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INTRODUCCION:
En el presente trabajo explicaremos los conceptos bsicos sobre el tema
Cromatografa liquida de alta resolucin (HPLC) , empezando desde sus inicios,
hasta llegar alta cromatografa liquida de alta resolucin , luego veremos sus
principales componentes sus aplicaciones y terminaremos el trabajo con unas
pequeas conclusiones.
Esta tcnica permite la separacin de componentes estrechamente relacionados
en mezclas complejas. La cromatografa en sus orgenes era exclusivamente
una tcnica de separacin que se transform en tcnica de anlisis cuando se
acoplo con un dispositivo para monitorear las especies qumicas que se iban
separando. As la cromatografa se ha convertido en un mtodo analtico de
primer orden para separar, identificar y cuantificar los compuestos presentes en
muestras liquidas o gaseosas (para muestras solidas se requiere una etapa de
disolucin o extraccin).
2. Objetivos
3. Antecedentes:
La cromatografa de lquidos de alta resolucin, es un modo de cromatografa
en la cual el proceso de separacin y transferencia de masa es entre la fase
estacionaria y la fase mvil y una temperatura dada.
3.1 Invencin:
de
inulina.
no
fueron
Sus
investigaciones,
utilizadas
por
sin
otros
3.2 Avances:
En 1959, introdujeron una nueva tcnica llamada cromatografa de
filtracin de gel. Esta se ha convertido en una poderosa y nueva
herramienta para la separacin de sustancias de alto peso
molecular, particularmente las protenas, y ha encontrado muchas
aplicaciones en los campos de la bioqumica, la medicina, la
fisiologa yla biologa. La mayora de las tcnicas de filtracin en gel
utilizan columnas y recientemente se han hecho trabajos con una
combinacin de filtracin en gel y materiales de intercambio inico,
logrando que las separaciones complejas sean extremadamente
rpidas y eficientes.
3.3. Aparicion
Los primeros equipos de cromatografa de gases aparecieron en
el Mercado a mediados del siglo XX. A su vez, la cromatografa
lquida de alta resolucin (HPLC High Performance Liquid
Chromatography, en ingls) comenz a desarrollarse en los
aos 1960, aumentando su importancia en las dcadas
siguientes, hasta convertirse en la tcnica cromatogrfica ms
empleada. Sin embargo esto se ir modificando con el paso de
los aos.
4.
Cromatografa:
5.
5.1
TIPOS
DE
CROMATOGRAFIA
LIQUIDA
DE
ALTA
RESOLUCION
5.1.1 Cromatogrfica de particin:
Se trata probablemente del tipo ms usado de cromatografa lquida de alta
resolucin. En ella se considera tanto el uso de fases lquidas retenidas sobre un
soporte slido como el de fases enlazadas unidas qumicamente al soporte
slido. La separacin de los solutos se basa en la diferente solubilidad entre las
fases mvil y estacionaria. En general la fase estacionaria debe tener polaridad
semejante a la de los analitos y la fase mvil se escoge de diferente polaridad
(aunque no tan diferente que el tiempo de retencin sea excesivamente largo).
Suele hablarse de dos tipos de cromatografa de particin:
a) Cromatografa en fase normal:
Emplea fases estacionarias polares y la mvil es poco polar.
4
a)
b)
VENTAJAS:
Ampliamente utilizado.
Fcil adaptacin alas determinaciones cuantitativas exactas.
Determinacin de compuestos no voltiles( alto peso molecular, iones
metlicos).
Aplicabilidad a sustancias de inters general (industria salud
medioambiente).
DESAVENTAJAS:
Instrumentacin costosa.
Dificultades en lo que se refiere a un anlisis cualitativo.
Elevado costo de operacin.
Requiere de una alta experiencia y conocimiento para su
funcionamiento.
6.1.
Solventes
NOMBRE
MW
BP
I.R.
[C]
UV
[nm]
Viscosidad
[cP]
[Debye]
Acetonitrilo
41
82
1.341
195
0.358
3.37
Dioxina
88
101
1.421
215
1.26
0.45
Etanol
46
78
1.359
205
1.19
1.68
Metanol
32
65
1.326
205
0.584
1.66
Isopropanol
60
82
1.375
205
2.39
1.68
Tetrahidrofurano
72
66
1.404
215
2.20
1.70
Agua
18
100
1.333
185
1.00
1.84
10
b) Filtracin de solventes
Las partculas pueden ocasionar costosos daos a la bomba HPLC, al guarda
columnas, y en general causar desgaste del sistema de HPLC. Los fabricantes
de los instrumentos tienen en cuenta este problema y recomiendan que se filtre
(0.45 o 0.22 micras) y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos.
Se utilizan tres mtodos para la filtracin
-
Filtracin al Vaco.
Filtracin en Lnea.
c) Desgasificacin de solventes
Su principal es erradicar los problemas que puedan causar.
-
Zonificacin.
Burbujear Helio.
Temperatura.
6.2.
Bombas
El caudal que suministran debe ser constante a lo largo del tiempo, ya que
de l depende la reproducibilidad de los tiempos de retencin.
a) Bombas neumticas:
Bombas
de
desplazamiento
directo.
Bombas
amplificadoras
de
aire
12
13
El motor utilizado en este tipo de bombas es de tipo paso a paso, con lo que se
consigue un perfecto control de su velocidad, y del desplazamiento que ejerce
sobre el pistn.
14
Este sistema de mezclado utiliza una bomba para cada uno de los disolventes
que se van a mezclar, estando la salida de cada bomba conectada a una
conexin en "T" o a una pequea cmara de mezcla. La denominacin de mezcla
15
en alta presin es debida a que la mezcla se realiza una vez que los disolventes
han pasado la bomba y, por lo tanto, han adquirido la presin de trabajo.
El mayor inconveniente de este sistema de mezcla, es el alto coste de las
bombas si se requieren mezclas con un porcentaje inferior a un 5 % de uno de
los componentes, ya que en este caso deben utilizarse bombas de alta precisin
y, adems, se necesita una bomba para cada uno de los disolventes a mezclar.
Como ventajas, se pueden sealar una buena reproducibilidad de las mezclas,
una rpida respuesta en los cambios de concentracin y, adems, la posibilidad
de utilizar cada una de las bombas por separado para trabajar con sistemas
isocrticos independientes.
6.3.
Sistemas de inyeccin
17
b) Inyectores de vlvula
Este sistema de inyeccin consiste en una vlvula de seis vas, dos de las cuales
estn conectadas entre s por medio de una espira ("loop"). Esta espira es un
tubo de volumen conocido, cuya misin es la de contener la muestra antes de
efectuarse la inyeccin.
La introduccin de la muestra en la columna se lleva a cabo en dos etapas; la
primera se realiza a presin atmosfrica, y consiste en cargar la muestra en la
espira con ayuda de una jeringa; en la segunda, mediante un giro de la vlvula,
se hace pasar el eluyente a travs de la espira hacia la columna.
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7. La Columna
La columna es el elemento fundamental de un cromatgrafo de lquidos, puesto
que es en ella donde tiene lugar la separacin; por lo tanto, resulta fundamental
una correcta eleccin de la columna adecuada para cada separacin, ya que con
una columna inadecuada o de mala calidad se nunca se obtendrn buenos
resultados aunque se disponga del mejor instrumental.
Las columnas ms utilizadas en cromatografa de lquidos son las de relleno;
estas columnas consisten en un tubo, generalmente de acero, relleno de una
fase estacionaria adecuada al tipo separacin que se pretende llevar a cabo. El
dimetro interno vara entre 2 y 60 mm dependiendo su utilizacin, a escala
analtica o semipreparativa, y su longitud vara entre 5 y 30 cm. Tambin se
encuentran hoy en da en el mercado columnas de pequeo dimetro
(microbore), con dimetros comprendidos entre 2 y 0,5 mm y longitudes entre 25
y 100 cm. Este tipo de columnas permite reducir el consumo de disolventes y,
por lo tanto, facilitan la posibilidad de acoplar la cromatografa lquida a otras
tcnicas analticas (fundamentalmente espectrometra de masas). Por otro lado,
se empieza a introducir la denominada cromatografa de lquidos capilar, en la
que se utilizan como columnas tubos (de slice fundida generalmente) de un
dimetro interno muy pequeo (entre 200 y 500 :m) y de gran longitud (varios
metros); en este tipo de columnas, la caracterstica ms importante es que la
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fase estacionaria se encuentra ligada qumicamente a las paredes del tubo, por
lo que se hace innecesaria la utilizacin de partculas de fase estacionaria como
en los dos casos anteriores.
Las caractersticas de la columna que influyen sobre su capacidad de separacin
son:
Dimetro interno.
Longitud.
Conexiones (reducciones).
Relleno.
Tamao de partcula del relleno
7.1.
Dimetro de la columna
Longitud de la columna
Conexiones
Relleno
22
7.5.
de
ligar
qumicamente
molculas
su
superficie.
Tamao de partcula
8. Detectores
Un detector para cromatografa es un dispositivo que permite medir, a la salida
de la columna, una propiedad fsica del eluyente, que deber depender de la
composicin de ste. La deteccin en cromatografa se realiza, habitualmente,
en continuo, aunque es posible la utilizacin de colectores de fracciones para la
identificacin y cuantificacin de pequeas fracciones del eluyente.
8.1.
25
8.2.
a) Volumen de la cubeta
El volumen de la cubeta puede provocar una prdida considerable de la
eficacia del sistema, ya que volmenes grandes de clula originan un efecto de
dilucin exponencial del soluto que sale de la columna, deformndose el pico y
pudindose mezclar dos solutos que salen separados de la columna.
El volumen mximo de la cubeta es funcin del porcentaje de prdida de eficacia
admisible para el sistema y, en general, se utilizan volmenes inferiores a 8 L para
evitar prdidas de eficacia.
b) Constante de tiempo
La constante de tiempo del detector indica el tiempo que necesita la electrnica
del detector para asumir la seal instantnea originada por el soluto. Constantes
de tiempo elevadas, dan origen a que picos que salen rpidamente de la columna
se vean ensanchados, y por lo tanto, dan origen a una prdida de la eficacia del
sistema. Para anlisis convencionales, son apropiadas constantes de tiempo
inferiores a 100 ms.
26
8.3.
Tipos de refractmetros
Las ventajas de este tipo de detector son su baja sensibilidad frente a las
partculas slidas y a las burbujas de aire que puedan penetrar en la cubeta y la
posibilidad de cubrir el intervalo completo de ndices de refraccin (desde 1,000
hasta 1,75), con una nica cubeta fcilmente equilibrable. Sus desventajas, son
su alto coste y, como consecuencia del crtico emplazamiento de la cubeta en el
centro de la ptica, su difcil manejo, lo que impide limpiar, quitar o reemplazar
fcilmente la cubeta cuando se forma en ella una pelcula o se atasca.
c) Detector de reflexin (Fresnel).
El segundo tipo de detector de ndice de refraccin utiliza el principio de Fresnel.
En la prxima, se muestra el esquema ptico de este tipo de detector. En l, el
29
Coeficiente
de
extincin
molar
(,)
de
varios
compuestos
TIPO DE COMPUESTO
Amina
Instauracin aliftica
CROMFORO
-NH2
-C=C-
LONGITUD DE ONDA
(nm)
195
2800
190
8000
32
210-230
21000
230-260
6000
Benceno
202
6900
Bifenilo
246
20000
Quinoleina
270
314
3600
2750
Antraceno
252
199000
Instauracin alicclica
-(C=C)2-(C=C)2-
LONGITUD DE ONDA
LONGITUD DE ONDA
(nm)
(nm)
COMPUESTO
EXCITACIN
EMISIN
Benceno
270
310
36
Tolueno
270
320
Clorobenceno
275
345
Fenol
285
365
Anilina
210
405
Acido benzoico
310
390
Benzonitrilo
280
360
g) Detectores electroqumicos.
Fundamentos
Este tipo de detectores, estn basados en la oxidacin del analito eludo
mediante un electrodo adecuado, registrndose la intensidad de la corriente,
mantenida mediante la electrolisis de los analitos, a lo largo del cromatograma. La
deteccin en este caso est basada en el conocido polargrafo de gota de
mercurio; este instrumento consta de un par de electrodos a los que se aplica
un potencial de oxidacin (potencial de semionda) suficiente para crear una
corriente de difusin. Puesto que la cantidad de corriente es una medida directa
de la concentracin de analito en un momento dado, el proceso es cuantitativo.
Para poder aplicar esta tcnica a la deteccin en cromatografa lquida, se han
desarrollado nuevos materiales para los electrodos y se han diseado cubetas
de electrolisis de escaso volumen y con geometras muy eficaces. Como
electrodos de medida, se utilizan los de pasta de carbn, carbn pulimentado y
amalgama de oro y mercurio, normalmente con un contraelectrodo de platacloruro de plata.
37
39
de
alimentacin:
Edulcorantes
artificiales,
antioxidantes,
aflatoxinas, aditivos
Productos de la industria qumica: Aromticos condensados, tensoactivos,
propulsores, colorantes
Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB
Qumica forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos
Medicina clnica: cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina,
estrgenos.
b) Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa
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a) presin alta
Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC o Guarda Columna por
partculas.
Solucin a largo plazo: Asegurase que todas las fases mviles se filtren
apropiadamente antes que entren a la bomba de HPLC. Tambin filtre todas las
muestras antes de inyectarlas.
a) Prdida de la resolucin
Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes de que se introduzcan las fases mviles en
el sistema de HPLC.
b) Picos hendidos
Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases mviles
en el sistema de HPLC.
Posible causa: Burbujas del aire atrapados en la celda del detector debido a una
mala desgasificacin de los solventes de la fase mvil.
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Posible causa: Trabajar con bombas, sellos pistones expuestos por mucho
tiempo a partculas en suspensin en la fase mvil.
10. CONCLUSIONES
Una de las principales ventaja de esta tcnica frente a otras metodologas
analticas clsicas es su especificidad, permitiendo la separacin, identificacin
y cuantificacin de los componentes orgnicos ms complejos.
La
el
HPLC
campo
analtica
de
ha
la
adquirido
una
investigacin
especial
y
importancia
desarrollo
en
cientfico,
Concluimos
resaltantes
que
del
unas
HPLC
de
es
las
su
caractersticas
alta
resolucin,
ms
su
43
11. RECOMENDACIONES
Filtrar, filtrar, filtrar!!! (tanto disolventes como muestra). Pues estas Partculas son
las que producen obstrucciones que pueden venir de fuera y dentro del sistema:
Solventes, tampones, Crecimiento bacteriano en las botellas de disolvente, La
muestra, desgaste de los componentes, etc. El Mantenimiento Preventivo es la
clave!
Intentar limpiar o cambiar los filtros regularmente o cada 3 meses. Si es posible, use
botellas de disolventes estriles o de color mbar, para retardar aparicin de algas.
Evite exposicin de la botella de disolvente directamente a la luz del sol (use papel
de aluminio, proteja de las ventanas).
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12. BIBLIOGRAFIA
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