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Ctedra de Microbiologa, Virologa y Parasitologa Laboratorio de Habilidades 6 rea Injuria 2015

Laboratorio de habilidades N 6
Mtodos inmunolgicos: directos e indirectos
Deteccin especfica de molculas mediantes pruebas inmunolgicas

Mtodo indirecto: Deteccin de anticuerpos (Ac)

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Introduccin

g
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Mtodo directo: Deteccin de antgeno (Ag)

Gran parte de los progresos alcanzados en la microbiologa clnica, segn hemos visto en los
laboratorios de habilidades, se deben al perfeccionamiento de los mtodos analticos de
medida. La introduccin de los procedimientos basados en las reacciones inmunolgicas (antes
de la era genmica) han representado un importante avance en el anlisis de molculas de
inters en biologa animal y vegetal difciles de medir empleando los mtodos convencionales
habituales.

Dentro de los procedimientos moleculares inmunolgicos, los ms tiles y prcticos son aquellos
que se basan en la especificidad de la unin Ag-Ac. La propiedad que tienen las
inmunoglobulinas (Ig) de unirse a un Ag, la especificidad de esta unin y el hecho de que
pueda ser visualizada por los fenmenos de precipitacin, aglutinacin, marcado con molculas
fluorescentes, con radioistopos o con enzimas, hace que estos mtodos se empleen
ampliamente an hoy en la era genmica.
Existen diversos mtodos basados en distintos procedimientos para visualizar la presencia de Ag
o Ac en muestras biolgicas humanas. Estos son la justificacin del presente laboratorio de
habilidades.

Objetivos

Al finalizar el encuentro el alumno debe ser capaz de:

Aproximarse a los fundamentos y aplicaciones de los principales recursos tcnicos,

metodolgicos y estrategias empleadas en los campos de la microbiologa.
Familiarizarse con las tcnicas bsicas moleculares inmunolgicas que permiten el anlisis
del estudio microbiolgico.
Comprender las aplicaciones de mtodos y tcnicas en el estudio de distintos procesos
infecciosos humanos e interpretar sus resultados.
Distinguir la sensibilidad y especificidad de las diferentes tcnicas empleadas.

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Mapa conceptual

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Inmunidad humoral
Antgeno

Proviene del griego anti: con propiedades contrarias y geno: crea oposicin. Es una
molcula que puede ser reconocida por el sistema inmune adaptativo desencadenando la
formacin de Ac. Son usualmente protenas o polisacridos. Esto incluye partes de bacterias
(cpsula, pared celular, flagelos, fimbrias y toxinas), de virus y de otros microorganismos. Los
lpidos y cidos nucleicos son antignicos solo cuando se combinan con protenas y
polisacridos. Tambin pueden funcionar como Ag molculas del ambiente, no-microbianas,
exgenos, como por ejemplo: polen, clara de huevo, protenas de tejidos y rganos
trasplantados, o protenas en la superficie de glbulos rojos transfundidos.
Anticuerpo
En 1890, E. von Behring y S. Kitasato describieron la actividad de los Ac contra la difteria y la
toxina tetnica. Propusieron la teora de la inmunidad humoral, que estableca la existencia de
un mediador en el suero sanguneo que podra reaccionar con un Ag extrao.

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Los Ac (Ig) son glicoprotenas del tipo gamma globulina. Pueden encontrarse de forma soluble
en la sangre u otros fluidos corporales. Est constituido por unidades estructurales bsicas,
cada una de ellas con dos grandes cadenas pesadas y dos cadenas ligeras de menor tamao,
que forman, por ejemplo, monmeros con una unidad, dmeros con dos unidades o pentmeros
con cinco. Los Ac son sintetizados por los linfocitos B. Aunque la estructura general de todos
ellos es muy semejante, una pequea regin del pice de la protena es extremadamente
variable, lo cual permite la presencia de millones de Ac, cada uno con un extremo ligeramente
distinto. A esta parte de la protena se la conoce como regin hipervariable. Cada una de estas
variantes se puede unir solo a una diana, que es lo que se conoce como Ag (epitope) y
reconocerla entre millones de molculas diferentes que poseemos en nuestro organismo.
La amplia cantidad de Ac y su diversidad se genera por combinaciones al azar de un juego de
segmentos genticos que codifican diferentes lugares de unin al antgeno (paratope).
Posteriormente sufren mutaciones aleatorias en la zona del gen del Ac, lo cual origina una
diversidad an mayor. Los genes de los Ac tambin se reorganizan en un proceso conocido
como conmutacin de clase de Ig que cambia la base de la cadena pesada por otra, creando
un isotipo de anticuerpo diferente que mantiene la regin variable especfica para el antgeno
diana. La produccin de anticuerpos es la funcin principal del sistema inmunitario humoral.
La interaccin in vitro Ag Ac

ti c
An
o
rp
ue

La unin Ag-Ac es reversible y estn

implicados enlaces no covalentes. Como ya
vimos, cada Ag est definido por su Ac, los
cuales interactan por complementariedad
espacial. La zona donde el Ag se une al Ac
recibe
el
nombre
de
epitope
o
determinante antignico, mientras que el
rea correspondiente de la molcula del Ac
es el paratope.

Epitope Paratope

Se realiza en 2 etapas: interaccin primaria (no visible) e interaccin secundaria (aparicin de

un fenmeno visible). Las segundas son ms sencillas y econmicas que las primeras pero para
su deteccin es necesario mayor cantidad y calidad de Ag o Ac.
Esto se relaciona directamente con la sensibilidad y la especificidad de cada prueba a
realizar. La mayor limitacin es la produccin de Ag Ac especficos comerciales para la
realizacin de las pruebas.

En la actualidad se producen reactivos de alta pureza en gran escala comercial por medio de
tcnicas de biologa molecular donde pueden modificarse las molculas para incrementar su
reactividad y/o afinidad.
Se usan molculas producidas por metodologa recombinante (por ej.: el DNA recombinante es
resultado del uso de diversas tcnicas que los bilogos moleculares utilizan para manipular las
molculas de DNA y difiere de la recombinacin gentica que ocurre sin intervencin externa
dentro de la clula), cuyo propsito es la de poder introducir cambios (modificaciones) en la
secuencia del gen que las codifica (por ejemplo cambiar un grupo qumico especfico) que
facilitan su purificacin, la hacen ms antignica o producen anticuerpos especficos para un
epitope o para un paratope determinado.

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LadeteccindeAgespruebaindudabledeunainfeccin
activaoreciente,enunamuestrabiolgicadelsitiode
infeccinoenmuestrasdondeelmicroorganismoest
ubicadoenotrolugarperoseeliminanporall.
LapresenciadeAcespecficos(suerodelpaciente)es
demostracinqueelagenteinfecciosoest(IgM)oestuvo
(IgG)presenteenesehospedero.

Son tcnicas rpidas, simples y altamente especficas. Se realizan las determinaciones

tanto de Ag como de Ac con las mismas tcnicas inmunolgicas de laboratorio. Pueden
realizarse cuando el paciente comenz la terapia antimicrobiana o su patologa la produce una
toxina del microorganismo. Es decir que la tcnica es la misma, lo que cambia es la muestra: si
es directamente de la muestra biolgica; es un ensayo directo y si la hacemos con suero del
paciente el ensayo se llamar indirecto.

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Suero del paciente: deben extraerse entre 5 y 10 ml de sangre, dejar que coagule a
temperatura ambiente (20 minutos) y separar el suero por centrifugacin (1000-1200 g durante
10 minutos). Una vez separado el suero, puede mantenerse a 4-6 C durante una semana, pero
es preferible congelarlo a -20 C (se conserva aos si se evita la descongelacin y congelacin
repetidas).
Entonces es bueno a esta altura recordar el concepto de ttulo.

Para la titulacin tanto de Ag como de Ac en distintos fluidos biolgicos. Es importante destacar

que NO es posible determinar la concentracin cuantitativa exacta de Ag ni de Ac sino que ser
posible calcular un ttulo de Ag o de Ac.

Para ello, se realiza la interaccin de diluciones seriadas del suero del paciente con cantidades
constantes de Ag o diluciones seriadas del material biolgico del paciente (Ag) con cantidades
constantes de Ac.

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Macrodilucin

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128

1/512

1/1024

1/2048

1/4096

Microdilucin

Seeligearbitrariamentecomottuloalainversa
delamximadilucindesuero(Ac)omaterial
biolgico(Ag)queproduceinteraccinvisible.

Por ejemplo:
Una muestra de lquido cefalorraqudeo la diluimos a la mitad 10 veces consecutivas, luego a
cada dilucin le aplicamos la tcnica elegida para que reaccione con anticuerpos especficos
conocidos. Observamos hasta qu dilucin dio positiva la interaccin Ag-Ac: Titulo de Ag XX.

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Paciente 1
Dilucin

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128

1/256

1/512

1/1024

Tcnica

Reactiva
a:
128dil

g
a

Concluimos que la reaccin en LCR investigando la presencia de un Ag XX fue reactiva hasta

128 dil. Por lo que el agente etiolgico de la patologa que cursa es el que posee el Ag XX.

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Paciente 2:

Dilucin 1/2
Tcnica

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128

1/256

1/512 1/1024

No
reactiva

El agente etiolgico de la patologa que cursa el paciente 2 no posee el Ag XX ensayado.

Los mtodos directos son reactivos o no son reactivos segn la sensibilidad que tenga la tcnica
empleada.
En cambio en los mtodos indirectos podemos trabajar con 2 muestras de suero de un
mismo paciente tomadas a diferentes tiempos (da 1 y a los 15 das) para comparar mediante
alguna tcnica el ttulo de Ac en ambas muestras e interpretar los resultados
Ejemplos:

Paciente 3: Seroconversin

Da1

Dilucin 1/2 1/4

Tcnica

Dilucin 1/2 1/4

Tcnica

1/8

1/16

1/32

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128

1/256

1/512

1/1024

1/64

1/128

1/256

1/512

1/1024

Dia15

Reactivo
a:
2dil
Reactivo
a:
128dil

Resultado: Infeccin activa del agente etiolgico cuyo Ag, es especfico del Ac ensayado
Paciente 4

Da1

Dilucin

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128

1/256

Tcnica

Da15

Dilucin

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128

1/256

Tcnica

1/512 1/1024

1/512 1/1024

Reactivo
a:
8dil
Reactivo
a:
16dil

Resultado: la patologa que cursa en este momento no se debe al agente etiolgico, cuyo Ag XX
especfico no induce la formacin del Ac ensayado.
Tuvo la infeccin a ese Ag en el pasado: Ac (IgG) de memoria inmunolgica.

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Paciente 5: Seroconversin

Dilucin 1/2
Tcnica

1/4

1/8

1/16

Da1
1/32 1/64

1/128

1/256

1/128

1/256

1/512 1/1024

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/512 1/1024

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Dilucin 1/2

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Da15

Tcnica

No
reactiva

Reactiva
a:
16dil

Resultado: Infeccin activa del agente etiolgico cuyo Ag XX es especfico del Ac ensayado

Se denomina SEROCONVERSIN a la aparicin de Ac o al

aumento del ttulo de Ac (IgG) en 4 veces en un perodo
entre2y4semanas.
1ramuestra
()
(+)(ej1:8)
(+)(ej1:4)
()
(+)(1:8)

2damuestra
()
(+)(ej1:8;1:16)
(+)(ej1:2)
(+)(hasta1/64)
(+)(>1:128)

Significado
Pacientesusceptible
PacienteInmune
PacienteInmune
Infeccinactual
Infeccinactual

Qu necesitamos para la realizacin de estas tcnicas?

Las tcnicas ms utilizadas en estos momentos son:

Aglutinacin

Son tiles tanto para detectar Ag (aglutinacin directa) como Ac (aglutinacin indirecta).
Se basan en que tanto sea el Ag como el Ac conocido debe estar adherido por su fragmento Fc
en un medio lquido a un soporte esfrico (partcula de ltex, glbulo rojo, oro coloidal, gelatina
u otro material) y se debe enfrentar con una gota de la muestra biolgica o del suero del
paciente.

Se forma una aglutinacin visible macroscpicamente de

partculas que nos indican la presencia de la interaccin Ag-Ac.

Es una tcnica poco sensible por lo que se utiliza mayormente

para identificacin de microorganismos (Laboratorio de
Habilidades N 3) debido a que requiere gran cantidad de
microorganismos en la muestra si buscamos identificarlos
despus de su aislamiento en medios de cultivo. Con ello
obtenemos el serotipo del microorganismo hallado o
simplemente se lo identifica (gnero y especie).
Se pueden realizar sobre un portaobjeto. Si la aglutinacin es
poco visible se puede colocar en un aglutinoscopio (vidrio con fuente de luz) o sobre un vidrio
oscuro.
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Si el soporte es un glbulo rojo la tcnica recibe el nombre de hemoaglutinacin

Inmunofluorescencia - Directa (IFD) o Indirecta (IFI)

La fluorescencia es la propiedad que tiene una sustancia de emitir luz cuando es expuesta a
radiaciones de baja longitud de onda y alta energa (UV, RX). Las radiaciones absorbidas
(invisibles al ojo) son transformadas en
luz visible o sea de una luz de mayor
longitud de onda que la incidente. La
absorcin de luz por parte de la molcula
de fluorocromo (sustancias que emiten un
fotn cuando son excitados por un fotn
incidente) la eleva a un estado de
excitacin en el cual contiene mayor
energa. La molcula permanece en
estado de excitacin por un perodo de
tiempo muy corto. El retorno a un nivel de
energa menor es acompaado por
emisin de luz (fluorescencia).

IFD

Se realiza en 1 solo paso. Se coloca la muestra sobre un porta objeto y se le adiciona un Ac

marcado con fluorescena. Se deja interaccionar y se enjuaga. La observacin de una
fluorescencia (con microscopio de fluorescencia) es reaccin positiva. La ausencia de
fluorescencia verde manzana es ausencia de Ag o sea reaccin negativa.
Ej: Los virus se pueden detectar por la produccin de protenas vricas cuando se estn
multiplicando en una clula mediante Ac especficos para esas protenas marcados.

IFI
Esta tcnica se realiza en 2 pasos:
1- Interaccin del Ag conocido con el suero del paciente (Ac?)
2- Revelado: colocar un anticuerpo especfico para la Fc del Ac marcado con fluorescena.
Observacin de fluorescencia verde manzana nos dice que es una reaccin positiva, que en
la muestra haba Ac especficos para el Ag que estaba en el soporte.
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Con un solo Ac marcado puedo realizar todas las IFI porque es especfico a la fraccin
constante de las Ig .
Ventajas:
Se pueden obtener resultados rpidos
No es necesario realizar cultivos
Se pueden identificar un microorganismo muerto o uno en un grupo mixto

Desventajas:
Costos en reactivo y equipo
Debe ser realizado por personal muy especializado.
Los resultados no son 100% especficos.

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ELISA (Enzimoinmunoanlisis)

Se realizan en microplacas de 96 pocillos fondo en U de plstico o un soporte de nitrocelulosa al

que se le ha fijado un Ag o un Ac conocido segn lo que desee estudiar.

Para evitar problemas de comprensin vamos a describir esta tcnica suponiendo que deseo
investigar en una muestra de endocrvix la presencia de Chlamydia trachomatis (Ct) sea la
realizacin de tcnica de ELISA directa.
En los pocillos o en la tira se fija el Ac especficos para Ct (comercial) se le aade una
gota de la suspensin del hisopado endocervical extrado de la paciente. Si tienen Ag de
Ct estos se fijarn a los Ac que estn.

Para revelar la existencia de esos Ag fijados se aade otro Ac dirigido tambin contra el
Ag de Ct pero marcado con una enzima.

Se le adiciona un sustrato (incoloro) sobre el que acta la enzima

Aparece un color debido a un producto coloreado cuya intensidad puede medirse con un
colormetro. Cuando en la muestra no existe Ag buscado (Ag Ct) no se produce color.

A lo largo de estos ltimos aos se ha ido optimizando esta tcnica ganando sensibilidad y
especificidad. Observemos por ejemplo lo que ocurri con la deteccin de la infeccin por HIV.

ELISA 1ra. generacin: No tan sensible y especfico. Por ejemplo para HIV se usaban
como Ag lisado de virus.

ELISA 2da. generacin: Ya se usaban protenas recombinantes y/o pptidos sintticos.

Ya se poda detectar HIV1 y HIV2.

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ELISA 3ra. generacin: tipo sndwich, utilizan un Ag marcado como conjugado. Gran
sensibilidad.

ELISA 4ta. generacin: Detectan Ag (p24) y Ac. Acortan el perodo ventana. Gran
sensibilidad.

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Quimioluminiscencia

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Se utilizan molculas que producen luz generalmente por oxidacin (quimioluminiscencia) como
ser: luminol, isoluminol, esteres de acridina adamantil dioxietano

HRP:Peroxidasaderbano

Inmunocromatografa

La inmunocromatografa se
basa en el desplazamiento de
una muestra a travs de una
membrana de nitrocelulosa. La
muestra es aadida en un
extremo de la tira en la zona del
conjugado, el cual est formado
por un Ac especfico contra el
epitope o uno de los epitopes
del Ag a detectar y un reactivo
de deteccin. Si la muestra
contiene el Ag problema, ste
se unir al conjugado formando
un complejo inmune (Ag-Ac) y
se desplazar a travs de la
membrana de nitrocelulosa.
Sino, migrarn el conjugado y la
muestra sin unirse.

La zona control est formada por un tercer Ac que reconoce al reactivo de deteccin. Cuando el
resto de muestra alcanza esta zona, el Ac se unir al conjugado libre que no ha quedado
retenido en la zona de captura. Esta lnea es un control de que el ensayo ha funcionado bien,
porque se colorea siempre, con muestras positivas y negativas.

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Son tcnicas muy sensibles, simples y rpidas. No es necesario de reactivos adicionales ni

instrumental.
Se presenta en varios formatos pero generalmente en tira, en el cual la muestra problema fluye
a lo largo de un sustrato slido por medio de una accin capilar.

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Ejemplo de utilizacin: Deteccin de HIV en campaas masivas - Test de embarazo disponible a

la venta en farmacias.

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Western blot

En las tcnicas antes descriptas para las reacciones serolgicas pueden haber situaciones en
que resulten positivas y no nos permiten conocer contra que Ag o mezcla de Ag se ha
producido esa reaccin. Pueden ser muy sensibles pero tambin puede ocurrir que nos den
falsos positivos. Es por esta razn que se hace una segunda tcnica para confirmar denominada
Western blot.
Se basa en los siguientes pasos:

1. Se separan determinados Ag conocidos por electroforesis en gel de poliacrilamida. Este

gel no es muy confiable para realizar interaccin entre Ag-Ac.
2.

Se transfieren los Ag separados a una membrana de nitrocelulosa.

3. Se cubre la membrana con suero del paciente (Ac????)

4. Se cubre luego con otro Ac marcado (especfico para la fraccin Fc del posible Ac del
paciente).

5. Revelado segn la marca que tenga el 2do. Ac: enzima, fluorescencia, etc.

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LIA (Line Inmunoassay)

Inmunoensayo comercial en lnea con protenas y pptidos sintticos de VIH-1 y VIH-2
impregnadas en tiras de nitrocelulosa.

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Se observan siempre bandas utilizadas como control de procedimiento y de peso molecular,

ausencia de bandas en la muestra del paciente resulta no reactivo.

RIBA (Recombinant inmunoblot assay)

En la actualidad los Ag se obtienen individualmente por una tcnica recombinante

(introduciendo un gen que codifica al Ag en una bacteria distinta, la cual producir el Ag puro).

Se coloca cada uno de los Ag que se desea estudiar en distintos puntos de la tira de
nitrocelulosa y se revela como un WB.

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Inmunidad Celular
Pruebas cutneas de hipersensibilidad mediadas por clulas
Ag (desencadena respuesta de inmunidad celular)

Ppula indurada: paciente sensibilizado

Inoculacin: intradrmica

Mecanismo: reaccin mediada por macrfagos activados por el interfern y producido por
los linfocitos T CD4.

Microorganismos : micobacterias, Brucella, Histoplasma, Leishmania, Paracocidioides, etc.

Lectura 48-72 hs. (precoces de hs. No corresponde a una respuesta celular)

Interpretacin: mm de induracin. Si se considera positiva, solo indica que ha habido

contacto previo con el agente etiolgico, cercano o lejano pero no se correlaciona con
enfermedad actual.

Ensayo de Interfern gamma (IGRA): reemplaza a la determinacin de PPD para

micobacterias, detecta la produccin de interfern gamma por los linfocitos T CD4, inducida
por los macrfagos que le presentan el Ag. Son ms tiles en los inmunodeprimidos y en los
vacunados por BCG.

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Para terminar

Comenzamos este caminar por el laboratorio de diagnstico microbiolgico clnico

proponindoles descubrir el fascinante mundo microbiano capaz de injuriar al hombre y cmo
detectarlo. Esperamos haber contribuido en algo.
Los esfuerzos, realmente, no fueron pocos. Hicimos todo lo que estuvo a nuestro alcance y un
poquito ms.
Quedamos a disposicin de Uds. Hasta pronto.
Cuerpo docente
Ctedra Microbiologa, Parasitologa y Virologa
Facultad de Ciencias Mdicas UNR

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