se repara, pero XRCC1 no es capaz de inducir la apoptosis, por lo que la clula prolifera, lo cual se corresponde con resistencia a OXA. De nuevo el grupo de Lenz analiza los resultados del tratamiento con 5-FU + OXA en dos trabajos. El primero23 incluye a 45 pacientes tratados en segunda lnea de quimioterapia. La RO para los pacientes con XRCC1 normal (aa) es del 83% (5 de 6) y del 33% para los pacientes con un cambio en algn alelo. Si se analizan por progresiones, las diferencias son del 22% para (aa), del 44% para (ag) y del 33% para los pacientes (gg). La supervivencia es de 11,2 meses para los (gg) y de 8,5 para los (aa). En el segundo trabajo24 se analiza a 61 pacientes en primera lnea de tratamiento con 5-FU + OXA. Aunque la respuesta global es muy baja (del 18%, lo que no refleja los resultados alcanzables actualmente en el tratamiento del CCR metasttico), el anlisis de las respuestas demuestra una clara superioridad para los pacientes con XRCC1 normal (gg) o arg/arg con un 73% de RO frente al 27% para los pacientes con algn cambio. El 66% de los que no presentaron respuesta eran heterocigotos o homocigotos para (aa) o gln/gln, lo que significa un riesgo 5,2 veces mayor de fallar al tratamiento (p = 0,03). Polimorfismo XPD. El gen del xeroderma pigmentosum de la clase D (XPD) es otro miembro importante del sistema de reparacin de ADN. Este gen presenta polimorfismos en tres posiciones, que son: C156A, llamada XPD156; Asp312Asn, llamada XPD312, y la que tiene por el momento ms importancia clnica, Lys751Gln, llamada XPD751. Se trata de un cambio en un aminocido
(single nucleotide polymorphism). En el caso de XPD751, el genotipo Lys/Lys se
considera la forma normal y por tanto debe mantener el sistema de reparacin intacto. El polimorfismo consiste en el cambio de una Lys por Gln o en la sustitucin de las dos Lys por Gln. Si bien la lgica indica que la presencia de un polimorfismo debera conducir a un dficit de reparacin, los estudios hasta el momento son contradictorios25,26. Tambin en este caso Lenz et al desarrollaron un estudio que incluye a 73 pacientes y en el que analizan la RO y la supervivencia con relacin a los tres polimorfismos descritos27. No encuentran ninguna influencia en los polimorfismos XPD156 ni XPD 312. El anlisis del polimorfismo XPD751, sin embargo, es de gran inters. Los pacientes son previamente tratados con 5-FU o CPT-11 y reciben segunda lnea de tratamiento con 5-FU + OXA. En este caso la RO y la supervivencia son significativamente mejores para los pacientes con el sistema de reparacin normal. As, los pacientes Lys/Lys presentaron un 24% de respuestas frente al 10% para los dems grupos (p = 0,015). La supervivencia fue de 17,4 meses para la forma Lys/Lys, de 12,8 para los heterocigotos y de tan slo 3,3 meses para los homocigotos Gln/Gln (p = 0,002). Tambin los resultados acumulados hasta el momento respecto a los genes implicados en la reparacin del ADN, tanto XRCC1 como XPD (ERCC2), indican una clara relacin entre sus polimorfismos y la respuesta al tratamiento. Consideraciones finales En este captulo hemos revisado los datos tanto conceptuales como de resultados comunicados hasta el momento. Queremos aadir para finalizar que es necesario sealar que la prctica totalidad de los estudios con resultados positivos provienen del mismo grupo de trabajo y que no se encuentran trabajos procedentes de otros grupos, por lo que es necesario confirmar estos resultados. No obstante, la experiencia acumulada hasta ahora indica que la determinacin de los polimorfismos genticos y otros marcadores, como la expresin de determinados genes, permite la seleccin de la combinacin ptima de citostticos para cada paciente y, por tanto, la individualizacin del tratamiento con quimioterapia no tan slo en el CCR, sino en los pacientes neoplsicos en general. Es ste un camino de futuro en el que debemos poner el mximo esfuerzo para disear ensayos clnicos comparativos con la potencia necesaria para alcanzar conclusiones con evidencia de primer orden.
Cncer colorrectal hereditario: anlisis molecular de los genes APC y
MLH1 El cncer colorrectal (CCR) es, actualmente, una causa importante de mortalidad, con ms de mil muertes al ao en nuestro pas1. En pases desarrollados con alta prevalencia de cncer colorrectal, se ha sugerido realizar un tamizaje a todo paciente mayor de 50 aos, o antes a pacientes con mayor riesgo, con antecedentes familiares, enfermedades inflamatorias intestinales y otros2. En Chile, iniciativas como esta supondran un alto costo, adems que los estudios disponibles producen incomodidad en los pacientes. Dentro de las variantes hereditarias de CCR se cuentan dos sndromes en los cuales la predisposicin a la enfermedad se basa en una mutacin de la lnea germinal3. Uno de ellos es la poliposis adenomatosa familiar (PAF)4. Esta se caracteriza por la presencia de mltiples adenomas colnicos (>100) de aparicin temprana, y por ser autosmica dominante con una penetrancia de 100%5,6. Adems, la PAF se asocia a lesiones en otros parnquimas, como adenomas periampulares, tumores desmoides, alteraciones retinales y cncer papilar de tiroides, entre otras7-13. En 1991, se identific al gen supresor de tumores APC (cromosoma 5) y se determin qu mutaciones en este gen son la causa principal de la PAF14. Este gen contiene 15 exones, entre los cuales, el de mayor tamao es el exn 15 con 6570 pb. El gen APC codifica para la protena APC, que se une a - catenina, promoviendo la degradacin de esta ltima, regulando as su funcin. La ausencia de APC permite la entrada de -catenina al ncleo, la cual activa la expresin de genes que estimulan la proliferacin celular. De esta forma, mutaciones que suprimen la funcin de APC, podran ser responsables del inicio de un proceso neoplsico al perderse el control del supresor APC sobre -catenina. As, la aparicin de plipos adenomatosos en todo el tracto digestivo, en especial en el colon, con una edad promedio de aparicin a los 16 aos, y de desarrollo del cncer a los 39 aos6, pueden explicarse por un descontrol del ciclo celular iniciado por la ausencia de la funcin de APC. Por otra parte, se estima que entre 1 y 5% de los cnceres
colorrectales aparecen en pacientes portadores de cncer de colon hereditario
no poliposo (HNPCC)4,6,15. Este sndrome, fue descrito por Henry Lynch16 en 1966, en dos familias que presentaban cncer colorrectal en ausencia de plipos del colon, por lo cual tambin se le conoce como sndrome de Lynch. Los individuos con HNPCC se caracterizan por presentar tumores a una edad temprana, de preferencia en el colon derecho y presentan antecedentes familiares de cncer tanto de colon y recto, como de otros tejidos (endometrio, ovario, urotelio). Como caracterstica importante, estos tumores presentan en su ADN genmico una inestabilidad microsatelital de alta frecuencia. Para la identificacin de pacientes de riesgo se han elaborado criterios clnicos, entre los cuales se cuentan los criterios de Amsterdam I y II y Bethesda6. Un alto porcentaje (90%) de los pacientes HNPCC presentan mutaciones en la lnea germinal, para el gen MLH1 (cromosoma 3, mRNA de 2524 pb, 19 exones) o bien para el gen MSH2 (cromosoma 2, mRNA 3145 pb, 16 exones)5. Estos dos genes codifican para enzimas que participan en el sistema de reparacin del ADN. De esta forma, la ausencia de cualquiera de estas funciones celulares permite la acumulacin de mutaciones en el ADN, que al ocurrir en genes supresores de tumores o protoncogenes, colaboran en el desarrollo del proceso neoplsico. Recientemente, nuestro grupo public el anlisis de genealogas y resultados quirrgicos de pacientes HNPCC y PAF17,18. Es destacable la gran relevancia que ha cobrado la deteccin de mutaciones en los genes involucrados en cncer de colon, especialmente en relacin con el pronstico y desarrollo del tumor, y en relacin con el diagnstico de familiares asintomticos. En este trabajo presentamos el hallazgo de dos mutaciones, una en el gen APC y otra en el gen MLH1, en tres familias chilenas. PACIENTES Y MTODOS Pacientes. Se incluyeron 5 pacientes: 2 con demostracin histopatolgica de cncer y que cumplieran los criterios de Amsterdam para HNPCC (una familia) y 3 con diagnstico histolgico de PAF que demostrara la presencia de al menos 100 plipos adenomatosos (2 familias). Tcnicas. Obtencin de ADN genmico: el ADN genmico fue aislado a partir de 10 ml de sangre perifrica, mediante el protocolo descrito por Lahiri et al en 199119. El ADN obtenido fue estudiado en busca de alteraciones del gen APC, en los pacientes con PAF, o en el gen MLH1, en la familia con HNPCC. Deteccin de mutaciones. El anlisis molecular de los genes se realiz por la tcnica de conformmeros de hebra simple (Single Strand Conformer PolymorphismSSCP). Para esto se realiz la amplificacin por PCR de todos los exones de los genes APC y MLH1 (menos el exn 15 del gen APC). Para el exn 15 del gen APC, se analizaron slo aquellas regiones que presentan una alta frecuencia de mutaciones segn est descrito en la literatura20. La reaccin por PCR se llev a cabo segn el siguiente protocolo: en un volumen final de 50 l se agregan 100 ng de ADN genmico, 25 pmoles de cada partidor, 1U de Taq ADN polimerasa (Fermentas), 0,2 mM de cada desoxinucletido trifosfato (dATP,dCTP,dGTP y dTTP), MgCl2 2,5 mM y amortiguador Taq (Tris-HCl 10 mM pH 8,8; KCl 50 mM, Nonidet P40 al 0,08%). Los partidores utilizados para cada
gen han sido previamente descritos en la literatura14,20-23. Los productos de
PCR fueron desnaturados, colocndolos a 90 por 5 min en una solucin que contiene: formamida al 95%, EDTA 20 M, azul de bromofenol al 0,25% p/v, xilencianol al 0,25% p/v y NaOH 10 mM. Posteriormente, estos productos se separan por electroforesis de alta resolucin en geles de poliacrilamida MDETM 0,5 X (Mutation Detection Enhancement, Cambrex Bio Science Rockland, Inc. ME, USA) en condiciones nativas. La electroforesis se realiz a una potencia constante de 3 watts por 14 h y el gel fue teido con nitrato de plata. Secuenciacin de ADN. Los productos de PCR que presentan un cambio en la migracin electrofortica, con respecto a los controles en la tcnica de SSCP, se someten a secuenciacin en un secuenciador automtico ABI PRISM 3100 v 3.7 (Applied Biosystems, CA, USA). Se definieron como mutaciones las alteraciones genticas que deriven en una protena de menor tamao, produciendo un efecto drstico sobre la funcin de la protena, a travs de la prdida de dominios de interaccin con otras molculas o cambios conformacionales. RESULTADOS Anlisis del gen APC en familias PAF. El caso ndice de la familia PAF4, cuya genealoga se presenta en la Figura 1A, corresponde a un paciente de 26 aos operado a los 21 aos por PAF, sometido a colectoma total e leo-recto anastomosis. El hermano de su padre, actualmente de 52 aos, fue sometido a una proctocolectoma total e ileostoma terminal por PAF a los 18 aos, momento en que se diagnostic un cncer de colon sigmoides. Este familiar y el caso ndice fueron sometidos al estudio gentico molecular. La familia PAF5 incluye a un paciente de 9 aos, cuya genealoga se muestra en la Figura 1B. Su padre fue operado a los 22 aos por PAF, y posteriormente falleci a los 41 aos por cncer de pncreas metastsico. Al paciente le fue diagnosticada una poliposis a los 6 aos, posterior a lo cual present sangrado digestivo bajo intermitente. La endoscopia digestiva alta confirm la presencia de plipos adenomatosos en el estmago y el duodeno. Por presentar una poliposis sintomtica, se decidi realizar una colectoma total ms una leo-recto anastomosis laparoscpica. El anlisis molecular del gen APC se realiz slo en este paciente. En las dos familias mencionadas, el anlisis molecular por medio de la tcnica SSCP determin cambios en la migracin electrofortica en un fragmento del exn 15 del gen APC (Figura 2A). La secuenciacin de este fragmento revel la delecin de cinco nucletidos entre las posi-ciones 3927 y 3931 del cADN denominada c.3927_3931delAAAGA. Esta delecin provoca un desplazamiento del marco de lectura del mARN, derivando en la aparicin de un codn de trmino prematuro. De esta forma, la traduccin se interrumpe en el codn 1313, sintetizndose una protena de tamao menor a lo normal (2843 aminocidos) (Figuras 2B y 2C). Anlisis del gen MLH1 en familia HNPCC. La genealoga de la familia HNPCC6 (Figura 3) est compuesta por una paciente de 53 aos, operada de cncer de colon derecho hace un ao, realizndose una colectoma total ms leo-recto anastomosis. Su hermano fue operado anteriormente por cncer de colon transverso a los 42 aos, realizndose la
misma ciruga. En estos dos pacientes se realiz un anlisis molecular. El
estudio molecular del gen MLH1 mediante SSCP mostr una probable mutacin en el exn 6 (Figura 4A). La secuenciacin de este fragmento demostr una insercin de una adenina en el codn 168 del exn 6, denominada c.504insA. Esta insercin provoca un desplazamiento del marco de lectura del mARN derivando en la aparicin de un codn de trmino prematuro. De esta forma, se obtiene una protena trunca de 171 aminocidos en comparacin con la protena normal de 756 aminocidos (Figuras 4B y 4C). DISCUSIN Dentro del espectro de los tumores colorrectales, aproximadamente 4 a 6% corresponde a dos entidades bien identificadas: PAF y HNPCC, para las cuales se ha identificado el gen de susceptibilidad correspondiente. En el primer caso, una mutacin en el gen APC es la responsable de este cuadro, mientras que en el segundo, alteraciones en los genes MLH1 o MSH2 se encontraran en la gran mayora de los que presentan este sndrome. Los familiares directos de los portadores de una mutacin en estos genes presentan hasta 50% de probabilidad de presentar el gen alterado. Por esta razn, todos deberan someterse a un estudio endoscpico precoz, ya que est demostrado que el identificar pacientes de riesgo permite detectar tumores en etapas tempranas, permitiendo una mejor sobrevida6,24-26. En los ltimos diez aos, el avance en el conocimiento de la gentica molecular humana, ha permitido identificar los genes responsables de diversas enfermedades hereditarias, incluidos algunos tipos de cncer. Esto mismo ha posibilitado identificar mutaciones causantes de estas patologas, permitiendo un diagnstico preciso en aquellos pacientes portadores de la enfermedad, adems de entregar a los no portadores la posibilidad de no someterse a estudios incmodos, de alto costo y de por vida. En este estudio, el anlisis de las dos familias PAF, mostr una delecin de 5 nucletidos entre los codones 1308 y 1310 del exn 15, entre dos sitios de unin de -catenina. Esta mutacin ha sido la ms frecuentemente descrita en la literatura mundial en pacientes con PAF, y produce un codn de trmino con la sntesis de una protena trunca. Esta protena truncada carece de la segunda regin de unin a -catenina, que es la de mayor importancia en la regulacin negativa de sta27. Es interesante que esta mutacin ha sido asociada por diversos autores con una aparicin ms temprana de los plipos28-30, un mayor compromiso rectal con la subsecuente necesidad de proctocolectoma27 y un comportamiento ms agresivo de la enfermedad31,32, que la mayora de los casos de PAF. En las familias estudiadas, se demuestra un fenotipo de la enfermedad agresivo y de aparicin precoz, con un caso operado antes de los 10 aos, otro a los 18, y dos familiares muertos por cncer antes de los 40 aos. Efectivamente, en el seguimiento de dos pacientes portadores de esta mutacin y que han sido sometidos a una colectoma total se ha observado el desarrollo de mltiples plipos rectales que no han respondido a la terapia farmacolgica con Celecoxib33. Esto hace pensar que en un corto plazo ser necesario extirpar el recto. En este sentido, un mejor conocimiento respecto a la asociacin
genotipo-fenotipo podra permitirnos plantear en los familiares asintomticos y
portadores de esta misma mutacin un enfoque teraputico distinto desde el inicio. Por todo lo anterior, concordamos con Wu y cols27 al afirmar que en individuos portadores de mutaciones en el codn 1309, el tamizaje endoscpico debe comenzar precozmente. En el caso inverso, es decir, pacientes que se presenten con poliposis en edades tempranas o de comportamiento agresivo, el estudio mutacional se debe iniciar en la regin del exn 15 que contiene esta mutacin. Esta mutacin tambin se ha descrito en familias donde aparece un caso de PAF sin antecedentes familiares, lo cual se denomina mutacin de novo34. Como se observa en la Figura 1B, el paciente y su padre son los nicos que han presentado poliposis (ambos abuelos vivos y sin evidencia de enfermedad), sugiriendo que la mutacin ocurri por primera vez en el padre. Este hecho concuerda con que la mutacin ocurre en una regin del gen llamada punto caliente (hot spot), es decir, con alta probabilidad de sufrir mutaciones. Una situacin distinta es la que se observa en los pacientes HNPCC, ya que como su abreviacin lo seala, este cncer no se asocia al desarrollo de mltiples plipos y, de este modo, se debe ser muy riguroso en la seleccin de los pacientes que se estudiarn. Desde el punto de vista costo-efectividad, debieran estudiarse los pacientes que renan los criterios Amsterdam I ya que en ellos la probabilidad de encontrar mutaciones puede llegar a 60%-70%5. Tal cual como se puede observar en la Figura 3, nos encontramos con una familia en la cual, adems del caso ndice, tres familiares de primer grado han presentado cncer de colon en dos generaciones sucesivas, uno de ellos antes de los 40 aos y adems en la anatoma patolgica se ha descartado una poliposis. Con respecto al tratamiento de los pacientes HNPCC, vemos que ambos fueron sometidos a una colectoma total con anastomosis ileorrectal, conducta fundamentada por el alto riesgo de desarrollar un tumor metacrnico (35% a 45%)26,35. Sin embargo, esta operacin no excluye el riesgo de desarrollar un cncer metacrnico del recto cuya probabilidad es de 11%3, por lo que se justifica un seguimiento endoscpico de por vida. La mutacin c.504insA del gen MLH1 fue descrita en el ao 200336 por primera vez, en un paciente de un estudio de 59 familias HNPCC de la poblacin norteamericana. Esta mutacin produce el desplazamiento del marco de lectura del mARN con lo que se sintetiza una protena truncada en el codn 171, que constituye cerca de 23% del tamao de la protena normal. No se describen en la literatura estudios funcionales de esta mutacin. Sin embargo, el hecho de que la protena se presente como un fragmento peque- o, que carece de los sitios de unin a las otras enzimas que participan en el complejo de reparacin del ADN, lleva a afirmar que la protena no sera funcional. Este estudio es el primero, en el medio nacional, en identificar mutaciones en pacientes portadores de variantes hereditarias de cncer colorrectal. La relevancia de estos resultados radica, tanto en la modificacin de conductas teraputicas en los pacientes que manifiestan la enfermedad (por la correlacin genotipo-fenotipo), como en la deteccin de
familiares asintom- ticos portadores de la mutacin, objetivo secundario de