Electroforesis Capilar

La electroforesis es un mtodo de separacin especies

elctricamente cargadas en solucin, bajo la influencia de un
campo
p elctrico.
Electroforesis

Electroforesis Capilar

Caractersticas de la Electroforesis Capilar:

Es una p
poderosa tcnica p
para la separacin
eficiente de
p
pequeas y grandes molculas
Tiempo rpido de anlisis
Utiliza pequeas cantidades de muestra
Bajo Costo.

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La Electroforesis Capilar (E.C.)

(E C ) incluye una familia de tcnicas que
involucran una gradiente diferencial o de equilibrio, que estn
basadas principalmente en los siguientes modos:
Electroforesis Capilar de Zona
Isotacoforesis Capilar
Enfoque Isolctrico Capilar
Electroforesis capilar en gel (CGE)
Cromatografa electrocintica capilar micelar (MEKC)
Todos estos sistemas pueden ser ejecutados en el mismo
instrumento de Electroforesis Capilar

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Electroforesis Capilar
p
de Zona
Utiliza una solucin buffer (electrolito base) el cual conduce la
corriente elctrica y provee la capacidad tamponante. La muestra
(mezcla de aniones, cationes y especies neutras) es introducida
en uno de los extremos del tubo capilar, formando en un principio
una zona aguda, bajo la aplicacin de un campo elctrico las
especies inicas

d l electrolito
del
l
l
y de
d la
l muestra migran en forma
f
independiente con una velocidad especfica, se separan en zonas,
si existen diferencias en sus movilidades.
Isotacoforesis capilar (CITP)
Utiliza dos buffer uno de entrada o frontal (movilidad ms alta) y
otro de salida o terminal (movilidad ms baja), la zona de la
muestra se encuentra entre estos dos buffers similar a un
sandwich.
sandwich
En la separacin se genera una gradiente de potencial.

Enfoque isolctrico Capilar o isoelectroenfoque (CIEF)

Est limitada a la separacin de compuestos anfotricos. En cada
extremo se ponen reservorios con cido fosfrico e hidrxido de
sodio respectivamente.
La separacin se lleva a cabo en una gradiente de pH
Electroforesis capilar en gel (CGE)
La CGE se lleva a cabo en una matriz formada por un polmero

de
acrilamida (poliacrilamida), que deja una serie de poros en los que
se aloja el tampn y en los que se lleva a cabo la separacin.
Cromatografa electrocintica capilar micelar (MEKC)
Este mtodo,
d
que combina
b
l cromatografa
la
f y la
l electroforesis
l
f
capilar, permite la separacin de molculas no cargadas. Es
necesario aadir un elemento tensioactivo (dodecil sulfato sdico,
SDS) en concentraciones
t
i
l suficientemente
lo
fi i t
t grandes
d
como para
que forme micelas.

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Partes principales del Sistema de Electroforesis

Capilar Depsitos para el buffer en el ctodo y en el nodo
Electrodos Sistema de inyeccin de la muestra Detector Fuente
de poder

El tubo capilar se llena con el buffer, se aplica un campo elctrico

(voltaje hasta 30 kV), la muestra es inyectada por reemplazo de

uno de los depsitos del buffer por el vial de la muestra, se
i t d
introduce
un volumen
l
d fi id de
definido
d sta.
t El detector
d t t es ubicado
bi d en
el sentido contrario al sitio de inyeccin.
La muestra es inyectada en el nodo y el flujo electrosmtico
(FE) es dirigido hacia el ctodo
ctodo..
Los componentes de la muestra migran con velocidades distintas
de acuerdo a su relacin carga/masa
Los componentes son llevados al sistema de deteccin por el FE
que es ms alto que la velocidad de los iones.
iones.

 Si la electroforesis es efectuada en ausencia del FE, la inyeccin

debe ser efectuada en el electrodo con el mismo signo que la
especie a separar (cambio de polaridad)
La mayora de los instrumentos usan un sistema de absorbancia
UV--Vis o fluorescencia.
UV
La respuesta del detector es registradaregistrada- Electroferograma
Un
U computador
t d conectado
t d all d
detector
t t permite
it la
l adquisicin
d i i i d
de
datos y su interpretacin.

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Instrumentacin
Inyeccin de la muestra:
hidrosttica electromigracin - por presin
Deteccin
Los requerimientos ms importantes para el diseo del detector son:
-Pequeo volumen en la celda de deteccin
-Pequea contribucin del ancho de peak
-Alta sensibilidad
-Gran rango dinmico

-Respuesta rpida
-Resistencia contra cambios de temperatura
-Selectividad
S l ti id d
-Fiable y de fcil uso

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Evaluacin de la ejecucin del detector

Para comparar el sistema de deteccin con respecto a su
ejecucin o para evaluar el mejor sistema de deteccin para una
separacin especfica, se usan los siguientes criterios:
-

sensibilidad (factor de respuesta)

lmite de deteccin (3 veces el ruido de la lnea base)
ruido (alta, baja y muy baja frecuencia)
rango lineal
l
l o rango d
dinmico

tiempo de respuesta

Modos de deteccin
UV/Vis -Fluorescencia Conductividad Electroqumico
espectrometra de masa
Lmparas UV/Vis: Mercurio(185,254, 280, 313, 365 nm),Se
cambia a travs de filtros y ventanas.
ventanas
Cadmio(229nm),Cinc( 214 nm), As(200nm)
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Deteccin Indirecta

La deteccin indirecta es utilizada para iones pequeos, por su baja

absorbilidad no pueden ser detectados por deteccin de absorbancia
directa.
El lmite de deteccin no es ms alto que dos rdenes de magnitud.
Es ms inestable que la deteccin directa. Puede observarse drifteo
de la lnea base, debido a la baja concentracin del electrolito.

Reglas para una buena ejecucin cuando se utiliza deteccin

indirecta
Buscar una absorbancia del coin visualizante cercana al lmite ms
alto de linealidad del detector.
La movilidad del coin debera ser cercana a la movilidad del par de
iones que son ms difcil de separar en la muestra.

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- Para minimizar el calor de Joule seleccionar un contrain de baja

movilidad
- El coin debe tener un amplio rango de absorbancia de manera de
elegir una longitud de onda donde todos los componentes de la
muestra
t posean muy baja
b j absortividad.
b
ti id d

Sistemas electrolitos deteccin indirecta

- Cromato ___ Aniones de alta movilidad
- Phtalato ____ aniones menos mviles
- Benzoato
- P-hidroxibenzoato
Columna Capilar
Composicin
Dimensiones
Acondicionamiento
Almacenamiento
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Sistema de Electroforesis Capilar en

condiciones normales

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Instrumentacin

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Electroforesis
La separacin por electroforesis est basada en diferencias en la
velocidad del soluto en un campo elctrico.
La velocidad de un in est dada por:
v = e.E

(1)

Donde
D
d v= velocidad
l id d del
d l ion
i
e = movilidad electrofortica
E= Campo elctrico aplicado
El campo elctrico es funcin del voltaje aplicado y la longitud del
capilar ( en volts/cm).
La movilidad es determinada por la fuerza elctrica que experimenta la
molcula balanceada por su arrastre friccional a travs del medio

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e Fuerza elctrica (FE)

(FE)
Fuerza Friccional (FF)

(2)

La fuerza elctrica puede estar dada

dada por:
FE = q . E (3 )

FF = - 6 r v

q : carga del in : viscosidad de la solucin r: radio del in

v: velocidad del in
Durante la electroforesis se presenta un estado de equilibrio
entre las fuerzas elctrica y friccional.
friccional.
Las fuerzas son iguales pero opuestas
opuestas::
q . E = 6 r v (5)
Resolviendo
R
l i d para lla velocidad
l id d y sustituyendo
i
d lla ecuacin
i (5)
en la ecuacin v= e.E (1), tenemos la ecuacin que describe
la movilidad.
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e= q //6 r ((6))

Alta movilidad: Especies pequeas y altamente cargadas

Baja movilidad: Especies grandes y mnimamente cargadas
e es una constate fsica y puede encontrarse en tablas.
Lo real es la movilidad efectiva y sta se calcula
experimentalmente ya que es altamente dependiente del pH (pK
del soluto) y la composicin del buffer de corrida.

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Flujo electrosmtico (EOF)

Es una consecuencia de la carga

g superficial
p
en el interior de
la pared del capilar.

Controla la cantidad de tiempo que el soluto permanece en el

capilar (flujo-movilidad).

Longitud de capilar

- Capilar de slice fundido: Exceso de ionizacin adsorcin

en la superficie del capilar
- EOF es controlado por los grupos silanoles (Si-OH) que
pueden existir en forma aninica (SiO-)

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El EOF es importante sobre pH 4.

Contraiones (cationes) ubicados cerca de la superficie para
mantener el balance de carga, forma la doble capa y crea una
diferencia de potencial cerca de la pared Potencial ZLa magnitud del EOF puede ser expresada en trminos de
velocidad o movilidad por:
VEOF = ( / ) E (7)
EOF = ( / )
(8)
donde :
VEOF= velocidad
EOF = movilidad del EOF
= potencial Zeta = constante dielctrica.

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CE : Flujo de perfil plano ( dispersin)

Cromatografa : Flujo laminar o parablico
Control del EOF
Alto pH : El EOF puede ser muy rpido, puede causar la elusin del
analito antes que la separacin suceda.
B j pH:
Bajo
H La
L pared
d cargada
d puede
d provocar adsorcin
d
i de
d los
l solutos
l t
catinicos.
El control del EOF se realiza por la alteracin de la carga superficial del
capilar o de la viscosidad del buffer.
buffer
Campo elctrico
pH del buffer
Fuerza inica o concentracin del buffer
Temperatura
Modificaciones orgnicas
Surfactantes
Polmeros hidroflicos neutros
Recubrimiento covalente
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13/12/2011

20

13/12/2011

21

13/12/2011

22

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23

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Parmetros

Analticos

La CZE es la forma ms simple.

Ti
Tiempo
de
d migracin
i
i
Movilidad
Dispersin de la zona del soluto
Eficiencia
Resolucin
Movilidad y tiempo de migracin:
El tiempo de migracin es el tiempo requerido para que el soluto
migre al punto de deteccin y est dado por el cuociente de la
distancia de migracin y la velocidad.
velocidad

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Movilidad aparente del analito :

a = l/ t E = l L/tV (9)
Donde a = e + EOF
V = voltaje aplicado
l = largo efectivo del capilar ( al detector)
L = largo total del capilar
t = tiempo de migracin
E= Campo elctrico
En p
presencia de EOF,, la medida de la movilidad se llama movilidad
aparente (a). La e puede ser obtenida de la a. La movilidad del
EOF se puede medir en forma independiente, a travs del uso de un
marcador neutro que se mueve a una velocidad igual al EOF.
Marcadores: acetona, dimethyl sulfoxide (DMSO) etc

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analito

TM

a (cm2/Vs)

e (cm2/Vs)

catin

38 4
38,4

3 05* 10-3
3,05

7 40*10
7,40
10-4

neutro

50,7

2,31* 10-3

2,31* 10-3

anin

93,1

1,26* 10-3

-1,05*10-3

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a = l/ t E = l L/tV (9)
Donde
a =
e + EOF

V = voltaje aplicado
l = largo efectivo del capilar ( al detector)
L = largo total del capilar
t = tiempo de migracin
E= Campo elctrico
Catin a =lL/Vt=(50*58,5)/(25.000*38,4) = 3,05 * 10-3
N t
Neutro
EOF =(50*58,5)/(25.000*50,7)
(50*58 5)/(25 000*50 7) = 2,31*
2 31* 10-33
e = a - EOF = (3,05*10-3)(2,31* 10-3) = 7,40*10-4

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Fuentes de amplitud de la zona:

a) Difusin longitudinal
-Define el lmite fundamental de la eficiencia
b) Calor de Joule
-Permite una gradiente de temperatura y el flujo laminar
c) Longitud de la inyeccin
- Debera ser menor que la longitud de la zona controlada por
la difusin
d) Adsorcin de la muestra
- Interaccin
del
d l analito
l
con las
l paredes
d d
dell capilar
l

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a)) Electrodispersin
- Conductividades desiguales de la muestra y el buffer
- Solutos con conductividades m
ms altas que
q el buffer
ff
- Soluto con ms baja conductividad que el buffer

b)) Desnivel de los reservorios del buffer

- Genera flujos laminares

c) Tamao de la celda del detector

- Debera ser pequeo relativo al ancho de peak

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+
+
+

+++ B

++
++
++

+++

+
+

Electrodispersin:
Electrodispersin:
- Formas del peak sesgadas
- Alta conductividad ( desenfoque) o baja conductividad de la muestra
( f
(enfoque)
)
- Estados isotacoforticos temporales, debido al exceso
de un in determinado.
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Siistema Electrolito
Requerimientos bsicos:
- El buffer no debe tener efecto negativo
g
en la separacin
p
- Alta capacidad buffer y amplio rango de pH
- Pequea variacin del buffer con la temperatura
- En el caso de UV/Vis el buffer debe mostrar una baja
absorbancia a la longitud de inters
- La movilidad del in del buffer debera ser similar al analito para
minimizar la dispersin electrofortica.
- La movilidad electrofortica del contra-in debera ser tan baja
como sea posible para minimizar la generacin de calor y utilizar altos
voltajes.

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Variables que afectan la eficiencia y selectividad que dependen de las

siguientes
i i t propiedades
i d d d
dell b
buffer:
ff
* pH
* fuerza inica
(la movilidad puede duplicarse si la fuerza inica
es incrementada 4 veces)
puede provocar:
aumento de la temperatura, cambios en la viscosidad
* Composicin del buffer
aditivos: agentes complejantes, solventes orgnicos,
surfactantes

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Buffers

pK

Rango

CH3CO2H/CH3CO2-

4,76

3,6-5,8

H3PO4/ H2PO4-

2,12

1,5-3

H2PO4-/HPO42-

7,21

5-8

H2PO4- / PO43-

12,67

11,5 - 13

cido ctrico/citrato

3,13/5,96/6,38

2-6

Borato HCl
Borato-HCl

9 14 (12
9,14
(12,73/13,8)
73/13 8)

8 0 9 1
8,0-9,1

Borato-NaOH

9,14 (12,73/13,8)

9,2-11

CHES

10,4

9,4-11,4

TRIS

7,0-9,0

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Anlisis Qumico
- Cul es la composicin de la muestra?
- Cul es la concentracin de los componentes de una muestra?
Comparacin con una solucin patrn identificacin cuantificacin

Fortificar la muestra
Contrastar con otra tcnica

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tener presente los siguientes parmetros y procedimiento

pH del buffer
Fuerza inica
P t t
Pre-tratamiento
i t d
dell capilar
il
Temperatura
Anlisis cuantitativo:
rea- altura
La Cx puede ser calculada por:
estndar externo
estndar interno
Validacin: p
precisin,, exactitud,, linealidad,, lmite de deteccin,,
lmite de cuantificacin, selectividad

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CE-MS aumenta la utilidad de la separacin a travs de CE. El

complemento con un espectrmetro de masa (MS) permite tener
una informacin

segura del peso molecular de un analito y

tambin provee la informacin de su estructura que ayudan a la

identificacin de compuestos. Sin embargo todava la interfase de
las dos tcnicas no es tan simple.
Como la EC se realiza a un alto voltaje hay todava muchos
aspectos que mejorar para disponer de una corriente estable para
ambos, la separacin por CE y la ionizacin de MS.
MS Otro factor es el
fl j en CE que no es suficientemente
flujo
fi i t
t tan
t
alto
lt para mantener
t
estable la ionizacin dentro de la fuente del espectrmetro de
masa.

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Entonces se necesita un flujo de un lquido extra que debe ser

agregado al sistema de CE para obtener iones de los analitos en
fase gaseosa.
Por tanto la interfase es crtica para obtener resultados
eficientes en la separacin a travs de CE
CE--MS con una interfase
comn..
comn

Figure 35: CE-MS sprayer

CE MS sprayer (image
CE-MS
(i
courtesy
t
off Agilent
A il
T h l i )
Technologies)
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APLICACIONES
Separaciones de iones pequeos (inorgnicos y orgnicos) de alta
y moderada movilidad
ANIONES
Eliminacin o inversin del FEO por recubrimiento de la pared del
capilar con surfactantes catinicos
Anlisis bajo polaridad reversa de los electrodos, con el nodo como
el lugar de la deteccin
Hidrxido de dodecildodecil-trimetilamonio; bromuro o hidrxido de
trimetilamonio
(TTAB o TTATTA-OH), bromuro de cetilcetil-trimetilamonio (CTAB), Bromuro o
hidrxido de hexametonium, dietilentriamina.

Ejemplo 1:
S2O32-, Cl-, I-, SO42-, NO2, ClO3-, CN-,F-,NO3C il
Capilar,
70 cm (Ld
(Ld=62)x75m
62) 75
, mM TTAB
electrolito: 5 mM cromato 0,5
I. Hidrodinmica
V= - 20 kV
254 nm 4 minutos

CATIONES

Metales alcalinos y alcalinotrreos metales de transicin

Se utilizan agentes complejantes dbiles como:
cido - hidroxihidroxi-isobutrico (HIBA) + NICENICE-pak.
Separacin de amonio: Utilizacin de ter corona como: 1818-crown
crown--6,
se incorpora
p
al buffer solo o en combinacin con un cido orgnico.
g
Metales de transicin:
Quelantes: EDTA, DTPA, NTA....
Deteccin: UV indirecta

Ejemplo 2
Separacin
de:
K+,Ba2+,Sr2+,Ca2+,Na+, Mg2+,Mn2+,Cd2+,Fe2+,Co2+,Pb2+, Ni2+, Li+, Zn2+
and
d Cu
C 2+
Capilar 60 cmx 75 m
Electrolito:
- creatinina 5 mM pH 4,4 con CH3COOH- cido - hidroxi
hidroxi--isobutrico
(HIBA) 6,5 mM
Inyeccin hidrosttica 214 (185)nm
8 minutos
La adicin de etilenglicol o metanol mejora el anlisis.

SULFONATOS Y ALQUILSULFONATOS
Deteccin UV indirecta y polaridad reversa usando electrolitos de baja
movilidad.
Ejemplo
j
p 3.
C1--C7 alquilsulfonatos
C1
Capilar 60 cm x 75 m
10 mM benzoato, 0,5 mM NICE
NICE--pak OFM Anion BT, pH 6,0
Inyeccin Hidrottica
V= 20 kV a 254 nm tiempo de corrida = 5,5 min.

ESPECIES ORGANOMETLICAS
Derivatizacin precapilar Deteccin directa deteccin indirecta
Eliminacin del FEO por recubrimiento de poliacrilamida.
DROGAS Y PRODUCTOS NATURALES
Antibiticos - analgsicos esteroides flavonoides vitaminas
Ejemplo 4 .
8 penicilinas
(amoxicillin, ampicillin, 6
6--aminopenicillanic acid, oxacillin,
clocicillin,ticarcillin,nafcillin,
,
,
, dicloxicillin))
Capilar 60x 75 m
Electrolito: NaH2PO4 a pH 9 ajustado con Na2B4O7 + SDS (sulfato
dodecil sdico)
Toma de muestra: Hidrosttica
V: 18 kV ;
L.onda: 214 nm
tiempo = 14 minutos

Ejemplo 5 Enalapril
Capilar de 57(LD=50)
57(LD 50) cm x 75 m
electrolito: 80 mM Na2B4O7 pH 8,5 + 100 mM SDS
V= 16 kV LO=254 nm Tiempo= 4 minutos
Ejemplo 6 Vitamina B6 y sus metabolitos
Capilar de 100 cm x 75 m
electrolito: 6 mM Na2B4O7 pH 8,5 + 50 mM SDS
Inyeccin hidrosttica V= 30 kV 200 nm 4 minutos
COMPUESTOS NEUTROS
Hidrocarburos alifticos o aromticos no pueden ser separados
electroforticamente
( Usar
U
MEKC)

Herbicidas
Ejemplo 7 Atrazina y simazina
Capilar
C
il d
de 50 cm x 75 m 10 mM
M NaH
N H2PO4 pH
H 8,5
8 5 + 25 mM
M SDS
pH 8 Inyeccin hidrosttica V= 10 kV 225 nm
10 minutos
AMINOCIDOS Y PROTENAS
Derivatizacin
Ejemplo 8
8. Aminocido 23PTH
Capilar de 50(LD=30) cm x 50 m
50 mM Na2B4O7 + NaH2PO4 -pH 9,0 + 100mM SDS
4,3 mM urea
Inyeccin hidrosttica
V= 10,5 kV
Long.
g Onda 210 nm,, corrida 30 minutos

Ejemplo
j
p 8 -7p
protenas
Capilar = 100cm x 50 m
electrolito 50 mM Na2B4O7 pH 9,5
V
V 22 kV LO=
LO 200 nm Tiempo=14
Ti
14 min
i
Despus de cada corrida el capilar es lavado con NaOH 1 M y luego
con el buffer
NUCLETIDOS, OLIGONUCLETIDOS Y CIDOS NUCLICOS
Ej
Ejemplo
l 9 - Oligodeoxythymidylic
Oli d
th
id li acids
id pd(T)
d(T)12-30
Capilar 40 (Ld=20) x 50 m
electrolito=Gel 75% en TRIS 50mM +50 mM cido brico + 7 mM urea
inyeccin electrocintica 1s,
4 kV; 260 nm 12 min