Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
1. Scopul
Scopul acestei proceduri specifice este de a prezenta modul de desfasurare
a etapelor necesare determinarii prezentei germenilor patogeni in materiile
fecale(Salmonella,Shigella,Escherichia coli enteropatogen,Stafilococ coagulazapozitiv).
2. Domeniu de aplicare
Procedura se adreseaz personalului din laborator, care lucreaz n
compartimentul "Bacteriologie"
3. Documente de referinta
-Tratat de Microbiologie Clinica de Dumitru Buiuc;Editura Medicala 2009
4. Definitii
Coprocultura cultivarea materiilor fecale ceea ce presupune izolarea
agentului etiologic bacterian pe medii adecvate si identificarea lui pe baza
caracteristicilor morfologice,de cultivabilitate,biochimice, si antigenice.
5. Abrevieri:
-ADCL-Leifson agar dezoxicolat citrat lactoza
-SS-Salmonella,Shigella Agar
-AABTL:Agar bila albastru de brom timol lactoza
-EPEC: Escherichia coli enteropatogen
-MIU:mediu pentru teste biochimice: mobilitate ,indol,uree
-MILF:mediu pentru teste biochimice:mobilitate,indol
,lizindecarboxilaza,fenilalanin dezaminaza
-TSI:mediu pentru teste biochimice:triple sugar iron agar
6. Resurse
6.1 Echipamente de incercare
-termostat
-autoclav
-termometre de camera si de incinte
-bec de gaz
-anse
-stativ pentru eprubete
6.2 Reactivi si materiale consumabile
-mediu de cultura ADCL
-mediu de cultura SS
-mediu de cultura AABTL
-mediu de cultura geloza simpla
-mediu de cultura geloza sange
-mediu Chapman
-mediu de imbogatire bulion selenit acid de sodiu
-mediu Muller Hinton
-medii pentru teste biochimice:MIU,MILF,TSI
-benzi indol/reactiv Kovacs
2
-ser fiziologic
-plasma
-placi Petri
-eprubete
-seruri aglutinante pentru Salmonella,Shigella,EPEC
-solutie dezinfectanta
-marker
7. Recoltarea , transportul si pastratrea probelor
Primirea pacientului
Dupa ce pacientul a fost inregistrat la registratura, unde i se creaza o fisa
de analize medicale si i se completeaza pe biletul de trimitere codul analizator si
numarul de ordine zilnic este directionat spre sala de recoltare unde recolteaza
asistentul care a fost trecut in fisa pacientului. Pacientul este primit in sala de
recoltare de catre asistent.
Identificarea pacientului
Din discutiile purtate cu pacientul si studierea biletului de trimitere se
asigura identitatea pacientului, pentru a se evita unele situatii nedorite.
Reguli de igiena
Recoltarea produsului patologic este precedata de activitati cu rol de
protejare ( de orice contaminare) a pacientului si a asistentului medical. In acest
sens asistentu medical se spala pe maini dupa preluarea biletului de trimitere,
recipiente cu scaun, urina cu apa calda si sapun .
Asistentul medical poarta manusi chirurgicale pe care le schimba la fiecare
pacient
Recoltarea probelor:
Materiale necesare :
coprocultoare tip din material plastic
intrebuintare prevazute cu lingurita sau tija,
sonde Nelaton sterile nr 14 16.
tampoane rectale cu tija lunga
de
unica
Pregatirea pacientului:
fizica
EXAMENUL BACTERIOLOGIC
Pentru stabilirea diagnosticului de laborator se vor cerceta caracterele
culturale, morfologice pe frotiuri colorate dupa metoda Gram si albastru de
metilen, comportamentul biochimic si structura antigenica.
Examinarea macroscopica
Se efectueaza din scaunul emis spontan si se inregistreza:
o Mirosul: fecaloid (salmoneloze, shigeloze,
campilobacterioze),
- fetid (caracteristic V. cholerae. E. coli enteropatogen),
- protozoare.
Preparate colorate
- Coloratia cu albastru de metilen
- o ansa cu materii fecale (preferabil mucus, sange) se
omogenizeaza cu 2 picaturi solutie de albastru de
metilen pe o lama,
- se acopera cu o lamela evitand formarea de bule de aer,
- se astepta 2 min,
- se examineaza cu obiectivul de 40X,
- se evidentiaza:
- polimorfonucleare 50/camp in shigeloze
- polimorfonucleare 20/camp in salmoneloze, dizenterie
amoebiana
- polimorfonucleare 2-5/camp in holera, infectii cu ETEC
- polimorfonucleare, macrofage si eritrocite in shigeloze,
- polimorfonucleare si hematii in campilobacterioze,
Preparate fixate
se urmaresc microorganismele
frotiul se prepara din portiuni nemucoase ale probei prim
omogenizarea unei anse putin incarcate intr-o picatura de
solutie salina izotona
dupa uscare se fixeaza timp de 3 4 min cu metanol
se coloreaza dupa metoda Gram
se evidentiaza flora gram-negativa dominanta si cea
gram-pozitiva (toxiinfectii alimentare cu stafilococ,
Bacillus, Clostidium)
dominanta fungilor
Examenul cultural
Tehnica insamantarii prin epizarea inoculului cu ansa bacteriologica pe
placi cu mediu selectiv agarizat:
Initial se evapora condensul de pe suprafata mediului prin mentinerea
placilor cca 30 minute la 37o C (in termostat) cu capacul intredeschis
uscarea placilor,
Se noteaza pe placa cu mediu de cultura numarul de identificare al
probei,
8
10
12
Diagnosticul serologic
In eventualitatea unei culturi abundente si aproape monomorfe pe
mediile de etalare, se va putea executa pentru un diagnostic prezumtiv si
rapid, aglutinarea cu seruri antishigella.
Aglutinarea culturilor suspecte pe repicari se incepe cu antiserurile
corespunzatoare grupelor B si D, mai frecvent intalnite si in caz negativ se
fac aglutinari cu celelate seruri.
Nota:
In cazul in care cultura repicata prezinta caracterele biochimice
pe mediile politrope caracteristice Shigellelor si totusi aglutinarea
ramane negativa, se va proceda la reexaminarea aglutinabilitatii
dupa termoinactivare sau a culturii vii cu serul de tip Shigella
flexneri G ( uneori serul polivalent pentru. Shigella nu
aglutineaza Shigella flexneri G)
In cazul lipsei oricarei aglutinarii, in contrast cu spectrul
biochimic caracteristic Shigellelor, se vor efectua teste
biochimice suplimentare (inclusiv ONPG)
OBS: Se inregistreaza in registrul pentru evidenta probelor de
bacteriologie totalitatea testelor de identificare efectuate si interpretarea
acestora cat si mediile de cultura folosite suplimentar fata de setul
standard.
Eliberarea rezultatului
Un rezultat negativ va fi eliberat la 24-48 ore de la primirea probei.
Un rezultat pozitiv va preciza taxonomia agentului patogen si va preciza
testarea pentru sensibilitatea la antibiotice si chimioterapice.
Coprocultura pentru E. coli, serotipuri enteropatogene
Probele recoltate se insamanteaza in mod obligatoriu:
15
17
nu
se
evidentiaza
aglutinarea
spontana
(picatura
ramane
18
19
8. Erori de diagnostic
8.1 Surse de eroare
numarul mic de unitati infectante/g materii fecale si eliminarea sporadica la
cazurile de portaj
volum prea mic al recoltei
depasirea intervalului de timp dintre momentul recoltarii si insamantarea
prelevatului
lipsa controlului de calitate al mediilor utilizate
folosirea echipamentelor incorect monitorizate
8.2 Evitarea erorilor
folosirea unor proceduri de imbogatire a prelevatului si repetarea
examenului negativ
volumul prelevatului sa fie minim 3-5 cm3
prelevatele care nu se insamanteaza poe medii de izolare(imbogatire sau
selective) intr-un intervalde 2 ore trebuie supus unui proces de conservarer
(conservare prin refrigerare pentru cel mult 24 h la +4C).
monitorizarea si intretinerea corespunzatoare a echipamentelor utilizate
pentru incercare
controlul de calitate al mediilor folosite
20
9.Exprimarea rezultatelor
Descrierea softului de interpretare
-interpretarea rezultatelor analizelor microbiologice se face prin aprecierea
caracterelor culturilor obtinute si interpretarea testelor biochimice si a reactiilor de
aglutinare
Estimarea incertitudinii de masurare
-in microbiologie incertitudinea de masurare se determina ca:
repetabilitatea metodei,determinata pe esantioane alese de laborator
acuratetea metodei sau exactitatea ,determinata pentru acele metode
pentru care exista materiale de referinta
repetabilitatea:apropierea
acordului
dintre
rezultatele
masuratorilor
9. Inregistrari
9.1 Inregistrari in foaia de lucru
21
22