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BOLETIM SPQ, 39, 1990

CROMATOGRAFIA DE LQUIDOS

Introduo
Cromatografia de Lquidos

(HPLC)
A Cromatografia de Lquidos (HPLC) uma tcnica analtica
de grande impacto actual e com um vasto campo de aplicaes, tanto na Indstria como na Universidade e Departamentos Governamentais, seja para o controle de qualidade de
rotina ou como potente ferramenta para a investigao pura
e aplicada.
No entanto, e apesar de dispor de to vasto campo de
utilizao, no encontra no nosso pas uma divulgao e uma
informao adequada e acessvel, sua altura e que se impe,
especialmente por parte de especialistas nesta rea.
O presente trabalho tem por objectivo divulgar a Cromatografia de Lquidos (HPLC), os seus fundamentos e os seus
campos de aplicao, estando dividido em quatro partes,
como sejam: Introduo, Teoria Fundamental, A Coluna
Cromatogrfica e O Equipamento.
INTRODUO
A Cromatografia de Lquidos ou HPLC (High Performance
Liquid Chromatography), como mais vulgarmente conhecida, consiste num mtodo analtico que tem por objectivo a
separao de distintas espcies qumicas presentes numa
amostra. A separao processa-se por meio de um mecanismo de interaco selectiva entre as molculas do soluto
(amostra) e duas fases, uma estacionria e outra mvel.
A fase estacionria refere-se coluna cromatogrfica, ou
seja, um cilindro rgido (normalmente de ao ou vidro) no
interior do qual se encontra um material de enchimento
formado por pequenas partculas.
A fase mvel ou solvente flui continuamente atravs do
sistema, arrastando a amostra injectada pela coluna e pelo
detector.
As substncias presentes na amostra, devido s suas distintas
estruturas moleculares e grupos funcionais, dispem de
distintos graus de afinidade com as fases mvel e estacionria e por conseguinte as suas velocidades de migrao
sero igualmente distintas, permitindo o desenvolvimento da
separao cromatogrfica. Pode-se ento concluir que a
substncia com maior afinidade com a coluna aquela que
elui por ltimo e, por oposio, a substncia que elui em
primeiro lugar ser a de menor afinidade com o enchimento (fase estacionria).
Como concluso, a Cromatografia de Lquidos separa as
espcies qumicas consoante as suas funes moleculares e
por conseguinte um mtodo que pode ser utilizado para
separar, identificar e quantificar substncias presentes em
diferentes tipos de produtos.

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Rafael Berbert Chust 4

TEORIA FUNDAMENTAL
Equao Fundamental

Ao procedermos a uma separao cromatogrfica por meio


de um Cromatgrafo de Lquidos, obtemos um cromatograma, ou seja, uma representao grfica da separao referida
por meio de picos correspondentes a cada um dos componentes da amostra. Para que se possa avaliar qualitativamente a
separao, necessrio definir termos como resoluo, capacidade de reteno e selectividade relativos separao ou ao
sistema cromatogrfico.
Resoluo (R)

Suponhamos o cromatograma representado na Figura 1.


Define-se resoluo como o grau ou magnitude da separao.
A expresso matemtica de resoluo (R) dada como sendo
a diferena entre os volumes de eluio de dois componentes
da amostra (V1 e V2) pela mdia da largura de banda cromatogrfica de ambos (W1 e W2), ou seja:
V2 -

(1)

R =
1/2 (W, + W2)
V2

vi
.olwn

FIGURA 1
Cromatograma-tipo

Note-se que V,, V2, WI e W, podem ser expressos em


unidades de volume, tempo ou mesmo comprimento no
cromatograma, devendo no entanto ter-se em ateno que
s medies devem corresponder unidades coerentes, pois
que R uma grandeza adimensional, ou seja, sem unidades.

a Director Tcnico-Comercial KONIK INSTRUMENTS, S.A.

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Sendo assim, a resoluo dever ser entendida como o grau


segundo o qual um pico se distingue de outro no cromatograma.
Capacidade de Reteno (k')
sabido que a Cromatografia de Lquidos uma tcnica
utilizada frequentemente em anlise qualitativa, por meio da
verificao da reteno de um dado componente da amostra
em determinado sistema cromatogrfico. O termo universal
utilizado para identificar ou localizar um pico o factor de
capacidade (k') de um sistema cromatogrfico. O factor de
capacidade relativo a um dado componente calculado
matematicamente segundo a seguinte equao:
V - Vo
k'
V

(4)

onde V medido em unidades de tempo, volume ou comprimento eSa variao da disperso dos picos, medida nas
mesmas unidades. Em geral, S resolvido directamente em
funo da medida de uma s largura de pico (W).
O mtodo mais simples para o clculo de N resulta no traado
de uma tangente curva gaussiana nos seus pontos de
inflexo e extrapolando a linha de base ate a interseco com
a tangente (Figura 2).

(2)

onde V, e Vo sero medidos nas mesmas unidades. Vo o


chamado volume morto e uma medida da reteno para
um componente que no interacciona com o sistema. Em
termos prticos, Vo o volume do sistema desde o injector ate
ao detector, podendo, devido ao volume insignificante da
tubagem, ser assumido como o volume da coluna que no
est ocupado pelo enchimento.
Podemos concluir ento que k' mede a capacidade de um
sistema cromatogrfico para reter os componentes da amostra. Note-se que os valores de k' para cada componente so
independentes de factores como o fluxo de solvente e a
dimenso da coluna.
Selectividade (a)

FIGURA 2
Mtodo Sigma 4 para clculo de N

Quando a largura de pico assim determinada, S=W/4 e


portanto
N

Outro factor a considerar a selectividade do sistema cromatogrfico, a qual tem a ver directamente com a qumica
envolvida na separao. O factor selectividade (a) ou factor
de separao expresso matematicamente por:
V, - Vo
k'2
a== k',
V, - Vo

N=
V

16V2

(5)

vv2

Este mtodo, denominado Sigma 4, o mais conhecido e


utilizado devido sua simplicidade.

(3)

Como se pode concluir, o factor de selectividade diz-nos


quando um pico elui relativamente a outro, estando directamente relacionado com a capacidade do sistema em promover a separao. Assim, se a=1, temos que , e por
conseguinte, no ocorre qualquer separao. Logo, para que
o sistema tenha poder para separar os componentes de uma
amostra, a deve ser maior que 1 (considerando-se ptimo um
valor de a igual a 1,2).
Nmero de Pratos Tericos (N)
Outra propriedade importante a levar em conta numa separao cromatogrfica o nmero de pratos tericos (N) de um
sistema, o qual descreve a disperso do pico cromatogrfico
em relao ao seu centro, constitundo ao mesmo tempo um
mtodo fcil para o controle dirio da eficincia do sistema.
Se assumirmos que o pico cromatogrfico uma curva de
Gauss perfeita, o nmero de pratos tericos do sistema pode
ser definido, em termos estatsticos clssicos, como:

FIGURA 3
Mtodo Sigma 5 para clculo de N

Outro mtodo, considerado mais exacto, o denominado


Sigma 5, onde se mede a largura do pico a 4,4% da altura do
mesmo, de forma perpendicular (Figura 3). Sendo assim,
S=W/5 e portanto
25 V2

N vv2

(6)


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Duas concluses se podem extrair do clculo de N:


se o pico simtrico, ambos os mtodos devem originar o
mesmo resultado;
se os picos apenas se aproximam da forma gaussiana, originaro um nmero de pratos tericos baixo.
Dever-se- chamar-se a ateno para o facto de que o
nmero de pratos tericos um termo relativo, ou seja, no
necessariamente o mesmo para todos os sistemas, onde
solvente, coluna, fluxo, equipamento e outras variveis so
distintas. No entanto, o clculo de N um excepcional
mtodo para o controle do desgaste da coluna cromatogrfica
em um dado sistema.

Tomando novamente a definio de N, uma concluso que se


pode intuir de que o nmero de pratos tericos de um dado
sistema uma varivel dependente do comprimento da
coluna cromatogrfica, devendo assim dispor de uma relao
de proporcionalidade com este ltimo. Assim, a expresso
que define esta relao :

L
H=
N

Equao Fundamental da Cromato grafia


Por ltimo, resta relacionar todos os factores anteriormente
definidos, tendo em vista integr-los numa nica equao
fundamental. Assim temos:
V2 - V

k
' =

R
/2 (W + W2)
1
V2 - Vo

V-V

V0

16V2

Se assumirmos que W = W =W2, por substituio obteremos:


V2 - V1

R=
e logo temos que a Equao Fundamental da Cromatografia
assume a seguinte forma:
1 (a - 1)
4

R=

1 (a - 1)
4
a

(0 + 1)

logo temos que a resoluo nula, o que correcto.


Suponhamos agora que a= 1, ou seja, que no ocorre separao dos componentes da amostra (k'.,=k'i):
--'- (1 - 1)
4
1

k'

(k' + 1)

sendo por conseguinte a resoluo nula, o que tambm


correcto.
A concluso final que podemos extrair de que a resoluo
de uma dada separao cromatogrfica depende directamente da capacidade de reteno dos componentes da amostra, da selectividade para a referida separao e da eficincia
da coluna cromatogrfica.

(7)

onde N j foi definido anteriormente e L o comprimento da


coluna cromatogrfica, sendo portanto H definido como
sendo a altura equivalente a um prato terico.
A altura equivalente a um prato terico (H) descreve portanto
a eficincia do material de enchimento da coluna e independente do comprimento da mesma. Note-se que H, de todos os
termos j definidos, o nico que apresenta unidades dimensionais (mm, em geral).
Por agora, a importncia de H resume-se a relacionar N com
o comprimento da coluna L, sendo que o nmero de pratos
tericos aumenta quando aumenta o comprimento da coluna,
sendo a inversa tambm verdadeira. Mais adiante, H deter
um importante papel no estudo dos fenmenos relacionados
com a dinmica da separao cromatogrfica.

Para que se tenha uma ideia da validade desta equao,


suponhamos que k'=0, ou seja, que no ocorre reteno
(V=V0):

R -

Altura Equivalente a um Prato Terico (H)

45

k'

(k' + 1)

(8)

A Equao de Van Deemter


Ate agora tem-se procedido a um estudo, por assim dizer,
esttico da separao cromatogrfica, partindo de conceitos geomtricos de representao da mesma. No entanto,
como se sabe, a separao depende de vrios factores de
ordem dinmica, como sejam o fluxo do solvente e a velocidade com que se processam as interaces qumicas substncia-fase mvel-fase estacionria.
Uma forma de avaliar a eficincia do sistema cromatogrfico
e, em particular, da coluna cromatogrfica, obtem-se atravs
do traado de uma curva que relacione a altura equivalente a
um prato terico (H) e a velocidade linear da frente do
solvente (u). O traado desta curva H=f(u) tem a denominao de Curva de Van Deemter e tem por objectivo avaliar o
tipo de enchimento utilizado e dar indicaes para a optimizao da separao cromatogrfica.
Anteriormente visualizamos a largura da banda cromatogrfica
(pico) como uma grandeza grfica qual podemos aplicar
conceitos trignomtricos. Passaremos a estud-la agora como
uma relao directa com o que se passa no interior da coluna
de separao.
Assim sendo, podemos admitir que o alargamento da banda
cromatogrfica depende fundamentalmente de quatro contribuies e ser o resultado da soma destas:
a) comprimento da migrao
Este fenmeno deve-se a que distintas molculas duma
mesma substncia podem ter distintas trajectrias no leito
cromatogrfico (Figura 4). A contribuio deste efeito dado
pela expresso:
A=y dp

(9)

onde dp o velor mdio do dimetro de partcula de um dado


enchimento e y uma constante relativa ao mesmo.

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k
o

b) difuso longitudinal
Se uma banda cromatogrfica permanece por um largo
perodo dentro de uma coluna de separao tender a difundir-se em todas as direces, incluindo o sentido longitudinal
da mesma, produzindo por conseguinte um alargamento
(diluio) da banda (Figura 5). Este efeito uma funo do
perodo de permanncia da banda na coluna e est relacionado com a velocidade linear da frente de solvente. A
expresso que o define ser:
B=

2 X, Dm

(10)

LI

onde X uma constante do enchimento, Dm a difuso da


substncia na fase mvel e u a velocidade linear da frente de
solvente.

(12)

[Sim

sendo [S]s a concentrao da substncia na ou sobre a fase


estacionria e [S]m a sua concentrao na fase mvel. O
factor de capacidade k' ento definido como:
k'

FIGURA 4
Trajectrias de migrao de molculas de uma mesma substncia

[S]s

Ss
(13)

Sm

onde Ss a quantidade de substncia na fase estacionria e


Sm a quantidade da mesma na fase mvel. Refira-se que estes
termos so referidos ao raio da fase mvel (a), sendo portanto:
k'

(14)

d) transferncia de massa na fase estacionria


Dispondo a fase estacionria de um volume finito porm
significativo, ser de esperar que as molculas difundam da
superfcie do enchimento at a fase estacionria (poros) e
tornem a sair superfcie novamente (Figura 6). 0 alargamento da banda poder ser ento descrito pela expresso:
Cs=

2 a k df2
3 (a + k)2 Ds

(15)

onde df a profundidade da fase estacionria (poro) e Ds a


difusibilidade da substncia na fase estacionria.

c)

-1

FIGURA 5
Difuso longitudinal

c) transferncia de massa na fase mvel


Para que possam ocorrer os fenmenos de partilha/adsoro
de uma molcula na fase estacionria, necessrio que a
mesma se encontre prxima da superfcie do enchimento. Se
tal no ocorre, seguir percorrendo a coluna sem interaccionar. Em dado instante, um certo nmero de molculas de
uma dada substncia encontram-se em posio de interaccionar com o enchimento, enquanto outras esto suficientemente afastadas do mesmo, o que implica que aps um curto
espao de tempo, estas ltimas migraro atravs da coluna
enquanto as primeiras sero realmente retidas pelo enchimento. O resultado obtido um significativo alargamento de
banda. A expresso que define esta contribuio dada por:
Cm=

dp2 u
x a (a + k2) Dm

onde k o coeficiente de distribuio entre as fases, a o raio


da fase mvel e x uma constante da mesma. Note-se que o
coeficiente de distribuio de uma dada substncia num dado
sistema definido como:

FIGURA 6
Transferncia de massa na fase estacionria

Podemos concluir ento que o efeito do comprimento da


migrao independente da velocidade linear (Eq. 9), que a
contribuio da difuso longitudinal inversamente proporcional velocidade linear (Eq. 10) e que a transferncia de
massa, tanto na fase mvel (Eq. 11) como na fase estacionria
(Eq. 15), directamente proporcional velocidade linear da
frente de solvente.
Assim sendo, e considerando C=Cm+Cs, temos que a forma
simplificada para exprimir a equao de Van Deemter :
H=A+1 +Cu

(16)

onde A, B, e C so, como vimos anteriormente, constantes de


um dado sistema cromatogrfico e permitem explicar a
forma tpica da curva de Van Deemter.
A expresso acima reproduzida (Eq. 16) aplicvel directa-

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mente em Cromatografia de Gases (GC). No entanto, em


HPLC temos a considerar dois outros factores:
- a difuso longitudinal quase desprezvel, pois as molculas no se difundem to rapidamente em um lquido como
num gs, o que implica tambm uma maior resistncia
transferncia de massas.
- a difuso de Eddy, fenmeno directamente relacionado
com as zonas da coluna onde o solvente no flui por estar
preso nos poros do enchimento. Assim sendo, uma molcula que se encontre diluda neste solvente s tem sada por
meio de difuso, sendo esta difuso particular designada por
Difuso de Eddy.

47

I PA / H
6
MEOH / H20

40
CH CN /H 0
3
2

20

O modelo matemtico para descrever a difuso de Eddy por


demais complexo e no est ao alcance deste trabalho. No

entanto, a sua participao de tal modo importante que a


forma simplificada da equao de Van Deemter para HPLC,
por analogia expresso aplicvel GC (Eq. 16), a
seguinte:
H=A+

10

15

FIGURA 8
Curvas de Van Deemter utilizando uma coluna C,8 e trs sistemas de
solventes distintos

(17)

onde C e x so constantes, com x permitindo valores menores


que 1.
A curva de Ven Deemter para HPLC aparecer ento com
uma pendente linear a fluxos baixos, desviando-se da linearidade a fluxos altos, em oposio constante linearidade da
curva de Van Deemter para o GC (Figura 7).

HETP
GC

A COLUNA CROMATOGRFICA
A coluna cromatogrfica onde se d o processo de separao das substncias que compem a amostra, sendo sem
dvida o constituinte mais importante e mais crtico de um
sistema cromatogrfico.
A escolha de uma coluna depende de variados factores, os
quais vamos procurar enumerar no decorrer deste trabalho,
por forma a elucidar alguns pontos que normalmente so
pouco claros vista de um cromatografista pouco experiente.
Em primeiro lugar, conveniente definir as caractersticas da
amostra, de acordo com o esquema apresentado na Figura 9.
hidrossolvel
polaridade
lipossolvel

HPLC
AMOSTRA

carga inica v positiva


negativa
estrutura qumica v grupo funcional
estereoqumica

FIGURA 7
Curvas de Van Deemtyer para GC e HPLC

De referir que as-curvas de Van Deemter so curvas obtidas


de forma prtica e que o estudo matemtico que vimos visa
essencialmente construir um modelo que permita explicar os
fenmenos que ocorrem durante a separao cromatogrfica.
Outro ponto a realar que a curva de Van Deemter uma
caracterstica de cada sistema cromatogrfico, variando com
alteraes de enchimento, dimenso da coluna, viscosidade
da fase mvel e temperatura, entre outros factores.
Por Ultimo, apresentam-se curvas tpicas de Van Deemter
obtidas com a mesma coluna porm com distintos sistemas
de solventes (H2O=gua, IPA=isopropanol, Me0H=metanol
e CH,CN=acetonitrilo) (Figura 8).

FIGURA 9
Classificao das caractersticas de uma amostra

PARTILHA (Fase Reversa)


ADSORO (Fase Normal)

MECANISMOS
DE SEPARAO

PERMEAO EM GEL (GPC)


CROMATOGRAFIA DE PAR INICO (PIG)
CROMATOGRAFIA DE INTERACO
HIDROFCBICA (HIC)
CROMATOGRAFIA IONICA (IC)
FIGURA 10

Alguns Mecanismos de Separao em HPLC

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Conforme as caractersticas da amostra, poder-se- escolher


o mecanismo de separao que melhor se lhe adapte. Os
mecanismos de separao mais difundidos pelos quais se
regem as colunas de HPLC esto presentes na Figura 10.
Alm disso, numa coluna cromatogrfica h a considerar
dois tipos de factores que a caracterizam:
factores qumicos, que dizem respeito ao enchimento (propriedades qumicas, rea superficial, etc.);
factores mecnicos, que dizem respeito ao invlucro (comprimento, dimetro interno, material, etc.).

formas irregulares. Em contrapartida, a partcula irregular


possui, regra geral e para o mesmo dimetro, maior rea
superficial e maior resistncia mecnica eroso provocada
pelo fluxo continuo de eluente. Devido a estes factos, em
escala analtica preferem-se enchimentos de partculas esfricas, sendo utilizados os enchimentos de partculas irregulares quase exclusivamente em escala preparativa. Outro factor que pode assumir importncia o custo do enchimento,
com vantagem para os enchimentos irregulares.
J a importncia da rea superficial e do tamanho de poro
tem a ver com o poder de reteno das molculas superfcie da partcula, em consequncia da maior rea de adsoro (.4=> maior rea superficial) e maior permeabilidade
(<=> maior tamanho de poro). A existncia de altos valores
para ambos implica uma menor transferncia de massa por
unidade de tempo, logo, maior reteno.
Quanto as caractersticas qumicas da slica, de salientar
que esta dissolve-se de forma acentuada em meios de pH
superior a 7,5. Assim sendo, tanto em fase normal como em
fase reversa, seja em fases estacionrias apenas de slica
como com base de silica, o pH de trabalho deve situar-se
entre 2 e 8. De notar que os enchimentos de base polimrica
so bastantes mais tolerantes em relao a variaes de pH,
cobrindo normalmente uma gama de pH de 1 a 13.

Caractersticas do Enchimento
Em geral as colunas de HPLC tm como base dos seus
variados enchimentos partculas de silica, devido a sua alta
porosidade e consequente elevada rea superficial, sejam
eles unicamente de silica ou de fase ligada (bonded phase),
em que atravs de uma reaco qumica se promove a ligao
de um grupo funcional aos grupos hidroxilo livres da slica.
Desta forma, os factores que afectam em maior grau as
performances de uma coluna e que fazem diferir os variados
enchimentos dos variados fabricantes so:
a) slica-base:
tamanho e forma de partcula;

rea superficial;
distribuio dos tamanhos de poro.
b) tipo de fase ligada:
grupo funcional (C18, C8, CN, etc.);
fase monofuncional ou polifuncional.
c) teor em carbono (carbon load).
d) segunda passagem de fase ligante (end capping).
e) procedimentos de fabrico.
Como se pode depreender, a silica-base do enchimento
desempenha um papel fundamental no desenrolar de um
processo cromatogrfico. As diferenas entre as variadas
sflicas disponveis encontram-se subordinadas aos seguintes
factores:
o tamanho e a forma da partcula, que representam um
papel importante na eficincia e estabilidade do leito cromatogrfico;
a rea superficial, expressa em metros quadrados por grama
(m7g), que indica a capacidade de adsoro do enchimento;
o tamanho de poro e a transferncia de massa, que tem a ver
com a velocidade a que se processa a separao bem como o
volume molecular ptimo a ser analisado pelo enchimento;
a qumica intrnseca da silica-base, como sejam o pH, o
contedo em metais e as condies de manufacturao.
Em relao ao tamanho da partcula, pode-se afirmar que as
partculas de menor dimetro aumentam a eficincia da
separao, devido aos menores volumes mortos crados. No
entanto, a presso de trabalho aumenta consideravelmente
nestas condies, sabendo-se que a diminuio do tamanho
de partcula proporcional ao quadrado do aumento de
presso. Sera interessante referir que o limite prtico considerado como mnimo para a tamanho de uma partcula so
3 um.
Quanto forma da partcula, esta implicar uma maior
estabilidade do leito cromatogrfico no caso de ser esfrica,
pois que um leito de partculas esfricas obviamente mais
homogneo e reprodutvel que um leito de partculas de

Mecanismos de Separao
Aps haver-se focado os factores relativos ao enchimento,
discutir-se- de seguida os vrios mecanismos de separao
presentes na Figura 10 e os fenmenos que os caracterizam.
Adsoriio (Fase Normal)

O que caracteriza o mecanismo de adsoro, ou fase normal,


a alta polaridade da fase estacionria (normalmente silica)

e a baixa a mdia polaridade do solvente (hexano, clorofrmio, isopropanol, etc.).


O grupo funcional da slica o grupo hidroxilo -OH, o qual
interacciona com os grupos polares das molculas da amostra
(grupos -OH, -NH,, etc.) por meio de atraco ou partilha
electrnica entre os- tomos envolvidos.
As principais aplicaes das colunas de silica so a separao
de vitaminas lipossoltiveis (A, D e E), ftalatos, fenis,
aflatoxinas e anilinas, entre outras.
Partilha (Fase Reversa)

O mecanismo de partilha, ou fase reversa, o mais amplamente difundido e por esta razo merece um destaque especial neste trabalho.
Este mecanismo baseia-se na partilha de electres entre as
nuvens electrnicas das cadeias moleculares da fase estacionria ligada e da substncia a separar, sendo estas interaces originadas por ligaes por pontes de hidrognio instantneas, foras de London e foras de Van der Waals.
Em relao a fase normal, a fase reversa mostra-se bastante
mais verstil, encontrando-se por conseguinte muito mais
frequentes referncias de aplicao dos seus mecanismos
(cerca de 90% dos casos) no universo bibliogrfico da
HPLC. Alm da versatilidade, h a realar os seus mais

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baixos custos operativos relativamente fase normal, devido


ao eluente ser constitudo na sua maior parte por gua, sendo
tambm utilizados o metanol, o acetonitrilo e o tetrahidrofurano, entre outros, ou seja, solventes de alta ou mdia
polaridade.
Quanto aos grupos funcionais de fase reversa ligada, estes em
geral apresentam uma polaridade baixa a mdia. O mais
popular o C18, ou ODS, cujo grupo principal o grupo
octadecilsilano.
Outros grupos funcionais, menos populares mas no menos
importantes e teis so os grupos Fenil, C8, C4, C2, CN, NH,
e Diol, este ltimo utilizado frequentemente em GPC e HIC-.
O processo de ligao do grupo funcional desejado
base d-se por meio de uma reaco qumica, em meio cido,
entre um grupo organosilano e um dado grupo hidroxilo livre
superfcie da silica, conforme se esquematiza de seguida:

C18 -

R-Si-OH + HO-Si-0 .4=> R-Si-O-Si- + H20

(18)

sendo R um radical orgnico.


J anteriormente se referiu que o pH ptimo de utilizao de
uma coluna de HPLC de 2 a 8. Acima de pH 8, a slica
solubiliza-se. Abaixo de pH 2, a fase ligada hidroliza-se,
dando origem reaco inversa do processo de ligao de
fase. Conclui-se assim que o uso prolongado de eluente a
baixo pH provoca uma considervel reduo na vida til de
uma coluna de fase reversa.
Duas caractersticas que dizem respeito s fases ligadas e
aquilo que as pode distinguir entre si so:
o teor em carbono (para fases C18, C8, Fenil e CN);
a segunda passagem de fase ligante (end capping).
O teor em carbono uma das caractersticas que marca a
distino entre duas colunas C18, por ex., de distintas origens, pois que diferentes teores de carbono implicam diferentes capacidades de reteno, sendo por conseguinte um
ndice de maior ou menor hidrofobicidade do enchimento.
Por sua vez, o end capping bastante importante na
performance de enchimentos de fase reversa. Este processo
consiste na ligao de um grupo alquilsilano de pequeno
volume aos grupos hidroxilo da slica-base que ainda permanecem livres aps a reaco de derivatizao primria. Isto
minimiza o efeito dos grupos hidroxilo livres e consequentemente qualquer mecanismo paralelo de adsoro.
Como consequncia da reaco de end capping, temos a
considerar:
esconde (derivatiza) os grupos hidroxilo ainda livres
aps a reaco primria;
minimiza os mecanismos de reteno paralelos;
adiciona carbono ao enchimento (aumenta o teor em
carbono).
De notar que a existncia de grupos hidroxilo livres caracteriza-se pela sobre-reteno de substncias orgnicas com
grupos electropositivos, como por ex. as aminas. Este efeito
deve-se interaco entre os tomos electronegativos do
oxignio presentes superfcie do enchimento com os tomos
electropositivos do azoto presente nas aminas.
Por ltimo, resta referir as aplicaes mais usuais das colunas
de fase reversa, conforme o grupo funcional que as caracteriza:

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PAH's, vitaminas, aminocidos, drogas teraputicas,


etc.
C 8 - fenis, alcalides, protenas, etc.
C4 - protenas.
CN vitaminas lipossolveis, pesticidas, corticosterides,
etc.
Fenil - cidos gordos livres, compostos aromticos, etc.
No entanto, outras fases ligadas existem livres de carbono e
com mecanismos que no se enquadram totalmente nos de
adsoro e partilha. De seguida apresentam-se alguns destes
grupos funcionais e as suas principais aplicaes:
NH, - carbohidratos, nucletidos, aminas, etc.
Diol - poliis, protenas (HIC), etc.
SAX - anies orgnicos.
SCX - caties orgnicos.
O mecanismo segundo o qual actua a coluna NH2 (aminopropilsilano) maioritariamente um mecanismo de fase reversa,
tomando partido da electropositividade dos tomos de azoto
presentes na fase estacionria, podendo no entanto ser utilizado como um mecanismo de fase normal. Os solventes
mais utilizados so a gua e o acetonitrilo, em variadas propores.
O mecanismo das colunas Diol actua como um mecanismo
de partilha, promovendo a interaco entre os tomos de
oxignio presentes no enchimento e na amostra. Os eluentes
so em geral solues salinas.
Os grupos funcionais das colunas SAX e SCX so, respectivamente, uma amina quaternria (tetrabutilamina) e um
cido carboxlico (cido fenilssulfnico). Estes enchimentos
funcionam como resinas de troca inica e os solventes
utilizados so solues tamponadas.
Permeao em Gel

(GPC)

O mecanismo de GPC, ou excluso molecular, baseia-se no


princpio da excluso por parte dos poros do enchimento das
molculas de maior volume molecular e da permeao
(transferncia de massa) nos mesmos por parte das molculas
de menor volume. Assim sendo, numa coluna GPC, as
molculas de maiores dimenses tm menores tempo de
reteno (sofrem excluso) e as de menor dimenso tardam
mais tempo a eluir (ou sejam, permeiam). Em geral, a
capacidade de separao de cada coluna determinada pelos
tamanhos de poro das partculas que compem o seu enchimento, medidos usualmente em Angstroms (A), havendo inclusivamente curvas de calibrao de volumes de reteno x
log [peso molecular]. Note-se que, partida, no ocorrem
quaisquer fenmenos de interaco e por conseguinte de
reteno qumica em colunas de GPC.
Os principais campos de aplicao da GPC so a anlise de
polmeros e resinas (solvente orgnico = GPC orgnica) e
protenas (solvente aquoso = GPC aquosa).
Cromatografia de Par Inico (PIC)

A Cromatografia de Par Inico no mais que uma modificao engenhosa da Cromatografia de Fase Reversa, resumindo-se a utilizar-se no eluente uma soluo de molaridade
prxima a 0,005 M de fosfato de tetrabutilamnio (separao
de cidos orgnicos) ou de cidos alquilssulfnicos de ca-

CROMATOGRAFIA DE LQUIDOS

BOLETIM SPQ, 39. 1990

deias lineares de 5, 6, 7 ou 8 tomos de carbono (separao

(separao de caties) ou bsico (separao de anies),


suportando as resinas eluentes de pH 1 a 13, em geral.

50

de bases orgnicas).
Como fcil de concluir, cidos e bases no interactuam
facilmente com a superfcie hidrofbica das colunas de fase
reversa (especialmente C18), devido carga associadas a
estas espcies; com a adio fase mvel dos sais referidos,
de carga contrria a das molculas da amostra, permite-se
que as mesmas e o sal reagente formem um par electronicamente neutro, podendo ento interactuar com a fase estacionria por um mecanismo de partilha. O modelo qumico
das reaces de par inico so:
cidos (meio bsico):
R-000(-) + (+)N (C4H9)4
(c. orgnico (reagente PIC)

[R-000(-)(+)N(C4H9)4] (19)
(par inico)

bases (meio cido):


R-NH3(+) R'S03(-) <> R-NH3(+)(-)S03-R1
(amina)
(reagente PIC)
(par inico)

(20)

O comprimento da cadeia dos cidos alquilssulfnicos um

factor a considerar: quanto maior a cadeia, maior a reteno,


ou seja, se utilizarmos como reagente PIC o cido octassulfnico (C81117SOOH), este originar uma maior reteno
dos compostos bsicos da amostra do que a que se originaria
ao utilizar o cido pentanossulfnico (C5H9SOOH), sendo
desta forma um factor de controle da separao. Outros
factores que podem ainda influenciar a separao sero a
concentrao do sal reagente, o pH da fase mvel e o tipo e
a concentrao do tampo a utilizar.
Cromato grafia de Interaco Hidrofbica (HIC)

A Cromatografia de Interaco Hidrofbica (HIC) um


mecanismo utilizado quase exclusivamente na separao de
protenas, pois partida no altera a sua actividade biolgica.
Os enchimentos para HIC so enchimentos hidrofbicos,
porm em menor grau que os de fase reversa convencional,
permitindo a separao das protenas de forma menos agressiva mediante gradientes de concentrao salina, evitando-se
assim o recurso a solventes orgnicos.
Os enchimentos so obtidos usualmente por meio de uma
primeira derivatizao da slica com uma poliamida, seguida
de uma segunda derivatizao com um radical propil, hidroxipropil, metil ou pentil, conferindo a derivatizao com
a poliamida uma maior estabilidade dos enchimentos de HIC
em termos de pH do que os enchimentos convencionais.
Cromatografia Inica (IC)
O campo de aplicao da Cromatografia Inica (IC), como o
nome indica, dirige-se separao de anies e caties

inorgnicos, incluindo os metais de transio.


Os enchimentos para IC so resinas de poliestireno que
dispem de grupos funcionais com capacidade para intercmbio inico (por ex. Ca2+ ou SO2-). Existem ainda colunas
com base de silica, menos vulgares e de menor vida til,
porm apresentando um custo consideravelmente mais baixo.
Os eluentes em IC so tampes de pH fortemente cido

Outros Mecanismos

Como as restantes tcnicas analticas, a HPLC no escapa ao


engenho dos investigadores e outros mecanismos de separao encontram-se j em fase de crescente utilizao. Apresentam-se alguns exemplos:
Cromatografia de Mecanismo Misto:
Combina um ou mais mecanismos, sendo os mais usuais:
fase reversa + troca inica
excluso molecular + troca inica
Cromatografia por Afinidade:
Utiliza ligandos especficos para a separao de famflias
especficas de enzimas, anticorpos ou complexos anticorpoantignio, glicoprotenas, etc.
Cromatografia de Pirkle:
Utiliza fases estacionrias quirais (aceitadores e dadores de
electres TO para a separao de enantimeros (ismeros
pticos).
O Invlucro

Por ltimo, algumas consideraes sobre o invlucro, ou


seja, a parte exterior da coluna cromatogrfica.
Quanto ao material que o constitui, surgem trs tipos fundamentais:

ao (convencional);
polietileno (cartuchos);
vidro (metal-free chromatography).
A escolha destes invlucros tanto tem a ver com razes de
ordem qumica como de ordem econmica. Os cartuchos
possuem inferior durabilidade porm so mais inertes e de
mais baixo custo que as colunas convencionais de ago. J as
colunas de vidro, devido ao seu carcter marcadamente
inerte, dirigem o seu campo de aplicao separao de
molculas biologicamente activas, pois no as desnatura; no
entanto, devido sua fragilidade, no se lhes pode aplicar
presses elevadas, limitando a sua aplicao.
Quanto s dimenses das colunas, estas respeitam uma
classificao no muito rgida, mas conveniente para se
compreender a nomenclatura vulgarmente utilizada em HPLC,
conforme o tipo de utilizao:
Classificao
MICROBORE
ANALTICA

Dimetro Interno Comprimento

SEMI-PREPARATIVA

PREPARATIVA

1 a 2 mm
3,9 a 4,6 mm
6,5 a 10 mm
19 a 22,5 mm

10 a 30 cm
15 a 30 cm
10 a 30 cm
25 a 30 cm

Esta classificao tem a ver com a capacidade media de carga


das colunas e por conseguinte define o seu campo de utilizao preponderante.
Como curiosidade refira-se que actualmente encontram-se
disponveis no mercado uma nova famlia de colunas, designadas por Fast-LC. Estas colunas, com apenas 3 a 5 cm de
comprimento e 4,6 mm de dimetro interno, so destinadas

BOLETIM SPQ, 39, 1990

CROMATOGRAFIA DE LQUIDOS

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a rpidas separaes (0,1 a 2 min em mdia), sendo de


bastante utilidade para trabalhos de rotina em amostras
pouco complexas.
O EQUIPAMENTO
A

Ao equipamento que permite a obteno de uma separao


cromatogrfica d-se vulgarmente o nome de Cromatgrafo.
Um cromatgrafo de lquidos constitudo esquematicamente por quatro componentes (Figura 11):
Sistema de Bombagem ou Bomba;
Sistema de Injeco ou Injector;
Sistema de Deteco ou Detector;
Sistema de Tratamento de Dados.

AMOSTRA

FIGURA II
Sistema tpico de Cromatografia de Lquidos (HPLC)

De seguida debruar-nos-emos muito resumidamente sobre


cada um destes componentes.

Sistema de Bombagem
O sistema de bombagem o corao do cromatgrafo de

lquidos, dele dependendo uma variedade de factores. As


caractersticas que definem um bom sistema de bombagem
so as seguintes:
o fluxo deve ser estvel e isento de pulsaes, por forma a
minimizar o rudo de fundo no detector;
a gama de fluxos deve ser ajustvel aos vrios modos de
operao de HPLC (microbore, analtica, semi-preparativa),
mas sem ser muito ampla para permitir uma boa reprodutibilidade a fluxos baixos. A gama ideal situar-se- entre 0,1 e
5,0 ml/min;
o volume deslocado (= volume da cabea da bomba) deve
ser constante, por forma a facilitar anlises quantitativas e
qualitativas;
a bomba deve suportar altas presses, pela prpria natureza
do fim a que se destina. A presso mxima ideal dever
rondar as 420 atm (aproximadamente 6000 psi);
a bomba deve ser facilmente adaptvel ao trabalho em
gradientes, seja ele a alta como a baixa presso.
Existem vrios tipos de sistemas de bombagem, sendo o mais
usual o de pisto recproco (Figura 12). Para se conseguir um
fluxo livre de pulsaes, utilizam-se dois ou trs pistes
recprocos em srie, sendo a bomba de dois pistes a mais
vulgarizada e de melhores resultados prticos.

FIGURA 12
Modelo esquemtico de bomba de pisto recproco: A reservatrio
de solvente; B "check valve"; C motor elctrico; D excntrico;
E pisto; F cmara hidrulica (cabea da bomba); G coluna

Sistema de Injeco
Os sistemas de injeco podem ser de trs tipos:
injeco directa por seringa;
vlvula de injeco;
vlvula de injeco automtica (injector automtico).
O sistema mais utilizado o por vlvula de injeco, pois
origina uma maior reprodutibilidade no volume injectado e
por conseguinte melhores resultados em anlise quantitativa.
Alm do mais, podem facilmente ser automatizados e apresentam custos reduzidos. O esquema de funcionamento de
uma vlvula de injeco est patente na Figura 13.

"L OAD"

"INJECT"
FIGURA 13

Modelo esquemtico de vlvula de injeco: A entrada de solvente


(bomba); B sada (coluna); C esgoto; D "loop" de injeco;
E injeco de amostra (needle port)

52

BOLETIM SPQ, 39, 1990

CROMATOGRAFIA DE LQUIDOS

Sistema de Deteco
Actualmente existe uma vasta gama de detectores para
HPLC. Uma opo por qualquer um deles depender essencialmente das caractersticas qumicas ou estruturais. das
espcies a detectar.
No se pretende proceder a um estudo exaustivo das caractersticas dos detectores de HPLC, j que estes se baseiam em
instrumentos e propriedades amplamente conhecidos. Vamonos assim cingir muito resumidamente sua enumerao
pelo nome por que so vulgarmente conhecidos, geometria e
campos de aplicao.
UV-VIS

So os detectores mais utilizados em HPLC, pois apresentam


o mais baixo custo, so praticamente insensveis a pequenas
variaes de fluxo e temperatura e totalmente compatveis

para gradientes de solventes.


Estes detectores so constitudos por uma lmpada de excitao (de Hg para detectores de filtros e de D2 para detectores
espectromtricos), um filtro ou rede de difraco (monocromador) e um divisor do feixe de luz, que dirige cada um dos
feixes resultantes e em igual intensidade a cada uma das duas
clulas de deteco (amostra/referncia), incidindo depois
ambos num fotodetector. Este fotodetector mede ento a
diferena entre a intensidade de luz que passa pelas duas
clulas, ou seja, que no absorvida, gerando um sinal
elctrico que amplificado e seguidamente convertido em
unidades de absoro por meio de um comparador logartmico.
A nica desvantagem de um detector UV-VIS a sua
selectividade, no podendo ser utilizado na deteco de
lpidos, hidrocarbonetos lineares, carbohidratos, cidos gordos e a maior parte dos polmeros.
ndice de Refraco Diferencial

Os detectores de ndice de refraco diferencial so detectores universais e por conseguinte apresentam resposta para
qualquer espcie de amostra.
A sua geometria limita-se a uma lmpada de emisso, que
incide o seu feixe luminoso sobre uma clula dupla (amostra/
referncia), um espelho e um fotodetector. Quando ambas as
clulas esto equilibradas (cheias apenas com fase mvel), a
luz que as atravessa no sofre qualquer tipo de desvio
(deflexo), incidindo na sua totalidade sobre o espelho e
reflectindo no fotodetector. No entanto, quando na clula da
amostra passa uma qualquer substncia, a luz sofre uma
deflexo, incidindo em menor intensidade no espelho e
consequentemente no fotodetector. A deflexo/refraco
tanto maior quanto maior for a diferena de composio
entre ambas as clulas, ou seja, quanto maior for a concentrao da substncia a quanti fi car.
A desvantagem que apresenta este tipo de detectores a sua
alta sensibilidade a variaes de fluxo e temperatura, sendo
tambm, por razes bvias, incompatvel com gradientes de
solventes. Devido j referida sensibilidade s mudanas de
temperatura, usual a utilizao de um pequeno forno para
a clula de deteco, o que aumenta o seu custo e torna-o
ligeiramente mais caro que um detector UV-VIS.

Os seus principais campos de aplicao so a anlise de


carbohidratos, polissacridos, lpidos, cidos gordos livres e
polmeros em geral (GPC).
Fluorescncia

No universo dos detectores de HPLC, os detectores fluorimtricos so os de maior sensibilidade (na ordem dos ppb),
possuindo todas as vantagens dos detectores UV-VIS e ainda
a especificidade de permitir discriminar os constituintes de
interesse numa matriz complexa de substncias no fluorescentes.
A geometria de um detector de fluorescncia consiste numa
lmpada de excitao (de espectro de bandas ou contnuo)
seguida de um filtro de excitao ou uma rede de difraco,
incidindo o feixe luminoso sobre a clula de amostra e
excitando a mesma, originando a emisso de um feixe de luz
ao retornar ao estado fundamental, o qual seguidamente
dirigido a um segundo filtro ou monocromador, que selecciona o comprimento de onda emitido, fazendo-o incidir por
ltimo no fotodetector.
A principal desvantagem de um detector fluorimtrico o
seu custo, o qual chega a ser 2 a 4 vezes superior ao de um
detector UV-VIS.
Quanto a aplicaes, estas dirigem-se com maior incidncia
anlise de PAH's, OPA-aminocidos, esterides, vitaminas
e aditivos e corantes alimentares.
Conductividade
O detector de conductividade electroltica encontra o seu

campo de aplicao na Cromatografia Inica, sendo um


detector de alta sensibilidade e selectividade.
O seu princpio de funcionamento consiste na medida da
conductividade total da soluo (eluente + amostra) por meio
de uma clula tubular com dois, quatro ou mesmo seis
elctrodos de Ag, Pt ou ao inoxidvel, que por sua vez so
parte integrante de uma ponte de Wheatstone, gerando desta
forma um sinal que ser posteriormente tratado e quantificado. A corrente alterna imposta possui uma frequncia entre 1
a 10 kHz.
Os detectores conductivimtricos em geral possuem grande
sensibilidade de deteco (at 10-8 M), sendo no entanto
extremamente sensveis a mudanas de temperatura. Devido
a este factor e tambm alta conductividade do eluente,
necessrio recorrer frequentemente a processos de compensao e supresso electrnica ou qumica.
Os principais campos de aplicao so os da Cromatografia
Inica, ou seja, a anlise de anies, caties e metais de
transio.
Electroqurnico
O detector electroqumico ou amperomtrico tem conhecido

uma larga expanso devido A. sua grande sensibilidade na


deteco de aminas biognicas.
O seu princpio de deteco consiste na oxidao ou reduo
da substncia a analisar na superfcie do elctrodo de trabalho; o ganho ou perda de electres resultante da reduo ou

BOLETIM SPQ, 39. 1990

CROMATOGRAFIA DE LQUIDOS

oxidao da substncia produz uma corrente proporcional


concentrao da mesma ao passar na clula de deteco.
A clula de deteco, que se encontra numa caixa de Faraday
para evitar interferncias elctricas, composta por trs
elctrodos:
referncia (Ag/AgC1);
auxiliar (Pt);
trabalho (Ag, Au ou Pt para substncias inorgnicas e
carbono vtreo para substncias orgnicas).
Os detectores electroqumicos possuem uma grande sensibilidade de deteco (at 107 M) e permitem uma grande
especificidade na identificao das espcies, obtida atravs
da possibilidade de seleco do potencial redox da reaco.
Os campos de aplicao deste tipo de detector so a anlise
de aminas biognicas (catecolaminas) e alguns ies de difcil
deteco por conductimetria, como sejam os cianetos, sulfuretos, sulfitos, halogenetos e arsenatos, entre outros.

Integradores Electrnicos Digitais

Outros Detectores

Alm dos detectores referidos, que so os de mais ampla


utilizao, outros h que por sua especificidade so tambm
utilizados em HPLC. Alguns destes detectores so enumerados de seguida:
detector de rede de dodos (PAD);
detector de infravermelhos (IR);
detector fototrmico;
detector de rotao ptica (detector polarimtrico);
detector de massas (MS);
detector de fotoionizao (PID);
detector de ionizao de chama (FID);
entre outros.
Sistema de Tratamento de Dados

Em geral, os detectores de HPLC emitem um sinal de sada


potenciomtrico (mV). Para que se possa quantificar esse
sinal necessrio a obteno de um registo grfico ou de um
aparelho que possua capacidade para tratar o sinal por si
mesmo, de forma automatizada.
Actualmente existem trs distintos nveis de sistemas de
tratamento de dados, como a seguir se refere.

53

Designados simplesmente por integradores, este tipo de


aparelhos recebe o sinal do detector e procede ao clculo
da rea dos picos por meio de um software especializado,
permitindo distintos mtodos de quantificao, como sejam
o de normalizao de reas, padro interno, padro
externo, etc.
Devido ao seu custo moderado, os integradores tm substitudo largamente os registadores potenciomtricos.
Computadores Pessoais (PC)

Actualmente, devido ao baixo custo e popularidade dos PC,


foram desenvolvidos conjuntos software + interfaces que
permitem a utilizao dos mesmos no tratamento de dados
em cromatografia.
Estes sistemas permitem as potencialidades dos vulgares
integradores e mais uma elevada capacidade de armazenamento de cromatogramas para um posterior tratamento pormenorizado e comparao de resultados.
Permitem ainda a integrao numa rede integrada de aquisio de dados LIMS (Laboratory Information Management
System), para gesto integrada e total automatizao no
laboratrio.
CONCLUSES
A Cromatografia de Lquidos (HPLC) uma tcnica de
elevado potencial analtico, cobrindo um vasto campo de
aplicaes. No entanto a sua parca divulgao em Portugal e
a inexistncia de um meio eficaz de troca de informaes
sobre os seus avanos e potencialidades tem obstado a que
tome um lugar de destaque, que lhe certamente devido, no
universo nacional da Qumica Analtica.
Aproveito esta oportunidade para lanar o repto constituio de uma Associao Portuguesa de Cromatografia, que se
dedicasse a promover e apoiar os vrios ramos da Cromatografia e tcnicas afins.
Se assim for, o objectivo deste trabalho foi atingido.
Referncias
L. R. Snyder, J. J. Kirkland, Introduction to Modern Liquid Chromatogra2nd Edition, John Wiley & Sons, New York, 1979
D. Chan Leach, M. A. Stadalius, J. S. Berus, L. R. Snyder, Reversed Phase

phy,

Registadores Potenciomtricos

Este tipo de aparelhos limita-se a receber o sinal de sada do


detector e proceder ao traado da variao do mesmo ao
longo do tempo.
A quantificao dos picos resultantes efectuada manualmente por planimetria, triangulao ou corte e pesagem.

HPLC of Basic Samples, LC*GC 6, 494 (1988)


H. M. McNair, Equipment for HPLC - VI, J. Chromatography Sci. 22, 521
(1984)
G. Horvai, F. Pal, Zs. Niegreisz, K. Tth. E. Pungor, Electrochemical
Detectors in Ion Chromatography, LC*GC 6, 1058 (1988)
E. S. Yeung, Detectors for Liquid Chromatography, John Wiley & Sons,
New York, 1986
L. I. Esteban, Introduccin a La Cromatografia de Gases, Universidad
Complutense de Madrid, 1979

Convite Reflexo...
Entre a Histria e a Filosofia da Cincia

A esmagadora maioria do trabalho histrico preocupa-se com processos, com o desenvolvimento ao longo
do tempo. Em princpio, o desenvolvimento e a mudana no precisam de desempenhar um papel semelhante em filosofia, mas na prtica, quero agora insistir,
se o fizessem, a viso do filsofo mesmo da cincia
esttica, e assim de questes como a estrutura da teoria
e a confi rmao da teoria, seria com fruto alterada.
Considerem, por exemplo, a relao entre as leis
empricas e as teorias, que explicarei de modo bastante
geral em vista desta breve concluso. Apesar das
dificuldades reais, que eu algures talvez tenha realado
as leis empricas acomodam-se relativamente bem A
tradio da filosofia da cincia. Podem, naturalmente,
ser directamente confrontadas com a observao ou a
experimentao. Mais de acordo com o ponto que
apresento, quando aparecem pela primeira vez, preenchem uma lacuna aparente, fornecendo informao
que antes faltava. Na medida em que a cincia se
desenvolve, elas podem refinar-se, mas as verses
originais permanecem como aproximaes As sucessoras, e a sua fora , por conseguinte, ou bvia ou
prontamente captada. Em suma, as leis, na medida em
que so puramente empricas, integram a cincia como
adies lquidas ao conhecimento e, assim, nunca esto
totalmente deslocadas. Podem deixar de ter interesse e,
por conseguinte, no mais ser citadas, mas isso outra
questo. Dificuldades importantes, repito, apresentamse A elaborao desta posio, dado que j no claro
saber o que deve ser uma lei puramente emprica. No
obstante, como idealizao admitida, esta explicao
padronizada das leis empricas ajusta-se bastante bem A
experincia do historiador.
No tocante As teorias, a situao diferente. A tradio
considera-as como coleces ou conjuntos de leis. Embora
admita que os membros individuais de um conjunto
possam ser confrontados com a experimentao apenas
atravs das consequncias dedutivas do conjunto no seu
todo, ela assimila assim as teorias As leis to estreitamente quanto possvel. Tal assimilao no se ajusta de
modo algum A. experincia do historiador. Quando este
olha para um dado perodo do passado, pode encontrar
lacunas no conhecimento que sero mais tarde preenchidas por leis empricas. Os antigos sabiam que o ar podia
ser comprimido, mas ignoravam a regularidade que relaciona quantitativamente o seu volume e presso; se
lhes perguntassem, admitiriam presumivelmente a
lacuna. Mas o historiador raramente ou nunca encontra
lacunas semelhantes que venham a ser preenchidas mais
tarde pela teoria. Na sua poca, a fsica aristotlica
abrangia o mundo acessvel e imaginvel to completamente como mais tarde faria a fsica newtoniana. Para
introduzir esta ltima, a primeira teve de ser literalmente
deslocada. Depois de isto ter acontecido, os esforos

para recuperar a teoria aristotlica chocaram com


dificuldades de natureza muito diferente das requeridas
para recuperar uma lei emprica. As teorias, tal como o
historiador as conhece, no podem decompor-se em
elementos constituintes em vista de uma comparao
di recta tanto com a natureza como entre si. No quer isto
dizer que no possam ser analiticamente decompostas,
mas antes que as partes legalides produzidas pela
anlise no podem, ao contrrio das leis empricas,
funcionar individualmente em tais comparaes.
Um princpio central da fsca de Aristteles era, por
exemplo, a impossibilidade do vcuo. Suponham que
um fsico moderno lhe dissesse que uma aproximao
estreita e arbitrria do vcuo se podia agora produzir no
laboratrio. Provavelmente, Aristteles ter-lhe-ia respondido que um recipiente esvaziado de ar e outros gases
no era o vcuo no sentido em que ele falava. Esta
resposta sugeriria que a impossibilidade do vcuo no
era, na sua fsica, uma questo meramente emprica.
Suponham agora que Aristteles admitia o ponto de vista
do fsico e anunciava que, afinal, podia existir o vcuo na
natureza. Ento ele teria exigido uma fsica completamente nova, porque o seu conceito de cosmos finito, dos
lugares no seu interior e do movimento natural, se mantm ou caem com o seu conceito de vcuo. Tambm
neste sentido, o enunciado legalide no existe vcuo
na natureza no funcionava como uma lei no interior da
fsica aristotlica. Isto , no poderia eliminar-se e
substituir-se por uma verso melhorada, deixando de p
o resto da estrutura.
Por conseguinte, para o historiador ou, pelo menos, para
este aqui presente, as teorias so holsticas em alguns
aspectos essenciais. Na medida em que o pode afirmar,
elas sempre existiram (embora nem sempre sob formas
que se possam descrever confortavelmente como
cientficas) e, portanto, sempre cobrem o Ambito total
dos fenmenos naturais concebveis (embora a maioria
das vezes sem grande preciso). Nestes aspectos elas
so claramente diferentes das leis e existem diferenas correspondentes inevitveis no modo como se
desenvolvem e avaliam. Destes ltimos processos
sabemos muito pouco e no aprenderemos mais
enquanto no aprendermos a reconstruir adequadamente teorias seleccionadas do passado. Como aeontece hoje, as pessoas preparadas para fazer este trabalho
so os historiadores, no os filsofos. Sem dvida, estes
poderiam aprender, mas durante o processo, como
sugeri, provavelmente tornar-se-iam tambm historiadores. Naturalmente, dar-lhes-ia as boas-vindas, mas
ficaria pesaroso se, durante a transio, perdessem a
sua viso dos problemas, um risco que considero bem
real. Para evitar isso, insisto em que a histria e a filosofia da cincia continuem a ser disciplinas separadas.
O que preciso, menos provavelmente produzido por
casamento do que pela conversao activa.
Thomas Kuhn, oik Tenso Essencial