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I. Resumen
Rafael Coronado
Daisy Friz
Daniela Troncoso
Jennifer Yaez
Pedro Corts
II. Introduccin
En los ltimos aos la resistencia a los carbapenmicos ha aumentado
considerablemente, esto debido a diversos mecanismos de resistencia por parte de la familia
Enterobacteriaceae y en general en los Bacilos Gram Negativos. El principal mecanismo es
la produccin -lactamasas, enzimas capaces de hidrolizar distintos antibiticos lactmicos. Dentro de la amplia gama de -lactamasas, las carbapenemasa, que se
encuentran en el grupo 2, 3 y 4 de Bush y Jacob y que corresponden a diferentes clases
moleculares de Ambler,
Descritas en Japn en el ao 1991 en Pseudomonas aeruginosa y posteriormente en
diversas especies de enterobacterias como Serratia marcescens. La carbapenemasa
corresponde a una metalo -lactamasa del grupo 3 de clase B denominada IMP. El gen
encargado de este mecanismo es capaz de transferirse a travs de plsmidos. Esta enzima se
ha descrito con mayor frecuencia en P. aeruginosa que en enterobacterias. En el ao 1997
se detect otra enzima con las mismas caractersticas, VIM, en P. aeruginosa,
posteriormente se detect en S. marcescens, E. coli y K. pneumoniae distribuida en distintos
pases de Europa.
Las enzimas IMP y VIM son capaces de hidrolizar a todos los -lactmicos a
excepcin del aztreonam y adems no se inhiben con inhibidores -lactmicos (cido
(EDTA) y compuestos
tiolticos
(cido
2-mercaptopropinico, cido
dipicolnico).
Hoy en da hay descritas otras enzimas con similares caractersticas como SPM,
GIM, SIM, AIM, DIM, KHM y NDM-1, las cuales crean un perfil multirresistente o
panresistente en los aislados bacterianos. El descubrimiento de una Klebsiella pneumoniae
que expresaba la enzima NDM fue encontrada en un paciente sueco proveniente de la India.
Hoy en da esta enzima se ha encontrado en otros pases Europeos y en otras especies de
enterobacterias (Escherichia coli) y en Bacilos no Fermentadores (Acinetobacter spp.).
Otro grupo importante de carbapenemasas son las de clase A (dentro del grupo 2).
La primera enzima de esta clase era de origen cromosmico, SME, se encontr por primera
vez en Serratia marcescens, luego en Enterobacter cloacae. De esta enzima existen al
menos 3 variantes capaces de hidrolizar a los carbapenems incluyendo al aztreonam, y en
menor medida a las cefalosporina de tercera y cuarta generacin. Estas no son inhibidas por
EDTA pero frente a los inhibidores de -lactamasas como el tazobactam son capaces de
inhibirlas parcialmente. Otras enzimas, IMI y NMC, fueron encontradas en Enterobacter
sp. Pero la enzima con mayor importancia y que se encuentra en la Clase A es la KPC ( K.
pneumoniae carbapenemasa), primeramente descrita en Estados Unidos en 1996, tambin
se ha aislado en pases Europeos, India y Amrica del Sur. Esta enzima es de naturaleza
plasmdica. No solo se ha descrito en Enterobacteriaceae sino que tambin en otros Bacilos
No Fermentadores (Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumanii).
La enzima KPC es capaz de hidrolizar eficientemente penicilinas, cefalosporinas y
carbapenmicos, en menor medida a las cefamicinas (cefoxitina), no son inhibidas por los
inhibidores -lactmicos pero si por el cido bornico (utilizado fenotpicamente).
El principal mecanismo de resistencia a los antibiticos -lactmicos en
enterobacterias es el enzimtico, debido a la produccin de -lactamasas. stas, debido a su
potencial expansivo y prevalencia han tenido una mayor relevancia clnica en la primera
dcada del siglo XXI, son las que generan resistencia a las cefalosporinas de tercera
generacin, como las -lactamasas de espectro extendido (BLEE), quedando como
alternativa teraputica los antibiticos carbapenmicos, como imipenem, meropenem,
doripenem y ertapenem.
Sin embargo, durante los ltimos aos se ha producido la aparicin y diseminacin
de enterobacterias productoras de enzimas que confieren resistencia a todos los antibiticos
-lactmicos, incluyendo los antibiticos carbapenmicos, lo cual limita de manera
importante el arsenal teraputico frente a estas bacterias. Las enzimas -lactamasas se
dividen en 4 grupos, segn la clasificacin molecular de Ambler, estando presente las
carbapenemasas en 3 de ellos (tabla 1).
Tabla 1. Grupos de -lactamasas y carbapenemasas
Grupo Ambler
Nombre Comn
Serin carbapenemasas
Resistencia a
Carbapenmicos,
Ejemplos Subtipos
KPC, GES, SME1
Penicilinas,
Cefalosporinas,
Aztreonam
B
Metalo
carbapenemasas
excepto Aztreonam
Cefalosporinasas
Penicilinas,
AmpC
Cefalosporinas, incluido
Cefoxitin,
Cefotetan,
Ceftriaxona, Cefotaxima
D
Oxacilinasas
Carbapenmicos,
OXA
Penicilinas,
Cefalosporinas,
Aztreonam
blaimp, blaspm, blandm, entre otros. Las cepas que presenten carbapenemasas son
sometidas a un estudio de caracterizacin molecular, el cual incluye la subtipificacin
gentica por electroforesis de campo pulsado (PFGE) y determinacin de tipo de secuencia
(ST) a travs de tipificacin de multilocus (MLST) de acuerdo a protocolos estandarizados.
En el periodo comprendido entre Enero de 2012 y Diciembre de 2014 el laboratorio
de referencia de IAAS recibi 2.557 cepas para la vigilancia de carbapenemasas en
enterobacterias, el 67,9% (1.736) de las cuales procedan de establecimientos de salud de la
Regin Metropolitana, principalmente pertenecientes al SS Metropolitano Sur, que
representa el 15,5% (396) del total de cepas recibidas. Klebsiella pneumoniae representa el
88% (2.249) de las cepas recibidas. De las cepas recibidas en el periodo de estudio se
confirm el 1,3% (34) con presencia de carbapenemasas. Como informacin
complementaria a este boletn, desde el inicio de la vigilancia en el ao 2012 hasta fines de
Abril del 2015, se han confirmado en total 40 cepas con presencia de carbapenemasas. El
94,1% (32) de las cepas confirmadas con presencia de carbapenemasas corresponden al tipo
KPC, 1 al tipo NDM y 1 cepa al tipo OXA. En la tabla 2 se presentan las cepas confirmadas
segn tipo de carbapenemasa y agente.
Las cepas confirmadas con presencia de carbapenemasas tipo KPC presentaron el
siguiente fenotipo: -lactamasa positiva BLEE, Test de Hodge positivo, Test de cido
Bornico positivo y prueba de Blue- Carba positivo.
Ao
Total
2012
2013
2014
Klebsiella pneumoniae
12
25
Klebsiella oxytoca
Enterobacter cloacae
Citrobacter freundii
Serratia marcescens
Escherichia coli
Total
13
14
34
BLEE
Test
Tipo
positivo
de
EDTA positivo
cido
Blue Carba
Hodge
Bornico
positivo
positivo
positivo
KPC
32
32
32
32
NDM
OXA
1*
1*
imipenem y meropenem, en el rango de categora sensible, segn CLSI. Este hecho motiv
la recomendacin del ISP para la inclusin de pruebas de screening para carbapenemasas en
Klebsiella sp. aisladas en pacientes de riesgo y que presenten algn grado de resistencia a
cualquier carbapenmico incluido ertapenem (Ord. C/160 del 28 de enero de 2014). No
obstante los valores de CIM obtenidos en este caso, las cepas se informaron como
resistentes a carbapenmicos. Este fenmeno tambin ha sido observado en una de las
cepas de E. cloacae KPC positivo, en la cepa K. pneumoniae OXA positivo y las 3 cepas de
K. oxytoca KPC positivo confirmadas en el ao 2014.
El estudio de caracterizacin molecular en las cepas de K. pneumoniae portadoras
de carbapenemasas, revel un carcter policlonal a travs de la subtipificacin por
electroforesis de campo pulsado. El estudio de tipo de secuencia (ST) detect la presencia
en nuestro pas del ST-258, tipo de secuencia ampliamente reportado en el mundo y con un
marcado componente epidmico. Adems, el estudio de MLST confirm la presencia de un
ST de carcter nacional denominado ST-1161, el cual no haba sido reportado previamente
en la base de datos internacional de MLST.
Existe la presencia de un nuevo tipo de carbapenemasa denominada Nueva Delhi
(metalo -lactamasa), que corresponde a un tipo de carbapenemasa que confiere resistencia
a todos los antibiticos -lactmicos excepto aztreonam. Por ello, los microorganismos
productores de NDM son considerados multi resistentes, dejando muy pocas opciones
teraputicas para tratar a pacientes infectados con estas bacterias. adems, los grmenes
productores de NDM son capaces de lograr una profusa diseminacin tanto a nivel
nosocomial como as tambin en el ambiente extra hospitalario. A diferencia de KPC donde
la dominacin por un nico tipo clonal es lo ms frecuente reportado, los pases que han
documentado la presencia de NDM sobrellevan simultneamente diseminacin vertical
como as tambin horizontal. Este mecanismo de resistencia fue detectado en Guatemala.
Desde 2012 a la fecha se ha detectado en distintos tipos bacterianos como, Klebsiella
pneumoniae, Acinetobacter pittii, Providencia rettgeri. Acinetobacter baumannii,
Escherichia coli y Enterobacter cloacae.
Esto fue
pesquisado a travs de pruebas de screening como (test de EDTA para metalo -lactamasas,
test de Hodge y cido Bornico) y pruebas moleculares PCR. Esta cepa fue aislada de un
paciente hospitalizado en un centro asistencial de la regin Metropolitana.
La deteccin exacta de Bacilos Gram Negativos productores de carbapenemasas es
de importancia para el control nosocomial de infecciones y para la pronta iniciacin de una
terapia antimicrobiana correcta. Actualmente la CLSI ha normado diferentes tipos de
screening para detectar este tipo de mecanismos de resistencia, algunos de ellos se
explicarn posteriormente.
IV. Mtodos de screening para bsqueda de Carbapenemasas
EDTA (monodisco)
Mtodo simple y sencillo, utilizado en las pruebas de sensibilidad a los
antimicrobianos para detectar fenotpicamente enzimas metalo -lactamasas (MBLs), estas
enzimas tienen la caracterstica de ser inhibidas por agentes quelantes de zinc, como el
EDTA (cido etilendiamino tetracetico) y el SMA (Mercaptoacetao de sodio).
Llamado doble difusin de discos, segn normas de la CLSI, en el cual se utilizan discos de
imipenem, meropenem y disco de EDTA. El disco de EDTA va colocado al centro y los
otros discos de carbapenem van ubicados uno a cada lado del disco de EDTA con una
distancia de 15 mm (de borde a borde de ambos discos).
Un resultado positivo consiste en la formacin de un conocido efecto huevo, este
se observa al darse agrandamiento de la zona de inhibicin del desarrollo alrededor del
disco de imipenem o meropenem hacia el disco de EDTA.
Test de Hodge Modificado
Este test no est recomendado por el EUCAST por su baja especificidad y por la dificultad
en la interpretacin de los resultados en bacterias con otros mecanismos de resistencia a lactmicos.
La sensibilidad y especificidad del test en la deteccin de otras carbapenemasas
distintas de la KPC puede variar. Este test ha demostrado tener poca sensibilidad en la
deteccin de la metalo--lactamasa de tipo Nueva Delhi (Clase B), con una sensibilidad por
debajo del 50% debido a que esta carbapenemasa es serino-dependiente, componente
crucial para la resistencia a los antibiticos. Incluso la adicin en medios de cultivo de
sulfato de zinc no pudo revertir los falsos negativos. Estudios realizados indican que la
NDM-1 es una lipoprotena anclada a la membrana externa de las bacterias Gram negativas,
caracterizada como una enzima periplsmica soluble. Esta localizacin celular es
consistente con la presencia de una secuencia de lipidacin cannica, denominada el
lipobox, que se encuentra en una posicin proximal al pptido seal de la NDM-1. Por lo
que esta -lactamasa de anclaje a membrana se opone a la deteccin en el THM.
En este estudio presentado se trata de mostrar que estos falsos negativos del THM pueden
ser atribuibles a la caracterstica de anclaje de NDM-1 .
Test de cido bornico
El cido bornico es un inhibidor selectivo de las carbapenesas tipo A
serincarbapenemasas (KPC, Sme, NMCA), observndose una sinergia entre los discos de
cido bornico y el antibitico carbapenmico. Sin embargo, el cido bornico presenta una
baja especificidad en detectar la presencia de carbapenemasas en cepas que presentan altos
niveles de AmpC como ocurre en Enterobacter sp, Citrobacter sp.
Otros mtodos de bsqueda de carbapemasas:
Carba Blue
Prueba bioqumica para la deteccin rpida de la produccin de carbapenemasas en
Bacilos Gram Negativos directamente de un cultivo bacteriano. Su principio es la hidrlisis
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Limitaciones
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14
nueva Delhi es dependiente de Zn, y se llevaron a cabo pruebas con distintas cepas que
producen diferentes clases de metalo -lactamasa.
Resultados
Las metalo -lactamasas que tienen la caracterstica de estar ancladas a la
membrana (NDM-1) da lugar a falsos negativos en el Test de Hodge Modificado. Con el fin
de demostrar el impacto de las MBL que se encuentran ancladas a la membrana y el
rendimiento del THM ante este aspecto. se realiz el THM con una cepa de E.coli DH5alfa
que posee variantes solubles y con la caracterstica de anclaje a la membrana de NDM-1 y
VINM-2
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VII. Conclusin
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VIII. Anexo
Protocolo de implementacin en laboratorio
Deteccin de carbapenemasas mediante Test de Hodge Triton
Este tipo de test permite de mejor manera la deteccin de carbapenemasas tipo Nueva Delhi
(NDM) y otras de importancia clnica como las conocidas KPC, MBLs y OXA48.
Para realizar este ensayo se requiere de los siguientes materiales
-
Procedimiento:
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de la cepa en estudio
Indeterminado THT: se observa una zona clara a lo largo de la estra de la cepa en estudio.
Esto se debe a que algunas cepas pueden producir sustancias que inhiben el crecimiento de
E. coli ATCC 25922.
IX. Referencias
Pasteran, F., Veliz, O., Ceriana, P., Lucero, C., Rapoport, M., Albornoz, E., Corso, A.
(2015). Evaluation of the Blue-Carba Test for Rapid Detection of Carbapenemases in
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Gram-Negative
Bacilli.
Journal
of
Clinical
Microbiology,
53(6),
19961998.
http://doi.org/10.1128/JCM.03026-14
Pasteran, F., Tijet, N., Melano, R. G., & Corso, A. (2015). Simplified Protocol for Carba NP
Test for Enhanced Detection of Carbapenemase Producers Directly from Bacterial Cultures.
Journal of Clinical Microbiology, 53(12), 39083911. http://doi.org/10.1128/JCM.0203215
Pasteran F, Gonzalez LJ, Albornoz E, Bahr G, Vila AJ, Corso A. 2016. Triton Hodge test:
improved protocol for modified Hodge test for enhanced detection of NDM and other
carbapenemase producers. J Clin Microbiol 54:640649. http://doi:10.1128/JCM.01298-15.
Erwin Landskron, Pedro Cortes. (2014). Capitulo XII. Drogas antimicrobianas.
Clasificacin de antibioticos y quimioterapicos. En Manual de Microbiologa Clnica y
Diagnstico Microbiolgico (486-491).
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