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So Paulo
2008
So Paulo
2008
AGRADECIMENTOS
Professora Deborah Bastos, com todo respeito e admirao, pela
oportunidade, orientao, confiana e por todos os ensinamentos,
fundamentais para minha formao.
Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior
(CAPES) pela concesso da bolsa de estudos e Fundao de Amparo
Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP) pelo auxlio financeiro
(Processo 2006/58019-5).
Leo Jnior pelo fornecimento do extrato solvel de erva mate.
Ao Professor Ubiratan Fabres Machado e equipe do Laboratrio de
Fisiologia e Biofsica do ICB-USP pela imensa contribuio ao trabalho, em
especial Dra Helayne Soares de Freitas.
Ao Professor Marcelo Lima Ribeiro e equipe da Universidade So
Francisco pela oportunidade de realizao e ajuda nas anlises de PCR.
Professora Sandra Vivolo pelas sugestes e crticas construtivas
que enriqueceram a dissertao.
Dra Simone Mendona pela ajuda nas anlises e sacrifcio dos
animais.
Gianni pela orientao estatstica.
s amigas Ruth, Greisse e Carla pela maravilhosa convivncia,
amizade e ajuda durante o Mestrado;
RESUMO
Introduo: A incidncia e prevalncia do Diabetes Mellitus aumentam a
cada ano, alcanando propores epidmicas. A infuso aquosa de erva
mate apresenta considerveis teores de cidos clorognicos, que alm de
atuarem como antioxidantes, podem diminuir a produo e absoro de
glicose, conforme indicado na literatura. Objetivos: Avaliar a influncia da
ingesto de infuso de erva mate sobre parmetros
bioqumicos
ABSTRACT
Introduction: The incidence and prevalence of Diabetes Mellitus are
increasing, reaching epidemic proportions. Yerba mate infusions are rich in
polyphenols, especially chlorogenic acids, that are known to have antioxidant
properties. Evidences suggest that dietary polyphenols could also play a role
in glucose metabolism and absorption. Objective: The aim of this study was
to evaluate if yerba mate extract could have antidiabetic properties in alloxaninduced diabetic Wistar rats. Research design and methods: Wistar rats
(n=41) were divided in four groups: non diabetic control (NDC, n=10); non
diabetic yerba mate (NDM, n=10); diabetic control (DC, n=11) and diabetic
yerba mate (DM, n=10). Diabetes was induced by alloxan (38 mg/kg bw).
The mate group animals received yerba mat extract diluted in saline
solution in a 1g extract/kg bw dose for 28 days, controls received saline
solution only. The following biochemical parameters were measured: serum
glucose, insulin and total cholesterol; hepatic glucose-6-fosfatase activity and
gene expression of the intestinal Na+/glucose cotransporter SGLT1.
Results: There were no significant differences in serum glucose, insulin, total
cholesterol and hepatic glucose-6-phosphatase activity between the groups
that ingested yerba mate extract (NDM and DM) and the controls (NDC and
DC). However, the intestinal SGLT1 gene expression was significantly lower
in animals that received yerba mate both in upper (p=0.007) and middle
small intestine (p<0,001). Conclusion: These results indicate that bioactive
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composio do extrato solvel de erva mate ............................ 44
Tabela 2 - Presena e grau de cetonria no primeiro dia de interveno
(d=1), de acordo com o grupo ...................................................................... 47
Tabela
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura qumica do cido clorognico (5-O-cafeoilqunico) ...... 21
Figura 2 - Transporte acoplado de Na+/glicose pelo cotransportador SGLT1
..................................................................................................................... 25
Figura 3 - Stio de ao do complexo enzimtico glicose-6-fosfatase ......... 26
Figura 4 - Delineamento Experimental ........................................................ 36
Figura 5 - Perfil cromatogrfico do extrato solvel de erva mate................. 44
Figura 6 - Diurese de 24 horas (mL) dos animais, segundo grupo e data de
coleta............................................................................................................ 46
Figura 7 - Evoluo da mdia de peso dos animais por grupo.................... 48
Figura 8 - Colesterol total dos animais ao final do experimento (d=29), de
acordo com o grupo...................................................................................... 49
Figura 9 - Expresso relativa dos transportadores SGLT1 intestinais
(duodeno) de acordo com o grupo. .............................................................. 52
Figura 10 - Expresso relativa dos transportadores SGLT1 intestinais
(jejuno) de acordo com o grupo.................................................................... 52
12
NDICE
1- INTRODUO....................................................................................... 14
1.1 - DIABETES E SADE PBLICA ....................................................... 14
1.2 DIAGNSTICO E ASPECTOS FISIOLGICOS DO DIABETES .... 16
1.3 POLIFENIS E CIDOS CLOROGNICOS ................................... 19
1.3.1 - Mecanismos de Ao................................................................. 24
1.4 ERVA MATE (Ilex paraguariensis)................................................... 27
1.5 - JUSTIFICATIVA:............................................................................... 30
2 - OBJETIVOS.......................................................................................... 31
2.1 - GERAL ............................................................................................. 31
2.2 - ESPECFICOS.................................................................................. 31
4 - RESULTADOS ..................................................................................... 44
4.1 COMPOSIO DO EXTRATO DE ERVA MATE: ........................... 44
4.2 - INDUO DO DIABETES E VARIVEIS DE CONTROLE DO
EXPERIMENTO........................................................................................ 45
4.3 - PARMETROS BIOQUMICOS E METABLICOS RELACIONADOS
AO DIABETES .......................................................................................... 48
5 DISCUSSO ........................................................................................ 53
13
6 - CONCLUSO ....................................................................................... 64
7 - BIBLIOGRAFIA .................................................................................... 65
ANEXOS ..................................................................................................... 75
Anexo 1 - Boxplot...................................................................................... 76
Anexo 2 - Carta de aprovao no comit de tica .................................... 78
14
1- INTRODUO
1.1 - DIABETES E SADE PBLICA
O Diabetes Mellitus uma sndrome de etiologia mltipla, decorrente
da falta de insulina e/ou da incapacidade da insulina de exercer
adequadamente seus efeitos. Como resultado ocorre a hiperglicemia, que
um importante fator no desenvolvimento e progresso da doena (SBD,
2002). problema de importncia crescente em sade pblica, pois sua
incidncia e prevalncia esto aumentando e alcanando propores
epidmicas. Este aumento se deve ao crescimento e ao envelhecimento
populacional, maior urbanizao e crescente prevalncia de obesidade e
sedentarismo (WILD et al., 2004).
Em 1985 estimava-se que existissem 30 milhes de adultos com
diabetes no mundo; esse nmero cresceu para 135 milhes em 1995,
atingindo 173 milhes em 2002, com projeo de chegar a 344 milhes no
ano 2030 (WILD et al., 2004). Atualmente, a prevalncia de diabetes maior
em pases desenvolvidos e estima-se que continuar sendo, porm o
aumento proporcional ser maior em pases em desenvolvimento, que em
2030 concentrar 2/3 dos indivduos diabticos. A estimativa de 70% de
aumento na prevalncia em pases em desenvolvimento, contra 42% nos
pases desenvolvidos (KING et al., 1998; WILD et al., 2004).
No ranking dos 10 pases com maior nmero de casos de diabetes, a
ndia aparece em primeiro lugar, seguida da China e dos Estados Unidos
nas estimativas dos anos 1995, 2000 e para 2030. O Brasil aparece em
15
oitavo lugar nas listas de 1995 e 2000, saltando para o sexto lugar na
estimativa para 2030, com aproximadamente 11,3 milhes de doentes (KING
et al., 1998; WILD et al., 2004). Em 2005 a populao de diabticos no
Brasil era estimada em 8 milhes, ou 4,5% da populao (SBD, 2007). Nos
Estados Unidos, aproximadamente 20 milhes de pessoas so diabticas, o
que corresponde a cerca de 7% da populao total. Estima-se que outros 54
milhes apresentem pr-diabetes, muitos no diagnosticados (ADA, 2008).
No mundo, o nmero de mortes atribudas ao diabetes est em torno
de
800
mil.
Entretanto,
consideravelmente
sabe-se
subestimado.
que
este
nmero
Freqentemente
de
doena
bitos
no
16
17
espontaneamente,
ocorrendo
apenas
quando
Pode ocorrer em
18
pelo
aparecimento
de
complicaes
crnicas
que
19
20
21
1999;
vasculares
(BIXBY
et
al.,
2005;
CLIFFORD,
2000),
22
23
24
1.3.1 - Mecanismos de Ao
Alguns mecanismos de ao dos cidos clorognicos sobre
parmetros relacionados ao diabetes foram propostos, porm ainda no
esto completamente definidos.
Em um estudo in vitro, WELSCH et al (1989) observaram uma
reduo de 80% da absoro de glicose pela membrana intestinal com a
presena de 5-CQA e o mecanismo sugerido foi a dissipao do gradiente
de Na+ na regio apical das clulas.
25
26
27
apresentou
mesma
ao
quando
administrado
oralmente
que se
renem
em
cooperativas
para process-la
ou
28
hemorridas,
obesidade,
fadiga,
reteno
de
lquido,
Devido a estas
29
et
al.,
2001);
atividade
quimiopreventiva
in
vitro
30
1.5 - JUSTIFICATIVA:
O diabetes mellitus uma doena cuja prevalncia tm tendncia
ascendente tanto em pases desenvolvidos quanto em desenvolvimento. Os
dados encontrados na literatura sugerem que alimentos e bebidas ricos em
cidos clorognicos possam exercer um papel benfico sobre a regulao
da glicemia. Sendo a erva mate Ilex paraguariensis (IP) um produto de fcil
acesso populao e com altos teores de cidos clorognicos, um estudo
sobre as possveis influncias de sua ingesto sobre parmetros
relacionados ao diabetes mellitus permitiria conhecer melhor o potencial
funcional deste produto, com potencial de utilizao da populao para, se
incorporado em dietas, auxiliar na preveno de doenas degenerativas e na
promoo de sade.
31
2 - OBJETIVOS
2.1 - GERAL
Avaliar a influncia da ingesto de erva mate sobre parmetros
sanguneos relacionados ao diabetes e sobre atividade da glicose-6fosfatase heptica e expresso do cotransportador de glicose SGLT1
intestinal em ratos Wistar.
2.2 - ESPECFICOS
-
32
3 - MATERIAIS E MTODOS
3.1 BEBIDA A BASE DE ILEX PARAGUARIENSIS
Utilizou-se extrato de erva mate verde na forma solvel, cedido pela
Leo Jnior S.A. Para a administrao, o extrato foi diludo em soluo
fisiolgica para a concentrao de 100 mg/mL.
33
No-Diabticos
Soluo
Fisiolgica (NDC)
(n=10)
Erva Mate (NDE)
(n=10)
Soluo
Fisiolgica (DC)
(n=15)
Diabticos
Erva Mate (DE)
(n=15)
A induo do diabetes foi feita por meio da droga aloxana (A741310G, Sigma-Aldrich, EUA) em dose nica de 38 mg/kg de peso do animal,
em uma soluo 30 mg/mL de soluo salina por meio intravenoso (veia
dorsal peniana), aps jejum de 12 horas e anestesia por inalao de ter
etlico. Os animais do grupo no-diabticos (ND) receberam a injeo com o
veculo apenas. Aps 2 horas, os animais receberam soluo de gua com
34
35
36
50 animais com
4 semanas
Crescimento e
adaptao (4
semanas)
28
GRUPO D
Induo do
diabetes
Grupo ND
Injeo com
salina
d=-3
Gaiolas
metablicas
(24 horas)
30
31
Coleta de sangue da
cauda para confirmao
do diabetes e coleta de
urina
Incio da
gavagem
GRUPO NDC
Salina
GRUPO NDE
Infuso de
erva-mate
GRUPO DC
Salina
Gaiolas
Metablicas
(24 Horas)
d=1
GRUPO DE
Infuso de
erva-mate
Pesagem peridica
durante
o
perodo
experimental
d=28
59
Coleta de urina
pesagem dos animais
60
dias
Sacrifcio e
coleta dos
orgos
d=29
37
Laboratrios
Ltda,
So
Paulo,
Brasil)
pelo
mtodo
de
38
atividade
do
complexo
enzimtico
glicose-6-fosfatase
foi
39
40
gua RNase free foram adicionados s mesmas, um novo tubo coletor foi
acoplado e novamente foi feita centrifugao centrifugadas a 10.000 x g por
1 min. As amostras sofreram choque trmico de 60 C por 2 minutos em
banho seco e em seguida foram tratadas com RNase out e incubadas em
estufa a 37C por 5 min.
A concentrao de RNA total foi determinada por leitura em
espectofotmetro em 260 nm. Essa leitura permite o clculo da
concentrao de cido nuclico da amostra. Uma unidade de densidade
ptica (DO) corresponde a aproximadamente 40 g/mL de fita simples e a
relao DO 260/DO 280 > 1,65 foi utilizada para estimar a pureza do cido
nuclico da amostra.
41
como
mdia,
desvio-padro,
entre
outras,
42
43
do
Instituto
de
Medicina
Tropical/Faculdade
de
44
4 - RESULTADOS
4.1 COMPOSIO DO EXTRATO DE ERVA MATE:
Foram determinados os teores de fenlicos totais, cafena e 5-CQA do
extrato solvel administrado aos animais (Tabela 1) e o perfil cromatogrfico
da amostra (Figura 5)
Tabela 1 - Composio do extrato solvel de erva mate
Composto
Quantidade (mg/g de extrato)
Fenlicos totais
420,0
Cafena
17,5
5-CQA
60,5
1= 5-CQA; 2= Cafena
45
ratos
dos
grupos
diabticos
apresentaram
diurese
46
*
*
#
Dados expressos como mdia (barra) e desvio padro (linha): *p<0,001 diabticos (DC e
DE) versus no-diabticos (NDC E NDE). #p=0,001 incio (d=1) versus final do experimento
(d=29). NDC= no-diabtico controle (n=10); NDE= no-diabtico erva mate (n=10); DC=
diabtico controle (n=11); DE= diabtico erva mate (n=10).
47
Cetonria
Total
NDC
NDE
DC
DE
Ausente
10
10
22
++
+++
Total
10
10
11
10
41
NDC= no-diabtico controle; NDE= no-diabtico erva mate; DC= diabtico controle; DE=
diabtico erva mate.
+= 5-40 mg/dL, cido acetilactico ligeiramente aumentado na urina;
++= 40-100 mg/dL, cido acetilactico aumentado na urina;
+++= mais de 100 mg/dL, cido acetilactico muito aumentado na urina.
10
10
38
++
+++
Total
10
10
11
10
41
NDC= no-diabtico controle; NDE= no-diabtico erva mate; DC= diabtico controle; DE=
diabtico erva mate.
+= 5-40 mg/dL, cido acetilactico ligeiramente aumentado na urina;
++= 40-100 mg/dL, cido acetilactico aumentado na urina;
+++= mais de 100 mg/dL, cido acetilactico muito aumentado na urina.
48
*p=0,02 e # p<0,001 no diabticos (NDC e NDE) versus diabticos (DC e DE); NDC= nodiabtico controle (n=10); NDE= no-diabtico erva mate (n=10); DC= diabtico controle
(n=11); DE= diabtico erva mate (n=10).
4.3
PARMETROS
BIOQUMICOS
METABLICOS
RELACIONADOS AO DIABETES
No foram observadas modificaes nos nveis de colesterol total em
funo da ingesto da erva mate (p=0,66) e a diferena entre diabticos e
no diabticos foi significativa (p<0,001). (Figura 8)
49
= outlier. * p<0,01 diabticos (DC e DE) versus no-diabticos (NDC e NDE). NDC= nodiabtico controle (n=7); NDE= no-diabtico erva mate (n=8); DC= diabtico controle
(n=11); DE= diabtico erva mate (n=10).
Figura 8 - Colesterol total dos animais ao final do experimento (d=29), de
acordo com o grupo
50
Desvio-padro
Mnimo
Mximo
NDC (n=7)
137,43a
15,00
121,50
159,26
NDE (n=9)
127,80a
22,80
99,00
170,61
DC (n=11)
486,66b
173,20
215,20
694,39
DE (n=10)
521,49b
118,35
222,13
633,70
Letras iguais indicam ln das mdias iguais entre grupos; p<0,001 diabticos (DC e DE)
versus no diabticos (NDC e NDE). NDC= no-diabtico controle; NDE= no-diabtico
erva mate; DC= diabtico controle; DE= diabtico erva mate.
Desvio-padro
Mnimo
Mximo
NDC (n=10)
0,92a
0,76
0,24
2,43
NDE (n=10)
0,86a
0,43
0,24
1,71
DC (n=11)
0,23b
0,17
0,05
0,58
DE (n=10)
0,29b
0,29
0,19
1,06
Letras iguais indicam que ln das mdias no diferem significativamente; p<0,001 grupos
diabticos (DC e DE) versus no-diabticos (NDC e NDE). NDC= no-diabtico controle;
NDE= no-diabtico erva mate; DC= diabtico controle; DE= diabtico erva mate.
51
Desvio-padro
Mnimo
Mximo
NDC (n=10)
254,91a
83,92
37,23
322,57
NDE (n=10)
262,05a
64,17
202,76
410,69
DC (n=11)
545,74b
206,58
272,77
829,03
DE (n=10)
518,87b
208,96
211,05
901,45
52
n=5 animais por grupo. = outlier. *p=0,007 grupos erva mate (NDE e DE) versus grupos
controle (NDC e DC). #p=0,01 grupos diabticos (DC e DE) versus no-diabticos (NDC e
NDE). NDC= no-diabtico controle; NDE=no-diabtico erva mate; DC= diabtico controle;
DE= diabtico erva mate.
*
#
n=5 animais por grupo. = outlier. *p<0,001 grupos erva mate (NDE e DE) versus grupos
controle (NDC e DC). #p=0,004 grupos diabticos (DC e DE) versus no-diabticos (NDC e
NDE). NDC= no-diabtico controle; NDE= no-diabtico erva mate; DC= diabtico controle;
DE= diabtico erva mate.
53
5 DISCUSSO
5.1 COMPOSIO DO EXTRATO DE ERVA MATE:
O extrato utilizado em nosso estudo corresponde ao total de slidos
solveis
do
chimarro.
Uma
cuia
de
chimarro
(500mL)
contm
54
condizentes
com
os
sintomas
encontrados
em
outros
55
5.3
PARMETROS
BIOQUMICOS
METABLICOS
RELACIONADOS AO DIABETES
A ingesto de erva mate no influenciou na taxa de colesterol total
(Figura 8). A mesma foi maior nos animais diabticos que nos nodiabticos, o que era esperado, pois em decorrncia do diabetes ocorre
maior converso de cidos graxos em colesterol, que liberado na corrente
sangunea nas lipoprotenas, aumentando assim o nivel de colesterol
sanguneo e o risco de desenvolvimento de doenas cardacas e vasculares
(GUYTON & HALL, 1998).
Como
esperado,
glicemia
dos
animais
diabticos
foi
56
57
Alm disso, todos esses trabalhos avaliaram o efeito agudo atravs de curva
glicmica logo aps o consumo e no aps certo tempo de consumo dirio
como no presente estudo.
A ocorrncia de resultados contraditrios entre o nosso estudo e os
mencionados acima, talvez esteja relacionada no apenas diferenas no
modelo animal e na dose empregada, mas tambm na metodologia de
medio da glicemia. Apesar de a dosagem nica de glicemia ser o mtodo
mais utilizado por ser mais fcil, rpido e apresentar menor custo, a anlise
da curva glicmica fornece uma impresso geral sobre a reatividade do
organismo
manejo
da
hiperglicemia
na
presena
de
um
composto/alimento teste. Desta forma, os efeitos hipoglicmicos ou antihiperglicmicos poderiam ser melhor visualizados (VERSPOHL, 2002).
Corroborando
essa
hiptese,
SOTILLO
&
HADLEY
(2002)
58
59
celulares
dos
hepatcitos
quanto
os
mesmos,
que
60
com
diferente
ismero
(3-CQA)
(ANDRADE-CETTO
&
61
62
63
64
6 - CONCLUSO
Os resultados indicam que o tratamento com erva mate no exerceu
efeitos benficos sobre parmetros importantes no controle do diabetes,
nem promoveu diferenas significantes na glicemia e concentrao de
insulina dos animais tratados. A atividade da glicose-6-fosfatase heptica,
enzima chave na liberao de glicose livre para a corrente sangunea,
tambm no foi afetada pelo tratamento com erva mate.
No entanto, a erva mate reduziu de maneira significativa a expresso
gnica dos cotransportadores de glicose SGLT1 no intestino delgado tanto
nos animais diabticos quanto nos no-diabticos, sugerindo que os
compostos bioativos da erva mate sejam capazes de reduzir a absoro de
glicose.
O consumo regular de erva mate interfere na absoro da glicose e
isto poderia ser um fator positivo de seu consumo.
So necessrios estudos que confirmem se este mecanismo de ao
ocorre em humanos e se podem, efetivamente, levar reduo da glicemia
e aumento da tolerncia glicose.
65
7 - BIBLIOGRAFIA
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Disponvel
http://diabetes.org.br/educacao/docs/Consenso_atual_2002.pdf
em:
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ANEXOS
Anexo 1 - Boxplot
Anexo 2 - Carta de aprovao no comit de tica
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Anexo 1 - Boxplot
O Boxplot uma representao grfica que nos fornece uma idia da
posio, disperso, assimetria e dados discrepantes.
A construo feita a partir de algumas medidas de posio:
Primeiro quartil (J1)
Mediana (J2)
Terceiro quartil (J3)
Definimos inicialmente aqueles valores que esto muito distantes do
primeiro ou do terceiro quartis, como sendo observaes discrepantes.
Para construir o Boxplot, consideraremos um retngulo onde esto
representados os quartis e a mediana. A partir do retngulo, para cima e
para baixo, seguem linhas at o ponto mais remoto que no seja uma
observao discrepante. Obteremos, ento, uma figura que representa o
conjunto dos dados, com exceo dos outlier. Estes sero representados
individualmente por X.
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