Sunteți pe pagina 1din 22

COPROCULTURA

1. Scopul
Scopul acestei proceduri specifice este de a prezenta modul de desfasurare
a etapelor necesare determinarii prezentei germenilor patogeni in materiile
fecale(Salmonella,Shigella,Escherichia coli enteropatogen,Stafilococ coagulazapozitiv).
2. Domeniu de aplicare
Procedura se adreseaz personalului din laborator, care lucreaz n
compartimentul "Bacteriologie"
3. Documente de referinta
-Tratat de Microbiologie Clinica de Dumitru Buiuc;Editura Medicala 2009
4. Definitii
Coprocultura cultivarea materiilor fecale ceea ce presupune izolarea
agentului etiologic bacterian pe medii adecvate si identificarea lui pe baza
caracteristicilor morfologice,de cultivabilitate,biochimice, si antigenice.
5. Abrevieri:
-ADCL-Leifson agar dezoxicolat citrat lactoza

-SS-Salmonella,Shigella Agar
-AABTL:Agar bila albastru de brom timol lactoza
-EPEC: Escherichia coli enteropatogen
-MIU:mediu pentru teste biochimice: mobilitate ,indol,uree
-MILF:mediu pentru teste biochimice:mobilitate,indol
,lizindecarboxilaza,fenilalanin dezaminaza
-TSI:mediu pentru teste biochimice:triple sugar iron agar
6. Resurse
6.1 Echipamente de incercare
-termostat
-autoclav
-termometre de camera si de incinte
-bec de gaz
-anse
-stativ pentru eprubete
6.2 Reactivi si materiale consumabile
-mediu de cultura ADCL
-mediu de cultura SS
-mediu de cultura AABTL
-mediu de cultura geloza simpla
-mediu de cultura geloza sange
-mediu Chapman
-mediu de imbogatire bulion selenit acid de sodiu
-mediu Muller Hinton
-medii pentru teste biochimice:MIU,MILF,TSI
-benzi indol/reactiv Kovacs
2

-ser fiziologic
-plasma
-placi Petri
-eprubete
-seruri aglutinante pentru Salmonella,Shigella,EPEC
-solutie dezinfectanta
-marker
7. Recoltarea , transportul si pastratrea probelor
Primirea pacientului
Dupa ce pacientul a fost inregistrat la registratura, unde i se creaza o fisa
de analize medicale si i se completeaza pe biletul de trimitere codul analizator si
numarul de ordine zilnic este directionat spre sala de recoltare unde recolteaza
asistentul care a fost trecut in fisa pacientului. Pacientul este primit in sala de
recoltare de catre asistent.
Identificarea pacientului
Din discutiile purtate cu pacientul si studierea biletului de trimitere se
asigura identitatea pacientului, pentru a se evita unele situatii nedorite.
Reguli de igiena
Recoltarea produsului patologic este precedata de activitati cu rol de
protejare ( de orice contaminare) a pacientului si a asistentului medical. In acest
sens asistentu medical se spala pe maini dupa preluarea biletului de trimitere,
recipiente cu scaun, urina cu apa calda si sapun .
Asistentul medical poarta manusi chirurgicale pe care le schimba la fiecare
pacient
Recoltarea probelor:
Materiale necesare :
coprocultoare tip din material plastic
intrebuintare prevazute cu lingurita sau tija,
sonde Nelaton sterile nr 14 16.
tampoane rectale cu tija lunga

de

unica

Pregatirea pacientului:

psihica : - asistentul explica pacientului tehnica e urmeaza a


se efectua si modul de recoltare a probelor de materii
fecale

fizica

pacientul este intrebat daca:


- proba de scaun a fost sau urmeaza sa se recolteze
- pentru probele recoltate la domiciliu nu a trecut mai mult de doua ore
prelevare,
- proba a fost pastrata si transportata la rece, imersata in mediu de transport
Cary Blair
- i s-au administrat antibiotice si sulfamide, deoarece toate acestea pot
compromite rezultatul analizei.
OBS.:
In caz contrar , analiza nu este concludenta si se recomanda
pacientului sa revina cand indeplineste toate conditiile cerute!
Procedura de recoltare

Prelevarea probelor trebuie facuta cat mai aproape de


debutul bolii si inaintea instituirii oricarui tratament
antimicrobian,

Probele de materii fecale pot fi prelevate din scaunul emis


spontan sau prin prelevare rectala

Prelevarea din scaun emis spontan:


Produsul care permite cele mai multe izolari (indiferent de
forma clinica) este scaunul proaspat, emis spontan.
Pentru defecare se utilizeaza containere de unica utilizare
din carton sau material plastic care pot fi decontaminate si
indepartate cu usurinta dupa efectuarea prelevarii,
Recoltarea se face cu ajutorul linguritei sau tijei
coprocultorului din portiuni din scaun cu mucus si eventual
urme de sange, iar cand lipsesc se recolteaza boluri fecale din
2-3 locuri diferite,
Cantitatea este de 5 g (un volum minim de 3- 5 cm 3) iar
daca scaunul este lichid recoltorul trebuie umplut in proportie
de jumatate,

La bolnavii cronici, purtatori, persoane nespitalizate,


scaunul va fi provocat prin purgativ salin (amestec de sulfat de
Na si Mg).
Pentru controlul purtatorilor de bacili tifici , prelevarea se
face timp de 3 zile consecutive, dupa o administrare mica de
purgative
o Prelevare rectala:
La bolnavii de dizenterie bacteriana si la investgarea
purtatorilor de Salmonella si Shigella, in cazurile in care nu
poate fi obtinuta o proba de scaun ca atare, se poate proceda
la recoltarea cu sonda Nelaton sterila nr. 14 16 sau cu
tampoane rectale sterile cu tija lunga.

La copii se poate utiliza si sonda de sticla sterila. La


adult, cu sonda sau tamponul rectal umezit cu solutie
fiziologica (nu se folosesc geluri lubrifiante) se penetreaza in
sfincterul anal prin rotare lenta si se introduce 15-20 cm, iar la
copii 10-12 cm, in colonul sigmoid.
La sonda Nelaton se adapteaza o seringa de 10 ml cu
care se fac 1- 2 aspiratii,
Produsul recoltat se suspenda in 2 ml solutie fiziologica
sterila sau in lichid conservant.

Se introduce tamponul sau proba in recoltorul etichetat


in prealabil, notandu-se codul zilnic si analizor al pacientului si
felul analizei:" corocultura, ex.microscopic, ex. micologic.
Transportul probelor
Transportul la laborator al prelevatelor de materii fecale destinate
examenelor microbiologice se face in cel mai scurt timp (fara sa depasasca 2
ore de la prelevare). Este indicata pastrarea la rece a probelor in acest interval
pana in momentul insamantarii.
In cazul in care acest interval nu poate fi asigurat este obligatorie
folosirea unui lichid conservat, de ex: solutie salina glicerinata tamponata ( in
raport de 1-3 g materii fecale la 10 ml solutie) sau cel mai indicat mediul de
transport Cary- Blair. Acestea mentin vibilitatea microorganismelor timp de 24
ore la temperatura ambianta.

Regula: Orice prelevat care nu se insamantaeza pe medii de izolare


(imbogatire sau selective) intr-un interval maxim de doua ore de la
prelevare trebuie supus unui proces de conservare:
Conservarea prin refrigerare la +4oC timp de 24 ore;
Conservarea in mediul de transport Cary-Blair asigurandu-se o buna
conservare la temperatura ambianta pana la 7 zile.
Nota: Daca aceste conditii nu sunt asigurate este de preferat a nu se
proceda la
efectuarea coproculturii.
Probele astfel recoltate, etichetate corespunzator, insotite de un bulletin
de analize in care sunt inscrise datele privind identitatera pacientului,
diagnosticul clinic prezumtiv, data si ora recoltarii, tratamentul cu antibiotice
aplicat anterior recoltarii, vor fi transporate imediat la laborator.
Transmiterea probelor recoltate in cadrul Laborator se face din sala de
recoltare catre laborator impreuna cu biletele de trimitere. Asistentul medical de
la recoltare transporta probele recoltate dupa fiecare 10 pacieni in laborator si
le depoziteaza pe masa de primire a probelor pentru examen bacteriologic.
Probele recoltate in cadrul punctelor de recoltare din afara Laborator sau
recoltate la domiciliu, se transporta obligatoriu pe mediu de transport si sunt
depozitate si transportate in siguranta in recipiente din plastic, la temperatura
scazuta.
OBS.: Probele biologice nu se transporta prin sala de asteptare!
Nota: Pe buletin se va specifica grupul de germeni pentru care se solicita
examinarea, evitandu-se termenul general de coprocultura.
Inregistrarea si conservarea probelor
Se inregistreaza fiecare proba in caietul de laborator Registrul pentru
evidenta probelor atribuindu-se un numar unic intern. Se specfica tipul
examenului solicitat.
Probele se vor pastra timp de 24 de ore la temperatura camerei
imersate in bulion de conservare-imbogatire sau in mediu de transport Cary
Blair.
8 Tehnica de lucru propriu-zisa.

EXAMENUL BACTERIOLOGIC
Pentru stabilirea diagnosticului de laborator se vor cerceta caracterele
culturale, morfologice pe frotiuri colorate dupa metoda Gram si albastru de
metilen, comportamentul biochimic si structura antigenica.
Examinarea macroscopica
Se efectueaza din scaunul emis spontan si se inregistreza:
o Mirosul: fecaloid (salmoneloze, shigeloze,
campilobacterioze),
- fetid (caracteristic V. cholerae. E. coli enteropatogen),

o Culoarea: - verzuie (V. cholerae),


- galbena caracteristica (E. coli, Salmonella),
- hemoragica,
- rosu viu (Serratia),
o Aspectul: - moale, fecaloid neformat (Salmonella,
Campylobacter),
moale cu grunji fecaloizi (Yersinia, Aeromonas)
lichid ca apa de orez (Vibrio, E. coli enterotoxigena),
muco-purulent :sciupat rectal (Shigella),
hemoragic lambouri de mucoasa epiteliala (E. coli
enterohemoragica),
muco-sanguinolent ( Shigella),
scaun inglobat in mucus (Shigella, E. coli enteroinvaziv),

Examinarea microscopica directa


Microscopia optica include examinarea de preparate umede si fixate
Preparate umede
Preparate native intre lama si lamela
o ansa cu materii fecale (preferabil mucus, sange) se
omogenizeaza cu o picatura de solutie salina izotona,
- se acopera cu o lamela evitand formarea de bule
- se examineaza cu obiectivul de 40X si se observa:
- oua si larve de helminti,

- protozoare.
Preparate colorate
- Coloratia cu albastru de metilen
- o ansa cu materii fecale (preferabil mucus, sange) se
omogenizeaza cu 2 picaturi solutie de albastru de
metilen pe o lama,
- se acopera cu o lamela evitand formarea de bule de aer,
- se astepta 2 min,
- se examineaza cu obiectivul de 40X,
- se evidentiaza:
- polimorfonucleare 50/camp in shigeloze
- polimorfonucleare 20/camp in salmoneloze, dizenterie
amoebiana
- polimorfonucleare 2-5/camp in holera, infectii cu ETEC
- polimorfonucleare, macrofage si eritrocite in shigeloze,
- polimorfonucleare si hematii in campilobacterioze,
Preparate fixate
se urmaresc microorganismele
frotiul se prepara din portiuni nemucoase ale probei prim
omogenizarea unei anse putin incarcate intr-o picatura de
solutie salina izotona
dupa uscare se fixeaza timp de 3 4 min cu metanol
se coloreaza dupa metoda Gram
se evidentiaza flora gram-negativa dominanta si cea
gram-pozitiva (toxiinfectii alimentare cu stafilococ,
Bacillus, Clostidium)
dominanta fungilor
Examenul cultural
Tehnica insamantarii prin epizarea inoculului cu ansa bacteriologica pe
placi cu mediu selectiv agarizat:
Initial se evapora condensul de pe suprafata mediului prin mentinerea
placilor cca 30 minute la 37o C (in termostat) cu capacul intredeschis
uscarea placilor,
Se noteaza pe placa cu mediu de cultura numarul de identificare al
probei,
8

Tamponul cu prelevat se descarca pe aprox din placa prin striuri


paralele suprapuse ,
Ultimele 3 4 striuri se reiau apoi cu ansa si se descarca in trei grupe
de striuri paralele nesuprpuse,
Ansa nu se flambeaza intre grupele de striuri,
Din suspensiile de materii fecale omogenizate in mediu de transport
sau in solutie salina izotona, se depun 2 3 picaturi la marginea
placii Petri,
Cu ansa se realizeaza grupe de striuri partial suprapuse,
Din mediile de imbogatire, agitate in prealabil se procedeaza ca mai
sus.
Proba se insamanteaza ca atare in caz ca scaunul este lichid, preferanduse portiunile cu striuri cu mucus si sange.
Scaunul consistent se omogenizeaza in mediile de transport in care au fost
transportate sau in 5 ml solutie salina fiziologica tamponata. Este foarte util sa se
verifice pH- ul lichidului conservat in care produsul a fost suspendat sa nu fie sub
Prelucrare ulterioara este diferentiata in functie de examenul solicitat
(Shigella, Salmonella, E. coli enteropatogen, Yersinia etc).
Nota: In caz ca nu exista nici o astfel de indicatie, laboratorul are obligatia
de a asigura in primul rand diagnosticul pentru Enterobacteriaceae
patogene: Salomonella, Shigella, Yersinia si E. coli serotipuri
enteropatogene ( pentru copiii sub 2 ani). Se va evita incarcarea
laboratorului cu solicitari pentru alte grupe din familia Enterobacteriaceae
sau din afara ei, exceptand stric situatiile in care exista o indicatie
epidemiologica certa (toxicozele, toxiinfectiile alimentare, enteritele de tip
epidemic).
Coprocultura pentru germenii grupului Salmonella
Probele recoltate se insamanteaza in mod obligatoriu:
Pe mediul de imbogatire selenit acid de sodiu trece ulterioara
dupa 16 ore incubare la 37C pe un mediu selectiv
Pe mediul ADCL ( sau Leifson) o placa pentru o proba
Sau pe mediul Istrate Meitert
Sau pe mediul Hektoen enteric

Este indicata si insamantarea directa pe aceste medii de izolare


In suspiciunea de febra tifoida, se va efectua o insamantare
abundenta pe mediul Wilson-Blair
Concomitant se insamateaza pe aceleasi medii culturi Salmonella ca
atare sau in suspensii de materii fecale, pentru controlul de calitate.
Dupa descarcare se disperseaza inoculul prin tehnica epuizarii ansei
bacteriologice, prin striuri apropiate pentru obtinerea de colonii izolate
Incubarea
Insamantarile efectuate pe mediul selenit acid de sodium si pe mediile de
izolare se examineaza dupa incubare timp de 18-24 ore la 37C iar pentru
culturile insuficient dezvoltate se va proceda la o incubare prelungita de 48 ore,
perioada de incubare obligatorie pentru mediul Wilson-Blair.
Citire si interpretare
Pe mediul ADCL (sau Leifson) dupa incubare 24 ore la 37 C:
Coloniile de Salmonella apar transparente, de culoare rozgalbui (ca si alte bacterii lactozo-negative)
Germenii care produc H2S (Proteus, Salmonella) pot prezenta
dupa 24 sau 48 ore colonii cu centru negricios
Germenii lactozo-pozitivi, in general inhibati, se pot dezvolta
sub forma unor colonii rosii, fara transparenta, cu o zona de
opacifiere a mediului in jurul coloniei
Pe mediul cu bila uscata (Istrate Meitert) :
Coloniile de Salmonella apar de culoare verde-albastruie
Germenii lactozo-pozitivi (E. coli) pot dezvolta colonii de culoare
galbena
Pe mediul Hektoen enteric:
Coloniile de Salmonella apar de culoare albastra
Germenii care produc H2S (Proteus, Salmonella) pot prezenta
dupa 24 sau 48 ore colonii cu centru negricios
Germenii lactozo-pozitivi, in general inhibati, se pot dezvolta
sub forma unor colonii rosii, cu o zona de virare in rosu a
mediului in jurul coloniei
Coloniile suspecte dezvoltate pe mediile de etalare directa
sau dupa imbogatire se repica pe:

10

Mediul Mac Conkey


Coloniile de Salmonella apar semitransparente, necolorate
(ca si alte bacterii lactozo-negative)
Germenii lactozo-pozitivi, in general inhibati, se pot dezvolta
sub forma unor colonii rosii, fara transparenta, cu sau fara
halou opalescent, uneori mucoide
Sau mediul AABTL
In mod obligatoriu pe mediile politrope TSI, MIU ( 2-4 colonii sunt
insamantate prin intepare cu ansa in profunzimea portiunii verticale a
mediului si in striuri pe suprafata inclinata)
Sau mediul SS agar

Mediile se incubeaza 18-24 ore la 37C.


Orice colonie care- pe mediul TSI: - produce H2S
- fermenteaza glucoza cu producere
de gaz (partea dreapta)
- nu produce acid din lactozazaharoza (partea inclinata)
- pe mediul MIU - ureazonegativa
- indolnegativa
- mobile
- pe mediul MILF : - lizindecarboxilaza pozitiva
- fenilalanindezaminaza negativa
=> este suspecta de Salmonella
Culturile care pe mediul TSI produc cantitati minime sau nu
produc H2S
- fermenteaza glucoza fara
producere de gaz
+ celelalte caractere de mai sus
=> sunt suspectate a fi Salmonella typhi si se procedeaza imediat
la identificarea serologica.
Diagnosticul serologic
Serotipia - o efectuam dupa schema Kauffmann-White
11

Se folosesc culturile de pe panta mediului TSI pentru aglutinari cu seruri anti


Salmonella polivalente si monovalente
In eventualitatea unei culturi abundente pe mediile de etalare se va
proceda la o aglutinare directa cu serul antisalmonella polivalent Vi si de
grup AO, BO, CO, DO, EO- pentru un diagnostic prezumtiv.
Culturile dezvoltate pe mediile politrope si pe mediile de repicare in
placi vor fi examinate, confruntandu-se cu aspectul culturii initiale. In cazul
in care ele prezinta spectrul biochimic caracteristic salmonellor (pe TSI,
MIU), sau culture suspecte pe repicari sa va trece la aglutinarea pe lama
cu serurile antisalmonella: serurile Poli O si Vi ca etapa screening; in caz
pozitiv se vor face aglutinari pe lama cu serurile O de grup (AO, BO, CO,
DO, EO) si apoi cu cele flagelare H de tip.
NOTA:
In eventualitatea in care tulpina- desi mobila-nu aglutineaza cu
serurile flagelare, se va da rezultatul de grup Salmonella (AO,
BO, CO, DO, EO)
Acelasi rezultat este recomandabil si in cazul in care tulpina nu
poate fi diagnosticata ca un anume serotip
Exceptie face Salmonella typhi, pentru care diagnosticul de
serotip trebuie sa fie realizat in prima etapa
In cazul unei aglutinari negative cu serul Poli O si Vi ( dar cu
spectru biochimic specific ptr. Salmonella) se vor efectua teste
biochimice suplimentare: cercetarea lizindecarboxilazei, testul
ONPG, retestarea serologica dupa termoinactivare.
Tulpina de Salmonella izolata se trimite la Institutul Cantacuzino
pentru identificare de serotip si lizotip.
OBS: Se inregistreaza in registrul pentru evidenta probelor de
bacteriologie totalitatea testelor de identificare efectuate si interpretarea
acestora cat si mediile de cultura folosite suplimentar fata de setul
standard.
Eliberarea rezultatului
Un rezultat negativ va fi eliberat la 24-48 ore de la primirea probei.
Un rezultat pozitiv va preciza taxonomia agentului patogen si va preciza
testarea pentru sensibilitatea la antibiotice si chimioterapice.

12

Coprocultura pentru germenii grupului Shigella


Probele recoltate se insamanteaza in mod obligatoriu:
Pe mediul ADCL ( sau Leifson) o placa pentru o proba
Sau pe mediul Istrate Meitert
Sau pe mediul Hektoen enteric
Sau mediul SS agar
Este indicata si insamantarea concomitenta directa pe aceste medii
de izolare
Concomitent se insamateaza pe aceleasi medii culturi Shigella ca
atare sau in suspensii de materii fecale, pentru controlul de calitate.
Dupa descarcare se disperseaza inoculul prin tehnica epuizarii
ansei bacteriologice, prin striuri apropiate pentru obtinerea de
colonii izolate
Incubarea
Placile se incubeaza 20 ore la 37C sau 48 ore in cazul in care coloniile nu
sunt bine dezvoltate.
Citire si interpretare
Dupa incubare se examineaza placile:
Pe mediul ADCL (sau Leifson) dupa incubare 24 ore la 37 C:
Coloniile de Shigella apar transparente, de culoare rozgalbui (ca si alte bacterii lactozo-negative)
Germenii lactozo-pozitivi, in general inhibati, se pot dezvolta
sub forma unor colonii rosii, fara transparenta, cu o zona de
opacifiere a mediului in jurul coloniei
Pe mediul cu bila uscata (Istrate Meitert) :
Coloniile de Shigella apar de culoare verde sau verdealbastruie
Germenii lactozo-pozitivi (E. coli) pot dezvolta colonii de culoare
galbena
Pe mediul Hektoen enteric:
Coloniile de Shigella apar de culoare albastra
13

Germenii lactozo-pozitivi, in general inhibati, se pot dezvolta

sub forma unor colonii rosii, cu o zona de virare in rosu a


mediului in jurul coloniei

Coloniile suspecte cu aspect similar celor de pe placile martor,


dezvoltate pe mediile de etalare directa sau dupa
imbogatire se repica in mod obligatoriu pe
urmatoarele medii:
Mediul Mac Conkey
Coloniile de Shigella apar semitransparente, necolorate (ca
si alte bacterii lactozo-negative)
Germenii lactozo-pozitivi, in general inhibati, se pot dezvolta
sub forma unor colonii rosii, fara transparenta, cu sau fara
halou opalescent, uneori mucoide
Sau mediul AABTL
In mod obligatoriu pe mediile politrope TSI, MIU si MILF ( 2-4
colonii sunt insamantate prin intepare cu ansa in profunzimea
portiunii verticale a mediului si in striuri pe suprafata inclinata)
Inocularea mediilor politrope trebuie facuta cu mare grija, pornind de
la colonii separate, fara produs de contaminare din apropierea
coloniei, deoarece acestea nu contin inhibitori pentru flora asociata.

Mediile se incubeaza 18-24 ore la 37C.

Orice cultura care pe- mediul TSI - nu produce H2S


-fermenteaza glucoza(partea
dreapta) fara producere de gaz
- nu produce acid din lactozazaharoza (partea inclinata)
- mediul MIU - ureazo-negativa
- imobila
- indol variabila
- mediul MILF - lizindecarboxilaza negativa
- fenilalanildezaminaza negativa
=> este suspecta de a fi Shigella si se aglutineaza cu serurile
antishigella existente in trusa standard.
14

Diagnosticul serologic
In eventualitatea unei culturi abundente si aproape monomorfe pe
mediile de etalare, se va putea executa pentru un diagnostic prezumtiv si
rapid, aglutinarea cu seruri antishigella.
Aglutinarea culturilor suspecte pe repicari se incepe cu antiserurile
corespunzatoare grupelor B si D, mai frecvent intalnite si in caz negativ se
fac aglutinari cu celelate seruri.
Nota:
In cazul in care cultura repicata prezinta caracterele biochimice
pe mediile politrope caracteristice Shigellelor si totusi aglutinarea
ramane negativa, se va proceda la reexaminarea aglutinabilitatii
dupa termoinactivare sau a culturii vii cu serul de tip Shigella
flexneri G ( uneori serul polivalent pentru. Shigella nu
aglutineaza Shigella flexneri G)
In cazul lipsei oricarei aglutinarii, in contrast cu spectrul
biochimic caracteristic Shigellelor, se vor efectua teste
biochimice suplimentare (inclusiv ONPG)
OBS: Se inregistreaza in registrul pentru evidenta probelor de
bacteriologie totalitatea testelor de identificare efectuate si interpretarea
acestora cat si mediile de cultura folosite suplimentar fata de setul
standard.
Eliberarea rezultatului
Un rezultat negativ va fi eliberat la 24-48 ore de la primirea probei.
Un rezultat pozitiv va preciza taxonomia agentului patogen si va preciza
testarea pentru sensibilitatea la antibiotice si chimioterapice.
Coprocultura pentru E. coli, serotipuri enteropatogene
Probele recoltate se insamanteaza in mod obligatoriu:

Pe mediul Mac Conkey


Sau pe mediul AABTL
Sau pe mediul Eozina albastru de metilen (Levin)

15

Este indicata si insamantarea concomitenta directa pe aceste medii


de izolare
Concomitent se insamateaza pe aceleasi medii culturi E. coli ca
atare sau in suspensii de materii fecale, pentru controlul de calitate.
Dupa descarcare se disperseaza inoculul prin tehnica epuizarii
ansei bacteriologice, prin striuri apropiate pentru obtinerea de
colonii izolate
Incubarea
Placile se incubeaza 20 ore la 37C sau 48 ore in cazul in care coloniile nu
sunt bine dezvoltate.
Citire si interpretare
Dupa incubare se examineaza placile:
Pe mediul Mac Conkey :
Coloniile lactozo-pozitive apar de culoare rosie cu sau fara
halou opalescent
Uneori pot fi mucoide
Coloniile lactozo-negative apar sub forma unor colonii
semitransparente si necolorate
Pe mediul Levine;
Coloniile lactozo-pozitive apar de culoare rosie cu sau fara
centru inchis
E. coli se dezvolta sub forma unor picaturi de fucsina
Se repica 5 10 colonii lactozo-pozitive pe aceleasi medii.
Orice cultura care pe- mediul TSI - nu produce H2S
-fermenteaza glucoza(partea
dreapta) cu producere de gaz
- produce acid din lactozazaharoza (partea inclinata)
- mediul MIU - ureazo-negativa
- mobila
- indol pozitiva
16

- mediul MILF - lizindecarboxilaza pozitiva


- fenilalanildezaminaza negativa
Diagnosticul serologic
Se procedeaza la aglutinarea pe lama cu ser polivalent anticolibacilar
In cazul unei aglutinari puternice si imediate, se vor executa aglutinari
pe lama cu seruri monovalente din setul standard.
Tulpinile E. coli serotipuri enteropatogene se testeaza pentru
sensibilitatea la antibiotice si chimioterapice.
OBS: Se inregistreaza in registrul pentru evidenta probelor de
bacteriologie totalitatea testelor de identificare efectuate si interpretarea
acestora cat si mediile de cultura folosite suplimentar fata de setul
standard.
Coprocultura pentru stafilococ coagulaza pozitiv
a. Principiu
-peste 96% din tulpinile de S. aureus coaguleaza plasma prin:
-activarea unui factor plasmatic similar trombinei,coagulaza libera
-actiunea directa asupra fibrinogenului ,coagulaza legata de peretele celular
-aderare stafilococilor care poseda coagulaza legata la macromoleculele de
fibrinogen are ca efect macroscopic aglutinarea suspensiei bacteriene
b.Indicatii
-precizarea prezentei stafilococului coagulazo-pozitiv in cazul de toxiinfectie
alimentara
c. Procedura
-se folosesc colonii izolate din cultura pura de 18-24 ore de pe geloza sange

17

-se urmareste aparitia autoaglutinarii prin emulsionarea a 1-2 colonii intr-o


picatura de ser fiziologic pana la obtinerea unei suspensii laptoase;daca nu
apare autoaglutinare in 10-20 secunde ,cultura va fi identificata prin aglutinare
-pe o lama se pun cateva picaturi de plasma si 5 colonii suspecte;se amesteca
cu grija si se observa coagularea plasmei

9. Aglutinarea pe lama cu seruri aglutinante pentru Salmonella,Shigella si EPEC


a. Principiu
antigenele somatice O,flagelareH sau de invelis ale bacteriilor reactioneaza
cu anticorpii omologi si formeaza agregate vizibile cu ochiul liber
b.Indicatii
completeaza identificarea biochimica prezumptiva a bacteriilor
se verifica absenta aglutinarii spontane a culturii de cercetat punand o
picatura de solutie salina fiziologica sterila pe o lama de microscop in care
se suspensioneaza cultura bacteriana luata cu ansa bacteriologica;dupa
omogenizare se fac miscari de inclinare si rotire a lamei care permit
agitarea picaturii timp de 3 minute;se examineaza pe fond intunecat si daca
apare reactia de aglutinare cultura e autoaglutinabila si nu poate fi
identificata prin reactie de aglutinare;
daca

nu

se

evidentiaza

aglutinarea

spontana

(picatura

ramane

oplalescenta si omogena)se continua aglutinarea cu serurile de diagnostic


corespunzatoare germenului care se diagnosticheaza

18

se suspensioneaza cultura de cercetat dupa twhnica descrisa mai sus


se examineaza picatura de amestec in care trebuie sa apara aglutinarea
c.Citire si interpretare
TEST POZITIV:aglutinare evidenta in 1-2 minute in picatura cu ser imun de
diagnostic in absenta aglutinarii in solutie salina fiziologica
TEST NEGATIV:absenta aglutinarii in ambele picaturi
7.5.4.2 Testul coagulazei
a. Principiu
-peste 96% din tulpinile se S. aureus coaguleaza plasma prin:
-activarea unui factor plasmatic similar trombinei,coagulaza libera
-actiunea directa asupra fibrinogenului ,coagulaza legata de peretele celular
-aderare stafilococilor care poseda coagulaza legata la macromoleculele de
fibrinogen are ca efect macroscopic aglutinarea suspensiei bacteriene
b.Indicatii
-precizarea prezentei stafilococului coagulazo-pozitiv in cazul de toxiinfectie
alimentara
c. Procedura
-se folosesc colonii izolate din cultura pura de 18-24 ore de pe geloza sange
-se urmareste aparitia autoaglutinarii prin emulsionarea a 1-2 colonii intr-o
picatura de ser fiziologic pana la obtinerea unei suspensii laptoase;daca nu
apare autoaglutinare in 10-20 secunde ,cultura va fi identificata prin aglutinare

19

-pe o lama se pun cateva picaturi de plasma si 5 colonii suspecte;se amesteca


cu grija si se observa coagularea plasmei

8. Erori de diagnostic
8.1 Surse de eroare
numarul mic de unitati infectante/g materii fecale si eliminarea sporadica la
cazurile de portaj
volum prea mic al recoltei
depasirea intervalului de timp dintre momentul recoltarii si insamantarea
prelevatului
lipsa controlului de calitate al mediilor utilizate
folosirea echipamentelor incorect monitorizate
8.2 Evitarea erorilor
folosirea unor proceduri de imbogatire a prelevatului si repetarea
examenului negativ
volumul prelevatului sa fie minim 3-5 cm3
prelevatele care nu se insamanteaza poe medii de izolare(imbogatire sau
selective) intr-un intervalde 2 ore trebuie supus unui proces de conservarer
(conservare prin refrigerare pentru cel mult 24 h la +4C).
monitorizarea si intretinerea corespunzatoare a echipamentelor utilizate
pentru incercare
controlul de calitate al mediilor folosite

20

9.Exprimarea rezultatelor
Descrierea softului de interpretare
-interpretarea rezultatelor analizelor microbiologice se face prin aprecierea
caracterelor culturilor obtinute si interpretarea testelor biochimice si a reactiilor de
aglutinare
Estimarea incertitudinii de masurare
-in microbiologie incertitudinea de masurare se determina ca:
repetabilitatea metodei,determinata pe esantioane alese de laborator
acuratetea metodei sau exactitatea ,determinata pentru acele metode
pentru care exista materiale de referinta
repetabilitatea:apropierea

acordului

dintre

rezultatele

masuratorilor

succesive ale aceleiasi probe,masuratori efectuate in aceleasi conditii de


masurare
reproductibilitatea:apropierea acordurilor dintre rezultatele masuratorilor
aceliuiasi produs,masurari obtinute in 2 sau mai multe laboratoare
-controlul mediului cu ajutorul tulpinilor de control se face la fiecare lot de mediu
turnat

9. Inregistrari
9.1 Inregistrari in foaia de lucru

21

numarul unic de inregistrare al pacientului (ID)


data prelevarii probei
analiza solicitata
9.2 Inregistrari in caietul de lucru
data insamantarii probelor
numarul unic de inregistrare al pacientului (ID)
analizele microbiologice solicitate
germenii testati si mediile pe care s-a facut prelevarea lor
teste biochimice efectuate
reactii de aglutinare efectuate
rezultatul analizei microbiologice
9.3 Raportul de analiza
inregistrarea rezultatului in buletinul de analiza

22