1.

Determinarea fotometric a hemoglobinei ca cianhemoglobin

Este metoda standard aleas pe plan mondial pentru determinarea hemoglobinei
(Hb).
Principiul metodei:
Fericianura de K oxideaz fierul feros din hemoglobin n fier feric (n toate
hemoglobinele din snge cu excepia verdo-hemoglobinei); astfel formndu-se
methemoglobina sau hemiglobina care pe msur ce se formeaz trece n
cianmethemoglobin sau cianhemiglobin, derivatul hemoglobinic cel mai stabil.
Reactivul utilizat este soluia Drabkin, care este furnizat de firmele distribuitoare
de reactivi.
Iniial se folosea reactivul van Kampen-Zijlstra, preparat dup
reeta urmtoare:
-Fosfat monopotasic
(KH2PO4)
0,14g
-Cianura de potasiu
(KCN)
0,05g
-Fericianura de potasiu [K3Fe(CN)6]
0,2g
-Apa distilat ad
1000 ml
Reactivul trebuie s aib un pH cuprins ntre 7,2-7,5 i s fie perfect limpede i
stabil.
Se pstreaz n sticle brune, la frigider, timp de 2 luni.
Tehnica de lucru
1. Se recolteaz 0,02 ml snge venos sau capilar cu o pipet de hemoglobin.
Se sterge bine vrful pipetei cu hrtie de filtru.
2. Se golete coninutul pipetei ntr-o eprubet n care se afl 5 ml de reactiv
Drabkin (pui n prealabil cu pipet gradat). Se spal pipeta de 2-3 ori. Se
omogemizeaz coninutul prin agitare i se ateapt 30 de minute.
3. Se citete extincia la spectrofotometru n banda de 540nm, n cuva de 10
mm, contra apei distilate.
4. Formula de calcul
Hb g/100ml = Ep x K
EP = extincia probei de cercetat
K = coeficientul de etalonare al aparatului
Calibrarea fotometrelor se face cu soluii standard de cianhemoglobin
preparate din hemoglobin uman.
Valori normale (Interval de referin)
Brbai 13-17 g/dl
Femei 11-15 g/dl

2. Determinare Hematocrit=Ht
Principiul metodei:
In sngele recoltat pe anticoagulant uscat (EDTA-Na 2) se separ masa
eritrocitar de plasm, prin centrifugare la 3500 rot/min, timp de 30 minute
pentru macrohematocrit i 5 minute pentru microhematocrit.
Material necesar
Pentru macrohematocrit
- tuburi de hematocrit originale, gradate 0-100 mm, sau tuburi de
105mm cu fundul plat, confecionate din pipete westergreen.
- Pipete Pasteur cu vrful lung 120-130 mm sau sering de 2 ml cu ac
lung de 120-130 mm.
- centrifug electric de peste 3000 rot/min.
- Nomogram
Pentru microhematocrit
- tuburi heparinate de microhematocrit
- microcentrifug de hematocrit
- Nomogram.
Tehnica
1. Se omogenizeaz coninutul flaconului de snge prin 10 rsturnri
complete, dar lente.
2. Se aspir sngele cu pipeta Pasteur, se evit ptrunderea bulelor de
aer.Coloana de snge trebuie s aib 100 mm.
In cazul microhematocritului, microtubii se umplu prin capilaritate, iar
captul liber al se astup cu plastilin.
3. Se introduc tubii n centifuga adecvat, pentru macrohematocrit se
centrifugheaz 30 minute la 3500 rot/min; iar pentru microhematocrit
5 minute la 3500 rot/min.
Calculul
Pentru tuburile Wintrobe originale citirea, evaluarea nlimii coloanei de
eritrocite, se face direct pe scala gradat a tubului.
In cazul tuburilor negradate citirea coloanei de eritrocite se face cu ajutorul
nomogramei.
Tubul de hematocrit se aeaz pe nomogram, perpendicular pe linia
orizontal inferioar (0%-0%), ncadrndu-se coloana de snge exact ntre
aceast linie i linia oblic superioar (100%-100%).
Valoarea Ht este indicat de linia de separaie dintre coloana de eritrocite i
coloana de plasm i se citete direct pe scala gradat.

In cazul utilizrii centrifugilor unghiulare limita de separaie dintre masa

eritrocitar i plasm este oblic, citirea se face la mijlocul acestei linii.
Valoarea macrohematocritului este ntotdeauna mai mare dect a
microhematocritului cu aproximativ 2-3%, deoarece prin metoda
microhematocritului tasarea eritrocitelor este mai complet.
Valori normale
La copii: 2-15 ani 36-39%
Femei: 37-47%
Brbai: 40-54%
Utilitate diagnostic
- Ht d informaii asupra masei eritrocitare procentuale.
- Este cea mai exact metod pentru aprecierea gradului de anemie i de
policitemie.
- Prezint modificri paradoxale: hemodiluie cu scderea Ht fr
modificarea volemiei; hemoconcentraie cu creterea Ht, fr ca
volemia s fie modificat sau chiar cu scderea acesteia (oc
hemoragic).
- Concomitent cu determinarea Ht poate fi apreciat masa leucocitar i
aspectul icteric sau lipemic al plasmei.

3.Viteza de sedimentare a hematiilor

VSH=ESR
Principiul
Se bazeaz pe proprietatea eritrocitelor de sedimenta in vitro ntr-o prob
de snge tratat n prealabil cu anticoagulant.
Material necesar
- soluie izotonic steril de citrat de sodiu
- pipete i stative Westergreen
- tuburi gradate de 5 sau cel mult 10 ml
- material necesar pentru puncie venoas
Tehnica
1. se repartizeaz cte 0,4 ml de citrat trisodic n tuburile gradate (n
prezent exist eprubete care conin cantitatea necesar de citrateprubete cu dop negru).
2. peste soluia de citrat se adaug 1,6 ml de snge. recoltat de la pacient
n momentul respectiv (actualmente se recoltez direct n eprubeta
vidat care absoarbe catitatea de snge necesar).
3. imediat, se aspir sngele citratat n eprubeta Westergreen pn la
diviziunea 0 mm.
4. se aeaz pipetele n stativ n poziie perfect vertical.
5. dup 1 or se face citirea. Rezultatul este reprezentat de distana pn
la care a cobort coloana de eritrocite exprimat n mm.
Stabilitatea probei este de 4-5 ore de la amestecarea sngelui cu citratul
trisodic.
Valori normale
- nou-nscui 1-2mm
- sugari
7-10mm
- copii mici
7-11mm
- brbai
3-8mm
- femei
6-11mm

Utilitate diagnostic
VSH este o reacie de disproteinemie deoarece modificrile sale sunt
corelate cu modificrile cantitative ale fibrinogenului i -globuluinelor.

Scderea numrului de eritrocite duce la scderea VSH-ului.

Scade n: policitemie, unele boli de staz hepatic, insuficien cardiac,
la administrarea unor medicamente (corticoizii, salicilatul,
tiosemicarbazona).
Crete n: sarcin, infectii acute si cronice, tumori maligne, nefroze,
unele boli de colagen, unele hemopatii (leucemie acut, anemii
hemolitice autoimune, macroglobuluinemie, plasmocitom).
VSH-ul poate furniza informaii suplimentare: plasma foarte deschis la
culoare indic o lips de Fe, de culoare galben-portocaliu o bilirubinemie
crescut, un aspect tulbure lptos o hipercolesterolemie; prezena unui
strat opac albicios deasupra coloanei de eritrocite indic un numr crescut
de leucocite.

4.Numrtoarea de eritrocite, leucocite i trombocite

Principiul
Sngele diluat n pipete speciale Potain este introdus n camera de numrat
(Burker-Turk). Globulele se numr pe o reea de volum determinat.
Material necesar
- Pipete Potain cu bila roie pentru numrtoarea de eritrocite, cu bila
alb pentru numrtoarea de leucocite.
- Camera Burker-Turk
- Mundstuck
- Snge capilar proaspt sau venos recoltat pe anticoagulant
Tehnica
Se dilueaz sngele n pipet Potain montat la tubul mundstuck atsfel:
- pentru eritrocite se folosete pipeta cu bil roie marcat 0,5-101, n
care se realizeaz o diluie de 1:200, se trage snge pn la marca 0,5,
se sterge vrful pipetei cu hrtie de filtru, apoi se trage lichid de
diluie pn la marca 101, se agit pipete si se las pe masa de lucru
timp de 5 minute.
- Pentru leucocite si trombocite se foloseste pipeta cu bila alb marcat
0,5-11, n care se realizeaz o diluie de 1:20, se sterge vrful pipetei
cu hrtie de filtru, apoi se trage lichid de diluie pn la marca 101, se
agit pipete si se las pe masa de lucru timp de 5 minute.
- Se umple camera de numrat atsfel: se agit pipeta Potain aproximativ
1 minut, se arunc primele 2-3 picturi, se umple camera de numrat
(care are lamela perfect aplicat) prin capilaritate.
Se ateapt depunerea elementelor figurate 1-2 minute pentru eritrocite i
leucocite i 15 minute pentru trombocite.
Numrtoarea
Pentru leucocite se numr n ptratele delimitate de liniile duble din cele
4 coluri ale camerei (50 de ptrate)= 1mm2 x 2 = 2mm2
Pentru eritrocite se numr 5 ptrate dintre liniile triple din centrul crucii
1/25 mm2 x 5 = 1/5 mm2

Calcul
Pentru a afla numrul de globule pe mm 3 de snge, trebuie s facem
corecia de nltime, suprafa i diluie.
Nr. Eritrocite = Nr.eritro.nimrate x 5 x 10 x 200 = Nr.eritro numrate x 10.000
Nr. Trombocite = Nr.trombo numrate x 5 x 10 x 20= Nr.trombo numrate x 1000
Nr. Leucocite = Nr.leuco numrate x x 10 x 20 = Nr.leuco numrate x 100
Valori normale
Leucocite

Eritrocite

nou-nscut
9 luni
6 ani
Adult

nou nscut
Sugar
6 ani
15 ani
Adult femeie
Adult brbat

Trombocite

15.000-30.000/l
9000-15.000/ l
4000-10.000/ l
4000-8000/ l
4.700.000-5.100.000/ l
4.500.000-4.700.000/ l
4.600.000/ l
4.800.000/ l
4.300.000600.000/ l
4.700.000700.000/ l

150 000 300 000/ l

Camera Burker-Turk:
Suprafaa unui ptrat mic = 1/400
Suprafaa unui ptrat mare = 1/25
Inlimea = 0,10 mm

5. Frotiul de snge
Frotiul de snge reprezint modalitatea de studiere a morfologiei elementelor
sanguine i a paraziilor sanguini; totodata orienteaz asupra catitii de
hemoglobin i a numrului de eritrocite, leucocite i trombocite din snge.
Frotiul de snge reprezint componenta cea mai important a unei
hemograme, orientnd semicantitativ i morfologic asupra tuturor
componentelor sanguine.
Material necesar
Lame de sticl curate i degresate, o lam lefuit foarte bine pentru
ntinderea frotiului.
Tenhica
Se aplic pe lam o pictur de snge capilar sau venos i se ntinde cu
ajutorul lamei lefuite inut ntr-un unghi de 45 prin executarea unei
micari de translaie de-a lungul lamei.
Preparatul se usuc foarte repede prin agitare n aer; acest timp reprezint o
prim fixare.
Se noteaz pe partea lefuit a lamei numele pacientului.
Este recomandabil s se efectueze dou frotiuri, unul pstrndu-se ca martor.
Frotiul este reuit cnd este subire, uniform, are dou laturi paralele i se
sfreste n franjuri.
Frotiul este nereuit cnd este neuniform, pictura este groas sau ntins,
uscat lent sau lama este nedegresat i prezint ochiuri.

6. Coloraia Giemsa
Aceast metod folosete un amestec de colorani acizi, bazici i neutrii;
colornd toate componentele celulei sanguine n funcie de afinitile lor
tinctoriale.
Material necesar
Tvia de colorat
Baghete de sticl
Pipete gradate
Suport pentru uscarea lamelor
Soluie Giemsa
Ap distilat (pH7-7,2)
Ulei de cedru
Alcool metilic sau etilic
Microscop pentru examinarea frotiului colorat
Coloraia panoptic
- Fixarea se face prin acoperirea integral a frotiului alcol metilic timp de 35 minute sau alcool etilic timp de 15 minute.
- Se vars alcoolul i se acoper lama cu colorant Giemsa, preparat conform
instruciunilor productorului, cu ajutorul unei pipete gradate,
- Se las 30-45 minute, apoi
- Se cltete cu ap de la robinet sub jet slab pentru a nu antrena
trombocitele
- Se terge dosul lamei pentru ca frotiul s rmn clar i se pun lama la
uscat n stativ.
Coloraia este nereuit cnd:
- Frotiul apare cu nuant roie datorit pH-ului apei distilate acide
folosite, splarea cu ap acid de la robinet a fost prelungit sau cnd
coloraia a fost insuficient,
- Frotiul este albastru n cazul pH-ului alcalin al apei distilate, frotiul
este gros sau supracolorat sau splarea a fost insuficient.
- Apariia de precipitate pe frotiu n cazul uscrii sau sedimentrii
colorantului.
Corectarea unor deficiene de coloraie
Un frotiu supracolorat se va corecta cu alcool metilic.
Un frotiu insuficient colorat se recoloreaz cu colorant Giemsa.
Examinarea frotiului sanguin
Se execut cu obiectivul cu imersie n urmtoarea ordine: eritrocit, trombocit
leucocit cu ntocmirea formulei leucocitare.

7. Formula leucocitar
Reprezint exprimarea procentual a diferitelor tipuri de leucocite dup
examinarea pe frotiul sanguin a cel puin 100 de leucocite.
Tehnica
Cu obiectivul cu imersie, pentru o corect identificare morfologic, se
parcurge frotiul deplasnd preparatul ntr-un singur sens i n zig-zag, pentru
a surprinde att elementele marginale ct i pe cele din mijlocul lamei
(limfociele au tendina de a se grupa pe centru, PMN i mononuclearele spre
margine i n franjuri. Pe msur ce se ntlnesc leucocite, 50 pe o latur, 50
pe cealalt se noteaz pe categorii, ntr-un tabel, n grupe de cte 10
elemente.
Se examineaz n total cel puin 100 de elemente i se stabilete procentul
fiecrui tip de leucocit. Exactitatea rezultatului este in raport cu numrul de
elemente examinate (200-400). Examinarea a mai puin de 100 de leucocite
are un coeficient de eroare att de mare nct este considerat lipsit de
valoare.
Numrul absolut pe tip de leucocit
Exprim numrul de tip de leucocit pe mililitrul de snge.
Exemplu: pentru un numr de leucocite de 6000/l cu un procent de 25%
limfocite, calculul este
Nr.absolut de limfocite = 25 x 6000/100 = 1500/l

Numr
leucocite
Neutrofile
nesegmentat
e
Neutrofile
segmentate
Eozinofile
Bazofile
Limfocite
Monocite

Tip
Nouleucocite nscut
15.00030.000
NS
5-10%

Sugar
900015000
1-5%

Copil
6 ani
400010.000
5%

S
E
B
L
M

Adult
40008000
1-4%

Valori
absolute/l
0-90

30-70%

25-30%

30-60%

60-70%

3000-4800

2-5%
0-1%
20-40%
2-8%

7%
1%
50-70%
6-8%

4%
1%
30-60%
4-8%

1-4%
0-1%
25-30%
4-8%

300-400
20-80
1500-2400
240-600

Corecia de eritroblastoz
Prezena eritroblatilor n sngele periferic constituie o complicaie n
numrarea corect a leucocitelor, deoarece eritroblatii nu sunt lezai de
soluia de acid acetic folosit la numrtoarea leucocitelor.In camera de
numrat eritroblatii nu pot fi deosebii de leucocite fiind inclui n
numrtoare.
Pentru a obine numrul corect de leucocite, se determin pe frotiul de snge
colorat, numrul de eritroblati la 100 de leucocite i se face un calcul de
corecie printr-o regul de 3 simpl.
Formula de corecie:
Nr.leucocite corectat = nr.leucocite necorectat x 100/100 + nr.eritroblati la 100 leucocite

Exemplu:
Elemente nucleate numrate n camer = 6000/l
Eritroblati pe frotiul de snge 20 la 100 de leucocite
120 elemente nucleate..100 leucocite
6000 elemente nucleate.X
X = 6000 x 100/120 = 5000

8. Numrarea Reticulocitelor
Numarul de reticulocite este un test specific pentru aprecierea funciei
medulare, util pentru stabilirea mecanismului de producere i urmrirea
tratamentului diferitelor tipuri de anemie.
Principiul metodei:
Evidenierea ribonucleoproteinelor reziduale din eritrocitele mature, prin
aplicarea unei coloraii supravitale cu bleu brilliant de cresyl 1%.
Reticulocitele sunt eritrocitele tinere care mai pstreaz nc resturi ale
reticulului endoplasmic, care se coloreaz n albastru.
Dintre numeroasele tehnici existente, cea care utilizeaz colorant uscat pe
lam este cea mai practic.
Tehnica:
- se pun 2 picturi de snge peste pictura de colorant uscat
- se amestec ntre suprafeele a 2 lame realiznd o camer umed
- se lasn repaus 5 minute
- se desprind lamele din amestec
- se ntind frotiuri subiri care se usuc rapid prin agitare.
Examinarea se face cu imersie i un obiectiv puternic n zonele cu distribuia
cea mai uniform a eritrocitelor.
Se examineaz 10-15 cmpuri notndu-se numrul de eritrocite i
reticulocite ntlnite, oprind examinarea la 1000 de eritrocite.
Rezultatele se exprim n reticulocite % i cifra absolut/L.
Valori normale: 0,5-1,5%
Indicele de producie al reticulocitelor se calculeaz dup formula:
Rt x Ht/45
Timpul de maturaie
Numrul de reticulocite este unul dintre cei mai fideli indicatori sanguini ai
produciei medulare i nu trebuie s lipseasc de pe nici un buletin de analiz
care indic o anemie.
Numrul absolut de reticulocite exprim numrul de reticulocite pe
microlitrul de snge. Se obine prin calcul cunoscnd procentul de
reticulocite i numrul de eritrocite/L.
Nr. Absolut Rt = Nr. Eritrocite/L/100
Valoarea normal n valori absolute = 60.000/L.

9. Indicii eritrocitari
1. MCV=VEM=volumul mediu al eritrocitelor
Ht=volumul eritrocitar la 100mL de snge
Ht x 10
MCV=
E
E=nr. De eritrocite existent n acelai volum
Valori normale: 80-943 medie 873
Valori patologice: >94 3 (macro-megalocite)
<80 3 (microcite)
Surse de eroare n numrtoarea clasic - numrul de eritrocite.
2. MCH=HEM=coninutul mediu de hemoglobin al eritrocitelor
Hb x 10
MCH=
E
Hb=cantitatea de hemoglobin la 100mL.
Valori normale; 25-32g medie 29pg
Valori patologice: >33pg i <25pg.
Crete n anemie pernicioas cu creterea VEM
Scade n anemie feripriv sever, cu scderea VEM i Hb.
Surse de eroare n numrtoarea clasic - numrul de eritrocite.
3. MCHC=CHEM=concentraia medie a hemoglobinei n eritrocit exprimat
n procente.
Indic cte grame de Hb sunt coninute n 100mL de eritrocite.
Hb x 100
MCHC=
Ht
Valori normale; 32-36g /100mL, medie 34g/100mL
Valori patologice: <30g/100mL

Creteri peste 36g/mL nu exist pentru c ncrctura normal cu Hb a

eritrocitelor este maxim. Crete cu VEM.
Variaia constantelor eritrocitare n anemii
Stare

MCV (3)

MCH (pg)

Normal
Anemie
normocitar
Anemie
macrocitar
Anemie
microcitar

82-92
82-92

27-31
25-30

MCHC
(g/100mL)
32-36
32-36

95-150

30-50

32-36

50-80

12-25

25-30