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Ttulo del documento: Evaluacin in vitro de aminocidos lisina y metionina con y sin proteccin
Ttulo del documento en ingls: Evaluation in vitro of amino acids lysine and methionine with
and without protection against ruminal degradation
Autores: Mnica Duque, Ricardo Rosero Noguera y Martha Olivera
Filiacin de Noguera y Olivera: Universidad de Antioquia, Facultad de Ciencias Agrarias. Grupo
de Investigacin Biognesis. Medelln, Colombia
Filiacin de Mnica Duque: Corporacin Universitaria Remington, Facultad de Medicina
Veterinaria. Grupo de Investigacin GINVER. Medelln, Colombia
Resumen: Con el propsito de evaluar la proteccin de los aminocidos sintticos lisina y
metionina se realiz una fermentacin ruminal in vitro donde se determinaron los parmetros de
degradabilidad ruminal, produccin de gas y la liberacin de nitrgeno amoniacal. El porcentaje
de degradacin de la MS y la liberacin del amoniaco fueron mucho mayor con la urea comparada
con los AA los cuales no difieron entre sin o con proteccin.
Palabras claves: amoniaco, degradacin ruminal, fermentacin, grasa, urea
Summary: With the purpose to evaluate the rumen proteccin of the synthetic amino acids (AA)
lysine and methionine, an in vitro rumen fermentation was performed where the parameters of
ruminal degradability, gas production and release of ammonia were determined compaaared with
urea as the N source. The DM degradability and release of ammonia were much higher with urea
compared with the AA which did not differ between protected and unprotected sloures of the two
AA.

Key words: ammonia, fermentation, rumen degradation, urea

Introduccin. La optimizacin en la utilizacin de la protena es importante para aumentar la

eficiencia en la produccin de leche y minimizar la liberacin de nitrgeno (N) al medio ambiente.
En los rumiantes, los aminocidos que llegan al intestino delgado para cubrir los requerimientos
del animal proceden de 3 fuentes: Protena microbiana, protena endgena y protena no
degradable en rumen (PNDR). La protena microbiana es sintetizada a partir de amonio y pptidos
que proceden de la degradacin de la protena consumida que llega al rumen. La protena
microbiana que sale del rumen es digerida y absorbida como aminocidos en el intestino delgado.
Se ha establecido que esta protena es de alta calidad porque contiene una alta proporcin de
aminocidos esenciales y un adecuado balance cuando es comparada con la composicin de la
protena del msculo y la leche (NRC 2001).
La protena endgena procede de descamaciones de piel, enzimas, jugos gstricos, etc. La protena
de origen dietario que no es degradada en el rumen (PNDR) entra al intestino delgado, donde es
digerida y proporciona aminocidos esenciales que pueden ser usados para completar y llenar los
requerimientos de aminocidos para el animal (NRC 2001). La calidad de la protena dietaria que
escapa de la degradacin ruminal es importante en el suministro de aminocidos (AA) esenciales
adicionales para completar los requerimientos de los animales, sin embargo, es insuficiente.
Dos de los aminocidos esenciales, lisina y metionina son considerados co-limitantes para el
crecimiento y sntesis de leche en diferentes tipos de dietas (Socha et al 2005) debido a que la
mayora de los AA de las materias primas de los suplementos son rpidamente degradados por los
microorganismos del rumen antes de su absorcin a nivel intestinal. Diversas investigaciones se

han desarrollado con el fin de encontrar tecnologas adecuadas para proteger aminocidos como
metionina (Met) y lisina (Lys) (Patton 2010), las cuales buscan una mayor precisin en las
formulaciones para el ganado de leche.
Estudios in vivo han presentado resultados variables a la suplementacin con estos dos
aminocidos (Doepel et al 2004). En algunos trabajos realizados suplementando estos dos
aminocidos no se han encontrado efectos en la produccin de leche y produccin de protena
(Krber et al 2000, Liu et al 2000, Ouellet et al 2003, Chung et al 2006). Sin embargo, otros
autores han encontado que la suplementacin dietaria con aminocidos protegidos deficientes en la
racin tienen el potencial de incrementar la produccin de leche (Robinson et al 1995; Wang et al
2010) y los contenidos de protena y grasa (Xu et al 1998, Robinson 2010; Kov et al 2010), y
sus efectos solamente son observados cuando la resistencia a la degradabilidad ruminal y
digestibilidad intestinal son altas (Bach y Stern 2000). En este sentido, tanto la degradabilidad
como la digestibilidad intestinal deben ser cuantificadas para determinar el grado de proteccin y
la disponibilidad de las fuentes de aminocidos, haciendo necesario el establecimiento de
metodologas adecuadas para tal propsito. El objetivo de este trabajo fue evaluar la tcnica in
vitro de produccin de gases y la liberacin de nitrgeno amoniacal como herramienta para
determinar el grado de proteccin ruminal de los aminocidos metionina y lisina en rumiantes.

Materiales y mtodos
Localizacin. Este ensayo fue desarrollado en el Laboratorio NUTRILAB - GRICA, perteneciente
a la Facultad de Ciencias Agrarias, ubicado en la Sede de Investigacin Universitaria, Universidad
de Antioquia, Medelln, Colombia.

Tratamientos. Se utilizaron dos aminocidos Lys y Met con y sin proteccin como fuente de
nitrgeno, las cuales fueron protegidas con jabones clcicos, y almidn de yuca como fuente de
energa para el crecimiento microbiano (Mould et al 2004). La tcnica de encapsulacin de AA
con lpidos (grasas y aceites), a menudo estn en combinacin con materiales inorgnicos,
estabilizantes y agentes suavizantes. Los aminocidos evaluados fueron provistos por la empresa
Nutraceutika- Nutricin funcional Ltda (carrera 42 # 53-183 Itag, Antioquia, Colombia). Sobre
las muestras de aminocidos fueron determinadas las concentraciones de materia seca a 65 C
(MS) y protena cruda (PC) por el mtodo Kjeldahl (AOAC 2002) (Tabla 1).
Tabla 1. Materia seca y protena cruda de las fuentes de nitrgeno evaluadas
Tratamiento#

Materia seca total, %

Protena cruda, % de la MS

Lys

95.3

71.1

LysP

96.5

51.4

Met

99.0

53.5

MetP

98.0

36.5

Urea

99.7

287

Almidn

85.1

0.0

#Lys: Lisina sin proteccin, Met: Metionina sin proteccin, LysP: Lisina protegida, MetP:
Metionina con proteccin
Los microorganismos ruminales para su crecimiento requieren nitrgeno y energa de forma
simultnea. Como se observa en la Tabla 1, la fuente de energa para los microrganismos
ruminales es el almidn, el cual no aporta nitrgeno al medio. La fuente de nitrgeno est

representada por las fuentes de AA que se evaluaron. En este contexto, la degradacin del almidn
est condicionada a la disponibilidad del nitrgeno aportado por los AA.
Los tratamientos experimentales para evaluar la eficacia del proceso de proteccin de los
aminocidos fueron:

Lys: Almidn + Lisina sin proteccin

LysP: Almidn + Lisina protegida

Met: Almidn + Metionina sin proteccin

MetP: Almidn + Metionina protegida

LysPMetP: Almidn + Lisina protegida y metionina protegida

Urea: Almidn + Urea

En cada frasco de incubacin se pes 1 g de almidn de yuca y cantidades variables de cada una
de las fuentes de AA y urea de tal manera que se garantizara un aporte de N total de 0.016 g como
sugerido por Mould et al (2004). En el tratamiento LysPMetP el N fue aportado en una relacin
3:1 Lys: Met como sugieren muchos autores que consideran que esta relacin es adecuada para
que se produzca una mayor produccin de protena lctea (Bach and Stern 2000, Bueno et al 2003,
Wu et al 2012).
Recoleccin de inoculo. El lquido ruminal fue colectado a las 6:00 am a partir de tres vacas
Holstein fistuladas en el rumen. El lquido ruminal se retir manualmente de los diferentes estratos

en el rumen y fue almacenado en recipientes trmicos previamente calentados con agua a 40 C.

Despus de la colecta, el lquido ruminal fue llevado al laboratorio y filtrado a travs de paos de
algodn. La parte lquida obtenida en este proceso fue colocada en un elermeyer, continuamente
saturada con CO2 a una temperatura constante de 39 C (Duque et al 2009).
Preparacin de los frascos de incubacin. La produccin de gas fue determinada por la tcnica in
vitro semi-automtica descrita por Mauricio et al (1999). Para seguir este protocolo de incubacin,
fueron utilizados frascos de vidrio con capacidad de 100 ml, en donde fue adicionado 1.0 g de
almidn de yuca y 0.016 g de nitrgeno, siendo este aportado por las diferentes fuentes
(aminocidos con o sin proteccin o por la urea).
En cada frasco se adicion 5 ml de lquido ruminal y 45 ml de la solucin tampn. Los frascos
fueron sellados con un tapn de caucho, agitados manualmente y transferidos a una estufa de
ventilacin forzada a 39 C, siendo este primer momento, el tiempo cero de incubacin.
Degradacin in vitro de la MS. Para estudiar la cintica de degradacin de la MS de los
tratamientos, los frascos de vidrio fueron retirados del proceso de incubacin en los horarios 2, 4,
8, 12, 24 y 30 horas. El residuo de la incubacin fue centrifugado por 5 minutos a 2500 rpm,
posteriormente el sobrenadante fue tomado para determinar el contenido de nitrgeno amoniacal y
el residuo slido fue dejado en el tubo falcn de peso conocido inicialmente. Los tubos falcn
fueron secados a 65 C por 48 horas y pesados para determinar la desaparicin de la MS.
Liberacin de nitrgeno amoniacal. Para determinar la liberacin del nitrgeno amoniacal, se
tom en un tubo 25 ml del lquido sobrenadante, y fue adicionado 5 ml de CaCl 2 al 25% y 2 g de
MgO comercial. Posteriormente, se procedi a realizar la destilacin y titulacin de la muestra,
obteniendo como resultado la cantidad de N.

Anlisis estadstico. Para determinar el efecto de los tratamientos sobre la degradacin de la MS y

liberacin de nitrgeno amoniacal a travs del tiempo fue realizado un anlisis de medidas
repetidas en el tiempo con ayuda del procedimiento PROC MIXED y LSMEANS de SAS.
Para estimar los parmetros de degradacin fue utilizado el procedimiento NLIN de SAS. Los
datos fueron ajustados al modelo propuesto por rskov y McDonald:
D = a+ b (1-exp (-c*t)), donde: D = degradabilidad ruminal de la fraccin b en el tiempo t, a =
fraccin soluble que es completamente degradada en el rumen, b = fraccin potencialmente
degradable en el rumen, c = es la tasa constante de degradacin de la fraccin b. Para separar los
medios fue utilizada la prueba de Tukey (p <0.05).

Resultados. Degradacin de la MS. El mayor porcentaje de degradacin se registr en el

tratamiento con urea (Figura 1). Esto indica que las fuentes de AA aportaron limitada cantidad de
nitrgeno al medio, restringiendo la actividad microbiana reflejada en los bajos porcentajes de
degradacin de la MS.

La mayor degradacin potencial se registr para el tratamiento con urea (Tabla 2).
Tabla 2. Parmetros de degradacin de la MS

Tratamiento a

Lys

7.12a

30.0c

0.029bc

LysP

7.44a

27.7c

0.024c

35.1c

Met

7.64a

41.3b

0.031abc

49.0b

MetP

7.69a

43.7b

0.036ab

LysPMetP

7.16a

48.3b

0.024c

55.5b

Urea

0.16b

86.7a

0.041a

86.8

abc

Degradabilidad potencial
37.1c

51.4b

medios en una misma lnea sin letras en comn indican valores diferentes al p<0.05, a: fraccin

rpidamente degradable, b: fraccin de lenta degradacin, a+b: potencial de degradacin, c: tasa

constante de degradacin de la fraccin b, fraccin indigestible: 100-(a+b)
Liberacin de nitrgeno amoniacal. La liberacin del nitrgeno amoniacal fue mucha ms alta con
urea comparada con los AA sin o con proteccin. Esto concuerda con la mayor degradacin de la
MS a las 24 horas pos-incubacin en este mismo tratamiento. Las fuentes de AA con y sin
proteccin liberaron semejantes cantidades de nitrgeno amoniacal evidenciando que el mtodo de
proteccin no tuvo el efecto esperado y que el paso limitante por parte de los microorganismos
para utilizar estas fuentes de nitrgeno fue la desaminacin.
Discusin. Las fuentes de lisina y metionina protegidas (LysP y MetP) tuvieron una dinmica de
degradacin igual a la observada con sus homlogas sin proteccin (Lys y Met). Esto indica que
an sin proteccin los amino cidos sintticos lysina y metionina tiene baja degradabilidad por
parte de los microorganismos ruminales.
El nmero de microrganismos en el rumen est determinado por la tasa de digestin de los
carbohidratos y la cantidad de protena o nitrgeno disponible en el fludo ruminal. El amonio es el

principal producto de la degradacin de la protena (sea esta suministrada como NNP o AA) y el
mayor precursor de la protena microbiana (Blmmel et al 1999, Broderick et al 2010). En el
tratamiento de urea el crecimiento de los microorganismos no fue limitado por la disponibilidad de
nitrgeno. En las Figuras 1 y 2 claramente se observa que la mayor degradacin del almidn se
corresponde con una mayor disponibilidad de nitrgeno amoniacal en el medio. Por tanto, las bajas
degradaciones de la MS observadas en los restantes tratamientos son atribuidas al limitado aporte
de nitrgeno por parte de las fuentes evaluadas.
Tradicionalmente se asume que los AA de la dieta son extensamente degradados en el rumen. Este
hecho junto con los altos requerimientos de AA limitantes en animales de alta produccin ha
llevado a pensar que su proteccin de la degradacin ruminal es necesaria para incrementar la
cantidad de AA que llega al duodeno. Sin embargo, diferentes investigaciones muestran que
importantes cantidades del requerimiento diario de AA puede ser cubierto dando AA sin
proteccin. Velle et al (1997) evaluaron en vacas no lactantes la digestibilidad aparente de 18 AA,
suministrados en cuatro dosis (75, 150, 300 y 600 mmol/dia). En este experimento las tasas de
degradacin difirieron entre AA, indicando que las desaminasas microbianas tienen marcada
especificidad por el tipo de AA. Para el caso de la metionina las desaminasas microbinas pueden
ser inhibidas por la liberacin de azufre.
Cottle y Velle (1989) evaluaron la degradacin y el flujo de AA sin proteccin en el rumen de tres
ovejas canuladas y encontraron que dosis de 15 g/da, permiten un flujo de 4.3 g de lisina y
metionina, lo que representa aproximadamente el 30 y 70% de los requerimientos diarios de estos
AA, respectivamente. Estos resultados sugieren que importantes proporciones del requerimiento
de AA puede ser cubierto dando fuentes sin proteccin.

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Volden et al (1998) evaluaron la degradacin ruminal de dosis crecientes de lisina, metionina y

treonina en seis vacas lactantes. Estos autores observaron una disminucin lineal en la degradacin
ruminal y un incremento significativo en las cantidades de AA que escapan del rumen con el
incremento en la dosificacin. Los valores medios de escape ruminal para los AA treonina,
metionina y lisina fueron 16.7, 22.1 y 20.5%, respectivamente. Considerando el alto precio de las
fuentes protegidas de AA (cuatro a cinco veces el de las fuentes no protegidas) y la baja tasa de
degradacin de la metionina, Mbanzamihigo et al (1997) sugieren que las fuentes no protegidas
sean incrementadas un 43% de la dosis recomendada de AA para obtener los mismos resultados de
las fuentes protegidas.

Conclusiones. En una fermentacin ruminal in vitro, los aminocidos sintticos lysina y metionia
tuvieron una muy baja degradabilidad por parte de los microorganismos ruminales, similar a lo
que se observ con los mismos aminocidos supuestamente protegidos contra la degradacin
ruminal.
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