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A sntese qumica
do DNA
Um instrumento indispensvel
s manipulaes genticas
Introduo
Ii menos de 10 anos, a sntese qumica de DNA era
um domnio esotrico, apangio de alguns qumicos
especializados. Calculava-se, em 1975, que seriam necessrios 20 anos para sintetizar um gene de 100 nucleotdeos segundo um esquema optimizado por computador ( 1 ).
Actualmente possvel realizar este trabalho em poucas semanas: por exemplo ns sintetizmos recentemente um gene de 270 nucletidos em cerca de um ms
a partir de dinucletidos protegidos. Esta proeza tcnica ao alcance de um nmero crescente de laboratrios
s possvel graas ao desenvolvimento acelerado das
tcnicas de sntese qumica, catalisado pelo advento das
tcnicas da Engenharia Gentica. O alargamento contnuo do campo de aplicao dos fragmentos sintticos
de DNA, assim como o aspecto fundamental do estudo
estrutural de certas sequncias particulares, constituram estmulos poderosos para os qumicos orgnicos
cujos esforos conduziram ao ajustamento e ao aperfeioamento das tcnicas de sntese.
Apresentamos neste artigo um resumo geral da qumica
que est na base da sntese de DNA tal como ela praticada actualmente, e algumas das suas aplicaes.
Alfredo Cravador *
o
HO
NH,
HO
OH
Timidind
OH
Desoxicitidina
l/ N
HO
HO
NH
Desoxiadenosina
OH
Desoxiguanosina
As bases que possuem funes aminas primrias (a timidina no possui) tm que ser protegidas.
Esta proteco permanente visto que o centro aminado no est implicado nas reaces de extenso oligomrica. Portanto os grupos protectores devem ser estveis ao longo de todas as etapas de sntese. No entanto
eles devem poder ser retirados no fim da sntese em
condies que preservem a integridade da molcula fi-
* Investigador no Laboratrio de Gentica Aplicada. Dpartement de Biologie Molculaire. Universit Libre de Bruxelles
Blgica.
22
nal. Os grupos que, nas estratgias de sntese mais utilizadas, melhor satisfizeram estas condies, so o grupo benzolo para a desoxicitidina e a desoxiadenosina e
o grupo isobutanolo para a desoxiguanosina ( 2 ). A sua
introduo tem de ser selectiva a fim de no bloquear
os grupos hidroxlicos do ciclo desoxirribofuranosilo.
Estes grupo so objecto de uma proteco transitria
que pode ser especificamente removida aps acilao
dos grupos aminados ( 3 ) (Exemplo: esquema 2).
CH,
o
OCH,
H
H
N
CI
_L
o
Ossoriadenosina
Esquema 2
HO
NH2
NH2
Si O
C I S i (CH , ),
OH
Si
Desoxicitidina
HO
NH 2 OH dil
OH
O
Si-^
OCH,
CH,
ONT CI
O grupo 4,4 '-dimetoxitritilo pode ser quantitativa e rapidamente retirado em condies de baixa acidez (Ex.:
cido dicloroactico, brometo de zinco) sem ruptura ou
com ruptura insignificante da ligao glicosdica; esta
reaco conduz formao do catio dimetoxitritilo de
cer laranja cuja absorvncia pode ser medida espectrofotometricamente. Esta medida particularmente til
na sntese em fase slida pois ela a nica indicao
da eficcia das reaces de condensao durante a
construo da cadeia oligonucleotdica.
/3) A fosforilao em posio 3 ' dos nucleosdeos protegidos nas bases e no grupo hidroxlico em 5 ' pode
conduzir, segundo a estratgia escolhida, a um bloco
completamente protegido, ou a uma espcie fosforilada
activa capaz de reagir directamente com outro bloco
desoxinucleotdico desprotegido em posio 5 ' para
formar a ligao internucleotdica.
Numerosos agentes de fosforilao tm sido utilizados
em sntese de oligodesoxirribonucleotdeos, sobretudo
na metodologia do fosfatotrister (Esquema 4).
0.17 0
MT 0
^,Nt
.._
F.
q^a''''Y'ae
_.
'0T ! =m
se ptoteqlCs
Oimetur}tritllo
alquilo, alquilo aWatltuldo ...
2_atilarilo
ltlo.ri lo, atilo subst iculao
trlasolo, oalbvotrlarolocloro ...
]`i
23
DMTO
DMT
.
\ N
)4_P
I
mente por um lado a funo fosfato e por outro o grupo hidroxlico 5 ' das suas proteces temporrias. Por
exemplo, o grupo dimetoxitritilo retirado em condies cidas suaves e o grupo cianoetilo em condies
bsicas suaves.
3 Reaces de Condensao
A reaco de condensao necessita evidentemente da
formao de espcies activas capazes de reagir com
bons rendimentos sem formao de produtos secundrios.
A activao do fosfatodister frequentemente realizada pela aco conjugada de um cloreto de arilosulfonilo e de uma amina heterocclica, ou de uma sulfonamida preparada antecipadamente a partir deste tipo de
compostos ('D) (Esquema 7).
^
^^
OH
0- 13 -N
DMTO.
'N
NJ
Dp
e'
CI
1,4"t, ^
/y
PINTO
o-P
II
EI,N
M8NT
H 2O
P OCH,CH,CN
DMTO
o- P OCNplFN
DMTO
-ocN,CH,CN
0- P- H NEt,
o -P -oCH,CH,CN
II
CI
CI
DMTO
/7
DMTO
N N
\ll
Bp
H
O
CHP p 0
OR
CH,D - P -N-<
/I N
OCH,
DMTO
DMTO
O \ ap
.CI
mD
CI p
CH 2 O P N
CH2O-
O \^^
OCH,
OR
MAT.
CH,
importante sublinhar que o sucesso da sntese qumica de DNA se baseia sobretudo na preparao destes
blocos de base, isto , na escolha dos diferentes grupos
protectores, no rendimento das diferentes reaces e na
pureza dos desoxinucletidos completamente protegidos.
2 Desproteco selectiva
Para poder condensar dois desoxinucletidos pelo mtodo do fosfato trister, necessrio libertar separada-
24
_II \,-
DOT
Bp
Bp
Bp
Bp
Esquema 9
lo \
II
OCE
C1Ph
C1Ph
DMT
oce
C1Ph
C1Ph
1. TCA
12. Sil ic a
Et 3 N
N
1. TCA 1 Et 3
2. Silica
Bp
P -OCE
ED
O\ D
CIPh
Bp
Bp
op
Bp
Bp
0I
CIPh
I.MSNT
C1Ph
2.Silica
C1Ph
C1Ph
CLPh C1Ph
1' MSNT
2. Silica
1
C1Ph
Bp
Bp
o
o
O
tl
II p " II
F NN -1- OCE DM^
1\ I
O
CIPh
O
C1Ph
O
u
II
II
-
C1Ph
o
P
\^ ' \
C1Ph
Bp
Bp
Bp
Bp
C1Ph
tlprsteao
OCE
repatitao
C1Ph
C1Ph
\ n\"
I 1. TCA
2. Silica
Et 3 N I
21 Wnaanaepeo
^-
MSNT
Silica
l31 omiaagaol
-O-C
m r
O
- (C
H,j, C i/ H-O
je)
O,rt aLetomitritlb
c(toaina o u tlmntne ou guanlnaprotegida ou timtna
Bp
Bp
Bp
p
DMT\
C1Ph
ON
C1Ph
1
O
C1Ph
Bp
C1Ph
Bp
O
II
P
I\
1
II
Bp
Bp
op
II
P
I \^
1\
0
C1Ph
C1Ph
C1Ph
II
_P
I
OCO
C1Ph
DMTO
DMTO
e
P H,NC
D C
OH
CH,
O
P polamero anaulOVel
pm (mmrm 1clEUel
v
25
ttico marcado numa extremidade, obtidos por digesto parcial com uma exonuclease ( 15 ). Este mtodo restringe-se a fragmentos de comprimento inferior a 20
nucleotidos.
II O campo das aplicaes
As aplicaes dos oligodesoxirribonucletidos de sequncia definida cobrem quase todos os aspectos da investigao que implicam a recombinao de DNA tanto no que diz respeito construo, identificao e
caracterizao de clones bacterianos particulares, como
manipulao do DNA clonado com o fim de modificar a sua estrutura.
Nos campos da determinao de sequncias de DNA,
do estudo das interreaces protena-DNA ou da anlise estrutural do DNA, os oligodesoxirribonucletidos
sintticos tm-se revelado uma arma extremamente til.
A coordenao das competncias e a conjugao dos
esforos conduziram no nosso laboratrio a alguns sucessos no domnio da Engenharia Gentica aplicada
medicina.
A sntese qumica de DNA de sequncia definida possibilitou a varredura (screening) de bancos de clones e o
isolamento de estirpes bacterianas como a alfa-!-antitripsina, a antitrombina III e a uroquinase ( 16 ) ( 17)
( 18 ) e a sntese total da sequncia de DNA que codifica
para a somatocrinina humana cuja introduo num vetor plasmdico ( 19 ) possibilitou a expresso deste factor
hormonal na bactria ( 2 ). Estes exemplos ilustram, de
maneira no exaustiva a importncia da qumica de
sntese dos cidos nucleicos em qualquer programa de
engenharia gentica: podemos prever, sem qualquer
dvida, que esta importncia continuar a aumentar
intensamente no futuro.
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PRODUTOS E EQUIPAMENTOS PARA A INDSTRIA E LABORATRIOS LDA