Introducere

Organismul viu se caracterizeaz printr-un dinamism continuu condiionat de

interaciunea unui ansamblu de reacii biochimice de degradare i sintez care determin
metabolismul. Organismul viu are capacitatea de a asigura desfurarea coordonat i autoreglat
a acestui ansamblu complex de reacii care se petrec cu viteze mari la temperatura mediului
ambiant.Virtual, toate aceste transformri sunt mediate de enzime, proteine specializate care
catalizeaz reaciile metabolice. 1
Sintetizate de ctre celule, enzimele sunt biocatalizatori care condiioneaz desfurarea,
coordonarea i autoreglarea ansamblului de reacii chimice, termodinamic posibile, specifice
materiei vii. Procesele enzimatice constituie o necesitate indispensabil a existen ei i
funcionrii organismului viu, fiind compatibile cu procesele biochimice eseniale pentru
meninerea i manifestarea funciilor celulare.2
Una dintre proprietile cele mai remarcabile ale enzimelor este specificitatea lor de
aciune, conform creia numai unele sunbstane sunt atacate, avnd loc doar un singur tip de
reacie, fr reacii i produi secundari. Dac nu ar exista specificitatea enzimelor, celulele ar fi
rapid covrite de reacii i produi secundari.3
O alt trstur remarcabil este puterea lor catalitic enorm. Dei sunt proteine i deci
molecule relativ fragile, enzimele i exercit extraordinarul efect catalitic n soluii apoase, la
pH-ul biologic i temperatur moderat, n contrast evident cu condiiile extreme, necesare
adesea accelerrii reaciilor chimice n laborator.4

11 Ionescu E., erban, M., Biochimie animal- Organizare molecular i macromolecular, Ed. Fundatiei Romnia de mine,
Bucureti 2001 pag. 136

2 Idem, pag 136

3 Lehninger,A.L., Biochimie vol 1, , Ed. Tehnica Bucureti 1987 pag 209
4 Idem, pag 209

~1~

Enzimele sunt biomolecule care n cantiti extrem de mici mresc i controleaz viteza
reaciilor biochimice, nu modific echilibrul de reacie i nu se transform n cursul acestor
reacii.
Studiul structurii chimice a enzimelor a fost posibil abia dup elaborarea metodelor de
izolare i purificare a proteinelor n general i a enzimelor n special, din sursele biologice.5
Potrivit prevederilor Comisiei pentru Enzime, biocatalizatorii sunt clasificai n ase
clase, fiecare avnd n comun tipul de reacie catalizat.La gruparea enzimelor nu s-a luat n
considerare structura proteic de aciune. Cele ase clase sunt:

Oxidoreductaze;
Transferaze;
Hidrolaze;
Liaze;
Izomeraze:
Ligaze.6
Comisia de enzime a IUBMV stipuleaz acordarea unui cod fiecrei enzime. Acesta este

alctuit din prefixul EC urmat de patru numere despr ite ntre ele prin punct. Primul numr
reprezint clasa de enzime i d informaii referitoare la tipul de reacie pe care o catalizeaz. Al
doilea numar reprezint subclasa i precizeaz donorul, gruparea sau legtura asupra creia
acioneaz enzima. Cel de al treilea numr reprezint sub-subclasa ce furnizeaz detalii
referitoare la informaiile transmise prin clas i subclas, cum ar fi tipul acceptorului, pozi ia
legturii. Ultimul numr reprezint ordinea din sub-subclas.7

5 Cojocaru, D.C.,Ciornea, E.,Olteanu, Z., Opric, L.,Cojocaru, S.I., Enzimologie general, Ed. Tehnopress Ia i-2007 pag 6
6 Israel-Roming, F. Noiuni fundamentale de enzimologie, Ed ARS DOCENDI Bucure ti 2014 pag11
7 Idem; pag. 12

~2~

Capitolul 1. Caracteristici generale ale ficinei

~3~

Fig. 1
Aceast enzim proteolitic a fost extrasa din latexul de Ficus glabrata, F. carica var.
Calimyrna, F. carica var. Kadota din care au fost extrase mai multe fracii active, care variaz n
funcie de specie i de varietatea acesteia sau de procesele de autoliz ale enzimei.9

8https://www.google.ro/search?
newwindow=1&sa=G&tbs=simg:CAESxQEawgELEKjU2AQaAggIDAsQsIynCBpgCl4IA
xIouRS4FKcK_1Am6FLwJvQnLCa0KqAqaNZQpyDeTKfAhkSmbNcY9nymtNBowGsHPQ
0V1N4-rme-o8V5MZvUodemaq_1Hb3nBnWBmcTCI1vjkL2WYe5fyt8hNI6sC0DAsQjq7CBoKCggIARIE8HCFiwwLEJ3twQkaMgoGCgRmb250CgkKB3Byb2R1Y3QKBQoDYXJ0Cg
YKBGxpbmUKDgoMaWxsdXN0cmF0aW9uDA&q=enzima+proteasas&tbm=isch&ei=
1DNiVcmQDYmPsgHr6YHIDg&ved=0CDYQsw4&biw=1366&bih=643#imgrc=kTnTb1oNWLmfM%253A%3BzN3jSj-GwBLRAM%3Bhttp%253A%252F
%252F4.bp.blogspot.com%252F_hRjp-HwQ9MA%252FR9hEJV2M6KI
%252FAAAAAAAAAAc%252FrS6Vt9CL0Vk%252Fs1600-h%252Fglucosa
%252Bisomerasa.bmp%3Bhttp%253A%252F%252Fexperimentciencia.blogspot.com
%252F%3B384%3B384
9 I. F. Dumitru, Dana Iordchescu, Introducere n enzimologie, Ed Medical Bucureti
1981; pag 576

~4~

Ficina este o tiol-enzim, inactiv la agenii oxidani sau care blocheaz gruprile SH (Netilmaleimida, cloracetamida, iodacetamida, sruri de mercur), cu o mas molecular de 25 000
26 000, alctuit dintr-o singur caten polipeptidic. n molecula de ficin au fost identificate
trei puni disulfurice i dou grupri sulfhidril, dintre care numai una se gsete n centrul activ al
enzimei, cea de a doua grupare SH neparticipnd efectiv la procesul catalizei enzimatice.
Ficina are o larg specificitate de substrat, hidroliznd numeroase proteine n care
scindeaz hidrolitic legturile peptidice dintre resturile de Tyr i Phe la valori de pH cuprinse
ntre 6,5 i 9,5. Aceast enzim prezint i proprietatea de a coagula laptele. Ficina este rezistent
fa de aciunea denaturat a ureei, ns n mediu uor acid este inactiv ireversibil.10
Ficina este o proteinaz foarte activ,cristalizat din seva smochinilor,ce catalizeaz
hidroliza multor proteine la pH acid (4,1),coagularea laptelui i digestia unor viermi vii,ce sunt
parazii ai tractului intestinal,avand aadar multe utilizri n medicin.Fiind folosita pentru
digestia proteinelor,ficina are un rol major in a spori aglutinarea celulelor ro ii din snge de
IgG( Imunoglobulina-glicoprotein cu funcie de anticorp).De asemenea ficina ne indic si
activitatea esterazei.Se ntampl adesea atunci cnd mncm direct piele sau pulp alb de
smochin s avem o senzaie de arsur sau mncrime.Acest senzaie se datoreaz prezenei
ficinei n seva fructelor,n special dac acestea sunt necoapte.

11

1.1 Denumire sistemic

Ficina are ca denumire sistemic: (-) - 5,7-dihidroxi-8- (1-metil-2-pirolidinil) flavone.12

1.2 Formula molecular

Ficina are urmtoarea formul molecular: C20H19NO4 13

10 I. F. Dumitru, Dana Iordchescu, Introducere n enzimologie, Ed Medical Bucureti 1981; pag 576
11 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/44881
12 http://es.wikipedia.org/wiki/Ficina_(alcaloide)
13 Idem

~5~

Fig. 2 Structura ficinei14

1.3 Codul
Codul ficinei este: E.C.3.4.22.3

15

E.C.3 clasa Hidrolaze;

catalizeaz scindarea hidrolitic a diferitelor legturi sau grupri;
E.C.3.4 subclasa din care face parte enzima;
scindeaz legaturi peptidice;
E.C.3.4.22 subsubclasa;
E.C.3.4.22.3 numrul pe care l ocup n subsubclas ( a treia enzim).16

1.4 Proprieti fizice

Masa molecular 337 374 g / mol
Punct de topire 235 C (508 K)17

14https://www.google.ro/search?
q=enzima+ficin&newwindow=1&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=9e1gVamED6S
E7gaj4HICg&ved=0CAcQ_AUoAQ&biw=1366&bih=643#imgrc=RJW5up83ypKpiM
%253A%3B4czsd30GpcHUfM%3Bhttp%253A%252F%252Fupload.wikimedia.org
%252Fwikipedia%252Fcommons%252F2%252F24%252FFICINA.png%3Bhttp%253A
%252F%252Fes.wikipedia.org%252Fwiki%252FFicina_(alcaloide)%3B229%3B179
15 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02198761
16 http://www.creeaza.com/referate/biologie/Clasificarea-enzimelor929.php
17 http://es.wikipedia.org/wiki/Ficina_(alcaloide)

~6~

Capitolul 2. Metode de determinare a activitii enzimatice

2.1. Determinarea activitii enzimatice a Ficinei, utiliznd ca substrat
Hemoglobina
Principiul metodei:
Ficina catalizeaz hidroliza pulberei de hemoglobin permind formarea unor compui
insolubili n acid tricloracetic (TCA).Precipitatele obinute vor fi centrifugate i transferate n
chiurete de cuar,si se v-a citi D.O.la 278nm.
Reactivi i soluii:
A Pulbere denaturat de hemoglobin
- se adaug 20g de pulbere denaturat de hemoglobin/1L tampon de testare
B Sol.tampon stock,pH 6, 0,5 M
- se adaug 10,54 g Fosfat de Potasiu K2HPO4 (dibazic)/litru
- se adaug 59,66 g Fosfat de Potasiu K2HPO4 (monobazic)/litru
C Sol.tampon de lucru,pH 6, 0,1 M
- se adaug 200 ml tampon stock/litru
- se adaug 6,1 g Clorhidrat de Cistein ( C3H7NO2S . HCl)/litru
D. 30% soluie acid tricloracetic (TCA) (C2HCl302) (w/v)

~7~

E. Soluie de enzim
- Enzima trebuie s fie dizolvat n sol.tampon de lucru pentru ca atunci cand adaugm
substratul (hemoglobin denaturat) s citim la spectrofotometru o absorban ntre 0,1-0,7.
Mod de lucru:
1. Se adaug 5ml de substrat hemoglobin n fiecare eprubet
2. Se incubeaz la baie de ap 39oC pt exact 30 min.
3. Se adaug 1ml sol.enzim i sol.tampon n fiecare eprubet (in martor se adaug doar 1ml
sol.tampon)
4. Eprubetele vor fi agitate,li se vor pune cte un dop i vor fi incubate la 39oC pt exact 30 min.
5. Se adaug 2ml sol.30% TCA n fiecare eprubet,se vortexeaz pentru a stopa reacia i pt a
precipita proteinele.
6. Centrifugare la 4800 r/15 min
7. Transferul supernatantului n chiurete de cuar cu pipete Pasteur
8. Citire D.O.=278nm la spectrofotometru
9. Ajustarea spectrofotometrului la zero cu martorul nainte sa se citeasc etaloanele.
Mod de calcul:
Se calculeaz activitatea Ficinei n Uniti Hemoglobin Spectrofotometrice (SHU).
Cantitatea de enzim ce elibereaz 1 mol de Tyrozin (C9H11NO3) per minut este reprezentat
de SHU/g.
SHU/g= (A) (V)/(E) (T) (W), unde:
- A=Absorbana ajustat;
- V=Volumul total al soluiei (8ml);
-E=Coeficientul Micromolar de Extincie al Tyrozinei (1.38);
- T=Timpul de incubare (30 min);
- W=Greutatea n grame de enzim. 18

2.2 Colectarea latexului

Latex proaspt colectat de la smochini (Ficus carica cv. Sabz), copaci care cresc n staia
de cercetare Estaban unde sunt separate fructele verzi imature din lstari. Toate probele de latex
18

http://animalscience.unl.edu/documents/2074044/4760341/32-FicinActivityDetermination.pdf/7ae3bdb5-8eff4e9b-9fac-33252b2a1a44

~8~

utilizate aici au fost colectate la mijlocul lunii septembrie. Lichidul ce conine latex se toarn n
tuburi de 15 mL i sunt depozitate la -20 C.19

2.3 Eliminarea gumei

Latexul ngheat a fost pus la dezgheat la temperatura de 4 C i a fost centrifugat la
100.000g, 0 C, 20 min. Pentru ndeprtarea gumei i alte resturi (Sgarbieri et al., 1964) produsul
obinut a fost liofilizat i depozitat la -20 C.20

2.4 Prepararea mostrelor

Aproximativ 20g pulbere de latex liofilizat este dizolvatat n 0,01 M tampon fosfat de
sodiu la pH 7,0. Soluia a fost dializat (separarea membranei: 10 000 Da) soluie tampon fosfat
0,01 M de sodiu la pH 7,0 la 4 C timp de 24 ore i a fost centrifugat (40,000g, 4 C, 30 min).
Materialul insolubil a fost ndeprtat iar supernatantul a fost imediat mprit n 30 volume egale
i depozitat la -20 C pentru analizele viitoare.21

2.5 Schimbarea cromatografic a cationilor n SP-Sepharose n curgere

rapid
Fiecare poriune a supernatantului a fost ncrcat pe o coloan cu curgere rapid -SP
Sepharose (51,2 mL volum), pre-echilibrat cu soluie tampon fosfat 0,01 M de sodiu la pH 7,0.
Coloana a fost splat cu aceelai souie tampon pn cnd nicio protein nu a mai fost detectat
n eluent. Apoi urmnd a fi eluat folosind un gradient de 0,3 - 0,6 M NaCI n aceela i soluie
tampon la un debit de 1 mL / min. Pentru a determina coninutul proteic al fiecrei fraciuni, se ia
absorbana la lungimea de und 280 nm, iar msurtoarea se face folosind spectometru UV.
Fraciunile de vrf I-VI au fost comasate, dializate mpotriva apei deionizat, liofilizate i
depozitate la -20 C pentru analize ulterioare.22
19 http://www.biochemj.org/bj/110/bj1100053.htm
20 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0031942212005286
21 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0003269774902504

~9~

2.6 Msurarea activiti enzimatice

Activitatea ficinei a fost testat la 37 C folosind cazein bovin (2% gr / v) ca substrat
n 100 mM tampon de fosfat de potasiu pH 7,6 coninnd 250 mM EDTA i 250 mM L-cistein
concentraia enzimatic a fost de 0,25 mg / mL pentru fiecare ficin. Activitatea de hidroliz a
ficinei este bazat pe metoda descris de Kunitz cu unele modificri, folosind cazein denaturat
ca substrat (Kunitz 1947). n timpul masurtorilor, 0,12 mL enzim dintr-o soluie tampon de
fosfat de potasiu M la pH 7,0 a fost incubat la 37 C, timp de 20 minute nainte de testare.
Reacia a fost stopat prin adugarea de 1,8 ml de 5% TCA. Pentru semifabricat, substratul a fost
adugat dup enzim, a fost primul inactivat de TCA. Precipitatul rezultat a fost ndeprtat prin
centrifugare la 10 000g timp 20 min, iar absorbana peptidelor solubile TCA n supernatant a fost
msurat la 280 nm.23

2.7 Concentraia proteinei i peptida

Concentraia proteinei a fost determinat folosind metoda Bradford cu albumin seric
bovin (BSA) ca standard (Bradford, 1976; Marshall i Williams, 1993). Concentraia peptidei a
fost cuantificat spectrofotometric cu OPA (o-ftaldialdehidei) metoda care utilizeaz pepton ca
etalon (Church i colab., 1983).24

2.8 Efectele hidrofobe de suprafa ai plasturilor n autoliza ficinei

(ANS) Spectrul de fluerescen extrinsec i suprafaa hidrofob a plasturilor pentru UF i
trei ficine legate la vrfuri (I, III, IV i V) sunt ilustrate n fig 1 i 2.
Fluorescen extrinsec arat cantitatea de suprafa a plasturilor hidrofobi. Ficina (A) a
avut cel mai mare factor de suprafa hidrofob al plasturilor i cel mai mic raport de autolitice la
proteolitice activitate i valoarea absolut (modulul) a potenialului zeta dintre ficinele studiate
(Fig. 2). Este rezistent mpotriva autolizei, deoarece sunt situate la suprafaa plasturilor
22 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0260877408003890
23 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0031942212005286
24 Idem

~ 10 ~

hidrofobi. Atunci cnd suprafaa altei ficine hidrofobe a sczut uor autoliza, are o activitate
foarte crescut. Micile schimbri la suprafaa ficinei au cauzat diferen e severe n
comportamentul autolizei.25

Fig. 3 Extrinsecul spectrului fluorescent (ans) al UF i cele trei ficine sunt nrudite vrfurilor
cromatogramice ale HPLC (I, III, IV i V).

26

25 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23312458
26 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3755362/figure/F9/

~ 11 ~

Fig. 4 Corelaia dintre modulul potenial zeta () al factorului de suprafe a vrfurilor hidrofobe,
i raia autolitic a activitii proteolitice () al UF i cele 3 ficine nrudite vrfurilor
cromatogramice ale HPLC (I, III, IV i V ) 27

27 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3755362/figure/F10/

~ 12 ~

Capitolul 3. Utilizri ale Ficinei

Proteazele joac un rol important n biotehnologii,ocupnd ferm primul loc pe piaa
mondial a enzimelor. Proteazele tiolitice vegetale i animale prezint importan economic
mare datorit activitii lor proteolitice ridicate mpotriva unui spectru larg de substraturi
proteice.
Ficina are multe aplicaii industriale printre care:n industria fotografic,prin dizolvarea
gelatinei din filmul fragmentat;n industria produselor din carne ca enzim de frgezire fiind
utilizat alturi de Papain, Bromelin i Actidin pentru a face mai gustoas carnea tare,n
special n cazul crnii de calitate medie obinut de la animale mai btrne sau productoare de
lapte.28
Recent, chitosanul a beneficiat de un numr mare de utilizri comerciale i, n egal
msur, biomedicale. Acesta poate fi folosit n agricultur,pentru tratarea seminelor i ca
biopesticid,ajutnd plantele s lupte mpotriva infeciilor fungice. Chitosanul este o polizaharid
care se realizeaz din chitin, prin tratarea carapacelor de crevei, precum i a altor crustacee cu
hidroxid de sodiu. Depolimerizarea chitosanului crete solubilitatea sa in ap, scade vscozitatea
soluiei i inhib formarea gelurilor n timpul depozitrii. Astfel, papaina, bromelina i ficina sunt
folosite n mod regulat pentru depolimerizarea chitosanului.29
Cnd molecule de IgG (Imunoglobulina G) sunt incubate cu Ficin, n prezena cysteinei, una
sau mai multe legaturi peptidice sunt rupte, producnd Fragmente de legare a AntigenuluiFAB;F(ab) 2.IgG1-ul izolat de la oarece este mai greu de digerat n Fab funcional sau
fragmente de F(ab)2 folosind papain sau pepsin, folosind Ficina putem obine randamente
mult mai mari.30

28

http://www.fabricadecarne.ro/enzime-utilizate-la-fabricarea-produselor-din-carne

29

https://books.google.ro/books?
id=Vbebivh96C8C&pg=PA185&lpg=PA185&dq=Ficain+applications&source=bl&ots=8BYrM0PiPD&sig=e4ogV7s94C
khTokp-Qucy7Skpsc&hl=ro&sa=X&ei=XqlXVe2RM6POyQPWrIHYBw&ved=0CCcQ6AEwAQ#v=onepage&q=Ficain
%20applications&f=false

30

https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/44881

~ 13 ~

Concluzii

Ficina este o tiol-enzim;

Aceast enzim proteolitic a fost extrasa din latexul de Ficus glabrata;
Ficina are o larg specificitate de substrat, hidroliznd numeroase proteine n care scindeaz
hidrolitic legturile peptidice;
Aceast enzim prezint i proprietatea de a coagula laptele;
Ficina este rezistent fa de aciunea denaturat a ureei, ns n mediu uor acid este inactiv

ireversibil;
Codul ficinei este: E.C.3.4.22.3;
Ficina face parte din clasa hidrolazelor;
Punct de topire 235 C (508 K);
Ficina se gasete n latexul smochinelor;
Activitatea ficinei a fost testat la 37 C folosind cazein bovin;
Ficina este utilizat n industria cosmetic, farmaceutic;
Ficina este una dintre cele mai cultivate i mai plantate tipuri de smochine din lume, datorit

calitii fructelor uscate i toleranei la ploaie;

Ficina este utilizat n industria fotografic pentru dizolvarea gelatinei din filmul
fragmentat;
Ficina,alturi de majoritatea enzimelor proteolitice vegetale au aplicaii foarte importante
n numeroase domenii, cum ar fi: industria detergenilor, industria panificaiei, industria
berii, industria alimentar, industria farmaceutic, textil, pielriei, chimic, furajer,
eliminarea deeurilor.

Bibliografie

~ 14 ~

1. Cojocaru, D.C.,Ciornea, E.,Olteanu, Z., Opric, L.,Cojocaru, S.I.,

Tehnopress Iai-2007
2. Ionescu E., erban, M.,

Biochimie animal- Organizare molecular

Enzimologie general, Ed.

i macromolecular, Ed.

Fundatiei Romnia de mine, Bucureti 2001

3. Israel-Roming, F. Noiuni fundamentale de enzimologie, Ed ARS DOCENDI Bucure ti
4. I. F. Dumitru, Dana Iordchescu, Introducere n enzimologie, Ed Medical Bucureti 1981
5. Lehninger,A.L., Biochimie vol 1, , Ed. Tehnica Bucureti 1987
6. https://www.google.ro/search?
newwindow=1&sa=G&tbs=simg:CAESxQEawgELEKjU2AQaAggIDAsQsIynCBpgCl4IAxIouR
S4FKcK_1Am6FLwJvQnLCa0KqAqaNZQpyDeTKfAhkSmbNcY9nymtNBowGsHPQ0V1N4rme-o8V5MZvUodemaq_1Hb3nBnWBmcTCI1vjkL2WYe5fyt8hNI6sC0DAsQjq7CBoKCggIARIE8HCFiwwLEJ3twQkaMgoGCgRmb250CgkKB3Byb2R1Y3QKBQoDYXJ0Cg
YKBGxpbmUKDgoMaWxsdXN0cmF0aW9uDA&q=enzima+proteasas&tbm=isch&ei=1DNiVc
mQDYmPsgHr6YHIDg&ved=0CDYQsw4&biw=1366&bih=643#imgrc=kTn-Tb1oNWLmfM
%253A%3BzN3jSj-GwBLRAM%3Bhttp%253A%252F%252F4.bp.blogspot.com%252F_hRjpHwQ9MA%252FR9hEJV2M6KI%252FAAAAAAAAAAc%252FrS6Vt9CL0Vk%252Fs1600-h
%252Fglucosa%252Bisomerasa.bmp%3Bhttp%253A%252F
%252Fexperimentciencia.blogspot.com%252F%3B384%3B384
7. http://es.wikipedia.org/wiki/Ficina_(alcaloide)
8. https://www.google.ro/search?
q=enzima+ficin&newwindow=1&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=9e1gVamED6SE7gaj4HICg&
ved=0CAcQ_AUoAQ&biw=1366&bih=643#imgrc=RJW5up83ypKpiM%253A
%3B4czsd30GpcHUfM%3Bhttp%253A%252F%252Fupload.wikimedia.org%252Fwikipedia
%252Fcommons%252F2%252F24%252FFICINA.png%3Bhttp%253A%252F
%252Fes.wikipedia.org%252Fwiki%252FFicina_(alcaloide)%3B229%3B179
9. http://www.mpbio.com/product.php?pid=02198761
10. http://www.creeaza.com/referate/biologie/Clasificarea-enzimelor929.php
11. http://es.wikipedia.org/wiki/Ficina_(alcaloide)
12. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0260877408003890
13. http://www.biochemj.org/bj/110/bj1100053.htm
14. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0031942212005286
15. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0003269774902504
16. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0260877408003890
17. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23312458
18. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3755362/figure/F9/
19. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3755362/figure/F10/
20. http://www.primaryinfo.org/ficin.htm
21.https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/44881

~ 15 ~