DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

UNIVERSITATEA VASILE ALECSANDRI

BACU
FACULTATEA DE TIINE
MASTER BIOLOGIE MEDICAL

REFERAT LA GENETIC I
EREDOPATOLOGIE UMAN
TEMA: DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE
DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII
MONOCLONALI

Masterand:
Adriana Mariana PESCARU (SMADU)
0

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

BACU

- 2016 -

INTRODUCERE
Imunologia studiaz, n primul rnd, funcia de aprare a organismului uman i
animal, care face parte din categoria funciilor de relaie i este esenial pentru
supravieuire. Sistemul imunitar este esenial pentru supravieuirea organismelor
multicelulare, datorit agresiunii permanente a agenilor infecioi (microorganisme i
virusuri).
Omul adult poart pe suprafaa mucoaselor i a tegumentului, un numr uria de
celule bacteriene, mai multe dect propriile celule, unele avnd potenialul de a iniia
procese infecioase.
Imunologia clinic folosete numeroase tehnici pentru studiul proteinelor care
mediaz imunitatea umoral, ca i pentru studiul celulelor care iau parte la imunitatea
celular.
Analiza imunologic este considerat ca una dintre cele mai de vrf tehnici din
domeniul biomedical.
Complexitatea i evoluia rapid a acestor tehnici au fcut necesar conturarea unui
departament specializat n cadrul laboratorului clinic, care se ocup cu metodele
imunologice de diagnostic (imunodiagnostic). Domeniile mai nou dezvoltate sau n curs
de

dezvoltare

laboratoarele

clinice

cuprind:

imunochimia,

imunocitologia,

histocompatibilitatea, radioimunoanaliza, enzimimunoanaliza.

Evaluarea cantitativ a anticorpilor post-infecioi (determinarea concentraiei
acestora titrul de anticorpi), realizat la momente succesive de timp, pe parcursul

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

derulrii procesului patologic, permite stabilirea evoluiei serologice a acestuia, precum i

localizarea n timp a debutului respectivei infecii.
Imunitatea celular se studiaz printr-o serie de teste de imunocitologie.

Figura 1 Celulele sistemului imunitar (sursa: http://www.justmed.eu)

Diagnosticul molecular este o tehnic utilizat pentru a analiza markerii biologici

ai genomului i proteomului codul genetic individual i felul n care celulele acestuia i
exprim genele i proteinele prin aplicarea biologiei moleculare n investiga iile
medicale. Tehnica este utilizat pentru diagnosticarea i monitorizarea bolilor, detectarea
riscului i stabilirea terapiilor celor mai eficiente n cazul fiecrui pacient n parte. Prin
analiza individual a pacientului i a afeciunii sale, diagnosticul molecular ofer
perspectiva unei medicini personalizate.

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

Figura 2 Tehnici utilizate n diagnosticul molecular (sursa: https://en.wikipedia.org)

PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII MONOCLONALI

Metodele de imunochimie aduc informaii asupra unor proteine din snge i alte
lichide biologice. De obicei, se folosesc antigenul (Ag) necunoscut i reactivul, anticorpul
(Ac) cunoscut.

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

Figura 3 Activarea LB i producerea de anticorpi (sursa: http://www.justmed.eu)

Anticorpii sunt molecule de natur proteic (globulin), produs n organitele

limforeticulare sanguine denumite limfocite, capabil s recunoasc o particul strin de
organism, denumit antigen, i s declaneze o reacie imunologic, care are ca rezultat
ndeprtarea respectivei particule. Specificitatea anticorpilor este foarte mare, ei putnd s
recunoasc o anumit molecul de antigen din alte sute de milioane de molecule identice.
La separarea electroforetic a proteinelor serice s-a observat c anticorpii sunt
coninui n zona gamma a globulinelor, ceea ce a dus la denumirea lor de
imunoglobuline.
Unitatea structural a anticorpului este o protein tetracatenar, denumit
monomer.
Anticorpii se leag de markeri specifici - antigene - care se gsesc pe
suprafaa virusurilor, bacteriilor sau a unor toxine i le aglutineaz.
Sistemul imunitar poate fabrica milioane de anticorpi diferii, care "lupt"
mpotriva unei largi varieti de invadatori poteniali. Un anticorp produs de organism, n
cazuri patologice, mpotriva propriilor sale celule sau esuturi poart denumirea
de autoanticorp.
Un anticorp care apare doar la anumii indivizi ai unei specii i care ac ioneaz
mpotriva componentelor esuturilor strine ale unui individ din aceeai specie poart
denumirea de izoanticorp.
Anticorpii sunt mediatorii rspunsului imun umoral, fr implicare n rspunsul
imun celular. Ei acioneaz prin: neutralizarea microorganismelor i a toxinelor produse
de microorganisme, realizeaz opsonizarea cu facilitarea fagocitrii microorganismului de
ctre celulele specializate i determin activarea complementului, att pe cale clasic, ct

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

i pe cale alternativ, conducnd la opsonizarea i/sau liza microorganismelor sau

antigenelor.
Anticorpii nu servesc doar la identificarea i distrugerea substanelor i
microorganismelor care agreseaz organismul, ci particip i la reconstrucia esuturilor
deterioarate. Aceast funcie, cu totul neateptat, a fost descoperit de un grup de
cercettori de la Stanford University School of Medicine.
In vivo, interaciunile antigen-anticorp sunt ntotdeauna reversibile, la un moment
dat antigenul prsind situsul combinativ pentru antigen al anticorpului. Interaciunea
antigen-anticorp este condiionat de complementaritatea structural dintre situsul
combinativ pentru antigen al anticorpului, care funcioneaz dup principiul cheiebroasc, potrivirea fiind perfect. Consecina complementaritii structurale este
complementaritatea electrochimic cu apariia unor fore care determin legturi
intermoleculare dintre cele dou entiti.
Antigenele pot fi definite ca structuri moleculare sau supramoleculare care, venite
n contact cu efectori specializai ai sistemului imunitar, sunt percepute ca entit i self sau
non-self. n situaia n care, antigenele sunt receptate a fi non-self, adic diferite n mod
absolut sau doar relativ de oricare din structurile biochimice proprii ale organismului, la
nivelul sistemului imunitar are loc o serie precis de restructurri morfo-func ionale,
deosebit de complexe, care se concretizeaz n elaborarea de molecule de anticorpi
(imunoglobuline) i de receptori de membran, tipuri de molecule nou sintetizate, care
manifest o activitate strict specific fa de antigenul care le-a adus sinteza.
Din punct de vedere structural, un antigen este alctuit dintr-o grupare purttoare,
voluminoas (englez CARRIER) i unul sau mai multe tipuri de EPITOPI (sinonim:
determinani antigenici sau grupri determinante).

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

Figura 4 Rspunsul imun (sursa: http://it.dreamstime.com)

Rolul primar al gruprii purttoare este de a exterioriza epitopii, de a-i face

vizibili, pentru accederea lor la efectorii imunologici i facilitarea contactului cu
acetia, efectorii fiind n prealabil pregtii pentru amintitul contact (imunoglobuline
anticorpi i receptori de membran ale cror situsuri de cuplare sunt compatibile cu
epitopii respectivi). Rspunsul imunologic al organismului este ndreptat asupra
epitopilor i numai parial asupra gruprii purttoare (efect de carrier).
Fiecare tip de epitopi va activa exclusiv clona limfocitar care deine a priorireceptori de membran corespunztori tipului de epitop stimulat. Astfel, antigenele cu
mai multe tipuri de epitopi vor activa, n consecin, simultan, mai multe i, n acela i
timp, anumite clone limfocitare, motiv pentru care imunoglobulinele rezultate n cursul
rspunsului imun sunt denumite anticorpi policlonali.

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

Figura 5 Diferena dintre anticorpii monoclonali i

cei policlonali (sursa: https://prezi.com)

Antigenele artificial modificate astfel nct s dein un singur tip de epitopi vor
conduce la obinerea unui rspuns imun materializat n sintez de anticorpi monoclonali,
consecin a activrii unei unice clone limfocitare. n sensul celor prezentate anterior, se
poate afirma c anticorpii policlonali sunt un amestec de anticorpi monoclonali.
Anticorpii monoclonali reprezint o populaie omogen de molecule ce prezint
aceeai specificitate fa de antigen i o identitate absolut a structurii moleculelor
imunoglobulinice, care poart aceast specificitate. O asemenea identitate a moleculelor
poate fi folosit doar folosind o singur celul productoare de anticorpi specifici, care s
fie selectat din multitudinea de celule productoare de anticorpi. Selectarea i
multiplicarea unei singure celule productoare de anticorpi specifici se realizeaz prin
tehnica de hibridizare celular, introdus de George Kohler i Cesar Milstein din 1975.
7

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

Anticorpii monoclonali:
o au afinitate monovalent, deoarece se leag de acelai epitop (determinant
antigenic);
o sunt monosferici, omogeni, au o specificitate riguroas (prin selecionare);
o se pot produce pentru un mare numr de substane, rolul lor fiind de a se
lega de acestea i de a le purifica;
o stimuleaz sistemul natural de aprare al organismului pentru a ataca n mod
specific celulele afectate;
o nu mor, ci se multiplic nelimitat;
o sunt utilizai i pentru purificarea unor molecule, a unor populaii i
subpopulaii celulare, spre exemplu: purificarea celulelor stem i a
limfocitelor;
o sunt sintetizai pentru obinerea unor vaccinuri sau pentru diagnosticarea
anumitor afeciuni (HIV-SIDA).

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

Figura 6 Reprezentare general a metodei folosite pentru obinerea

de anticorpi monoclonali (sursa: https://en.wikipedia.org)

Fiind dat aproape orice substan, este posibil s se produc anticorpi monoclonali
care s se lege n mod specific de acea substan; ele pot servi apoi pentru detectarea sau
purificarea acelei substane. Acesta a devenit un important instrument al biochimiei,
biologiei moleculare i medicinei.

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

Producerea unui anticorp monoclonal poate s aib loc in vivo, aa cum este cazul
n unele gamapatii monoclonale (mielom multiplu, boala Waldenstrm, leucemii limfoide
cronice, limfoame maligne) sau in vitro din hibridoame formate prin fuziunea limfocitelor
B normale de specificitate cunoscut cu celule de mielom. Un mare numr de astfel de
anticorpi monoclonali produi industrial i de specificiti diferite sunt utiliza i n mod
curent n cercetare i biologia clinic pentru diagnosticul i tratamentul multor boli, mai
ales n cancerologie, patologia inflamatorie i imunitar.
Sunt utilizai n tipizarea hematiilor din sistemele ABO i Rh i n tratamente
deoarece, cu ajutorul lor, se pot inactiva i/sau neutraliza anumite toxine, se poate face
imunizarea pasiv cu ajutorul lor, n rabie i tetanos, n tratamentul cancerelor sunt cuplai
cu citostatice sau izotopi radioactivi, n transplantele medulare iar n bolile autoimune au
efect imunosupresor.
n 1970, s-a descoperit c limfocitele B canceroase ntlnite n mielomul multiplu,
produc un singur tip de anticorp (o paraprotein). Aceast descoperire a fost folosit
pentru studierea structurii anticorpilor, dar nu era nc posibil s se produc anticorpi
identici specifici unui anumit antigen.
Obinerea de anticorpi monoclonali (amestec omogen de imunoglobuline cu
specificitate comun pentru un anumit epitop) este necesar multor investigaii
diagnostice imunologice (de exemplu, cnd sunt reperate i identificate structuri
antigenice n variate produse biologice utiliznd anticorpi monoclonali specifici, fiecare
n parte, epitopilor antigenului, anticorpii fiind marcai cu substane de semnalizare, a a
cum se ntmpl la reacia de imunofluorescen).

10

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

Figura 7 Producerea anticorpilor monoclonali (sursa: http://www.academia.edu)

Toate investigaiile imunoserologice, indiferent de tipul i modul lor de desfa urare,

sunt fundamentate pe interaciunea specific dintre antigenul i anticorpul corespunztor
acestuia. Specificitatea de interaciune antigen-anticorp, permite identificarea precis a
unuia dintre reactanii imunologici, pe seama cunoaterii identitii reactantului omolog i
a rezultatului interaciunii dintre acetia (formarea de precipitate, aglutinarea, etc).
Tehnicile imunologice au evoluat devenind cele mai larg rspndite metode de
diagnostic n laboratoarele clinice i de cercetare. Acestea nu sunt utilizate doar pentru
diagnosticul bolilor infecioase, ci i pentru diagnosticul imunologic n cancer, boli
autoimune, boli imunodeficitare; pentru identificarea i cuantificarea unei largi varietai
de proteine umane i animale (Ag sau Ac).
Tehnicile imune utilizeaz Ag sau Ac specifici n procedurile lor i sunt configurate n
aa fel nct permit investigarea Ac specifici ce sunt produi n organismul uman, ca
11

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

rspuns la intervenia unei proteine non-self (Ag) sau pentru a detecta unii constituen i ai
unor microorganisme cu proprieti antigenice.
Termenii de serologie sau serodiagnostic se refer la studiul sau detecia Ag sau
Ac n ser, saliva, urin (serologic assay sinonim cu immunoassay).
Tehnicile imunologice (immunoassays) care se bazeaz pe principiul aciune enzim/
substrat enzimatic, ca sistem indicator, sunt denumite teste imunologice enzimatice
(enzyme immunoassays/ EIAs). Exist foarte multe tipuri de sisteme EIA, dar cel mai
frecvent utilizat sistem este enzyme liked immunosorbent assay (ELISA), n care
reactivii Ag sau Ac sunt adsorbii pe un suport solid (faza solid/ plci plastic cu
godeuri).
Dac sistemul indicator utilizeaz fluorocromi (substane fluorescente) sau
izotopi radioactivi, tehnicile sunt clasificate ca: tehnici imunologice fluorescente (IFA)
sau tehnici imunologice radioactive (RIA).
Rezultatele se exprim n moduri diferite: uzual, rezultatele se exprim ca pozitiv
sau negativ (reactiv/ non-reactiv), indicnd prezena sau absena Ag sau Ac detectabil fa
de valoarea cutt-of stabilit n protocolul

reaciei.

Se raporteaz

un titru

care

indic cantitatea sau concentraia de Ac specific sau cantitatea de Ag detectat (pg/ml).

Titrul reaciei este definit ca inversul celei mai mari diluii/ser, lichid de punc ie,
care a mai produs un rezultat pozitiv.
Observaia privind legarea specific a Ac de Ag a reprezentat baza dezvoltrii
iniiale a diagnosticului imunologic. Fenomenele de precipitare i aglutinare au devenit
bazele dezvoltarii metodelor de cercetare, care au fost adoptate pentru teste de diagnostic
clinic.
* Principiul hemaglutinarii (HA) a fost exploatat pentru dezvoltarea tehnicii de
hemaglutino-inhibare (HAI), utilizat larg pentru detecia Ac specifici mpotriva unor
virusuri (v. gripal).
* Sistemul Complement (C`) odat studiat i neles, a fost utilizat in tehnicile
imunologice, ca Reacie de fixare a C` (RFC`).
* Tehnicile imunologice de precipitare au devenit larg utilizate, reacii imunologice
12

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

specifice, ce exprim i rezultate semicantitative.

Avantajele tehnicilor imunologice:
- simplicitate;
- timp redus pentru obinerea rezultatelor;
- raport bun cost-eficien;
- sensibilitate;
- specificitate;
- siguran;
- posibilitate de standardizare a metodei;
- utilizarea de platforme automatizate;
- obinerea de rezultate n cazul bolilor infecioase determinate de
microorganisme necultivabile;
- diagnostic serologic obinut n cazul bolilor infecioase determinate de
ageni nalt patogeni, periculoi a fi manipulai vii, n culturi;
- tehnicile imunologice sunt foarte utile n monitorizarea evoluiei bolii
(diferenierea fazei acute/IgM de faz cronic/IgG);
- evaluarea necesitii i a momentului imunizrii (vaccinrii) de protecie
pentru persoanele care lucreaz n condiii specifice (grupe de risc expuse la
mbolnviri) sau care circul n zone geografice endemice;
- monitorizarea personalului medical expus accidental la contactul cu
produse biologice infectate (snge sau secreii provenite de la bolnavi de hepatita
viral B, C, sau HIV pozitivi);
- monitorizarea mamelor bolnave de SIDA (nivel Ac, ncrctura viral,
etc) n vederea administrrii tratamentului antiretroviral de protecie a nounscutului.
Reactia de fixare a Complementului (RFC): este o tehnic clasic, dezvoltat n
anii 1900. nc este utilizat de unele laboratoare. Este o procedur riguroas i
standardizat, dar consum timp ndelungat i personal bine instruit, cu experien.
13

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

Tehnica: Se pune n contact Ag cunoscut, titrat, standardizat cu Ac (ser bolnav

inactivat termic) suplimentat cu C`. Dac n ser sunt prezenti Ac specifici Ag-ului
cunoscut, se formeaz complexe imune (Ag-Ac) activate de C`. Se adaug sistemul
hemolitic, ca sistem indicator (hematii de berbec sensibilizate cu Ac-anti iepure) pentru
vizualizarea reaciei. C` fixat pe complexele imune Ag/Ac nu mai este liber i devine
disponibil s se lege de sistemul hemolitic indicator, hemoliza nu are loc iar hematiile cad
n buton la fundul godeului sau sedimenteaz la fundul tubului. Aadar, la reacia pozitiv
(Ac specifici sunt prezeni): buton hematic = absena hemolizei.
Dac nu sunt Ac specifici n serul de bolnav, C` se fixeaz pe sistemul hemolitic
indicator, are loc hemoliza iar lichidul n mediul de reacie este omogen opalin i rozat.
Rezultat negativ: prezena hemolizei.
Tehnica imunofluorescenei se bazeaz pe proprietatea fluorocromilor de a se fixa
pe imunoglobuline, fr a le modifica proprietile biologice.
Aceti anticorpi marcai fluorescent vor deveni trasori sensibili pentru antigenele
tisulare i, n urma legrii lor de un antigen corespunztor, confer fluorescen
complexului antigen-anticorp format.

Figura 8 Imufluorescena (sursa: http://www.justmed.eu)

Fluorocromii sunt substane care, iradiate de un fascicul de lumin cu lungime de

und mic i frecven mare, emit radiaii cu lungime de und superioar, situate n zona

14

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

vizibil a spectrului, permind formarea unei imagini fluorescente a

complexului

antigen-anticorp.
Fluresceina - lumina verde; rhodamina - lumina roie.
Pentru a releva prezena fluorocromilor fixai n cadrul reaciei Ag/Ac, trebuie
folosit un microscop cu surs de UV i filtre de excitaie capabile de a elimina radia iile
cu lungime de und inutile.
Reacia se realizeaz n dou variante :
Varianta direct :
o Se aplic frecvent pentru identificare antigenelor.
o Se folosete un ser imun standard, marcat cu o substan fluorescent.
o Anticorpii din acest ser, fluoresceni i specifici, vor reaciona cu Ag de
identificat, formnd complexe fluorescente, ce pot fi observate n lumina UV.
o Avantajele constau n:
rapiditatea tehnicii;
permite evidentierea Ag microbiene, dup inactivarea lor cu
antibiotice.
Varianta indirect:
o Se desfoar n dou etape:
1. n prima etap, preparatul fixat, ce conine antigenul, cunoscut sau
necunoscut, se trateaz cu ser nefluorescent, rezultnd un complex
Ag-Ac nefluorescent.
2. n a doua etap, pentru a face acest complex vizibil, preparatul se
trateaz cu ser antiglobulinic fluorescent, activ fa de specia care a
furnizat serul specific din prima etap.
o n aceast tehnic, antigenul este acoperit cu un dublu strat de Ac: cei
nefluoresceni, specifici fa de Ag i cei fluoresceni, antigamaglobuline.
Reactia de hemaglutino-inhibare (HAI): face parte din reaciile care testeaz
pierderea capacitii de manifestare a unor efecte virus-specifice, n prezena unui ser
imun specific.
Se utilizeaz frecvent pentru a detecta prezen a anticorpilor fa de un virus
hemaglutinant n serul unui pacient suspectat de o infecie. E folosit n viroze i se
15

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

bazez pe capacitatea unor virusuri de a determina aglutinarea eritrocitelor printr-o serie

de componente din structura lor. n prezena anticorpilor hemaglutino-inhibani din serul
pacientului cu infecia virala, are loc inhibarea hemaglutinrii. Dup amestecul unor
cantatiti cunoscute de virus standard cu diluii n serie de ser de la bolnav, se adaug
suspensia de eritrocite. Dac serul conine Ac specifici, ei se leag de particula viral i
mpiedic aglutinarea hematiilor. Dac serul nu conine anticorpi specifici virusului
standard, acesta va produce aglutinarea hematiilor. Martorul virus standard trebuie s
prezinte hemaglutinare, iar cel de hematii nu trebuie s o prezinte.

Figura9 Schema reaciei de hemaglutinare (sursa: http://www.qreferat.com)

Tehnica reaciei :
o Serul de testat se supune unui tratament ce nltur inhibitorii naturali ai
hemaglutinrii.
o Serul este apoi inactivat la 56C.
o Antigenul standard tulpini standard de virus gripal, care va fi i titrat nainte
de reacie.
o Eritrocitele folosite sunt de coco.
o Iniial se efectueaz diluii binare din serul de cercetat .
o Peste fiecare diluie se adaug antigenul reprezentat de virusul standard titrat la
4UHA.
o Se incubeaz 30 minute.
o Se adaug n fiecare godeu suspensia de eritrocite.
o Se incubeaz 60 minute la temperatura camerei.
16

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

o Se citete: titrul Ac hemaglutinoinhibani e dat de diluia cea mai mare din serul
de cercetat, la care nu se observ hemaglutinarea.
o Se efectueaz o serie de martori: martor virus standard; martor ser normal;
martor ser sigur pozitiv, martor ser sigur negativ, martor eritrocite.
o Reacia se folosete n diagnosticul serologic al unor viroze (grip, rujeol,
oreion), dar i n identificarea serologic (infecii cu virusuri hemaglutinantegripale, paragripale, folosind seruri standard adecvate).
o Aglutinarea direct se poate obine prin doua proceduri: pe lam i n tuburi.
Aglutinarea pe lam: pe o lam curat i degresat, se pune o picatur din serul
aglutinant standard, n care se emulsioneaz o proiune din cultura germenului de
identificat, pn se obine o suspensie omogen. Dac exist coresponden imun ntre
Ag de identificat i Ac standard, se constat apariia unor grunji, iar reac ia e considerat
pozitiv. Absena grunjilor cu o suspensie omogen-tulbure e considerat reac ie
negativ.
Se realizeaz i un martor, n care se suspensioneaz o ans din cultur, n ser
fiziologic, martorul trebuie s fie negativ.
Aglutinarea n tuburi: se folosete, att n identificare serologic ct i n
diagnosticul serologic. n idendificarea serologic se efectueaz diluii succesive din
serul aglutinant (de la diluia 1/10 pn la cel indicat pe fiol), care se pun n contact cu
cantiti constante de Ag necunoscut

(din cultura germenului). Dupa incubare, se

stabilete titrul Ac aglutinani (ultima diluie n care se prezint aglutinarea), iar dac
acesta e cel de pe fiol sau cel putin din aceasta, se concluzioneaz asupra
corespondenei Ag/Ac.
Pentru stabilirea titrului de Ac din diagnosticul serologic - se plaseaz ntr-o serie
de tuburi, volume constante din diluii crescnde ale serului de testat, peste care se adaug
un volum constant din suspensia de Ag standard. Dup incubare, diluia cea mai nalt din
ser, care prezint grunji de aglutinare, stabilete titrul anticorpilor aglutinani.

17

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

Aglutinarea indirect-pasiv - este o reacie ce folosete particule naturale sau

artificiale (proteina stafilococic, latex, hematii) ncrcate in vitro cu Ag sau Ac (ca

elemente standard), care vor fi aglutinate de Ac sau Ag corespunzatoare din prob.
Tehnica RIA (Radioimmunoassay): const n creterea sensibilitii i
specificitii tehnicilor imunologice cu ajutorul unor peptide marcate radioactiv,
pentru o mai bun identificare i cuantificare a diferitelor tipuri de Ag
(hormoni, medicamente, enzime, steroli, proteine serice etc).
Radioimunodetecia a fost utilizat la nceput pentru msurarea concentraiei
hormonilor, diverselor medicamente i a unei palete largi de biomolecule. De asemenea,
imunodetecia a fost utilizat i la detecia fosfatazei acide (din prostat) i a unei
izoenzime a creatin kinazei.
n unele cazuri, enzima este ataat covalent la un anticorp care, la rndul su,
leag un antigen.
Tehnica se bazeaz pe afinitatea unui antigen necunoscut pentru anticorpul su
specific i pe posibilitatea formei radioactive a antigenului de a intra n competi ie cu
antigenul dozat, nemarcat, dar de acelai tip.
n timpul acestei competiii de legare cu anticorpul specific, antigenul radioactiv
este diluat de cantitatea necunoscut de antigen ce urmeaz a fi determinat.
Cantitatea de complexe antigen marcat-anticorp, care se stabilete prin msurarea
radioactivitaii prezente la nivelul unui filtru ce nu las s treac dect elemente izolate
ale reaciei este o funcie invers a concentraiei de antigen nemarcat care se determin.
Se citete la un scintilator pentru radiaii gama.
Necesit precauii majore referitoare la manipularea izotopilor
radioactivi de ctre personalul calificat.
Tehnica ELISA (Enzyme-linked-ummuno-sorbent-assay): este o tehnic uoar
care permite diagnosticarea unui numar mare de probe, automatizat/semiautomatizat,
nu necesit substane radioactive, are sensibilitate i specificitate bune.

18

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

Este o tehnic biochimica utilizat n imunologie, pentru a detecta prezen a de Ac

sau Ag n prelevate biologice. n ELISA, o cantitate necunoscut de Ag este fixat pe
suprafaa solid (n godeurile plcii de microtitrare) i apoi, Ac specific este adugat n
godeuri, astfel nct s se combine cu Ag. Ac este legat de o enzim, iar n etapa final,
este

adaugat

o substan,

astfel

nct

enzima s acioneze

asupra

acestui

substrat, determinnd un semnal detectabil.

Citirea se face la spectrofotometru, cu lungime de und corespunztoare: orice
complex Ag/ Ac cuplat cu substana fluorescent va emite semnal, iar cantitatea de Ag din
prob, depinde de magnitudinea fluorescenei.
Concentratiile de Ag cunoscute n probele testate, constituie o curb standard,
utilizat pentru calculul concentraiei de Ag din probele prelucrate.
Tipuri de tehnici ELISA:
- ELISA direct:
Se fixeaz pe godeurile plcii ser anti-IgA.
Se incubeaz cu serul pacientului, care, dac prezint IgA , acesta se
va fixa pe Ac anti IgA.
Se adaug antigenul marcat cu peroxidaz, recunoscut de eventualele
IgA din serul de testat specific de antigen.
Adaugarea substratului specific enzimei.
Apariia reaciei colorate dac serul de testat conine IgA specifice
antigenului conjugat.
Se evalueaz spectrofotometric.
Prin tehnica direct se evideniaz anticorpii anti-HIV1 i anti HIV2
din serul sau LCR prelevate de la bolnavul suspectat cu SIDA.
n acest caz (testarea pentru SIDA), varianta tehnicii este calitativ.
Pentru a se aprecia rezultatele, se compar absorbana probelor cu
absorbana controlului cut-off.
Dac absorbana este mai mare dect absorbana medie a controlului
cut-off, rezult un test pozitiv.
Dac absorbana este mai mic dect absorbana medie a controlului
cut-off, rezult un test negativ.
19

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

Dac absorbana este egal cu absorbana medie a controlului cut-off,

suspectam un bolnav n perioada de sero-conversie (repetm reacia
dupa 6 sptmni) sau n perioada de declin, cnd sistemul imun e
considerabil afectat.
Dup testare, n cazul unui rezultat pozitiv, probele se vor trece prin
testul de confirmare Western-Blot.

Figura 10 Tehnica ELISA direct (sursa: https://www.scribd.com)

- ELISA sandwich varianta 1

Antigenul este plasat pe godeuri (coating)
Se nltur antigenul nefixat (surcoating)

printr-o splare cu o soluie

proteic (gelatin)
Se introduc serurile de testat, care, dac conin Ac specifici Ag de pe

godeuri, se vor lega de acetia

Incubare 2 ore la 20-37 C
Splare pentru a ndeprta toi Ac nespecifici i pe cei nelegai
Adugarea de Ac anti-Ig umane conjugai cu peroxidaz
Splare pentru a elimina Ac conjugai nefixai (liberi)
Adugarea substratului enzimei care conine i cromogenul.
Se produce colorarea n galben dac enzima a rmas n godeu i a degradat
substratul. Intensitatea culorii este proporional cu cantitatea enzimei, deci

cu cantitatea de Ac conjugai fixati indirect de antigen.

Se adaug o soluie de blocare a reaciei enzimatice, pentru a stopa reacia.
Se calculeaz concentraia elementului cercetat spectrofotometric.

20

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

Figura 11 Tehnica ELISA sandwich (sursa: https://www.scribd.com)

- ELISA sandwich varianta 2

Aceast tehnic permite dozarea unui antigen care prezint 2 epitopi
recunoscui de 2 tipuri de anticorpi.
Godeul e tapetat cu un anumit tip de Ac monoclonali pe care se fixeaz
specific, interacionnd, un epitop al Ag de dozat
Se introduc apoi n reacie anticorpii monoclonali conjugati , care se leag de
celalalt epitop, fiind prini n sandwich.
- ELISA competitiv are la baz acelai mecanism ca i tehnicile directe
Se fixeaz n godeuri Ag cunoscut, incubat 1 ora la 37 C.
Se adaug, concomitent, serul bolnavului i un ser monoclonal specific
antigenului cu o incubare la 37g C timp de o or.
Dac exist Ac specifici n serul pacientului acetia vor competiiona cu cei
monoclonali.
Se pipieteaz conjugatul anticorpi anti-anticorpi monoclonali cuplai cu
enzima.
Se adaug substrat enzimatic i cromogen, se incubeaz iar, o ora la 37C.
Se efectueaz 3 splri pentru a ndeprta elementele nefixate.
Se adaug o substan pentru stoparea reaciei enzimatice i se efectueaz
citirea spectrofotometric.
Testul este pozitiv atunci cnd Ac de test se leag de Ag, deci nu se fixeaz
Ac marcai cu enzim, astfel nu se degradeaz substratul i nu apare
culoarea.
Testul este negativ = apariia culorii citire absorban.

21

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

Figura 12 Tehnica ELISA competitiv (sursa: https://www.scribd.com)

Tehnica
imunofluorescentei
se,
modifica
biologice.
proprietatile
fluorescent
vor
deveni
trasori
sensibili
tisulare
si
pentru
in
antigenele
corespunzator
confera
fluorescenta
antigencomplexului
anticorp
format.
care
lumina
iradiate
cu
lungime
de
un
de
unda
de
mica
cu
superioara
lungime
situate
de
unda
zona
vizibila
a
formarea
unei
a
imagini
complexului
antigen-anticorp.
rhodamina
-proprietatea
lumina
rosie.
marcati
fragmentului
la
nivelul
Fc.
fixati
in
cadrul
reactiei
un
atg-atc
trebuie
folosit
filtre
de
excitatie
capabile
a
de
elimina
radiatiile
cu
lungime
unda
inutile.
variante
:indirecta
directa
:de
identificare
antigenelor.
standard
marcat
cu
o
substanta
fluorescenta.
fluorescenti
reactiona
cu
si
atg
specifici
identificat
vor
fluorescente
ce
pot
fi
observate
in
lumina
UV.
rapiditatea
permite
evidentierea
tehnicii
,fascicul
si
atg
microbiene
Varianta
antibiotice.
:in
etape:
fixat
ce
contine
antigenul
,de
cunoscut
sau
necunoscut
complex
atg-atc
rezultand
un
nefluorescent
fluorocromilor
bazeaza
pe
de
aenzimatice
se
fixa
pe
biologic
modifica
proprietatile
biologi
pentru
a
stopa
reactia.
elementului
cercetat
spectrofotometr
unor
masoara
tehnici
titrul
sensibile
unui
atg
,
ce
sau
atc
,
radioact
varianta
1
godeuri
(coating)
surcoating)
o
solutie
proteica
printr-o
spalare
(cu
gelatina)
testat
specifici
,
care
atg
de
daca
pe
contin
atc
acestia.
indeparta
si
pe
cei
nelegati
toti
atc
nespecifici
umane
conjugati
cu
peroxidaza

conjugati
Incubare
nefixati
2
ore
la
(
liberi)
20-37g
C.
enzimei
cromogenul.
care
contine
si
galben
daca
enzima
a
ramas
in
godeu
si
a
degradat
culorii
cantitatea
este
enzimei
proportionala
,
deci
cu
fixati
indirect
de
antigen.
blocare
a
reactiei
spectrofotometric
radio
inta imunohistochimiei este detectarea antigenelor celulare sau tisulare specifice
imunofluorescenta
Imunohistochimie (IHC)

prin aplicarea unor anticorpi marcai care pot fi vizualizai prin microscopie optic sau cu
fluorescen. n ultimii 20 de ani, acest domeniu s-a dezvoltat rapid i a devenit de o mare
importan n practica zilnic, n mod special atunci cnd aceast metod a devenit
disponibil pe scar larg pentru esuturile fixate cu formalin i incluse n parafin.

Figura 13 Imunohistochimie indirecta (sursa: http://www.justmed.eu)

Imunohistochimia prezint o aplicaie important n diagnosticul tumorilor prin

stabilirea liniei de difereniere n tumorile slab difereniate (tabel 1). Majoritatea
patologilor folosesc o abordare n trepte, ncepnd cu un set de markeri generici
coninnd citokeratine (pentru difereniere epitelial), markeri melanocitici, CD45
22

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

(antigen comun leucocitar pentru difereniere hematopoietic) i vimentin (pentru

difereniere mezenchimal). n al doilea pas, se acord atenie unor anticorpi specifici
alei pe baza rezultatelor anterioare.

Figura 14 Imunohistochimie (sursa: http://www.justmed.eu)

Dac se descoper o metastaz cu punct de plecare neprecizat, imunohistochimia

poate indica locul de origine. De exemplu, factorul de transcripie TTF1 este exprimat de
celulele normale ale plmnului i tiroidei dar i de celulele tumorale derivate din aceste
organe.
IHC este important i n evaluarea prognosticului i a prediciei rspunsului la
terapie. Avnd la dispoziie terapia intit, determinarea prezenei unei proteine prin IHC
poate modifica secvena terapeutic. Exemple mai cunoscute sunt: statusul receptorilor
estrogenici i al expresiei Her2/neu n cancerul mamar.

Figura 15 Imunohistochimie directa (sursa: http://www.justmed.eu)

Tabel 1. Markeri tumorali utilizai n imunhistochimie

23

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI
Antigen detectabil
Alfa fetoproteina
Calretinin

Neoplazia asociat
Tumori germinale, carcinom hepatocelular
Mezoteliom, tumori stromale, corticosuprarenaliene, sarcoame
sinoviale
Antigen
carcinoembrionar Intestine, pancreas, col uterin, plmn, ovar, sn, tract urinar
monoclonal (mCEA)
CD34
Hemangiopericitom,
lipom
pleomorfic,
GIST,
dermatofibrosarcom protuberans
CD99
Sarcom Ewing, PNET (tumori neuroendocrine primare), tumori
fibroase solitatare/hemangiopericitom, sarcom sinovial,
limfoame, leucemii, tumori stromale
CD117
GIST, mastocitoz, seminoame
Cromgranin
Tumori neuroendocrine (neuroblastice, cu celule Merkel,
tumori carcinoide, feocromocitom, carcinom microcelular)
Citokeratin
Carcinoame, unele sarcoame
Desmin
Sarcoame (muchi netezi sau striai, sarcom stromal
endometrial)
EMA (epithelial membrane antigen) Carcinoame, meningioame, unele sarcoame
Factorul VIII, CD31, CD 34, FL1
Sarcoame (vasculare)
Proteina acid glial fibrilar (GFAP) Glioame (astrocitoame, ependimoame)
GCDFP-15 (gross cystic disease Sn, ovar, gland salivar
fluid protein)
Hormoni
Glande endocrine, tumori intestinale, pancreatice
hCG
Celule germinale i trofoblastice, carcinoame
keratin
Carcinoame, unele sarcoame
Neuron specific enolaza
Tumori
neuroendocrine,
carcinom
bronho-pulmonar
microcelular, sn
PSA
Prostat
Proteina S100
Melanom, sarcoame
Tiroglobulin
Tiroid
Vimentin
Sarcoame, tumori renale, endometriale, pulmonare, limfoame,
leucemii, melanoame.

Avantajul acestei metode const n sensibilitatea i specificitatea ridicat, corelaia cu

parametriii morfologici clasici, poate fi utilizat retrospectiv i adaptat la preparate
citologice i la microscopia electronic.
Contribuiile majore ale imunohistochimiei la diagnostcul histopatologic este
reprezentat de:
Identificarea originii tisulare a unor tumori nedifereniate, contribuind la stabilirea
unei conduite terapeutice;
Identificare unor factori prognostici i predictivi moleculari (Ki-67, p53, Her2/neu);
24

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

Identificarea unor inte moleculare (erB-2, CD 20), etap obligatorie n indicarea

unei terapii moleculare intite;
Evidenierea

unor

factori

infecioi

asociai

cancerului,

cu

valoare

prognostic/predictiv (ex. virusul HPV).

BIBLIOGRAFIE

1. Carl A. Burtis, Edward R. Ashwood, David E. Bruns (2012). Tietz Textbook of

Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics
2. Bogdan A. Tabac (2014). Indrumar pentru laboratorul de imunologie veterinar
3. Robert K. Oldham, Robert O. Dillma. JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY
VOLUMUL 1 NUMRUL 1 OCTOMBRIE 2008
4. Australian Prescriber (2006). "Monoclonal antibody therapy for non-malignant
disease"
5. Marks LV, A Healthcare Revolution in the Making: The Story of Csar Milstein
and Monoclonal Antibodies: Making monoclonal antibodies
6. http://anatomie.romedic.ro
7. http://documents.tips
25

DIAGNOSTICUL MOLECULAR: PROCEDEE DE DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC, ANTICORPII

MONOCLONALI

8. http://www.justmed.eu
9. https://www.scribd.com
10.http://www.qreferat.com
11.http://www.academia.edu
12.https://en.wikipedia.org
13. https://prezi.com
14.http://it.dreamstime.com
15.http://www.slideserve.com
16.https://www.synevo.ro
17.http://docslide.net

26