Métodos Oficiales de Análisis (Aceites) PDF

Panreac Aceites
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A N A L I T I C O S
M E T O D O S
E N
O F I C I A L E S
A L I M E N T A R I A
D E
A N A L I S I S
Aceites
y grasas
Panreac Aceites
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PANREAC QUIMICA, S.A. ha publicado desde

hace aos la coleccin de Mtodos Analticos en
Alimentaria, que creemos ha sido de gran utilidad
por la gran acogida que han tenido por parte de
nuestros clientes.
M E T O D O S
A N A L I T I C O S
E N
A L I M E N T A R I A
Durante todo este tiempo se han producido modificaciones tanto en los mtodos propuestos en la
legislacin, como en la oferta de nuevos productos
fabricados y distribuidos por Panreac. Las nuevas
ediciones de los Mtodos Analticos en Alimentaria
irn recogiendo todas estas modificaciones y se irn
actualizando de manera acorde.
La incorporacin de Espaa en la Unin Europea y
la transposicin de las Directivas Comunitarias en la
Legislacin Espaola hace que, cada vez ms, se utilicen los mtodos de las Normativas Comunitarias
en el trabajo habitual. Por tanto, las nuevas ediciones se realizarn con los mtodos establecidos en las
Directivas. Este principio se ha introducido en la
nueva edicin del folleto Aceites y Grasas y se ir
implementando en las nuevas ediciones actualizadas
de los distintos mtodos.
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Los ttulos de las 6 monografas son:
Aceites y grasas
Aguas potables
de consumo pblico
y aguas de bebida envasadas
Carne y productos crnicos
Cereales, derivados de cereales
y cerveza
Leche y productos lcteos
Productos derivados de la uva,
aguardientes y sidras
Obviamente esta edicin ha sido actualizada con las
disposiciones publicadas hasta el momento, que
establecen nuevos procedimientos o que modifican
notablemente caractersticas anteriormente establecidas.
Por ltimo, comentarles que estn a su disposicin
adems de esta coleccin, nuestros:
Catlogo General de Reactivos PANREAC
Catlogo ADITIO de Aditivos Alimentarios
Manual Bsico de Microbiologa CULTIMED.
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Aceites y grasas
C O N T E N I D O
Recoge una transcripcin ntegra de los mtodos oficiales de anlisis publicados en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas:
NL248/1 de 5.9.91 Reglamento (CEE)
N2568/91 de la Comisin de 11 de julio de 1991
actualizados con las siguientes modificaciones
hasta la fecha: (Mayo 1999).
NL150/17 de 2.6.92 Reglamento (CEE)
N1429/92 de la Comisin de 26 de mayo de 1992
NL258/49 de 28.10.95 Reglamento (CE)
N2527/95 de la Comisin de 27 de octubre de
1995
L341/25 de 12.12.97 Reglamento (CE)
N2472/97 de la Comisin de 11 de diciembre de
1997
L28/5 de 4.2.98 Reglamento (CE) N282/98 de
la Comisin de 3 de febrero de 1998
L85/3 de 20.3.98 Reglamento (CE) N623/98
de la Comisin de 19 de marzo de 1998
A continuacin de los mtodos de anlisis se
indican los reactivos Panreac recomendados.
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Aceites
Anexo VI: Determinacin del contenido en

eritrodiol y uvaol
Anexo I: Caractersticas de los aceites

de oliva .......................................... 12
Anexo II: Determinacin del grado de
acidez
1.
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
Objeto .......................................................
Principio.....................................................
Reactivos...................................................
Material......................................................
Procedimiento............................................
Expresin...................................................
14
14
14
15
15
15
Anexo III: Determinacin del ndice de

perxidos
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Objeto .......................................................
Ambito de aplicacin ................................
Definicin ..................................................
Principio ....................................................
Aparatos ....................................................
Reactivos ..................................................
Muestra .....................................................
Procedimiento............................................
Expresin de los resultados ......................
15
15
15
15
15
16
16
16
16
17
17
17
17
18
19
19
Anexo VII: Determinacin de los cidos

grasos situados en la posicin
2 de los triglicridos de
aceites y grasas
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Objeto........................................................
Campo de aplicacin .................................
Principio.....................................................
Equipo .......................................................
Reactivos...................................................
Preparacin de la muestra .........................
Preparacin de las placas
cromatogrficas .........................................
8. Procedimiento............................................
9. Expresin de los resultados .......................
10. Notas.........................................................
28
28
28
28
29
30
30
30
31
31
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Objeto........................................................
Principio.....................................................
Aparatos ....................................................
Reactivos...................................................
Preparacin de las muestras......................
Procedimiento............................................
Clculo y expresin de los resultados ........
31
31
32
32
32
32
32
32
Anexo IX: Prueba espectrofotomtrica en

el ultravioleta
Anexo V: Determinacin de la
composicin y del contenido
de esteroles mediante
cromatografa de gases
con columna capilar
1. Objeto .......................................................
2. Principio ....................................................
3. Material .....................................................
4. Reactivos ..................................................
5. Procedimiento ...........................................
6. Expresin de los resultados ......................
Apndice ..........................................................
27
27
27
27
27
27
28
Anexo VIII: Determinacin del porcentaje

de trilinolena
Anexo IV: Determinacin del contenido

de ceras mediante
con columna capilar
1. Objeto........................................................
2. Principio ....................................................
3. Aparatos ...................................................
4. Reactivos ..................................................
5. Procedimiento ...........................................
6. Expresin de los resultados ......................
Apndice ..........................................................
Introduccin . ....................................................
1. Objeto .......................................................
2. Principio ....................................................
3. Material y aparatos ....................................
4. Reactivos ..................................................
5. Procedimiento ...........................................
20
20
20
20
21
24
24
Introduccin ......................................................
1. Objeto........................................................
2. Principio.....................................................
3. Material y aparatos.....................................
4. Reactivos...................................................
5. Procedimiento............................................
Apndice I: Preparacin de la almina
y control de su actividad ............................
Apndice II: Ajuste del espectrofotmetro..........
35
35
35
35
35
35
36
36
36
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Anexo X "A": Anlisis de los steres

metlicos de los cidos
grasos mediante
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Objeto........................................................
Reactivos...................................................
Aparatos ....................................................
Procedimiento............................................
Expresin de los resultados .......................
Caso especial de determinacin de los
ismeros trans ...........................................
Caso especial de utilizacin de un
catarmetro (funcionamiento basado en
el principio de los cambios de
conductividad trmica)...............................
Informe del anlisis.....................................
2.
3.
4.
37
37
37
38
41
42
44
44
Anexo X "B": Preparacin de los steres

metlicos de los cidos
grasos de conformidad con
los puntos I y II del anexo VI
del Reglamento (CEE)
N 72/77
Introduccin ......................................................
1. Objeto........................................................
Procedimiento A
2. Principio del mtodo .............................
3. Material y aparatos................................
4. Reactivos..............................................
5. Procedimiento.......................................
Procedimiento B
4. Reactivos..............................................
5. Procedimiento.......................................
Procedimiento C
4. Reactivos..............................................
5. Procedimiento.......................................
Procedimiento D
4. Reactivos..............................................
5. Procedimiento.......................................
Procedimiento E
4. Reactivos..............................................
5. Procedimiento.......................................
44
45
45
45
45
45
46
46
46
46
46
46
46
47
47
47
47
47
48
48
48
48
6
Anexo XI: Determinacin del contenido en
solventes halogenados voltiles
en el aceite de oliva
1.
Principio del mtodo .................................. 48
Equipo ....................................................... 48
Reactivos................................................... 49
Procedimiento de anlisis........................... 49
Anexo XIII:
1.
Neutralizacin y decoloracin del aceite de

oliva en laboratorio.....................................
1.1 Neutralizacin del aceite .............................
1.1.1 Equipo.....................................................
1.1.2 Reactivos ................................................
1.1.3 Modo de operar ......................................
1.2 Decoloracin del aceite neutro.................
1.2.1 Equipo.....................................................
1.2.2 Modo de operar ......................................
49
49
49
49
50
50
50
50
Anexo XIV: Notas complementarias 2, 3

y 4 del captulo 15 de la
nomenclatura combinada
1.
2.
3.
Nota 2A .....................................................
Nota 2B .....................................................
Nota 2C .....................................................
Nota 2D .....................................................
Nota 2E .....................................................
Nota 3 .......................................................
Nota 4 .......................................................
50
51
52
52
52
52
52
Anexo XV:
1.
2.
3.
Contenido en aceite de los orujos de aceituna

1.1 Material............................................... 52
1.2 Reactivo ............................................. 53
Modo de operar......................................... 53
Expresin de los resultados ....................... 54
Anexo XVI: Determinacin del ndice

de yodo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Objeto........................................................
Definicin ...................................................
Principio.....................................................
Reactivos...................................................
Material......................................................
Preparacin de la muestra .........................
Procedimiento............................................
Expresin de los resultados .......................
54
54
54
54
55
55
55
55
Anexo XVII: Mtodo para la determinacin

de estigmastadienos en los
aceites vegetales
1.
2.
Objetivos.................................................... 56
Aplicacin .................................................. 56
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M
3.
4.
5.
6.
Fundamento ..............................................
Instrumental ...............................................
Reactivos...................................................
Metodologa...............................................
56
56
56
57
Anexo XVIII: Determinacin del contenido

de triglicridos con ECN42 (diferencia
entre el contenido terico y los datos
obtenidos por HPLC)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Objeto........................................................
Principio.....................................................
Mtodo ......................................................
Evaluacin de los resultados ......................
Ejemplo......................................................
60
60
60
60
65
66
Relacin de reactivos y productos

auxiliares Panreac que se utilizan en los
mtodos de Anlisis de Aceites y
Grasas................................................... 72
Relacin de aditivos y coadyuvantes

tecnolgicos para uso alimentario
industrial............................................... 74
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M
REGLAMENTO (CEE) N 2568/91 DE LA
COMISIN de 11 de julio de 1991 relativo
a las caractersticas de los aceites de
oliva y de los aceites de orujo de oliva y
sobre sus mtodos de anlisis
LA COMISIN DE LAS COMUNIDADES

EUROPEAS,
Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad
Econmica Europea.
Visto el Reglamento n 136/66/CEE del Consejo,
de 22 de septiembre de 1966, por el que se
establece la organizacin comn de mercados en
el sector de las materias grasas (1), cuya ltima
modificacin la constituye el Reglamento (CEE) n
3577/90 (2), y, en particular, su artculo 35 bis,
Considerando que en el Anexo del Reglamento
n 136/66/CEE se establecen las denominaciones y
definiciones de los aceites de oliva y de los aceites
de orujo de oliva comercializados dentro de cada
Estado miembro, as como en los intercambios
intracomunitarios y con terceros pases;
Considerando que, para poder distinguir los
diferentes tipos de aceite, procede definir las caractersticas fisicoqumicas de cada uno de ellos, as
como las caractersticas organolpticas de los aceites vrgenes, a fin de garantizar as la pureza y calidad de estos productos, sin perjuicio de otras disposiciones existentes en la materia;
Considerando que conviene determinar de
manera uniforme en toda la Comunidad la presencia de las caractersticas de los diferentes tipos de
aceite; que, para ello, procede establecer los mtodos comunitarios de anlisis qumico y de valoracin organolptica; que conviene, sin embargo,
permitir que durante un perodo transitorio se utilicen otros mtodos de anlisis que sean aplicados
en los Estados miembros, estableciendo al mismo
tiempo que en caso de presentarse resultados
divergentes prevalezcan los obtenidos a travs del
mtodo comn;
Considerando que la definicin de las caractersticas fisicoqumicas de los aceites de oliva y de sus
mtodos de anlisis comporta la adaptacin de las
notas complementarias del captulo 15 de la
nomenclatura combinada;
Considerando que el mtodo de valoracin de
las caractersticas organolpticas de los aceites vrgenes requiere la creacin de unos paneles de
catadores seleccionados y especialmente adiestrados; que conviene, por lo tanto, prever el plazo
necesario para instaurar una estructura de este
tipo; que, dadas las dificultades a las que se enfren-
(1) DO n 172 de 30. 9. 1966, p. 3025/66.

(2) DO n L 353 de 17. 12. 1990, p. 23.
tarn determinados Estados miembros para crear

dichos paneles, procede autorizar que se recurra a
paneles existentes en otros Estados miembros;
Considerando que, para garantizar el correcto
funcionamiento del sistema de las exacciones reguladoras aplicables a la importacin de orujo de oliva,
es conveniente prever un mtodo nico para la
determinacin del contenido en aceite de estos productos;
Considerando que, para no perjudicar el comercio, resulta oportuno prever un perodo limitado
para la salida al mercado del aceite que haya sido
envasado antes de la entrada en vigor del presente
Reglamento;
Considerando que procede derogar el Reglamento (CEE) n 1058/77 de la Comisin (3), cuya
ltima modificacin la constituye el Reglamento
(CEE) n 1858/88 (4);
Considerando que el Comit de gestin de las
materias grasas no ha emitido dictamen alguno en
el plazo establecido por su presidente,
HA ADOPTADO EL PRESENTE
REGLAMENTO:
Artculo 1
1. Se considerarn aceites de oliva vrgenes, a
que se refieren las letras a), b), y c) del punto 1 del
Anexo del Reglamento n 136/66/CEE, los aceites
cuyas caractersticas se ajusten a las indicadas,
respectivamente, en los puntos 1, 2 y 3 del Anexo I
del presente Reglamento.
2. Se considerar aceite de oliva virgen lampante, a que se refiere la letra d) del punto 1 del Anexo
del Reglamento n 136/66/CEE, el aceite cuyas
caractersticas se ajusten a las indicadas en el punto 4 del Anexo I del presente Reglamento.
3. Se considerar aceite de oliva refinado, a que
se refiere el punto 2 del Anexo del Reglamento n
136/66/CEE, el aceite cuyas caractersticas se ajusten a las indicadas en el punto 5 del Anexo I del presente Reglamento.
4. Se considerar aceite de oliva, a que se refiere el punto 3 del Anexo del Reglamento n
5. Se considerar aceite de orujo de oliva crudo,
a que se refiere el punto 4 del Anexo del Reglamento n 136/66/CEE, el aceite cuyas caractersticas se
ajusten a las indicadas en el punto 7 del Anexo I del
presente Reglamento.
(3) DO n L 128 de 24. 5. 1977, p. 6.

(4) DO n L 166 de 1. 7. 1988, p. 10.
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6. Se considerar aceite de orujo de oliva refinado, a que se refiere el punto 5 del Anexo del Reglamento n 136/66/CEE, el aceite cuyas caractersticas se ajusten a las indicadas en el punto 8 del
Anexo I del presente Reglamento.
7. Se considerar aceite de orujo de oliva, a que
se refiere el punto 6 del Anexo del Reglamento n
El anlisis contradictorio ser realizado por el

panel de catadores de conformidad con las disposiciones citadas anteriormente.
Para la valoracin de las caractersticas organolpticas con ocasin de operaciones relacionadas
con el rgimen de intervencin, el panel de catadores proceder a aquella con arreglo a las disposiciones del Anexo XII.
*Nota: Al no considerarse la valoracin organolptica un anlisis
qumico, se ha omitido el anexo XII.
Si est interesado en l, no dude en solicitarlo.
Artculo 2
Artculo 3
10
1. Las caractersticas de los aceites, previstas en

el Anexo I, se determinarn empleando los mtodos
de anlisis siguientes:
para determinar los cidos grasos libres,
expresados en porcentaje de cido oleico, el mtodo recogido en el Anexo II,
para determinar el ndice de perxidos, el
mtodo recogido en el Anexo III,
para determinar los alcoholes alifticos, el
mtodo recogido en el Anexo IV,
para determinar el contenido de esteroles, el
mtodo recogido en el Anexo V,
para determinar el eritrodiol + uvaol, el mtodo
recogido en el Anexo VI,
para determinar los cidos grasos saturados
en la posicin 2 del triglicrido, el mtodo recogido
en el Anexo VII,
para determinar el contenido de trilinolena, el
mtodo recogido en el Anexo VIII,
para el anlisis espectrofotomtrico, el mtodo
recogido en el Anexo IX,
para determinar la composicin de cidos grasos, el mtodo recogido en los Anexos X A
y X B,
para determinar los solventes halogenados
voltiles, el mtodo recogido en el Anexo XI,
para la valoracin de las caractersticas organolpticas de los aceites de oliva vrgenes, el mtodo recogido en el Anexo XII, que se aplicar de conformidad con el apartado 2,
para la prueba de la refinacin, el mtodo
recogido en el Anexo XIII.
para determinar los estigmastadienos, el
mtodo recogido en el Anexo XVII. (Modificado por
el Reglamento 656/95)
para determinar la composicin de los triglicridos de ECN42, el mtodo que figura en el Anexo
XVIII. (Modificado por el Reglamento 2472/97)
2. El analista, asistido en su caso por expertos,
llevar a cabo la valoracin de las caractersticas
organolpticas con arreglo al procedimiento descrito en la ficha de degustacin contemplada en el
Anexo XII. En caso de que el anlisis determine
caractersticas organolpticas distintas de las resultantes de la denominacin del producto, el analista
someter la muestra al examen de un panel de
catadores, con arreglo a las disposiciones del Anexo XII.*
Hasta el 28 de febrero de 1993 (modificado por

el Reglamento 183/93), la introduccin de los mtodos de anlisis previstos en el artculo 2 no ser bice para que los Estados miembros empleen otros
mtodos comprobados y cientficamente vlidos,
siempre que con ello no se obstaculice la libre circulacin de los productos reconocidos conformes a la
normativa en aplicacin de los mtodos comunitarios. Los Estados miembros interesados comunicarn a la Comisin dichos otros mtodos antes de
utilizarlos.
En caso de que alguno de estos otros mtodos
d un resultado diferente del alcanzado por el mtodo comn, se considerar vlido el resultado obtenido en aplicacin del mtodo comn.
Artculo 4
1. A fin de apreciar las caractersticas organolpticas, los Estados miembros constituirn paneles de
catadores seleccionados y entrenados de acuerdo
con las normas previstas en el mtodo descrito en
el Anexo XII.
2. En caso de que un Estado miembro tenga
dificultades para constituir un panel en su territorio
podr recurrir a un panel que se halle establecido
en otro Estado miembro.
Artculo 5
Las notas complementarias 2, 3 y 4 del captulo
15 de la nomenclatura combinada que figura en el
Anexo I del Reglamento (CEE) no 2658/87 del Consejo (5) sern sustituidas por el texto que figura en el
Anexo XIV del presente Reglamento. (Modificado
por el Reglamento 183/93)
Artculo 6
1. El contenido en aceite de orujo de aceituna y
dems residuos de la extraccin del aceite de oliva
(cdigos NC 2306 90 11 y 2306 90 19) se determinar con arreglo al mtodo recogido en el Anexo XV.
(5) Do n L 256 de 7. 9. 1987, p. 1.
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M
2. El contenido de aceite mencionado en el
apartado 1 se expresar como porcentaje del
extracto seco en peso.
Artculo 7
Sern aplicables las disposiciones comunitarias
sobre la presencia de sustancias extraas distintas
de las mencionadas en el Anexo XI.
Artculo 8
1. Cada Estado miembro comunicar a la Comisin las medidas adoptadas en aplicacin del presente Reglamento.
2. Cada Estado miembro comunicar a la Comisin, al inicio de cada semestre una recapitulacin
de los datos analticos de las determinaciones efectuadas durante el semestre precedente.
Estos resultados sern examinados por el Comit de gestin de las materias grasas con arreglo al
procedimiento previsto en el artculo 39 del Reglamento n 136/66/CEE.
Artculo 9
Queda derogado el Reglamento (CEE) n
1058/77.
Artculo 10
1. El presente Reglamento entrar en vigor el
tercer da siguiente al de su publicacin en el Diario
Oficial de las Comunidades Europeas.
No obstante, el mtodo que figura en el Anexo
XII se aplicar a partir del 1 de enero de 1992,
excepto en lo que se refiere a las operaciones relacionadas con la intervencin.
El presente Reglamento no se aplicar a los
aceites de oliva y de orujo de oliva envasados antes
de la fecha de entrada en vigor del presente Reglamento y comercializados hasta el 31 de octubre de
1992.
El presente Reglamento ser obligatorio en
todos sus elementos y directamente aplicable en
cada Estado miembro.
Hecho en Bruselas, el 11 de julio de 1991.
Por la Comisin
RAY MAC SHARRY
Miembro de la Comisin
ANEXOS
Indice
Anexo I: Caractersticas de los aceites de oliva
Anexo II: Determinacin del grado de acidez
Anexo III: Determinacin del ndice de perxidos
Anexo IV: Determinacin del contenido de ceras
mediante cromatografa de gases con columna
capilar (Modificado por el Reglamento 183/93)
Anexo V: Determinacin de la composicin y del
contenido de esteroles mediante cromatografa de
gases en columna capilar
Anexo VI: Determinacin del eritrodiol y uvaol
Anexo VII: Determinacin de los cidos grasos
saturados en la posicin 2 de los triglicridos de
aceites y grasas
Anexo VIII: Determinacin del porcentaje de trinolena
Anexo IX: Prueba espectrofotomtrica en el
ultravioleta
Anexo X "A": Anlisis de los steres metlicos de
los cidos grasos mediante cromatografa de gases
Anexo X "B": Preparacin de los steres metlicos de los cidos grasos
Anexo XI: Determinacin del contenido en solventes halogenados voltiles en el aceite de oliva
Anexo XII: Valoracin organolptica del aceite de
oliva virgen
Anexo XIII: Neutralizacin y decoloracin del
aceite de oliva en laboratorio (Modificado por el
Reglamento 183/93)
Anexo XIV: Notas complementarias 2, 3 y 4 del
captulo 15 de la nomenclatura combinada
Anexo XV: Contenido de aceite de los orujos de
aceituna
Anexo XVI: Determinacin del ndice de yodo
Anexo XVII: Mtodo para la determinacin de
estigmastadienos en los aceites vegetales (Modificado por el Reglamento 656/95)
Anexo XVIII: Mtodo para la determinacin de la
composicin de los triglicridos de ECN42 (Modificado por el Reglamento 2472/97)
11
20
20
> 20
5
15
5
15
2,0
3,3
> 3,3
0,5
1,5
> 0,5
0,5
1,5
3. Aceite de oliva virgen corriente
4. Aceite de oliva virgen lampante
5. Aceite de oliva refinado
6. Aceite de oliva
7. Aceite de orujo de oliva crudo
8. Aceite de orujo de oliva refinado
9. Aceite de orujo de oliva
0,20
0,20
0,20
0,20
> 0,20
0,20
0,20
0,20
> 350
350
2,0
-
1,8
2,0
0,50
0,15
0,15
0,15
Estigmastadienos (2)
mg/kg
1,5
1,5
1,3
350
350
1,3
1,3
1,3
cidos grasos
saturados en
posicin 2
de los
triglicridos
(%)
250
250
250
Ceras
mg/kg
0,5
0,5
0,6
0,3
0,3
0,3
0,2
0,2
0,2
Diferencia
entre ECN42
y HPLC
y ECN42
clculo
terico
5,30
5,50
3,30
3,40
3,70
2,60
2,60
2,50
K232 (*)
2,00
2,50
1,00
1,20
> 0,25
0,25
0,25
0,20
K270 (*)
0,11
0,10
0,10
0,10
K270
despus de
pasar por
almina
(3)
0,20
0,25
0,13
0,16
0,01
0,01
0,01
D-K
(*)
< 3,5
3,5
5,5
6,5
Panel test
(*)
(1) Lmite mximo total de compuestos halogenados detectados mediante captura de electrones.
Para cada uno de los componentes el lmite mximo es de 0,10 mg/kg.
(2) Suma de ismeros que podran (o no podran) separarse mediante una columna capilar.
(3) Para la verificacin de aceite refinado, cuando el K270 sobrepase el lmite de la categora correspondiente, deber procederse a la determinacin del K270 despus de ser tratado con
almina.
Notas:
Los resultados de los anlisis debern expresarse con el mismo nmero de decimales que los previstos para cada caracterstica.
La ltima cifra deber aumentarse en una unidad si la cifra siguiente es superior a 4.
Para cambiar de categora a un aceite o declararlo no conforme a su pureza bastar con que una sola de las caractersticas no se ajuste a los lmites fijados.
Las caractersticas indicadas con asterisco (*), relativas a la calidad del aceite, implican lo siguiente:
en el caso del aceite de oliva virgen lampante, los lmites (excepto el de K232) no debern respetarse simultneamente;
en el caso de los dems aceites de oliva vrgenes, el incumplimiento de uno de los lmites supondr un cambio de categora, aunque seguirn clasificados dentro de una de las categoras de los aceites de oliva vrgenes.
20
1,0
ndice de
Disolventes
perxidos halogenados
mg/kg
meq O2/kg
(*)
(*) (1)
2. Aceite de oliva virgen
Acidez (%)
(*)
CARACTERSTICAS DE LOS ACEITES DE OLIVA
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1. Aceite de oliva virgen extra
Categora
12
(modificado por el Reglamento (CE) N 2472/97)
ANEXO I
Panreac Aceites
Pgina 12
0,6
0,6
0,6
0,6
0,6
0,6
0,6
0,6
0,6
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,3
0,3
0,3
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,05
0,05
0,05
0,10
0,20
0,20
0,20
0,40
0,40
0,05
0,05
0,05
0,10
0,30
0,30
0,10
0,35
0,35
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
0,05
0,05
0,05
0,05
0,05
0,05
0,05
0,05
0,05
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,2
0,2
0,2
Brasicasterol
(%)
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
Campesterol
(%)
< Camp.
< Camp.
< Camp.
< Camp.
< Camp.
< Camp.
< Camp.
Estigmasterol
(%)
93,0
93,0
93,0
93,0
93,0
93,0
93,0
93,0
93,0
Betasitosterol
(1)
(%)
Nota:
Los resultados de los anlisis debern expresarse con el mismo nmero de decimales que los previstos para cada caracterstica.
La ltima cifra deber aumentarse en una unidad si la cifra siguiente es superior a 4.
Para cambiar de categora a un aceite o declararlo no conforme a su pureza bastar con que una sola de las caractersticas no se ajuste a los lmites fijados.
(1) Suma de: Delta-5,23-Estigmastadienol + Clerosterol + Sitosterol + Sitostanol + Delta-5-Avenasterol + Delta-5-Avenasterol + Delta-5,24-Estigmastadienol.
1. Aceite de oliva virgen extra

2. Aceite de oliva virgen
3. Aceite de oliva virgen corriente
4. Aceite de oliva virgen lampante
5. Aceite de oliva refinado
6. Aceite de oliva
7. Aceite de orujo de oliva crudo
8. Aceite de orujo de oliva refinado
9. Aceite de orujo de oliva
Mirstico
(%)
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
1000
1000
1000
1000
1000
1000
2500
1800
1600
Delta-7- Esteroles
Estigmas- totales
tenol
(mg/kg)
(%)
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
12
12
> 4,5
Eritrodiol
y uvaol
(%)
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Categora
Sumas
Sumas de
de los
los ismeros
ismeros translinoleicos y Colesterol
Lino- Araqu- Eicose- Beh- Lignotransoleicos translinolnicos
(%)
lnico lnico noico nico crico
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
Contenido de cidos
Panreac Aceites
Pgina 13
13
Panreac Aceites
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Pgina 14
ANEXO II
DETERMINACIN DEL GRADO DE ACIDEZ
1. OBJETO
Determinar los cidos libres en los aceites de oliva. El contenido en cidos grasos libres se expresa
mediante la acidez calculada segn el mtodo convencional.
1.1. Principio
Disolucin de la muestra en una mezcla de
disolventes y valoracin de los cidos grasos libres
mediante una solucin etanlica de hidrxido potsico.
1.2. Reactivos
Todos los reactivos deben ser de calidad analtica reconocida y el agua utilizada debe ser agua
destilada o de una pureza equivalente.
1.2.1. Mezcla de ter dietlico y etanol de
95% (V/V), en proporcin de volumen 1:1.
Nota: El ter dietlico es muy inflamable y puede
formar perxidos explosivos. Debe utilizarse tomando especiales precauciones.
Debe neutralizarse exactamente en el momento
de su utilizacin con la solucin de hidrxido potsico (1.2.2) en presencia de 0,3 ml de la solucin de
fenolftalena (1.2.3) por cada 100 ml de mezcla.
Nota: Si no es posible utilizar ter dietlico, puede sustituirse por una mezcla de disolventes formada por etanol y tolueno. Si fuera necesario, el etanol podra sustituirse, a su vez, por 2-propanol.
REACTIVO
Etanol de 95 % (V/V)
Etanol
Etanol de 95-96% (V/V)
ter dietlico
14
Hidrxido potsico
2-Propanol
Solucin de 10 g/l de fenolftalena
en etanol de 95-96% (V/V)
Solucin etanlica valorada de
hidrxido potsico, = 0,1 M
Solucin etanlica valorada de
hidrxido potsico, = 0,5 M
Tolueno
Virutas de aluminio
1.2.2. Solucin etanlica valorada de hidrxido potsico, = 0,1M o, en caso necesario,

= 0,5M.
Nota 1.
Debe conocerse, y comprobarse inmediatamente antes de su utilizacin, la concentracin exacta
de la solucin etanlica de hidrxido potsico.
Debe utilizarse una solucin que haya sido preparada por lo menos cinco das antes y decantada en
un frasco de vidrio marrn cerrado con tapn de
goma. La solucin debe ser incolora o de color
amarillo paja.
Nota: Se puede preparar una solucin incolora y
estable de hidrxido potsico de la manera siguiente: Llevar a ebullicin, y mantener sta a reflujo
durante una hora, 1000 ml de etanol con 8 g de
hidrxido potsico y 0,5 g de virutas de
aluminio. Destilar inmediatamente. Disolver en el
destilado la cantidad requerida de hidrxido potsico. Dejar reposar durante varios das y decantar el
lquido claro sobrenadante, separndolo del precipitado de carbonato potsico.
La solucin tambin puede prepararse de la
manera siguiente sin efectuar la destilacin: aadir 4
ml de butilato de aluminio a 1000 ml de etanol y
dejar reposar la mezcla durante algunos das.
Decantar el lquido sobrenadante y disolver en l la
cantidad necesaria de hidrxido potsico. La
solucin est lista para ser utilizada.
1.2.3. Solucin de 10 g/l de fenolftalena en
etanol de 95-96% (V/V) o solucin de 20 g/l de
azul alcalino (en caso de aceites de oliva muy coloreados) en etanol de 95-96% (V/V).
RECOMENDACIN PANREAC
Cdigo
Denominacin
121085
Etanol 96% v/v PA
132770
121515
131090
281327
Eter Dietlico estabilizado con ~6 ppm de BHT

PA-ACS-ISO
Potasio Hidrxido 85% lentejas PA
2-Propanol PA-ACS-ISO
Fenolftalena solucin 1% RV
182146
Potasio Hidrxido 0,1 mol/l (0,1N) etanlica SV
181519
Potasio Hidrxido 0,5 mol/l (0,5N) etanlica SV
131745
A13805
Tolueno PA-ACS-ISO
Aluminio, virutas, 99+%
Panreac Aceites
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Pgina 15
M
1.3. Material
Material habitual de laboratorio, y en particular:
1.3.1. Balanza analtica
1.3.2. Matraz erlenmeyer de 250 ml de capacidad
1.3.3. Bureta de 10 ml de capacidad, con graduacin de 0,05 ml
1.4. Procedimiento
1.4.1. Preparacin de la muestra para la prueba
La determinacin se efectuar en una muestra
filtrada. Si el contenido global de humedad e impurezas es inferior al 1%, se utilizar la muestra tal
cual.
1.4.2. Muestra para la prueba
Tomar la muestra, segn el grado de acidez previsto, de acuerdo con el cuadro siguiente:
Grado de
acidez previsto
Peso de la
muestra (en g)
Precisin de la
pesada de la
muestra (en g)
<1
1a4
4 a 15
15 a 75
> 75
20
10
2,5
0,5
0,1
0,05
0,02
0,01
0,001
0,0002
Pesar la muestra en el matraz erlenmeyer (1.3.2)

1.4.3. Determinacin
Disolver la muestra (1.4.2) en 50 a 150 ml de la
mezcla de ter dietlico y etanol (1.2.1), previamente
neutralizada.
Valorar, agitando, con la solucin de hidrxido
potsico de 0,1M (1.2.2) (vase nota 2) hasta el viraje
del indicador (la coloracin rosa de la fenolftalena
debe permanecer al menos durante 10 segundos).
Nota 1: La solucin etanlica valorada de hidrxido potsico (1.2.2) puede sustituirse por una solucin acuosa de hidrxido potsico o sdico siempre que el volumen de agua aadido no provoque
una separacin de las fases.
Nota 2: Si la cantidad necesaria de la solucin
de hidrxido potsico de 0,1M supera los 10 ml,
debe utilizarse una solucin de 0,5M.
Nota 3: Si la solucin se enturbia durante la valoracin, aadir una cantidad suficiente de la mezcla
de disolventes (1.2.1) para que la solucin se aclare.
1.5 Expresin de la acidez en
porcentaje de cido oleico
La acidez, expresada en porcentaje de cido
oleico es igual a:
M
100
VxcxM
V x c x x =
1000
P
10 x P
siendo:
V : volumen en ml de la solucin valorada de
hidrxido potsico utilizada.
c : concentracin exacta, en moles por litro, de
la solucin de hidrxido potsico utilizada.
M: peso molecular del cido en que se expresa
el resultado (cido oleico = 282).
P: peso en gramos de la muestra utilizada.
Se tomar como resultado la media aritmtica
de dos determinaciones.
ANEXO III
DETERMINACIN DEL NDICE DE
PERXIDOS
1. OBJETO
La presente norma describe un mtodo para la
determinacin del ndice de perxidos de los aceites y grasas.
2. MBITO DE APLICACIN
La presente norma es aplicable a los aceites y
grasas animales y vegetales.
3. DEFINICIN
El ndice de perxidos es la cantidad (expresada
en miliequivalentes de oxgeno activo por kg de grasa) de perxidos en la muestra que ocasionan la
oxidacin del yoduro potsico en las condiciones
de trabajo descritas.
4. PRINCIPIO
La muestra problema, disuelta en cido actico
y cloroformo, se trata con solucin de yoduro potsico. El yodo liberado se valora con solucin valorada de tiosulfato sdico.
5. APARATOS
Todo el material utilizado estar exento de sustancias reductoras u oxidantes.
Nota: No engrasar las superficies esmeriladas.
5.1. Navecilla de vidrio de 3 ml
5.2. Matraces con cuello y tapn esmerilados,
de 250 ml de capacidad aproximadamente, previamente secados y llenos de gas inerte puro y seco
(nitrgeno o, preferiblemente, dixido de carbono).
5.3. Bureta de 25 o 50 ml, graduada en 0,1 ml.
15
Panreac Aceites
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Pgina 16
6. REACTIVOS
6.1. Cloroformo para anlisis, exento de oxgeno por borboteo de una corriente de gas inerte
puro y seco.
6.2. cido actico glacial para anlisis, exento de oxgeno por borboteo de una corriente de gas
inerte puro y seco.
6.3. Solucin acuosa saturada de yoduro
potsico, recin preparada, exenta de yodo y
yodatos.
REACTIVO
cido actico glacial para anlisis
Almidn soluble
Cloroformo para anlisis
Solucin acuosa de tiosulfato sdico
0,01 N
Solucin acuosa de tiosulfato sdico
0,002 N
Solucin de almidn, en solucin
acuosa de 10 g/l
Yoduro potsico
Cdigo
Denominacin
131008
Acido Actico glacial PA-ACS-ISO
121096
Almidn de Patata soluble PA
131252
Triclorometano estabilizado con etanol PA-ACS-ISO
181723
Prepararlo a partir de Sodio Tiosulfato 0,1 mol/l
(0,1N) SV diluido convenientemente con agua
181723
Prepararlo a partir de Sodio Tiosulfato 0,1 mol/l
(0,1N) SV diluido convenientemente con agua
283146
Almidn solucin 1% RV
131542
7. MUESTRA
La muestra se tomar y almacenar al abrigo de
la luz, y se mantendr refrigerada dentro de envases de vidrio totalmente llenos y hermticamente
cerrados con tapones de vidrio esmerilado o de
corcho.
8. PROCEDIMIENTO
El ensayo se realizar con luz natural difusa o
con luz artificial. Pesar con precisin de 0,001 g en
una navecilla de vidrio (5.1) o, en su defecto, en un
matraz (5.2) una cantidad de muestra en funcin del
ndice de perxidos que se presuponga, con arreglo
al cuadro siguiente:
16
6.4. Solucin acuosa de tiosulfato sdico

0,01N o 0,002N valorada exactamente; la valoracin se efectuar inmediatamente antes del uso.
6.5. Solucin de almidn, en solucin acuosa de 10 g/l, recin preparada con almidn soluble.
ndice de perxidos
que se supone
(meq de O2/kg)
Peso de la muestra
problema (en g)
de 0 a 12
de 12 a 20
de 20 a 30
de 30 a 50
de 50 a 90
de 5,0 a 2,0
de 2,0 a 1,2
de 1,2 a 0,8
de 0,8 a 0,5
de 0,5 a 0,3
Potasio Yoduro PA-ACS-ISO
10 ml de cloroformo (6.1). Disolver rpidamente la

muestra problema mediante agitacin. Aadir 15 ml
de cido actico (6.2) y, a continuacin, 1 ml de
solucin de yoduro potsico (6.3). Cerrar rpidamente el matraz, agitar durante 1 minuto y mantenerlo en la oscuridad durante 5 minutos exactamente, a una temperatura comprendida entre 15 y 25C.
Aadir 75 ml aproximadamente de agua destilada. Valorar (agitando al mismo tiempo vigorosamente) el yodo liberado con la solucin de tiosulfato
sdico (6.4) (solucin 0,002N si se presuponen
valores inferiores a 12 y solucin 0,01N si se presuponen valores superiores a 12), utilizando la solucin de almidn (6.5) como indicador.
Efectuar dos determinaciones por muestra.
Realizar simultneamente un ensayo en blanco.
Si el resultado del ensayo en blanco sobrepasa
0,05 ml de la solucin de tiosulfato sdico 0,01N
(6.4), sustituir los reactivos.
9. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS
Abrir un matraz (5.2) e introducir la navecilla de

vidrio que contenga la muestra problema. Aadir
El ndice de perxidos (I.P.), expresado en miliequivalentes de oxgeno activo por kg de grasa se

calcula mediante la frmula siguiente:
V x N x 1000
IP =
P
Panreac Aceites
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Pgina 17
M
siendo:
V: ml de solucin valorada de tiosulfato sdico
(6.4) empleados en el ensayo, convenientemente corregidos para tener en cuenta el
ensayo en blanco.
N: normalidad exacta de la solucin de tiosulfato
sdico (6.4) empleada.
P: peso, en gramos de la muestra problema.
El resultado ser la media aritmtica de las dos
determinaciones efectuadas.
ANEXO IV
(Modificado por los Reglamentos (CEE)
N 183/93 y 177/94)
DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE
CERAS MEDIANTE CROMATOGRAFA DE
GASES CON COLUMNA CAPILAR
1. OBJETO
El presente mtodo describe un procedimiento
para la determinacin del contenido de ceras en
determinados aceites y grasas en las condiciones
de ensayo.
Puede utilizarse, en particular, para distinguir el
aceite de oliva obtenido mediante extraccin (aceite
de orujo de oliva).
2. PRINCIPIO
Fraccionamiento de la grasa o aceite, a los que
se habr aadido un patrn interno adecuado,
mediante cromatografa en columna de gel de slice
hidratado. Recuperacin de la fraccin eluida en las
condiciones de ensayo (cuya polaridad es inferior a
la de los triglicridos) y, a continuacin, anlisis
directo mediante cromatografa de gases columna
capilar.
3. APARATOS
3.1. Matraz Erlenmeyer de 25 ml.
3.2. Columna de vidrio para cromatografa de
15 mm de dimetro interior y 30-40 cm de longitud.
Recomendacin Panreac: 727401 Columna
para cromatografa "flash" con adaptador y vlvula
de tefln. 20 mm ID x 400 mm longitud.
3.3. Cromatgrafo de gases adecuado con
columna capilar, dotado de un sistema de introduccin directa en la columna, que incluya los siguientes elementos:
3.3.1. Horno termosttico para las columnas,
que pueda mantener la temperatura deseada con
una oscilacin mxima de 1C.
3.3.2. Inyector en fro para introduccin directa
en la columna.
3.3.3. Detector de ionizacin de llama y convertidor-amplificador.

3.3.4. Registrador-integrador que pueda funcionar con el convertidor-amplificador (3.3.3), con un
tiempo de respuesta inferior o igual a un segundo y
velocidad del papel variable.
3.3.5. Columna capilar de vidrio o slice fundida,
de 10-15 m (6) de longitud y 0,25-0,32 mm de dimetro interior, con un recubrimiento interno de SE52 o SE-54 lquido, o equivalente, de un espesor
que oscile entre 0,10 y 0,30 m .
Recomendacin Panreac: 723310.10 Columna
capilar para GC PERMABOND SE-52 de 10 m de
longitud, 0,32 mm de ID y 0,25 m de espesor de
capa.
3.4. Microjeringa para inyeccin en columna, de
10 l de capacidad, provista de una aguja cementada.
4. REACTIVOS
4.1. Gel de slice 70-230 mesh, artculo 7754
Merck.
Mantener el gel en el horno durante cuatro horas
a una temperatura de 500C. Dejar enfriar y aadir
un 2% de agua. Agitar bien para homogeneizar la
mezcla. Mantener al abrigo de la luz durante al
menos 12 horas antes de su uso.
Recomendacin Panreac: 711037.1000
POLYGOPREP 60-130, tamao partcula 63-200 m
4.2. n-Hexano, de calidad para cromatgrafa.
4.3. ter etlico, de calidad para cromatogrfa.
4.4. n-Heptano, de calidad para cromatografa.
4.5. Solucin patrn de laurilaraquidato al
0,1 % (m/v) en hexano (patrn interno).
4.6. Gas portador: hidrgeno puro, de calidad
para cromatografa de gases.
4.7. Gases auxiliares:
hidrgeno puro, de calidad para cromatografa
de gases,
aire puro, de calidad para cromatografa de
gases.
17
(6) En la Directiva consta errneamente como mm
Panreac Aceites
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REACTIVO
ter etlico para cromatografa
n-Heptano, de calidad para
cromatografa
n-Hexano, de calidad para
cromatografa
Pgina 18
Cdigo
Denominacin
362551
Eter Dietlico estabilizado con etanol
(UV-IR-HPLC) PAI
362062
n-Heptano (UV-IR-HPLC-HPLC preparativa) PAI
362063
5. PROCEDIMIENTO
18
5.1. Separacin de la fraccin de las ceras

5.1.1. Preparacin de la columna cromatogrfica.
Suspender en n-hexano anhidro 15 g de gel de
slice hidratado al 2% e introducir en la columna.
Dejar sedimentar espontneamente. Completar
la sedimentacin con ayuda de un vibrador elctrico, a fin de obtener una banda cromatogrfica ms
homognea. Hacer pasar 30 ml de n-hexano para
eliminar las posibles impurezas.
5.1.2. Cromatografa en columna.
Pesar con exactitud 500 mg de la muestra en un
matraz de 25 ml; aadir una cantidad de patrn
interno apropiada, en funcin del contenido de
ceras que se presuma; por ejemplo, aadir 0,1 mg
de laurilaraquidato si se trata de aceite de oliva y
0,25-0,50 mg si se trata de aceite de orujo de oliva.
Transferir la muestra preparada a la columna
cromatogrfica, que se habr acondicionado como
se indica en el punto 5.1.1 con ayuda de dos porciones de 2 ml de n-hexano.
Dejar fluir el disolvente hasta que se site a 1 mm
por encima del nivel superior del absorbente. A continuacin, iniciar la elucin cromatogrfica; recoger
140 ml de la mezcla de n-hexano y ter etlico en la
proporcin de 99:1 a un ritmo de 15 gotas aproximadamente cada diez segundos (2,1 ml/minuto).
Secar la fraccin resultante en un evaporador
rotatorio hasta que se haya eliminado casi todo el
disolvente. Eliminar los ltimos 2 o 3 ml mediante
una corriente dbil de nitrgeno y aadir a continuacin 10 ml de n-heptano.
5.2. Anlisis por cromatografa de gases
5.2.1. Operaciones preliminares y acondicionamiento de la columna.
5.2.1.1. Instalar la columna en el cromatgrafo
de gases, conectando el terminal de entrada al sistema en columna y el terminal de salida al detector.
Comprobar el funcionamiento general del cromatgrafo de gases (funcionamiento de los circuitos de
gas, eficacia del detector y del registrador, etc.).
5.2.1.2. Si la columna se utiliza por vez primera,
es conveniente acondicionarla. Hacer pasar a travs
de la columna una corriente ligera de gas y, a continuacin, encender el cromatgrafo de gases. Calentar gradualmente hasta alcanzar una temperatura de
n-Hexano (UV-IR-HPLC) PAI
ensayo (vase la nota). Mantener esta temperatura

durante al menos dos horas y, a continuacin, ajustar
el aparato a las condiciones de ensayo (regulacin
del flujo del gas, encendido de la llama, conexin con
el registrador electrnico, regulacin de la temperatura del horno para la columna, regulacin del detector,
etc.). Registrar la seal con una sensibilidad al menos
dos veces superior a la exigida para efectuar el anlisis. La lnea de base deber ser lineal, sin picos de
ningn tipo, y no deber presentar deriva.
Una deriva rectilnea negativa indica que las
conexiones de la columna no son correctas; una
deriva positiva indica que la columna no ha sido
acondicionada adecuadamente.
Nota: La temperatura de acondicionamiento
deber ser en todo momento al menos 20C inferior
a la temperatura mxima especificada para el eluyente que se utilice.
5.2.2. Eleccin de las condiciones de ensayo
5.2.2.1. Las condiciones de ensayo son generalmente las siguientes:
temperatura de la columna: se parte de una
temperatura inicial de 80C que se incrementa a
razn de 30C/minuto hasta los 120C, y que, a
continuacin, se programa para que aumente
5C/minuto hasta alcanzar los 340C;
temperatura del detector: 350C;
velocidad lineal del gas portador: hidrgeno,
20-35 cm/segundo,
sensibilidad instrumental: 4-16 veces la atenuacin mnima,
sensibilidad del registrador: 1-2 mV desde el
fondo de la escala,
velocidad del papel: 30 cm/hora,
cantidad inyectada: 0,5-1 l de solucin.
Estas condiciones pueden modificarse en funcin de las caractersticas de la columna y del cromatgrafo de gases (a fin de obtener cromatogramas que renan las siguientes condiciones: el
tiempo de retencin del patrn interno C32 debe
ser de 25 2 minutos y el pico ms representativo
de las ceras debe estar comprendido entre el 60 y
el 100% desde el fondo de la escala).
5.2.2.2. Determinar los parmetros de integracin
de los picos de manera que se obtenga una evaluacin correcta de las reas de los picos considerados.
5.2.3. Realizacin del anlisis
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5.2.3.1.Tomar 1 l de solucin con la microjeringa de 10 l; sacar el mbolo hasta que la aguja est
vaca. Introducir la aguja en el sistema de inyeccin
e inyectar rpidamente despus de 1 o 2 segundos.
Despus de 5 segundos aproximadamente, extraer
lentamente la aguja.
5.2.3.2. Llevar a cabo el registro hasta que las
ceras se hayan eluido completamente.
La lnea de base debe satisfacer siempre las
condiciones exigidas (5.2.1.2).
5.2.4. Identificacin de los picos
Identificar los picos sobre la base de los tiempos
de retencin, comparndolos con mezclas de ceras
analizadas en las mismas condiciones y cuyos tiempos de retencin sean conocidos.
La figura 1 presenta un cromatograma de las
ceras de un aceite de oliva virgen.
5.2.5. Anlisis cuantitativo
5.2.5.1.Determinar con ayuda del integrador las
reas de los picos correspondientes al patrn interno y a los steres alifticos de C40 a C46.
5.2.5.2. Determinar el contenido de cada uno de
los steres en mg/kg de materia grasa, aplicando la
siguiente frmula:
Ax ms 1000
ster (mg/kg) =
As m
siendo:
Ax : rea del pico de cada uno de los steres;
As : rea del pico del laurilaraquidato;
ms: peso, en miligramos, del laurilaraquidato
aadido;
m: peso, en gramos, de la muestra tomada para
la determinacin.

Expresar los contenidos de las distintas ceras y
la suma de esos contenidos en mg/kg de materia
grasa.
APNDICE
Determinacin de la velocidad lineal del gas
Inyectar de 1 a 3 l de metano (propano) en el
cromatgrafo de gases, despus de haberlo ajustado a las condiciones de ensayo normales. Medir el
tiempo que tarda el gas en recorrer la columna,
desde el momento de su inyeccin hasta la aparicin del pico (tM).
La velocidad lineal en cm/segundo viene dada
por la frmula L/tM, siendo L la longitud de la columna expresada en cm y t M el tiempo medido en
segundos.
19
FIGURA 1: Cromatograma de las ceras de un aceite de oliva virgen
I.S. = Patrn interno del ster C32
1 = steres C36
2 = steres C38
4 = steres C42
5 = steres C44
3 = steres C40
6 = steres C46
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ANEXO V
DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN Y
DEL CONTENIDO DE ESTEROLES
MEDIANTE CROMATOGRAFA DE GASES
CON COLUMNA CAPILAR
1. OBJETO
para la determinacin del contenido de esteroles en
las materias grasas, expresado como contenido de
cada uno de los esteroles analizados y como contenido total de esteroles.
2. PRINCIPIO
Saponificacin de la materia grasa, a la que se
habr aadido a-colestanol como patrn interno, con
una solucin etanlica de hidrxido potsico; a continuacin, extraccin del insaponificable con ter etlico.
Separacin de la fraccin de esteroles del insaponificable extrado mediante cromatografa en placa de gel de slice bsica; los esteroles recuperados
del gel de slice se transforman en trimetilsililteres y
se analizan mediante cromatografa de gases con
columna capilar.
3. MATERIAL
20
3.1. Matraz de 250 ml, provisto de refrigerante

de reflujo con juntas esmeriladas.
3.2. Embudos de separacin de 500 ml.
3.3. Matraces de 250 ml.
3.4. Equipo completo de cromatografa en capa
fina, utilizando placas de vidrio de 20x20 cm.
Recomendacin Panreac: 809013 Placa TLC.
Slica gel standard. Vidrio. SIL G-25, 0,25 mm espesor, 20x20 cm.
704050 Cubeta de desarrollo ranurada con tapa
20x20 cm.
704054 Spray pulverizador.
3.5. Lmpara ultravioleta de una longitud de
onda de 366 o 254 nm.
Recomendacin Panreac: 704048 Cabina de
visualizacin UV.
3.6. Microjeringa de 100 l y 500 l.
3.7. Embudo cilndrico filtrante con filtro poroso
G3 (porosidad 15-40 m), de 2 cm de dimetro y 5
cm de altura, aproximadamente, con un dispositivo
adecuado para la filtracin en vaco y una junta
esmerilada macho 12/21.
3.8. Matraz cnico para vaco de 50 ml, con
junta esmerilada hembra 12/21 acoplable al embudo filtrante (3.7).
3.9. Probeta de 10 ml de fondo cnico con
tapn hermtico.
3.10. Equipo de cromatografa de gases que

pueda funcionar con columna capilar, provisto de
un sistema de divisin de flujo formado por:
3.10.1. Horno para la columna, que pueda mantener la temperatura deseada con precisin de 1C.
3.10.2. Inyector con elemento vaporizador de
vidrio tratado con persilano.
3.10.3. Detector de ionizacin de llama y convertidor-amplificador.
3.10.4. Registrador-integrador que pueda funcionar con el convertidor-amplificador (3.10.3), con
un tiempo de respuesta no superior a 1 segundo y
con velocidad de papel variable.
3.11. Columna capilar de vidrio o slice fundida,
de 20 a 30 m de longitud y de 0,25 a 0,32 mm de
dimetro interno, recubierta interiormente de lquido
SE-52, SE-54 o equivalente, con un espesor uniforme que oscile entre 0,10 y 0,30 m.
capilar de slica fundida (fase no enlazada qumicamente) FS-SE-54 de 25 m de longitud, 0,25 mm de
ID y 0,25 m de espesor de capa
3.12. Microjeringa de 10 l para cromatografa
de gases, con aguja endurecida.
4. REACTIVOS
4.1. Hidrxido potsico, solucin etanlica 2N
aproximadamente: disolver, enfriando al mismo
tiempo, 130 g de hidrxido potsico (valoracin
mnima del 85%) en 200 ml de agua destilada y
completar hasta un litro con etanol. Conservar la
solucin en botellas de vidrio oscuro bien cerradas.
4.2. ter etlico de calidad para anlisis.
4.3. Sulfato sdico anhidro de calidad para
anlisis.
4.4. Placas de vidrio recubiertas con gel de slice, sin indicador de fluorescencia, de 0,25 mm de
espesor (disponibles en el comercio ya preparadas
para el uso).
Slica gel standard. Vidrio. SIL G-25, 0,25 mm espesor, 20x20cm
4.5. Hidrxido potsico, solucin etanlica
0,2N: disolver 13 g de hidrxido potsico en 20 ml
de agua destilada y completar hasta un litro con
etanol.
4.6. Benceno para cromatografa.
4.7. Acetona para cromatografa. (Vase
5.2.2).
4.8. Hexano para cromatografa. (Vase
5.2.2).
4.9. ter etlico para cromatografa. (Vase
5.2.2).
4.10. Cloroformo de calidad para anlisis.
4.11. Solucin patrn para cromatografa en
capa fina: colesterol o fitosteroles, solucin al 2%
en cloroformo. (Modificado por el Reglamento (CE)
183/93)
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4.12. Solucin de 2,7-diclorofluorescena al
0,2% en etanol. Para hacerla ligeramente bsica se
aaden algunas gotas de solucin alcohlica 2N de
hidrxido potsico.
4.13. Piridina anhidra para cromatografa.
4.14. Hexametildisilazano.
4.15. Trimetilclorosilano.
4.16. Solucin problema de trimetilsililteres de
los esteroles: preparar en el momento del uso a
partir de esteroles puros o de mezclas de esteroles
REACTIVO
Acetona para cromatografa
Benceno para cromatografa
Cloroformo de calidad para anlisis
Colesterol
2,7-diclorofluorescena
Etanol
ter etlico de calidad para anlisis
ter etlico para cromatografa
Hexametildisilazano
Hexano para cromatografa
Hidrxido potsico
Piridina anhidra para cromatografa
Sulfato sdico anhidro de calidad
para anlisis
Trimetilclorosilano
obtenidos de aceites que los contengan.

4.17. a-colestanol, disolucin al 0,2% (m/V) en
cloroformo (patrn interno).
4.18. Gas portador: hidrgeno o helio de calidad para cromatografa de gases.
4.19. Gases auxiliares:
hidrgeno de calidad para cromatografa de
gases,
aire de calidad para cromatografa de gases.
Cdigo
Denominacin
361007
Acetona (UV-IR-HPLC) PAI
361192
Benceno (UV-IR-HPLC) PAI
131252
Triclorometano estabilizado con etanol
PA-ACS-ISO
A11470
Colesterol, 99+%
133606
2',7'-Diclorofluorescena PA-ACS
121085
Etanol 96% v/v PA
132770
Eter Dietlico estabilizado con ~6 ppm de BHT
PA-ACS-ISO
362551
(UV-IR-HPLC) PAI
A15139
1,1,1,3,3,3-Hexametildisilazano, 98+%
362063
121515
481457
Piridina seca (mx. 0,01% de agua) DS-ACS
131716
Sodio Sulfato anhidro PA-ACS-ISO
A13651
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Preparacin del insaponificable.
5.1.1. Con la microjeringa de 500 l introducir
en el matraz de 250 ml un volumen de disolucin de
a-colestanol al 0,2% en cloroformo (4.17) que contenga una cantidad de a-colestanol correspondiente al 10% aproximadamente del contenido de esteroles en la alcuota de la muestra para la
determinacin. Por ejemplo, para 5 g de muestra
aadir 500 l de la solucin de a-colestanol al
0,2%, si se trata de aceite de oliva, y 1500 l, si se
trata de aceite de orujo de oliva. (Modificado por el
Reglamento (CE) 183/93)
Evaporar en corriente de nitrgeno hasta sequedad y, a continuacin, pesar con precisin, en el
mismo matraz, 5 g de muestra seca y filtrada.
En el caso de aceites con un alto contenido de
colesterol puede producirse un pico cuyo tiempo de
retencin sea idntico al del colestanol. En tal caso
el anlisis de la fraccin de esteroles debe realizarse
Trimetilclorosilano, 98+%
dos veces: con patrn interno y sin l, o hay que

utilizar betulinol en lugar de colestanol. (Modificado
por el Reglamento (CE) 183/93)
5.1.2. Aadir 50 ml de solucin etanlica de
hidrxido potsico 2N, adaptar el refrigerante de
reflujo y calentar en bao Mara con ligera ebullicin,
agitando enrgica e ininterrumpidamente hasta que
se produzca la saponificacin (la solucin se vuelve
lmpida). Calentar durante 20 minutos ms y, a continuacin, aadir 50 ml de agua destilada por la parte superior del refrigerante; separar el refrigerante y
enfriar el matraz a 30C aproximadamente.
5.1.3. Transvasar cuantitativamente el contenido del matraz a un embudo de separacin de
500 ml, mediante varios lavados con un total aproximado de 50 ml de agua destilada. Agregar 80 ml
aproximadamente de ter etlico, agitar enrgicamente durante unos 30 segundos y dejar reposar
hasta la separacin de las fases (nota 1).
Separar la fase acuosa inferior pasndola a un
segundo embudo de separacin. Efectuar otras
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dos extracciones de la fase acuosa por el mismo

procedimiento, utilizando cada vez de 60 a 70 ml de
ter etlico.
Nota 1: Las posibles emulsiones podrn eliminarse aadiendo pequeas cantidades de alcohol
etlico o metlico con un pulverizador.
5.1.4. Reunir las fracciones etreas en un mismo embudo de separacin y lavarlas con agua destilada (50 ml cada vez) hasta que el agua de lavado
presente reaccin neutra.
Una vez eliminada el agua de lavado, secar con
sulfato sdico anhidro y filtrar sobre sulfato sdico
anhidro a un matraz de 250 ml previamente pesado, lavando el embudo y el filtro con pequeas cantidades de ter etlico.
5.1.5. Destilar el ter hasta que queden unos
pocos ml; a continuacin, secar con un vaco ligero
o en una corriente de nitrgeno, completando el
secado en una estufa a 100C durante 15 minutos
aproximadamente; dejar enfriar en un desecador y
pesar.
5.2. Separacin de la fraccin de esteroles.
5.2.1. Preparacin de las placas bsicas:
sumergir completamente las placas con gel de slice
(4.4) en la solucin etanlica 0,2N de hidrxido
potsico (4.5) durante 10 segundos; dejar secar las
placas en campana durante dos horas y, por ltimo,
mantenerlas en una estufa regulada a 100C durante una hora. Sacarlas de la estufa y conservarlas en
un desecador de cloruro de calcio hasta el momento del uso (las placas sometidas a este tratamiento
debern utilizarse en un plazo de quince das como
mximo).
Nota 2: Si se utilizan placas bsicas de gel de
slice para la separacin de la fraccin de esteroles,
ya no es necesario tratar el insaponificable con almina. De este modo, todos los compuestos de
naturaleza cida (cidos grasos y otros) quedan
retenidos en la lnea de aplicacin, y la banda de los
esteroles aparece perfectamente diferenciada de la
banda de los alcoholes alifticos y triterpnicos.
5.2.2. Introducir en la cubeta de desarrollo de
las placas una mezcla de benceno-acetona 95:5
(v/v) hasta una altura de 1 cm aproximadamente.
Puede utilizarse como alternativa una mezcla de
hexano y ter etlico 65:35 (v/v). Cerrar la cubeta
con su correspondiente tapa y dejar transcurrir
media hora como mnimo, de forma que se alcance
el equilibrio lquido-vapor. En las caras interiores de
la cubeta pueden colocarse tiras de papel de filtro
que se sumerjan en el eluyente: de esta manera el
tiempo de desarrollo se reduce casi un tercio y se
obtiene una elucin ms uniforme y regular de los
componentes.
Nota 3: Para que las condiciones de elucin
sean perfectamente reproducibles, la mezcla de
desarrollo deber cambiarse en cada prueba.
5.2.3. Preparar una solucin de insaponificable
(5.1.5) en cloroformo al 5% aproximadamente y,
con la microjeringa de 100 l, depositar 0,3 l de

dicha solucin en una placa cromatogrfica (5.2.1)
a unos 2 cm de uno de los bordes, formando una
lnea lo ms fina y uniforme posible. A la altura de la
lnea de aplicacin se depositan, en un extremo de
la placa, de 2 a 3 l de la solucin de referencia de
esteroles (4.11) para poder identificar la banda de
esteroles una vez efectuado el desarrollo.
5.2.4 Introducir la placa en la cubeta de desarrollo, preparada como se indica en el punto 5.2.2.
Deber mantenerse una temperatura ambiente
entre 15 y 20C. Tapar inmediatamente la cubeta y
dejar que se produzca la elucin hasta que el frente
del disolvente se site a 1 cm aproximadamente del
borde superior de la placa. Sacar la placa de la
cubeta y evaporar el disolvente en una corriente de
aire caliente o dejando la placa bajo una campana
unos minutos.
5.2.5. Pulverizar la placa ligera y uniformemente
con la solucin de 2,7-diclorofluorescena. Al examinar la placa a la luz ultravioleta puede identificarse la
banda de los esteroles mediante comparacin con
la mancha obtenida a partir de la solucin de referencia; marcar con lpiz negro los lmites de la banda a lo largo de los mrgenes de fluorescencia.
5.2.6. Rascar con una esptula metlica el gel
de slice contenido en el rea delimitada.
Introducir el material obtenido, finamente triturado, en el embudo filtrante (3.7); aadir 10 ml de cloroformo caliente, mezclar cuidadosamente con la
esptula metlica y filtrar en vaco, recogiendo el filtrado en el matraz cnico (3.8) acoplado al embudo
filtrante.
Lavar el residuo en el embudo tres veces con
ter etlico (empleando cada vez unos 10 ml), recogiendo cada vez el filtrado en el mismo matraz cnico acoplado al embudo. Evaporar el filtrado hasta
obtener un volumen de 4 a 5 ml, transvasar la solucin residual al tubo de ensayo de 10 ml (3.9) previamente pesado, evaporar hasta sequedad
mediante calentamiento suave en corriente ligera de
nitrgeno, recoger con algunas gotas de acetona,
evaporar de nuevo hasta sequedad, introducir en
una estufa a 105C durante unos 10 minutos, dejar
enfriar en el desecador y pesar.
El residuo que queda en el tubo de ensayo est
formado por la fraccin de esteroles.
5.3. Preparacin de los trimetilsililteres.
5.3.1. Agregar al tubo que contiene la fraccin
de esteroles el reactivo de silanizacin formado por
una mezcla de piridina-hexametildisilazano-trimetilclorosilano 9:3:1 (v/v/v) (nota 4), a razn de 50 l
por miligramo de esteroles, evitando toda absorcin
de humedad (nota 5).
Nota 4: Existen soluciones comerciales listas
para el uso. Adems, tambin existen otros reactivos de silanizacin, como el bis-trimetilsililacetamida + 1% de trimetilclorosilano, que se diluye en el
mismo volumen de piridina anhidra.
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5.3.2. Tapar el tubo y agitar cuidadosamente (sin
invertir) hasta la completa disolucin de los esteroles. Dejar reposar un cuarto de hora, como mnimo,
a temperatura ambiente y centrifugar durante algunos minutos; la solucin lmpida queda lista para el
anlisis mediante cromatografa de gases.
Nota 5: La formacin de una ligera opalescencia
es normal y no ocasiona ninguna interferencia. La
formacin de una floculacin blanca o la aparicin
de una coloracin rosa son indicios de presencia de
humedad o de deterioro del reactivo. En este caso
deber repetirse la prueba.
5.4. Cromatografa de gases.
5.4.1. Operaciones preliminares: acondicionamiento de la columna.
5.4.1.1. Colocar la columna en el cromatgrafo
uniendo uno de los extremos de la columna al
inyector y el otro al detector.
Efectuar los controles generales del equipo para
cromatografa de gases (estanqueidad de los circuitos de gases, eficacia del detector, eficacia del sistema de divisin de flujo y del sistema de registro, etc.).
5.4.1.2. Si la columna se utiliza por vez primera,
es conveniente acondicionarla previamente. Hacer
pasar un ligero flujo de gas a travs de la columna,
encender el equipo de cromatografa de gases e iniciar un calentamiento gradual hasta alcanzar una
temperatura al menos 20C superior a la temperatura de trabajo (nota 6). Mantener dicha temperatura durante 2 horas como mnimo; a continuacin,
poner el equipo completo en condiciones de funcionamiento (regulacin del flujo de gases y de la relacin de split, ignicin de la llama, conexin con el
registrador electrnico, regulacin de la temperatura del horno del detector y del inyector, etc.) y registrar la seal con una sensibilidad al menos dos
veces superior a la prevista para el anlisis. El trazado de la lnea de base debe ser lineal, exento de
picos de cualquier tipo y no debe presentar deriva.
Una deriva rectilnea negativa indica que las
conexiones de la columna no son totalmente estancas; una deriva positiva indica que el acondicionamiento de la columna es insuficiente.
Nota 6: La temperatura de acondicionamiento
deber ser siempre, como mnimo 20C inferior a la
temperatura mxima prevista para la fase estacionaria utilizada.
5.4.2. Eleccin de las condiciones de trabajo.
5.4.2.1. Las condiciones de trabajo exigidas son
las siguientes:
temperatura de la columna: 260C 5C,
temperatura del evaporador: 280C,
temperatura del detector: 290C,
velocidad lineal del gas portador: helio 20 a 35
cm/s, hidrgeno 30 a 50 cm/s,
relacin de split de 1/50 a 1/100,
sensibilidad del instrumento: de 4 a 16 veces
la atenuacin mnima,
sensibilidad de registro: 1 a 2 mV f.e.
velocidad del papel: 30 a 60 cm/hora,

cantidad de sustancia inyectada: 0,5 a 1 l de
solucin de TMSE.
Estas condiciones pueden modificarse en funcin de las caractersticas de la columna y del cromatgrafo, de modo que se obtengan cromatogramas que cumplan los siguientes requisitos:
el tiempo de retencin del b-sitosterol debe ser
de 20 5 minutos,
el pico del campesterol debe ser: para el aceite de oliva (contenido medio del 3%), 15 5% del
fondo de escala; para el aceite de soja (contenido
medio del 20%), 80 10% del fondo de escala,
se deben separar todos los esteroles presentes; es necesario que los picos no slo se separen
sino que se resuelvan completamente, es decir, que
el trazo del pico llegue a la lnea de base antes de
que se inicie el pico siguiente. No obstante, podr
admitirse una resolucin incompleta si el pico a TRR
1,02 puede cuantificarse utilizando la perpendicular.
5.4.3. Realizacin del anlisis.
5.4.3.1.Con la microjeringa de 10 l tomar 1 l
de hexano, aspirar 0,5 l de aire y, a continuacin,
entre 0,5 y 1 l de la solucin problema; elevar el
mbolo de la jeringa de modo que la aguja quede
vaca. Introducir la aguja a travs del septum y, despus de 1 o 2 segundos, inyectar rpidamente;
transcurridos unos 5 segundos, extraer la aguja lentamente.
5.4.3.2.Continuar el registro hasta la completa
elucin de los TMSE de los esteroles presentes. La
lnea de base debe ajustarse en todo momento a
las condiciones exigidas (5.4.1.2).
5.4.4. Identificacin de los picos.
Para la identificacin de los diferentes picos se
utilizan los tiempos de retencin y la comparacin
con mezclas de TMSE de los esteroles analizadas
en las mismas condiciones.
La elucin de los esteroles se efecta en el
orden siguiente: colesterol, brasicasterol, 24-metilencolesterol, campesterol, campestanol, estigmasterol, D-7-campesterol, D-5,23-estigmastadienol,
clerosterol, b-sitosterol, sitostanol, D-5-avenasterol,
D-5,24-estigmastadienol, D-7-estigmastenol, D-7avenasterol.
En el cuadro I figuran los tiempos de retencin
correspondientes al b-sitosterol para las columnas
SE 52 y SE 54.
Las figuras 1 y 2 ilustran los cromatogramas tpicos de algunos aceites.
5.4.5. Determinacin cuantitativa.
5.4.5.1.Calcular las reas de los picos del
a-colestanol y de los esteroles utilizando el
integrador. No se tomarn en cuenta los picos de
aquellos componentes que no figuren en el cuadro
I. El factor de respuesta para el a-colestanol debe
considerarse como 1.
5.4.5.2.Calcular del modo siguiente el contenido
de cada uno de los esteroles, expresado en
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mg/100 g de materia grasa:
Ax
% del esterol X = x 100
A
Ax ms 100
esterol x =
As m
siendo:
Ax : rea del pico del esterol x,
As : rea del pico del a-colestanol,
ms : peso de a-colestanol aadido, en miligramos,
m : peso de la muestra tomado para la determinacin, en gramos.
(Modificado por el Reglamento (CE) 183/93)

6.1. Se registran el contenido de cada uno de
los esteroles en mg/100 g de materia grasa y, como
esteroles totales, su suma.
6.2. El porcentaje de cada uno de los esteroles
simples es la razn entre el rea del pico correspondiente y la suma de las reas de los picos de los
esteroles.
siendo:
Ax : rea del pico de x,
A: suma de las reas de todos los picos.
APNDICE
Determinacin de la velocidad lineal del gas
Inyectar en el cromatgrafo, preparado para trabajar en condiciones normales, de 1 a 3 l de metano (o propano) y medir el tiempo que tarda el gas en
recorrer la columna, desde el momento de la inyeccin hasta el momento en que aparece el pico (tM).
La velocidad lineal en cm/s viene dada por L/tM,
siendo L la longitud de la columna en cm y tM el
tiempo, expresado en segundos.
Cuadro I
Tiempos de retencin relativos de los esteroles
Pico
Identificacin
Tiempo de retencin
Columna
SE 54
24
Columna
SE52
Colesterol
D-5-colesten-3-b-ol
0,67
0,63
Colestanol
5-a-colestan-3-b-ol
0,68
0,64
Brasicasterol
[24S]-24-metil-D-5,22-colestadien-3-b-ol
0,73
0,71
24-metilencolesterol
24-metilen-D-5,24-colestadien-3-b-ol
0,82
0,80
Campesterol
[24R]-24-metil-D-5-colesten-3-b-ol
0,83
0,81
Campestanol
[24R]-24-metil-colestan-3-b-ol
0,85
0,82
Estigmasterol
[24S]-24-etil-D-5,22-colestadien-3-b-ol
0,88
0,87
D-7-campesterol
[24R]-24-metil-D-7-colesten-3-b-ol
0,93
0,92
D-5,23-estigmastadienol
[24R,S]-24-etil-D-5,23-colestadien-3-b-ol
0,95
0,95
10
Clerosterol
[24S]-24-etil-D-5,25-colestadien-3-b-ol
0,96
0,96
11
b-sitosterol
[24R]-24-etil-D-5-colesten-3-b-ol
12
Sitostanol
24-etil-colestan-3-b-ol
13
D-5-avenasterol
[24Z]-24-etiliden-D-5-colesten-3-b-ol
1,03
1,03
14
D-5,24-estigmastadienol
[24R,S]-24-etil-D-5,24-colestadien-3-b-ol
1,08
1,08
1,02
1,02
15
D-7-estigmastenol
[24R,S]-24-etil-D-7,24-colesten-3-b-ol
1,12
1,12
16
D-7-avenasterol
[24Z]-24-etiliden-D-7-3-b-ol
1,16
1,16
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Figura 1
Cromatograma de la fraccin de esteroles de un aceite de oliva bruto
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Figura 2
Cromatograma de la fraccin de esteroles de un aceite de oliva refinado
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M
ANEXO VI
DETERMINACIN DEL CONTENIDO EN
ERITRODIOL Y UVAOL
INTRODUCCIN
El eritrodiol, entendido corrientemente como
conjunto de los dioles eritrodiol y uvaol, es un componente del insaponificable, caracterstico de algunos tipos de materias grasas. Su concentracin es
mucho ms elevada en los aceites de oliva obtenidos mediante extraccin que en los obtenidos
mediante presin o en el aceite de pepita de uva y,
por lo tanto, su determinacin puede servir para
comprobar la existencia de aceite de oliva obtenido
mediante extraccin.
1. OBJETO
para determinar el eritrodiol en las materias grasas.
2. PRINCIPIO
La materia grasa se saponifica con una solucin
etanlica de hidrxido potsico; a continuacin se
extrae el insaponificable con ter etlico y se purifica
pasndolo por una columna de almina.
El fraccionamiento del insaponificable se realiza
mediante cromatografa en capa fina en placa de
gel de slice y se aslan la banda de la fraccin esterlica y la del eritrodiol.
Los esteroles y el eritrodiol recuperados de la
placa se transforman en trimetilsililteres y seguidamente se analiza la mezcla mediante cromatografa
de gases.
El resultado se expresa en porcentaje de eritrodiol respecto del conjunto de eritrodiol + esteroles.
3. MATERIAL Y APARATOS
3.1. El mismo material que el indicado para el
mtodo del Anexo V (Determinacin del contenido
de esteroles).
4. REACTIVOS
4.1. Los mismos reactivos que los indicados
para el mtodo del Anexo V (Determinacin del
contenido de esteroles).
4.2. Solucin patrn de eritrodiol al 0,5% en
cloroformo.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Preparacin del insaponificable
Se realiza tal como se indica en el apartado
5.1.2 del mtodo del Anexo V
5.2. Separacin del eritrodiol y los esteroles

5.2.1. Vase el apartado 5.2.1 del mtodo del
Anexo V.
5.2.2. Vase el apartado 5.2.2 del mtodo
mencionado.
5.2.3. Preparar una solucin del insaponificable
al 5% en cloroformo.
Con una microjeringa de 0,1 ml depositar 0,3 ml
de esta solucin en una placa cromatogrfica a
aproximadamente 1,5 cm del borde inferior de la
placa, formando una banda lo ms fina y uniforme
posible. Depositar en un extremo de la placa, como
referencia, algunos microlitros de las soluciones de
colesterol y eritrodiol.
5.2.4. Introducir la placa en la cubeta de desarrollo, preparada como se indica en el apartado
5.2.1. La temperatura ambiente debe ser de unos
20C. Tapar inmediatamente la cubeta y dejar que
se produzca la elucin hasta que el frente del disolvente se site a 1 cm aproximadamente del borde
superior de la placa. Sacar sta de la cubeta de
desarrollo y evaporar el disolvente en una corriente
de aire caliente.
5.2.5. Pulverizar la placa uniformemente con la
solucin alcohlica de 2',7'-diclorofluorescena. Al
examinar la placa a la luz ultravioleta pueden identificarse las bandas de los esteroles y del eritrodiol
mediante comparacin con las referencias; delimitar
las bandas con una punta ligeramente por el exterior de los mrgenes de fluorescencia.
5.2.6. Rascar con una esptula metlica el gel
de slice contenido en las reas delimitadas. Reunir
el material obtenido en un matraz cnico de 50 ml;
aadir 15 ml de cloroformo caliente, agitar bien y filtrar en el embudo de filtro poroso vertiendo el gel de
slice sobre el propio filtro. Lavar tres veces con 10
ml de cloroformo caliente cada vez, recogiendo el
filtrado en un matraz esfrico de 100 ml. Evaporar
hasta obtener un volumen de 4 a 5 ml, transvasar al
tubo de centrifugado de fondo cnico de 10 ml previamente tarado, evaporar hasta sequedad mediante calentamiento suave en corriente de nitrgeno y
pesar.
5.3. Preparacin de los trimetilsililteres
Se realiza tal como se indica en el apartado 5.3
del mtodo del Anexo V.
5.4. Cromatografa de gases
Se realiza tal como se indica en el apartado 5.4
del mtodo citado. Las condiciones operativas de la
cromatografa de gases deben cumplir los requisitos necesarios para analizar los esteroles y, adems, permitir la separacin de los TMSE del eritrodiol y del uvaol.
Una vez inyectada la muestra, dejar que se
desarrolle el proceso hasta que se produzca la elucin de los esteroles presentes, el eritrodiol y el uvaol; identificar los picos (el eritrodiol y el uvaol tienen
tiempos de retencin relativos, respecto al b-sitosterol,
de alrededor de 1,45 y 1,55, respectivamente) y
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calcular sus reas de la misma forma que para los

esteroles.
A1 + A2
Eritrodiol, % = x 100
A1 + A2 + Aesteroles
siendo:
A1 :
rea del pico del eritrodiol,
A2 :
rea del pico del uvaol,
Aesteroles: suma de las reas de los esteroles
presentes.
Los resultados deben expresarse con una cifra
decimal.
ANEXO VII
DETERMINACIN DE LOS CIDOS
GRASOS SITUADOS EN LA POSICIN 2
DE LOS TRIGLICRIDOS DE ACEITES
Y GRASAS
1. OBJETO
La presente norma describe un mtodo para la
determinacin de la composicin porcentual de cidos grasos que se encuentran esterificados en la
posicin 2 (oposicin interna) de los triglicridos.
2. CAMPO DE APLICACIN
28
La presente norma es aplicable a los aceites y

grasas cuyo punto de fusin se sita por debajo de
los 45C, debido a las caractersticas especiales de
la accin de la lipasa pancretica.
No es aplicable sin reservas a los aceites y grasas que contengan cantidades importantes de cidos grasos con 12 tomos de carbono o menos
(aceites de coco y de palmiste, materias grasas
butricas), de cidos grasos altamente insaturados
(con ms de cuatro enlaces dobles) que tengan 20
tomos de carbono o ms (aceites de pescado y de
mamferos marinos) o de cidos grasos que tengan
grupos con funciones oxigenadas, adems del grupo cido.
3. PRINCIPIO
Neutralizacin de los aceites y grasas si fuera
necesario. Purificacin mediante tratamiento en
columna de almina. Hidrlisis parcial de los triglic-
ridos bajo la accin de la lipasa pancretica durante

un tiempo determinado. Separacin de los monoglicridos resultantes mediante cromatografa en capa
fina y metanlisis de estos monoglicridos. Anlisis
de los steres metlicos mediante cromatografa
gas-lquido.
4. EQUIPO
4.1. Matraz de fondo redondo de 100 ml.
4.2. Matraz de fondo redondo de 25 ml con
boca esmerilada.
4.3. Refrigerante de aire de 1 m de longitud,
adaptable al matraz 4.2.
4.4. Matraz erlenmeyer de 250 ml.
4.5. Vaso de precipitados de 50 ml.
4.6. Embudo de separacin de 500 ml.
4.7. Columna para cromatografa, de vidrio, con
dimetro interior de 13 mm y longitud de 400 mm,
provista de un disco de vidrio poroso y de una llave.
de tefln. 20 mm ID x 400 mm longitud.
4.8. Tubo de centrfuga de 10 ml con tapn de
vidrio esmerilado.
4.9. Bureta de 5 ml graduada en 0,05 ml.
4.10. Jeringa hipodrmica de 1 ml provista de
una aguja fina.
4.11. Microjeringa que pueda dispensar gotas
de 3-4 ml.
4.12. Aplicador para cromatografa en capa
fina.
4.13. Placas de vidrio de 20 x 20 cm para cromatografa en capa fina.
Slica gel standard. Vidrio. SIL G-25, 0,25 mm espesor, 20x20 cm.
4.14. Cubeta de desarrollo para cromatografa
en capa fina, de vidrio, provista de una tapa de
vidrio esmerilado, adecuada para las placas de
20 x 20 cm.
Recomendacin Panreac: 704050 Cubeta de
desarrollo ranurada con tapa 20x20 cm.
4.15. Pulverizador para cromatografa en capa
fina.
Recomendacin Panreac: 704054 Spray pulverizador.
4.16. Estufa regulada a 103 2C.
4.17. Termostato regulable a una temperatura
comprendida entre 30 y 45C con precisin de
0,5C.
4.18. Evaporador rotatorio.
4.19. Vibrador elctrico, con el que pueda agitarse vigorosamente el tubo de centrfuga.
4.20. Lmpara ultravioleta para examinar las
placas de capa fina.
Recomendacin Panreac: 704048 Cabina de
visualizacin UV.
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M
Para el control de la actividad lipsica:
4.21. pH-metro.
Recomendacin Panreac: 923 501 pHmetro
digital pH 300.
4.22. Agitador espiral.
4.23. Bureta de 5 ml.
4.24. Cronmetro.
Para la eventual preparacin de la lipasa:
4.25. Agitador de laboratorio, adecuado para
dispersar y mezclar materiales heterogneos.
5. REACTIVOS
5.1. n-Hexano o, en su defecto, ter de petrleo (punto de ebullicin 30-50C), de calidad
para cromatografa.
5.2. 2-Propanol, o etanol, 95% (v/v) de calidad para anlisis.
5.3. 2-Propanol, o etanol, solucin acuosa 1/1.
5.4. ter dietlico, exento de perxidos.
5.5. Acetona.
5.6. cido frmico, al menos de 98% (p/p).
5.7. Solvente de desarrollo: una mezcla de
n-hexano (5.1), ter dietlico (5.4) y cido frmico
(5.6) en las proporciones 70/30/1 (v/v/v).
5.8. Almina activada para cromatografa, neutra, actividad l segn Brockmann.
REACTIVO
Acetona
cido clorhdrico
cido frmico, al menos de 98% (p/p)
Cloruro de calcio
Colato sdico
2,7-diclorofluorescena
Etanol, 95% (v/v) de calidad para anlisis
Etanol al 95% (v/v)
ter de petrleo (punto de ebullicin
30-50C), de calidad para cromatografa
ter dietlico, exento de perxidos
Goma arbiga
Hidrxido sdico
Hidrxido sdico 1N
n-Hexano de calidad para
cromatografa
2-Propanol de calidad para anlisis
Solucin acuosa de hidrxido sdico 0,1N
Solucin de 10 g/l de fenolftalena en
etanol al 95% (v/v)
Tris-hidroximetil-aminometano
5.9. Gel de slice con aglutinante, de calidad

para cromatografa en capa fina.
5.10. Lipasa pancretica de calidad adecuada
(vanse las notas 1 y 2).
5.11. Hidrxido sdico en solucin acuosa de
120 g/l.
5.12. cido clorhdrico, solucin acuosa 6N.
5.13. Solucin acuosa de 220 g/l de cloruro de
calcio (CaCl2).
5.14. Solucin acuosa de 1 g/l de colato sdico (de calidad enzimtica).
5.15. Solucin tampn: solucin acuosa de
tris-hidroximetil-aminometano 1M, ajustada a
pH = 8 con cido clorhdrico (5.12) (controlar con un
potencimetro).
5.16. Solucin de 10 g/l de fenolftalena en
etanol al 95% (v/v).
5.17. Solucin de 2 g/l de 2',7'-diclorofluorescena en etanol al 95% (v/v); alcalinizar ligeramente aadiendo 1 gota de solucin de hidrxido
sdico 1N por 100 ml.
Para el control de la actividad lipsica:
5.18. Aceite neutralizado.
5.19. Solucin acuosa de hidrxido sdico 0,1N.
5.20. Solucin acuosa de 200 g/l de colato
sdico (de calidad enzimtica).
5.21. Solucin acuosa de 100 g/l de goma arbiga.
Cdigo Denominacin
131007 Acetona PA-ACS-ISO
131019 Acido Clorhdrico 35% PA-ISO
131030 cido Frmico 98% PA-ACS
121221 Calcio Cloruro anhidro, polvo PA
121215 Calcio Cloruro 2-hidrato escoriforme PA
A17074 cido clico, sal sdica, 99%
133606 2',7'-Diclorofluorescena PA-ACS
121085 Etanol 96% v/v PA
361315
ter de Petrleo 40-60C (UV) PAI
132770
142061
131687
182415
362063
Eter Dietlico estabilizado con ~6 ppm de

BHT PA-ACS-ISO
Goma Arbiga polvo PRS
Sodio Hidrxido lentejas PA-ACS-ISO
Sodio Hidrxido 1 mol/l (1N) SV
131090
181694
281327
Sodio Hidrxido 0,1 mol/l (0,1N) SV
131940
Tris (Hidroximetil) Aminometano PA-ACS
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6. PREPARACIN DE LA MUESTRA
Si la acidez de la muestra, determinada con
arreglo al mtodo del Anexo II es inferior al 3%, se
efectuar directamente la purificacin en columna
de almina como se describe en el punto 6.2.
Si la acidez de la muestra, determinada con
arreglo al mtodo del Anexo II, es superior al 3%, se
efectuar una neutralizacin alcalina en presencia
de un solvente, como se describe en el punto 6.1, y
a continuacin se realizar la purificacin en columna de almina descrita en el punto 6.2.
6.1. Neutralizacin alcalina en presencia de un
solvente.
Introducir en el embudo de separacin (4.6)
aproximadamente 10 g de aceite crudo y aadir
100 ml de hexano (5.1), 50 ml de 2-propanol (5.2),
algunas gotas de solucin de fenolftalena (5.16) y el
volumen de solucin de hidrxido sdico (5.11)
correspondiente a la acidez libre del aceite ms un
0,3 % de exceso. Agitar enrgicamente durante 1
minuto, aadir 50 ml de agua destilada, agitar de
nuevo y dejar reposar.
Una vez que se haya producido la separacin,
separar la capa inferior que contiene los jabones.
Separar, asimismo, todas las capas intermedias
(muclago, materias insolubles). Lavar la solucin de
hexano del aceite neutralizado con porciones sucesivas de 25-30 ml de la solucin de 2-propanol
(5.3), hasta que desaparezca el color rosa de la
fenolftalena.
Eliminar la mayor parte del hexano mediante
destilacin en vaco en el evaporador rotatorio
(4.18); desecar el aceite en vaco a 30-40C
mediante una corriente de nitrgeno puro hasta la
completa eliminacin del hexano.
6.2. Purificacin con almina.
Preparar una suspensin de 15 g de almina
activada (5.8) en 50 ml de hexano (5.1) y verterla en
la columna cromatogrfica (4.7), removiendo al mismo tiempo. Dejar que la almina se asiente uniformemente y esperar a que el nivel del solvente descienda a 1-2 mm por encima del absorbente. Verter
cuidadosamente en la columna 5 g de aceite disueltos en 25 ml de hexano (5.1); recoger todo el eluyente de la columna en un matraz de fondo redondo (4.1).
7. PREPARACIN DE LAS PLACAS
CROMATOGRFICAS
30
Limpiar perfectamente las placas de vidrio (4.13)

con etanol, ter de petrleo y acetona para eliminar
cualquier rastro de materia grasa.
Introducir en un matraz erlenmeyer (4.4) 30 g de
polvo de slice (5.9). Aadir 60 ml de agua destilada.
Tapar y agitar enrgicamente durante 1 minuto.
Transferir inmediatamente al aplicador la mezcla

semifluida (4.12) y recubrir las placas limpias con
una capa de 0,25 mm de espesor.
Secar las placas al aire durante 15 minutos y a
continuacin en la estufa (4.16) a 103 2C durante
1 hora. Antes del uso, enfriar las placas en un desecador a temperatura ambiente. En el comercio pueden adquirirse placas preparadas.
8. PROCEDIMIENTO
8.1. Hidrlisis con lipasa pancretica.
Pesar en el tubo de centrfuga (4.8) 0,1 g aproximadamente de la muestra preparada; si la muestra
es aceite lquido, proceder como se indica a continuacin; si es una grasa slida, disolverla en 0,2 ml
de hexano (5.1), aplicando, si es necesario, un ligero calentamiento.
Aadir 20 mg de lipasa (5.10) y 2 ml de solucin
tampn (5.15). Agitar bien, pero con cuidado, y
aadir a continuacin 0,5 ml de la solucin de colato sdico (5.14) y 0,2 ml de la solucin de cloruro
de calcio (5.13). Cerrar el tubo con el tapn esmerilado, agitar cuidadosamente (evitando humedecer
el tapn) e introducir el tubo inmediatamente en el
termostato (4.17) a 40 0,5C y agitar manualmente
durante 1 minuto exacto.
Sacar el tubo del termostato y agitar enrgicamente con el vibrador elctrico (4.19) durante 2
minutos exactos.
Enfriar de inmediato en agua corriente; aadir 1
ml de cido clorhdrico (5.12) y 1 ml de ter dietlico
(5.4). Tapar y mezclar enrgicamente con el vibrador elctrico. Dejar en reposo y extraer la capa
orgnica con la jeringa (4.10), tras centrifugar si fuese necesario.
8.2. Separacin de los monoglicridos por cromatografa en capa fina.
Con ayuda de la microjeringa (4.11) colocar el
extracto a 1,5 cm aproximadamente del borde inferior de la placa cromatogrfica, depositndolo de
manera que forme una lnea fina, uniforme y lo ms
estrecha posible. Introducir la placa en una cubeta
de desarrollo (4.14) bien saturada y desarrollar con
el solvente de desarrollo (5.7) a unos 20C hasta 1
cm aproximadamente del borde superior de la placa.
Secar la placa al aire a la temperatura de la
cubeta y pulverizarla con la solucin de 2',7'-diclorofluorescena (5.17). Identificar la banda de los
monoglicridos (Rf aproximadamente 0,035) con luz
ultravioleta (4.20).
8.3. Anlisis de los monoglicridos por cromatografa gas-lquido.
Raspar con una esptula la banda citada en el
punto 8.2 (procurando no raspar los componentes
que permanezcan en la lnea de base) y pasarla al
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matraz de metilacin (4.2). Tratar directamente la
slice recogida como se indica en el Anexo X-B, de
modo que los monoglicridos se transformen en
steres metlicos, y, a continuacin, examinar los
steres mediante cromatografa en fase gaseosa,
como se describe en el Anexo X-A.
Calcular la composicin de los cidos grasos
situados en la posicin y expresar el resultado con
una cifra decimal (nota 3).
10. NOTAS
Nota 1: Control de la actividad lipsica
Preparar una emulsin oleosa como sigue: agitar en un mezclador adecuado una mezcla constituida por 165 ml de solucin de goma arbiga
(5.21), 15 g de hielo picado y 20 ml de aceite neutralizado (5.18).
En un vaso de precipitados (4.5) introducir 10 ml
de esta emulsin, 0,3 ml de solucin de colato sdico (5.20) y 20 ml de agua destilada.
Colocar el vaso en un termostato a 37C 0,5C
(nota 4) e introducir los electrodos del pH-metro
(4.21) y un agitador espiral (4.22); despus, aadir
gota a gota con una bureta (4.23) solucin de hidrxido sdico (5.19) hasta obtener un pH de 8,5.
Aadir una suspensin acuosa de la lipasa (vase a continuacin) en cantidad suficiente. Se mide
el pH y, tan pronto como alcance el valor de 8,3, se
pone en marcha un cronmetro y se va aadiendo
la disolucin de hidrxido sdico (5.19) gota a gota,
con la velocidad necesaria para mantener constante el pH de 8,3; anotar cada minuto el volumen de
solucin alcalina consumido.
Llevar los datos obtenidos a un sistema de ejes
de coordenadas, indicando en abscisas los tiempos
y en ordenadas los mililitros de solucin alcalina
necesarios para mantener constante el pH. Deber
obtenerse una grfica lineal.
La suspensin de lipasa mencionada es una
suspensin en agua al 1/1000 (p/p). Deber emplearse en cada ensayo una cantidad suficiente de
esta suspensin, de modo que en 4 o 5 minutos se
consuma 1 ml de solucin alcalina aproximadamente. Normalmente se necesitan de 1 a 5 mg de polvo.
La unidad lipsica se define como la cantidad de
enzima que libera 10 meq de cido por minuto. La
actividad A del polvo utilizado, medida en unidades
lipsicas por mg, se calcula mediante esta frmula:
siendo:
V : volumen de solucin de hidrxido sdico
(5.19) consumido por minuto
(calculado a partir de la grfica),
P : peso, en mg, de la muestra problema de polvo.
Nota 2: Preparacin de la lipasa
En el comercio pueden encontrarse lipasas de
actividad lipsica satisfactoria. Tambin es posible
prepararlas en laboratorio de la manera siguiente:
tomar 5 kg de pncreas fresco de cerdo, refrigerado a 0C; eliminar la grasa slida y el tejido conjuntivo que lo rodean, y triturar en un molino de cuchillas
hasta obtener una pasta fluida. Con un agitador
(4.25) agitar la pasta junto con 2,5 l de acetona
anhidra, durante 4-6 horas y despus centrifugar.
Efectuar tres extracciones ms del residuo con el
mismo volumen de acetona anhidra, dos extracciones con una mezcla de acetona y ter etlico 1:1
(V/V), y dos extracciones con ter etlico, en este
orden.
Desecar el residuo al vaco durante 48 horas
para obtener un polvo estable, que debe almacenarse en un refrigerador.
Nota 3: Es aconsejable en todos los casos
determinar la composicin de los cidos grasos
totales de la misma muestra, ya que la comparacin
con la de los cidos situados en la posicin 2 facilitar la interpretacin de las cifras obtenidas.
Nota 4: Por tratarse de un aceite lquido, la
hidrlisis se efecta a 37C. No obstante, en el caso
de la muestra problema se efectuar a 40C a fin de
que puedan examinarse las grasas con puntos de
fusin de hasta 45C.
ANEXO VIII
DETERMINACIN DEL PORCENTAJE DE
TRILINOLENA
1. OBJETO
Determinacin de la composicin de los triglicridos de los aceites lquidos vegetales expresada en
su nmero equivalente de carbonos mediante cromatografa de lquidos de alto rendimiento.
La presente norma describe un mtodo para
efectuar la separacin y determinacin de la composicin de los triglicridos de los aceites vegetales
segn su peso molecular y grado de insaturacin
en funcin de su nmero equivalente de carbonos
(vase la nota 1).
V x 10
A =
P
La presente norma es aplicable a todos los aceites vegetales que contengan triglicridos de cidos
grasos de cadena larga. Este mtodo es especial-
31
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mente adecuado para detectar la presencia de

pequeas cantidades de aceites semisecantes
(ricos en cido linoleico) en aceites vegetales cuyo
principal cido graso insaturado sea el cido oleico,
como es el caso de los aceites de oliva.
3. PRINCIPIO
Separacin de los triglicridos en funcin de su
nmero equivalente de carbonos mediante cromatografa de lquidos de alta resolucin en fase inversa e interpretacin de los cromatogramas.
4. APARATOS
4.1. Cromatgrafo de lquidos de alta resolucin
con control termosttico de la temperatura de la
columna.
4.2. Sistema de inyeccin con un volumen de
10 ml.
4.3. Detector: refractmetro diferencial. La sensibilidad en toda la escala deber ser como mnimo
de 10-4 unidades de ndice de refraccin.
4.4. Columna de acero inoxidable de 250 mm de
longitud y 4,5 mm de dimetro interior, rellena de par-
REACTIVO
Acetona
Cloroformo
Acetonitrilo
Tripalmitina
5. REACTIVOS
Los reactivos debern ser de calidad para anlisis. Los disolventes de elucin debern desgasificarse y podrn reciclarse varias veces sin que ello
afecte a las separaciones.
5.1. Cloroformo.
5.2. Acetona.
5.3. Acetonitrilo.
5.4. Fase mvil: acetonitrilo + acetona (las proporciones se ajustarn para obtener la separacin
deseada; comenzar con una mezcla 50:50).
5.5. Disolvente de solubilizacin: acetona o
mezcla de acetona-cloroformo 1:1.
5.6. Triglicridos de referencia: pueden utilizarse bien
triglicridos comerciales (tripalmitina, triolena, etc.), en
cuyo caso se reflejarn en un grfico los tiempos de
retencin frente al nmero equivalente de carbonos,
alternativamente un cromatograma de referencia del
aceite de soja (vanse las notas 3 y 4 y las figuras 1 y 2).
Cdigo Denominacin
131007 Acetona PA-ACS-ISO
131252 Triclorometano estabilizado con etanol
PA-ACS-ISO
131881 Acetonitrilo PA-ACS
A10922 Glicerol tripalmitato, 98%
6. PREPARACIN DE LAS MUESTRAS

Preparar del siguiente modo una solucin al 5%
de las muestras que vayan a analizarse: pesar 0,5
0,001 g de la muestra en un matraz aforado de 10
ml y enrasar hasta 10 ml con el disolvente de solubilizacin (5.5).
7. PROCEDIMIENTO
32
tculas de slice de 5 mm de dimetro con un 22-23%

de carbono en forma de octadecilsilano (nota 2).
4.5. Registrador y/o integrador.
7.1. Instalar el sistema cromatogrfico. Bombear

fase mvil (5.4) a razn de 1,5 ml/mm para purgar el
sistema completo. Esperar hasta que se obtenga
una lnea de base estable. Inyectar 10 ml de la muestra preparada como se indica en el punto 6.
8. CLCULO Y EXPRESIN DE LOS
RESULTADOS
Utilcese el mtodo de normalizacin interna, es
decir, considrese que la suma de las reas de los
picos de los diferentes triglicridos es igual a 100%.
Calcular el porcentaje relativo de cada triglicrido

mediante esta frmula:
rea del pico
% del triglicrido = x 100
reas de los picos
donde:
reas de los picos: suma de las reas de los
picos
El resultado se expresa con un decimal.
Nota 1: El orden de elucin puede determinarse
calculando el nmero equivalente de carbonos, que
a menudo viene dado por la relacin NEC = NC 2n,
siendo NC el nmero de carbonos y n el nmero de
enlaces dobles; es posible calcularlo con una precisin mucho mayor tomando en consideracin el origen del enlace doble. Si no, nl y nln son el nmero de
enlaces dobles atribuible a los cidos oleico, linoleico
y linolnico, respectivamente, el nmero equivalente
de carbonos puede calcularse mediante la relacin
siguiente:
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NEC = NC do no dl nl dln nln
Los coeficientes do, dl y dln pueden calcularse
mediante los triglicridos de referencia.
En las condiciones que se especifican en el presente mtodo, la relacin que se obtenga ser similar a la siguiente:
NEC = NC [2,60 no] [2,35 nl] [2,17 nln]
Nota 2: Ejemplos: Lichrosorb (Merck) RP 18 Art
50333;
Lichrosphere (Merck) 100 CH 18 Art 50377 o
similares.
para HPLC, cartucho ChromCart , CC250/4.6
Lichrospher 100 RP18,5 mm.
Nota 3: Algunos triglicridos de referencia tambin
permiten calcular la resolucin respecto a la triolena:
a= TR' /TR'olena
utilizando el tiempo de retencin corregido
TR' = TR TR disolvente.
La representacin grfica del log a frente a f
(nmero de enlaces dobles) permite determinar los
valores de retencin de todos los triglicridos de los
cidos grasos contenidos en los triglicridos de
referencia (vase la figura 2).
Nota 4: La eficacia de la columna debe permitir

separar claramente el pico de la LLL (trilinolena) de
los triglicridos con tiempo de retencin prximo.
Nota 5: En el caso de los aceites vrgenes lampantes y de los aceites de orujo de oliva brutos,
para obtener una buena separacin del pico de la
trilinolena de los picos adyacentes o de posibles
sustancias interferentes, se debe purificar previamente el aceite segn la metodologa siguiente:
Se lleva a cabo la absorcin de 200 l de aceite
sin diluir en una columnita de slice slida para
extraccin de lquido (tipo SEP PAK silica cartridgewaters part. n 51900).
Recomendacin Panreac: 731829 Cartucho
SPE, Slica gel, CHROMAFIX 400-SiOH, 400 mg
La elucin de los triglicridos se efecta con
20 ml de hexano anhidro para HPLC en un tiempo
mximo de 20 segundos.
El producto eluido se seca en una corriente de
nitrgeno y se recoge con isopropanol o acetona
(5 ml). Se inyectan entre 10 y 20 l en HPLC. Es
necesario comprobar que la composicin de cidos
grasos del aceite sea la misma antes y despus de
la purificacin, dentro de los lmites de error del
mtodo analtico adoptado.
Figura 1
Cromatograma de una muestra de aceite de soja
33
Nota: P: cido palmtico;
St: cido esterico;
O: cido oleico;
L: cido linoleico;
Ln: cido linolnico.
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Figura 2
Representacin grfica del log alfa frente a f (nmero de enlaces dobles)
Nota: La: cido lurico; My: cido mirstico; P: cido palmtico; St: cido esterico;
O: cido oleico; L: cido linoleico; Ln: cido linolnico.
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ANEXO IX
PRUEBA ESPECTROFOTOMTRICA EN EL
ULTRAVIOLETA
INTRODUCCIN
La prueba espectrofotomtrica en el ultravioleta
puede proporcionar indicaciones sobre la calidad
de una materia grasa, su estado de conservacin y
las modificaciones inducidas por los procesos tecnolgicos.
Las absorciones en las longitudes de onda indicadas en el mtodo se deben a la presencia de sistemas dinicos y trinicos conjugados. Los valores
de estas absorciones se expresan en extincin
especfica E1%,1cm (extincin de una solucin de
la materia grasa al 1% en el disolvente determinado,
en un espesor de 1 cm) que se expresar convencionalmente como K, tambin denominado coeficiente de extincin.
1. OBJETO
El mtodo describe el procedimiento de ejecucin de la prueba espectrofotomtrica en el ultravioleta de las materias grasas.
2. PRINCIPIO
La materia grasa se disuelve en el disolvente
requerido y se determina la extincin de la solucin
a las longitudes de onda prescritas, respecto al
disolvente puro. A partir de los valores espectrofotomtricos se calculan las extinciones especficas.
REACTIVO
Almina bsica para
cromatografa en columna
Ciclohexano de calidad para
espectrofotometra
Isooctano de calidad para
espectrofotometra
n-Hexano para cromatografa
3.1. Espectrofotmetro para medidas de extincin en el ultravioleta entre 220 y 360 nm, con posibilidad de lectura para cada unidad nanomtrica.
3.2. Cubetas de cuarzo, con tapadera, con
paso ptico de 1 cm. Las cubetas, llenas de agua o
de otro disolvente adecuado, no deben presentar
entre ellas diferencias superiores a 0,01 unidades
de extincin.
3.3. Matraces aforados de 25 ml.
3.4. Columna de cromatografa, de 270 mm de
longitud y 35 mm de dimetro en la parte superior:
de 270 mm de longitud y 10 mm de dimetro en la
parte inferior.
4. REACTIVOS
4.1. Isooctano (2,2,4-trimetilpentano) de calidad para espectrofotometra: debe tener, respecto al agua destilada, una transmitancia del 60%
como mnimo a 220 nm y del 95% como mnimo a
250 nm; o
ciclohexano de calidad para espectrofotometra: debe tener, respecto al agua destilada, una
transmitancia del 40% como mnimo a 220 nm y del
95% como mnimo a 250 nm. (Modificado por el
Reglamento (CE) 183/93)
4.2. Almina bsica para cromatografa en
columna, preparada y controlada como se describe en el apndice I.
4.3. n-Hexano para cromatografa.
Cdigo Denominacin
121100 Aluminio xido Bsico PA
361250
Ciclohexano (UV-IR-HPLC) PAI
362064
Iso-Octano (UV-IR-HPLC) PAI
362063
5. PROCEDIMIENTO
5.1. La muestra debe ser perfectamente homognea y estar exenta de impurezas en suspensin.
Los aceites lquidos a temperatura ambiente se filtran con papel de filtro a una temperatura aproximada de 30C, las grasas slidas se homogeneizan y
se filtran a una temperatura superior en 10C como
mximo a su temperatura de fusin.
5.2. Se pesan con precisin 0,25 g aproximadamente de la muestra preparada y se colocan en
un matraz aforado de 25 ml, se completa con el

disolvente adecuado y se homogeneiza. La solucin resultante debe estar perfectamente clara. Si
presenta opalescencia o turbidez, se filtrar rpidamente con papel de filtro.
5.3. Se llena una cubeta con la solucin obtenida y se miden las extinciones, usando como referencia el disolvente empleado, a las longitudes de
onda comprendidas entre 232 y 276 nm. Los valores de extincin obtenidos deben estar comprendidos en el intervalo entre 0,1 y 0,8; en caso contrario
35
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es necesario repetir la medida utilizando soluciones

ms concentradas o ms diluidas segn el caso.
5.4. Cuando se quiera determinar la extincin
especfica despus del tratamiento con almina se
proceder del siguiente modo: en la columna para
cromatografa se introducen 30 g de almina bsica
en suspensin en hexano; despus de asentarse el
absorbente se elimina el exceso de hexano, hasta
1 cm aproximadamente sobre el nivel superior de la
almina.
Se disuelven 10 g de materia grasa, homogeneizada y filtrada tal como se describe en el punto 5.1,
en 100 ml de hexano y se vierte esta solucin en la
columna. Se recoge el lquido eluido y se evapora
totalmente el disolvente en vaco a una temperatura
inferior a 25C.
Con la materia grasa as obtenida se procede
inmediatamente tal como se indica en el punto 5.2.
6.1. Se expresan las extinciones especficas o
coeficientes de extincin a las diversas longitudes
de onda, calculadas como sigue:
El
Kl =
ce
siendo:
Kl : extincin especfica a la longitud de onda
lambda,
El : extincin medida a la longitud de onda
lambda,
c : concentracin de la disolucin en g por 100 ml,
e : espesor de la cubeta en cm.
Los resultados deben expresarse con dos cifras
decimales.
6.2. La prueba espectrofotomtrica del aceite
de oliva segn el mtodo oficial de los Reglamentos
de la CEE requiere la determinacin de la extincin
especfica, en solucin en isooctano, a las longitudes de onda de 232 y 270 nm, y la determinacin
de K definido como:
Km 4 + Km + 4
K = Km -
2
36
donde Km es la extincin especfica a la longitud

de onda m, longitud de onda de mxima absorcin
alrededor de 270 nm.
APNDICE I
Preparacin de la almina y control de
su actividad
A.1.1. Preparacin de la almina
En un recipiente que pueda cerrarse hermticamente se echa la almina previamente desecada en
horno a 380-400C durante tres horas, se aade
agua destilada en una proporcin de 5 ml por 100 g
de almina, se cierra rpidamente el recipiente, se
agita repetidas veces y se deja reposar durante 12
horas como mnimo antes del uso.
A.1.2. Control de la actividad de la almina
Se prepara una columna para cromatografa con
30 g de almina. Se opera tal como se describe en
el apartado 5.4. Se hace pasar a travs de la
columna una mezcla formada por:
95% de aceite de oliva virgen, con extincin
especfica a 268 nm menor que 0,18,
5% de aceite de cacahuete tratado con tierras
decolorantes en el proceso de refinado, con una
extincin especfica a 268 nm mayor o igual que 4.
Si, despus del paso por la columna, la mezcla
presenta una extincin especfica a 268 nm mayor
que 0,11, la almina es aceptable; en otro caso se
debe aumentar el porcentaje de hidratacin.
APNDICE II
Ajuste del espectrofotmetro
A.2. El aparato debe revisarse peridicamente
(por lo menos cada seis meses) tanto en lo que se
refiere a la conformidad de la longitud de onda
como a la exactitud de la respuesta.
A.2.1. El control de la respuesta de la longitud
de onda puede hacerse mediante una lmpara de
vapor de mercurio o mediante filtros adecuados.
A.2.2. Para controlar la clula fotoelctrica y el
fotomultiplicador se procede como sigue: se pesan
0,2 g de cromato potsico de calidad para espectrofotometra, se disuelven, en un matraz aforado
de 1000 ml, en una solucin de hidrxido potsico 0,05N y se completa hasta el enrase. De la solucin obtenida se toman exactamente 25 ml, se
transvasan a un matraz aforado de 500 ml y se
completa hasta el enrase con la misma solucin de
hidrxido potsico.
Se mide la extincin a 275 nm de la solucin as
obtenida, utilizando la solucin de hidrxido potsico como referencia. La extincin medida en cubeta
de 1 cm deber ser de 0,200 0,005.
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REACTIVO
Cromato potsico
Hidrxido potsico 0,05N
Cdigo Denominacin
121497 Potasio Cromato PA
181517 Prepararlo a partir de Potasio Hidrxido
1 mol/l (1N) SV diluido convenientemente
con agua
ANEXO X A
ANLISIS DE LOS STERES METLICOS
DE LOS CIDOS GRASOS MEDIANTE
CROMATOGRAFA DE GASES
1. OBJETO
El presente mtodo internacional proporciona
orientaciones generales para determinar, mediante
cromatografa de gases con columna de relleno o
capilar, la composicin cualitativa y cuantitativa de
una mezcla de steres metlicos de cidos grasos
obtenidos con arreglo al Anexo X B.
El mtodo no es aplicable a los cidos grasos
polimerizados.
2. REACTIVOS
2.1. Gas portador
Gas inerte (nitrgeno, helio, argn, hidrgeno,
etc.), perfectamente desecado y que contenga
menos de 10 mg/kg de oxgeno.
Nota 1: El hidrgeno, que slo se emplea como
gas portador en las columnas capilares, puede
duplicar la velocidad del anlisis, pero es peligroso.
Existen dispositivos de seguridad.
2.2. Gases auxiliares
2.2.1. Hidrgeno (pureza 99,9%) exento de
impurezas orgnicas.
2.2.2. Aire u oxgeno, exento de impurezas
orgnicas.
2.3. Patrn de referencia
Una mezcla de steres metlicos de cidos grasos puros, o los steres metlicos de una grasa de
composicin conocida y, preferentemente, similar a
la de la materia grasa objeto de anlisis.
Deber evitarse la oxidacin de los cidos grasos poliinsaturados.
3. APARATOS
Las normas que figuran a continuacin se refieren al equipo ordinario para cromatografa de
gases, utilizando columnas de relleno y/o capilares
y un detector de ionizacin de llama. Podr utilizarse cualquier aparato cuya eficacia y resolucin se
ajusten a lo dispuesto en el punto 4.1.2.
3.1. Cromatgrafo de gases

El cromatgrafo de gases constar de los
siguientes elementos:
3.1.1. Sistema de inyeccin
Utilizar un sistema de inyeccin:
a) con columnas de relleno, con un espacio
muerto lo ms pequeo posible (en este caso, el
sistema de inyeccin podr calentarse a una temperatura que sea entre 20 y 50C superior a la de la
columna); o
b) con columnas capilares; en este caso, el sistema de inyeccin estar especialmente diseado
para poder operar con esa clase de columnas;
podr utilizarse un inyector con divisin de flujo o un
inyector "on column".
Nota 2: En ausencia de cidos grasos con
menos de 16 tomos de carbono, podr utilizarse
un inyector de aguja mvil.
3.1.2. Horno
El horno podr calentar la columna a 260C
como mnimo y mantener dicha temperatura con
una oscilacin mxima de 1C, si se emplea una
columna de relleno, y de 0,1C, si se emplea una
columna capilar. Este ltimo requisito es especialmente importante si se utiliza una columna de slice
fundida.
Se recomienda emplear en todos los casos un
sistema de calentamiento programado, sobre todo
en el caso de cidos grasos con menos de 16 tomos de carbono.
3.1.3. Columna de relleno
3.1.3.1.Columna de un material inerte a las sustancias que vayan a analizarse (es decir, vidrio o
acero inoxidable) y de las dimensiones siguientes:
a) Longitud: de 1 a 3 m. Con cidos grasos de
cadena larga (ms de C20) es conveniente utilizar
una columna relativamente corta. Para el anlisis de
cidos con 4 o 6 tomos de carbono se recomienda una columna de 2 m.
b) Dimetro interior: de 2 a 4 mm.
Nota 3: Si hay componentes poliinsaturados con
ms de tres enlaces dobles, pueden descomponerse en una columna de acero inoxidable.
Nota 4: Puede utilizarse un sistema con doble
columna de relleno.
Recomendacin Panreac: 710006 Columna de
acero inoxidable con relleno standard, 6' long., 1/8"
OD, 2 mm ID.
3.1.3.2.Relleno, que incluya los siguientes elementos:
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a) Soporte: tierra de diatomeas lavada con cido

y silanizada, u otro soporte inerte adecuado, con un
margen estrecho de tamao de grano (margen de
25 m, entre 125 y 200 m); el tamao medio de
grano estar en funcin del dimetro interior y de la
longitud de la columna.
b) Fase estacionaria: lquido polar de tipo polister (por ejemplo: polisuccinato de dietilenglicol, polisuccinato de butanodiol, poliadipato de etilenglicol,
etc.), cianosiliconas o cualquier otro lquido que permita efectuar la separacin cromatogrfica exigida
(vase el punto 4). La fase estacionaria deber
constituir del 5% (m/m) al 20% (m/m) del relleno.
Para algunas separaciones podr utilizarse una fase
fija no polar.
Recomendacin Panreac: 705103 Chromosorb
recubierto con fase estacionaria Dietilenglicol
succinato / 10% en Chromosorb W-AW.
3.1.3.3.Acondicionamiento de la columna
Estando la columna desconectada del detector,
si es posible, calentar el horno gradualmente hasta
185C y hacer pasar a travs de la columna recin
preparada una corriente de gas inerte a razn de
20-60 ml/min durante 16 horas como mnimo a la
temperatura citada y, a continuacin, a la temperatura de 195C durante 2 horas ms.
3.1.4. Columna capilar
capilar FS-CW 20 M, 25 m long., 0,25 mm ID,
0,25 m espesor.
3.1.4.1.Tubo de un material inerte a las sustancias que vayan a analizarse (generalmente, vidrio o
slice fundida). El dimetro interior estar comprendido entre 0,2 y 0,8 mm. La superficie interior se
someter a un tratamiento adecuado (por ejemplo,
preparacin de la superficie, inactivacin) antes de
introducir el recubrimiento de fase fija. En la mayora
de casos, es suficiente una longitud de 25 m(3).
3.1.4.2.Fase estacionaria de tipo poliglicol
[poli(etilenglicol) 20 000], polister (polisuccinato de
butanodiol) o polisiloxano polar (cianosiliconas),
generalmente. Son apropiadas las columnas de
fase qumicamente ligada.
Nota 5: Existe el riesgo de que los polisiloxanos
polares dificulten la identificacin y separacin del
cido linolnico y de los cidos C20.
El espesor de la fase estar comprendido entre
0,1 y 0,2 m.
3.1.4.3.Montaje y acondicionamiento de la
columna.
Observar las precauciones normales de montaje
de columnas capilares (es decir, instalacin de la
columna en el horno, eleccin y montaje de las juntas (estanqueidad), conexin de los extremos de la
columna al inyector y al detector (reduccin de los
espacios muertos). Colocar la columna bajo un flujo
(3) En la Directiva consta errneamente como mm
de gas portador [por ejemplo, 0,3 bar (30 kPa) para

una columna de 25 mm de longitud y 0,3 mm de
dimetro interior].
Acondicionar la columna programando el gradiente de temperatura del horno a 3C/min a partir
de la temperatura ambiente hasta alcanzar una
temperatura 10C inferior al lmite de descomposicin de la fase estacionaria. Mantener el horno a
esa temperatura durante 1 hora hasta que se estabilice la lnea de base. Restablecer la temperatura
de 180C para trabajar en condiciones isotrmicas.
Nota 6: En el comercio pueden obtenerse
columnas adecuadas previamente acondicionadas.
3.1.5. Detector que puede calentarse a una
temperatura superior a la de la columna.
3.2. Jeringa
Tendr una capacidad mxima de 10 l y estar
graduada en 0,1 l.
3.3. Registrador
Si se emplea la curva del registrador para calcular la composicin de la mezcla analizada, se necesita un registrador electrnico de alta precisin
compatible con los aparatos utilizados. El registrador deber tener las siguientes caractersticas:
a) tiempo de repuesta inferior a 1,5 s y, preferiblemente, inferior a 1 s (el tiempo de repuesta es el
tiempo que tarda la pluma registradora en pasar de
0 a 90% despus de la introduccin instantnea de
una seal del 100%);
b) ancho del papel: 20 cm como mnimo;
c) velocidad del papel: ajustable a valores comprendidos entre 0,4 cm/min y 2,5 cm/min.
3.4. Integrador
La utilizacin de un integrador electrnico permite efectuar clculos rpidos y precisos. Debe proporcionar una respuesta lineal de sensibilidad adecuada y la correccin de la desviacin de la lnea de
base debe ser satisfactoria.
4. PROCEDIMIENTO
Las operaciones descritas en los puntos 4.1 a
4.3 slo son vlidas si se emplea un detector de
ionizacin de llama.
Como alternativa puede emplearse un cromatgrafo de gases con catarmetro (cuyo funcionamiento se basa en el principio de los cambios de
conductividad trmica). En ese caso, las condiciones de ensayo debern modificarse como se indica
en el punto 6.
4.1. Condiciones de ensayo
4.1.1. Determinacin de las condiciones operativas ptimas
4.1.1.1.Columna de relleno
Al establecer las condiciones de ensayo debern tenerse en cuenta las variables siguientes:
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a) longitud y dimetro de la columna;
b) composicin y cantidad de la fase estacionaria;
c) temperatura de la columna;
d) flujo del gas portador;
e) resolucin exigida;
f) tamao de la muestra problema, determinado
de modo que el conjunto del detector y el electrmetro d una respuesta lineal;
g) duracin del anlisis.
Como norma general, las cifras de las tablas 1 y 2
permitirn obtener los resultados deseados, es decir,
al menos 2000 platos tericos por metro de longitud
de columna en el caso del estearato de metilo, y su
elucin en 15 minutos aproximadamente.
Cuando el aparato lo permita, la temperatura del
inyector deber ser de 200C aproximadamente y la
del detector deber ser igual o superior a la de la
columna.
Por lo general, la razn entre la velocidad de flujo del hidrgeno suministrado al detector de ionizacin de llama y la del gas portador oscila entre 1:2 y
1:1, en funcin del dimetro de la columna. El flujo
del oxgeno es de 5 a 10 veces superior al del hidrgeno.
Tabla 1
Dimetro interior
de la columna
mm
Flujo del gas

portador
ml/min
2
3
4
15 a 25
20 a 40
40 a 60
metlicos de manteca de cacao) en proporciones

aproximadamente equivalentes.
Escoger la temperatura de la columna y el flujo
del gas portador de manera que el mximo del pico
del estearato de metilo se registre aproximadamente 15 minutos despus del pico del disolvente. Utilizar una cantidad suficiente de la mezcla de steres
metlicos, de manera que el pico del estearato de
metilo se eleve a tres cuartos aproximadamente de
la escala completa.
Calcular el nmero n de platos tericos (eficacia) mediante la siguiente frmula:
dr1
n = 16
a1
la resolucin R mediante la siguiente frmula:

2
R =
a1 + a2
siendo:
dr1 :
a1 y a2
:
Tabla 2
Concentracin
de la fase fija
% (m/m)
Temperatura
de la columna
C
5
10
15
20
175
180
185
185
4.1.1.2.Columna capilar
Las propiedades de eficacia y permeabilidad de
las columnas capilares implican que la separacin
de los constituyentes y la duracin del anlisis
dependen considerablemente del flujo del gas portador en la columna. Por lo tanto, para optimizar las
condiciones operativas ser necesario manipular
este parmetro (o, lo que es ms sencillo, la presin
en cabeza de columna) segn se desee mejorar las
separaciones o efectuar un anlisis rpido.
4.1.2. Determinacin del nmero de platos tericos (eficacia) y de la resolucin (figura 1)
Efectuar el anlisis de una mezcla de estearato
de metilo y de oleato de metilo (por ejemplo, steres
distancia en mm, desde el inicio del

cromatograma hasta el mximo del
pico del estearato de metilo,
anchura, en mm, de los picos del estearato de metilo y del oleato de metilo,
respectivamente, medida entre los
puntos de interseccin de las tangentes en los puntos de inflexin de la curva con la lnea de base,
distancia, en mm, entre los dos mximos de los picos del estearato de
metilo y del oleato de metilo.
y el ndice de resolucin "Ir" mediante la siguiente frmula:

a
b
siendo:
a : altura del pico ms pequeo, medida a partir
de la lnea de base;
b : altura del punto ms bajo del valle comprendido entre los dos picos adyacentes, medida
a partir de la lnea de base.
(Modificado por el Reglamento (CEE)
N 1429/92)
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Figura 1
Cromatograma para determinar el nmero de platos tericos (eficacia) y la resolucin
Se establecern unas condiciones de anlisis

que permitan obtener al menos 2 000 platos tericos por metro de longitud de columna para el estearato de metilo y una resolucin de 1,25 como mnimo.
40
4.2. Muestra problema

Tomar con la jeringa (3.2) de 0,1 l a 2 l de la
solucin de steres metlicos preparados con arreglo al Anexo X B e inyectarlos en la columna.
En el caso de steres no disueltos, preparar una
solucin de 100 mg/ml aproximadamente en heptano de calidad para cromatografa e inyectar de
0,1 l a 1 l de esta solucin.
Si slo se desean detectar los componentes
presentes en cantidades muy pequeas, se podr
aumentar el tamao de la muestra (hasta 10 veces).
4.3. Anlisis
Como norma general, las condiciones de ensayo son las que se especifican en el punto 4.1.1.
No obstante, cuando se determinan cidos con
menos de 12 tomos de carbono es posible operar
a menor temperatura de columna, mientras que

cuando se determinan cidos grasos con ms de
20 tomos de carbono es posible operar a una
temperatura mayor. A veces se puede utilizar en los
dos casos anteriores un sistema de programacin
de temperatura. Por ejemplo, si la muestra contiene
steres metlicos de cidos grasos con menos de
12 tomos de carbono, inyectar la muestra a 100C
(o a 50 60C si hay cido butrico) y elevar inmediatamente la temperatura a razn de 4 8 C/min
hasta alcanzar el nivel deseado. En algunos casos
es posible combinar ambos procedimientos.
Tras el calentamiento programado, se contina
la elucin a temperatura constante hasta que todos
los componentes se hayan eluido. Si el instrumento
no puede efectuar un calentamiento programado,
se opera a dos temperaturas fijas comprendidas
entre 100 y 195C.
Si es necesario, se recomienda que se efecte
un anlisis con dos fases fijas de diferente polaridad
para comprobar la ausencia de picos ocultos, por
ejemplo en caso de presencia simultnea de C18:3 y
C20:0 o C18:3 y C18:2 conjugados.
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4.4. Preparacin del cromatograma y las grficas de referencia
Analizar la mezcla patrn de referencia (2.3) aplicando las mismas condiciones de ensayo que a la
muestra y medir los tiempos o las distancias de
retencin de los cidos grasos que la componen.
Representar grficamente en papel semilogartmico, para cualquier grado de insaturacin, el logaritmo del tiempo o de la distancia de retencin en funcin del nmero de tomos de carbono. En
condiciones isotrmicas, las grficas de los steres
de cadena lineal con el mismo grado de insaturacin deben formar lneas rectas. Dichas lneas rectas deben ser aproximadamente paralelas.
Deben evitarse las condiciones que propicien la
existencia de picos ocultos, es decir, una resolucin insuficiente para separar dos componentes.
5.1. Anlisis cualitativo
Identificar los picos del estearato de metilo de la
muestra a partir de los grficos citados en el punto
4.4, si es necesario por interpolacin.
5.2. Anlisis cuantitativo
5.2.1. Determinacin de la composicin
Salvo en casos excepcionales, utilizar el mtodo
de normalizacin interna, es decir, partir del principio de que todos los componentes de la muestra
estn representados en el cromatograma, de
manera que el total de las reas situadas debajo de
cada pico representa el 100% de los constituyentes
(elucin total).
Si el equipo incluye un integrador, utilizar las
cifras que ste proporcione. En caso contrario,
determinar el rea situada debajo de cada pico multiplicando la altura del pico por el ancho a la mitad
de la altura y, cuando sea necesario, tomar en consideracin las atenuaciones utilizadas durante el
registro.
5.2.2. Mtodo de clculo
5.2.2.1.Caso general
Calcular el contenido de un componente dado (i)
(expresado como porcentaje en masa de steres
metlicos), mediante la determinacin del porcentaje
que representa el rea de su pico en relacin con la
suma de las reas de todos los picos, aplicando la
frmula siguiente:
Ai
x 100
A
siendo:
Ai : rea del pico correspondiente al componente i.
A : suma de las reas de todos los picos.
Expresar el resultado con una cifra decimal.
Nota 7: En este caso general se considera que

el resultado del clculo basado en las reas relativas
representa el porcentaje en peso. Para los casos en
que no es vlida esta consideracin, vase el punto
5.2.2.2.
5.2.2.2.Utilizacin de factores de correccin
En algunos casos, por ejemplo en presencia de
cidos grasos con menos de 8 tomos de carbono
o de cidos con grupos secundarios, si se utilizan
detectores de conductividad trmica o si es necesario alcanzar mayor nivel de exactitud, deben aplicarse factores de correccin para convertir los porcentajes de las reas de los picos en porcentajes en
peso de los componentes.
Determinar los factores de correccin con un
cromatograma obtenido del anlisis de una mezcla
de referencia de steres metlicos de composicin
conocida en condiciones de ensayo idnticas a las
empleadas para el anlisis de la muestra.
La frmula que se aplicar a la muestra de referencia para obtener el porcentaje en peso del componente i es la siguiente:
mi
x 100
m
siendo:
mi : peso del componente i de la muestra de
referencia,
m : suma de los pesos de los diversos componentes de la muestra de referencia.
A partir del cromatograma de la muestra de referencia (4.4) calcular el porcentaje (rea/rea) del
componente i del siguiente modo:
Ai
x 100
A
siendo:
Ai : rea del pico correspondiente al componente i,
A : suma de las reas de todos los picos.
El factor de correccin se calcula del siguiente
modo:
mi x A
Ki=
Ai x m
Por lo general, los factores de correccin se
expresan con relacin a KC16, de modo que los factores relativos se convierten en lo siguiente:
Ki
K'i=
KC16
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En la muestra, el contenido de cada componente i, expresado como porcentaje en peso de los

steres metlicos, es el siguiente:
K'i x Ai
x 100
(K'i x Ai)
Expresar los resultados con una cifra decimal.
5.2.2.3.Utilizacin de patrn interno
En algunos anlisis (por ejemplo, cuando no se
cuantifican todos los cidos grasos por estar presentes simultneamente cidos de 4 y 6 tomos de
carbono y cidos de 16 y 18 tomos de carbono, o
cuando es necesario determinar la cantidad absoluta de un cido graso en la muestra) es preciso utilizar un patrn interno. Se emplean con frecuencia
cidos grasos de 5, 15 o 17 tomos de carbono.
Debe determinarse, si es necesario, el factor de
correccin del patrn interno.
El porcentaje en peso del componente i, expresado como steres metlicos, se calcula mediante
esta frmula:
mp x K'i x Ai
x 100
m x K'p x Ap
siendo:
Ai : rea del pico correspondiente al componente i.
Ap : rea del pico correspondiente al patrn
interno.
K'i : factor de correccin del componente i (con
relacin a KC16).
K'p: factor de correccin del patrn interno (con
relacin a KC16).
m : peso, en mg, de la muestra.
mp : peso, en mg, del patrn interno.
Expresar los resultados con una cifra decimal.
6. CASO ESPECIAL DE
DETERMINACIN DE LOS
ISMEROS TRANS
(Reglamento (CEE) N 1429/92)
42
Es posible determinar el contenido de ismeros

trans de los cidos grasos con un nmero de tomos de carbono comprendido entre 10 y 24 por
separacin de los steres metlicos, utilizando
columnas cromatogrficas capilares con una polaridad especial.
6.1. Columna capilar de silicio de un dimetro
interno comprendido entre 0,25 mm y 0,32 mm y
de 50 m de longitud, recubierta de una capa de cianopropisilicona de un espesor comprendido entre
0,1 y 0,3 m (tipo SP 2340, tipo SP 2380, C.P. sil

88, Silor 10 o similar).
capilar para GC, OPTIMA 240, 60 m long.,
0,25 mm ID, 0,25 m espesor.
6.2. Los steres metlicos se preparan segn el
procedimiento B descrito en el Anexo X "B". Las
materias grasas con una acidez libre superior al 3%
deben neutralizarse previamente con arreglo al punto 6.1 del Anexo VII.
6.3. Las condiciones generales de trabajo para
la cromatografa en fase gaseosa son las siguientes:
temperatura de la columna programada de
150 a 230C (por ejemplo, 165C durante 15
minutos y a continuacin un aumento de 5C por
minuto hasta alcanzar 200C),
temperatura del inyector: 250C si se utiliza el
sistema de inyector divisor o la temperatura inicial
de la columna si se emplea el sistema "on column",
temperatura del detector: 260C,
flujo del gas vector (helio e hidrgeno):
1,2 ml/minuto.
La cantidad inyectada debe ser tal que, en las
condiciones de sensibilidad empleadas, la altura del
pico correspondiente al ster metlico del cido araqudico sea igual o superior al 20% del fondo de
escala.
6.4. La identificacin de los diversos steres
metlicos se efecta comparando los tiempos de
retencin con los de las mezclas de referencia (tal y
como se indica en el punto 2.3).
Los steres de los cidos grasos trans son eluidos antes que los ismeros cis correspondientes.
En la figura 2 se presenta un ejemplo de cromatograma.
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M
Figura 2
Cromatograma de gases tipo relativo a la determinacin de los ismeros trans
de los cidos grasos con columna capilar
Cromatograma de gases tipo relativo a la determinacin de los ismeros trans de los cidos
grasos con la columna capilar 726089.60 (recomendacin Panreac)
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6.5. La eficacia de la columna determinada con

arreglo al punto 4.1.2 deber permitir una separacin, con un ndice de resolucin superior a 2, de
determinadas parejas crticas, como la formada por
el grupo de los cidos transisoleicos y el pico del
cido oleico (trans C18:1/cis C18:1).
Nota 8: Teniendo en cuenta las caractersticas

particulares de este mtodo, los resultados deben
darse con dos decimales.
7. CASO ESPECIAL DE UTILIZACIN
DE UN CATARMETRO
(FUNCIONAMIENTO BASADO EN EL
PRINCIPIO DE LOS CAMBIOS DE
CONDUCTIVIDAD TRMICA)
6.6. La proporcin de los diversos cidos grasos

trans se calcula estableciendo la relacin entre la
superficie del pico correspondiente y la suma de las
superficies de todos los picos presentes.
Se toman en consideracin los porcentajes de
los cidos:
trans octadecenoicos (T 18:1), que en el Anexo I del presente Reglamento figuran como tal de
ismeros transoleicos,
cis-trans y trans-cis octadecadienoicos
[(CT/TC) 8:2], que en el Anexo I del presente Reglamento figuran como tal de ismeros translinoleicos,
trans-cis-trans, cis-cis-trans, cis-trans-cis,
trans-cis-cis octadecatrienoicos [(TCT+CCT+CTC
+TCC) 18:3], que en el Anexo I del presente Reglamento figuran como total de ismeros translinolnicos.
Para la determinacin de la composicin cualitativa y cuantitativa de una mezcla de steres metlicos de cidos grasos tambin podr utilizarse un
cromatgrafo de gases provisto de un detector
cuyo funcionamiento se base en el principio de los
cambios de conductividad trmica (catarmetro).
En ese caso, las condiciones establecidas en los
puntos 3 y 4 debern modificarse como se indica
en la tabla 3.
Para el anlisis cuantitativo, utilizar los factores
de correccin definidos en el punto 5.2.2.2.
Tabla 3
Variable
Longitud: 2 a 4 m
Dimetro interior: 4 mm
Soporte
Tamao de grano entre 160 y 200 m
Concentracin de la fase estacionaria
De 15% a 25% (m/m)
Gas portador
Helio o, en su defecto, hidrgeno, con el menor

contenido de oxgeno posible
Gases auxiliares
Ninguno
Temperatura del inyector
De 40 a 60C ms que la de la columna
Flujo del gas portador
Normalmente entre 60 y 80ml/min
Tamao de la muestra problema inyectada
Normalmente entre 0,5 y 2 l
8. INFORME DEL ANLISIS
44
Valor / condicin
Columna
ANEXO X "B"
En el informe del anlisis se expondrn los mtodos utilizados para la preparacin de los steres
metlicos y para la realizacin del anlisis mediante
cromatografa de gases, as como los resultados
obtenidos. Se mencionarn, asimismo, cualesquiera procedimientos de trabajo que no se especifiquen en la presente norma internacional o que se
consideren facultativos, as como toda circunstancia que pueda haber influido en los resultados.
PREPARACIN DE LOS STERES

METLICOS DE LOS CIDOS GRASOS DE
CONFORMIDAD CON LOS PUNTOS I Y II
DEL ANEXO VI DEL REGLAMENTO (CEE)
N 72/77 O SEGN EL MTODO QUE SE
DESCRIBE A CONTINUACIN
El informe del anlisis incluir todos los datos

necesarios para la completa identificacin de la
muestra.
La eleccin del procedimiento a utilizar deber

hacerse en funcin de la composicin de los cidos
y de la acidez de la materia grasa que haya que
examinar y del anlisis mediante cromatografa de
gases que deba efectuarse.
INTRODUCCIN
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M
En particular:
cuando se trate de materias grasas que contengan cidos grasos inferior a C12, slo podrn utilizarse los procedimientos en tubo cerrado o con
dimetlico,
cuando se trate de materias grasas con una
acidez superior al 3%, slo podrn utilizarse los
procedimientos con mezcla de metanol y cido
clorhdrico o con sulfato dimetlico,
en la determinacin mediante cromatografa
de gases de los ismeros trans, slo podrn utilizarse los procedimientos con metilato sdico o con
sulfato dimetlico,
el procedimiento con mezcla de metanol,
hexano y cido sulfrico deber utilizarse en la preparacin de los steres metlicos de pequeas cantidades de materias grasas por separacin mediante cromatografa en capa fina.
No se tendr en cuenta el insaponificable cuando no supere el 3%; en caso contrario, los steres
metlicos debern prepararse a partir de los cidos
grasos.
e) con mezcla de metanol, hexano y cido sulfrico.
Procedimiento A
2. PRINCIPIO DEL MTODO
La materia grasa objeto de anlisis se calienta a
reflujo con alcohol metlico y metilato sdico. Los
steres metlicos que se obtengan se extraen con
ter etlico.
3.1. Matraz redondo de 100 ml con refrigerante
de reflujo, provisto en su extremidad superior de un
tubo para cal sdica, con junta esmerilada.
3.2. Probetas de 50 ml.
3.3. Pipeta de 5 ml graduada en divisiones de
0,1 ml.
3.4. Embudos de separacin de 250 ml.
3.5. Matraz redondo de 200 ml.
1. OBJETO
4. REACTIVOS
A continuacin se describen cinco procedimientos para la preparacin de los steres metlicos de
las materias grasas:
a) con metilato sdico;
b) con metilato sdico en tubo cerrado;
c) con mezcla de metanol y cido clorhdrico en
tubo cerrado;
d) con sulfato dimetlico;
REACTIVO
Cloruro sdico
ter de petrleo 40-60C
ter etlico
Metanol anhidro
Sodio metal
4.1. Metanol anhidro.

4.2. Solucin de metilato sdico en metanol al
1% aproximadamente. Se prepara disolviendo
0,34 g de sodio metal en 100 ml de metanol anhidro.
4.3. ter etlico.
4.4. Solucin de cloruro sdico al 10%.
4.5. ter de petrleo 40-60C.
Cdigo Denominacin
131659 Sodio Cloruro PA-ACS-ISO
131315 Eter de Petrleo 40-60C PA-ISO
132770 Eter Dietlico estabilizado con ~6 ppm de BHT
PA-ACS-ISO
481091 Metanol seco (mx. 0,01% de agua)
DS-ACS-ISO
131699 Sodio metal, barras PA-ACS
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Introducir en el matraz de 100 ml 2 g de
grasa previamente deshidratada en sulfato sdico y
filtrada. Aadir 35 ml de metanol, acoplar el refrigerante y llevar a ebullicin mantenindola a reflujo
durante algunos minutos.
5.2. Interrumpir el calentamiento, separar el
refrigerante y aadir rpidamente 3,5 ml de la solucin de metilato sdico; acoplar nuevamente el
refrigerante y hervir a reflujo durante 3 horas como
mnimo. La metilacin se habr completado cuando

toda la materia grasa se haya disuelto y la mezcla
de reaccin est perfectamente transparente a temperatura ambiente.
5.3. Enfriar y verter la mezcla de reaccin en una
ampolla de separacin de 250 ml, aadir 35 o 40 ml
de ter etlico, 100 ml de agua y 5 o 6 ml de la solucin de cloruro sdico al 10%. Agitar y esperar a
que se produzca la separacin de las capas; transferir la fase acuosa a una segunda ampolla de separacin y extraerla de nuevo con 25 ml de ter etlico.
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Aadir a los extractos etreos reunidos 50 ml de

ter de petrleo 40-60C, lo que provocar la separacin del agua que debe eliminarse.
Lavar la fase etrea tres veces con 10 o 15 ml
de agua cada vez, desecar sobre sulfato sdico y
pasar filtrando a travs de papel a un matraz redondo de 200 ml.
Concentrar la solucin al bao Mara hasta unos
20 ml mientras se hace pasar una corriente de
nitrgeno puro.
Procedimiento B
3.1. Tubo de vidrio de paredes gruesas, de
unos 5 ml (altura: 40-45 mm, dimetro: 14-16 mm).
3.2. Pipeta de 1 ml graduada en divisiones de
0,1 ml.
4. REACTIVOS
4.1. Solucin de metilato sdico en metanol al
1,5% aproximadamente. Se prepara disolviendo
0,50 g de sodio metal en 100 ml de metanol anhidro.

La materia grasa objeto de anlisis es tratada
con metilato sdico en solucin metanlica, en recipiente cerrado, a 85 90C.
REACTIVO
Metanol anhidro
Sodio metal
Cdigo Denominacin
DS-ACS-ISO
131699 Sodio metal, barras PA-ACS
5. PROCEDIMIENTO
Procedimiento C
5.1. Introducir en el tubo de vidrio 2 g de materia grasa previamente deshidratada en sulfato sdico y filtrada. Aadir 0,3 g (unos 0,4 ml) de la solucin de metilato sdico y cerrar el tubo a la llama.
5.2. Mantener el tubo durante dos horas al
bao Mara a una temperatura entre 85 y 90C agitndolo de vez en cuando. La esterificacin se
habr conseguido cuando se vuelva transparente el
contenido del frasco tras la sedimentacin de la glicerina y de los residuos de los reactivos.
5.3. Enfriar a temperatura ambiente. Abrir el
tubo cuando se vayan a utilizar los steres metlicos. stos no necesitan de ninguna otra manipulacin antes de ser analizados.

La materia grasa objeto de anlisis es tratada
con una mezcla de metanol y cido clorhdrico, en
tubo cerrado, a 100C.
3.1. Tubo de vidrio de paredes gruesas, de
unos 5 ml (altura: 40-45 mm, dimetro: 14-16 mm).
3.2. Pipetas aforadas de 1 y 2 ml.
4. REACTIVOS
4.1. Solucin de cido clorhdrico en metanol al
2%. Se prepara con cido clorhdrico gaseoso y
metanol anhidro (nota 1).
4.2. Hexano de calidad adecuada para cromatografa.
46
REACTIVO
Hexano de calidad adecuada
para cromatografa
Metanol anhidro
Cdigo Denominacin
362063 n-Hexano (UV-IR-HPLC) PAI
481091
Metanol seco (mx. 0,01% de agua)

DS-ACS-ISO
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M
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Introducir en el tubo de vidrio 0,2 g de

materia grasa, previamente deshidratada en sulfato
sdico y filtrada, y 2 ml de la solucin de cido clorhdrico en metanol. Cerrar el tubo a la llama.
5.2. Mantener el tubo durante 40 minutos al
bao Mara a 100C.
5.3. Enfriar el tubo en agua corriente, abrirlo,
aadir 2 ml de agua destilada y 1 ml de hexano.
Centrifugar y extraer la fase del hexano que estar
lista para ser utilizada.
3.1. Tubo de ensayo de vidrio de paredes gruesas, de 20 ml aproximadamente de capacidad, con

tapn esmerilado 10/19 y enganches de seguridad.
3.2. Refrigerante de reflujo de cinco ampollas
con junta esmerilada 10/19.
3.3. Filtros de vidrio de fondo poroso, de graduacin G 2 y dimetro de 20 mm.
3.4. Tubos de ensayo de vidrio de fondo cnico, de unos 10 ml de capacidad.
3.5. Jeringas de 1 y 5 ml.
4. REACTIVOS
Procedimiento D
La materia grasa objeto de anlisis se saponifica
con una solucin en alcohol metlico de hidrxido
potsico, y despus se trata con sulfato dimetlico.
Tras aadir cido clorhdrico, los steres metlicos
formados se separan espontneamente. Mediante
el tratamiento posterior con almina, se obtienen
steres metlicos de elevada pureza.
REACTIVO
cido clorhdrico concentrado (d = 1,19)
Alcohol metlico de calidad
adecuada para cromatografa
Hidrxido potsico
xido de aluminio
Solucin al 0,05% del indicador verde
de bromocresol en alcohol metlico
Sulfato dimetlico (d = 1,335 a 15C)
4.1. Solucin al 10% de hidrxido potsico en

alcohol metlico de calidad adecuada para cromatografa.
4.2. Solucin al 0,05% del indicador verde
de bromocresol en alcohol metlico.
4.3. Sulfato dimetlico (d = 1,335 a 15C).
4.4. cido clorhdrico concentrado (d = 1,19)
diluido 1:1 con alcohol metlico de calidad cromatogrfica.
4.5. xido de aluminio normalizado segn el
mtodo Brockmann para cromatografa de adsorcin.
Cdigo Denominacin
131020 cido Clorhdrico 37% PA-ACS-ISO
361091 Metanol (UV-IR-HPLC-HPLC preparativa) PAI
121515
121100
281760

Aluminio xido Bsico PA
Verde de Bromocresol solucin 0,04% RV
162714
Dimetilo Sulfato PS
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Introducir en el tubo de ensayo de 20 ml
unos 2,2 ml de materia grasa previamente deshidratada en sulfato sdico y filtrada; aadir 5 ml de la
solucin de hidrxido potsico y algunos granos de
piedra pmez para regular la ebullicin. Acoplar el
refrigerante de reflujo y calentar agitando sobre llama pequea durante 5 minutos. Para que la saponificacin sea completa, la solucin deber volverse
transparente. Por ltimo, enfriar en agua corriente y
separar el refrigerante.
5.2. Aadir dos gotas del indicador y, lentamente, con la ayuda de una jeringa, 1 ml de sulfato
dimetlico. Cerrar hermticamente el tubo de ensayo y agitar durante dos o tres minutos, introduciendo con frecuencia el fondo del tubo en agua hirvien-
do: la reaccin ser completa cuando el indicador

pase del azul al amarillo. Al final, enfriar el tubo en
agua corriente, abrirlo y aadir 5 ml de la solucin
metanlica de cido clorhdrico.
5.3. Tras agitar durante unos segundos, inclinar
el tubo y darle ligeras sacudidas que faciliten la aparicin de los steres metlicos en forma de masa
oleosa (nota A).
Retirar los steres metlicos con una jeringa,
introducirlos en un tubo de fondo cnico, aadir un
volumen de almina equivalente a un cuarto del
volumen de los steres metlicos, agitar y filtrar con
papel de filtro.
Nota A: En caso de que no se produzca espontneamente la separacin de los steres metlicos,
aadir al tubo 5 ml de agua y agitar.
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Procedimiento E
3.2.
3.3.
3.4.
3.5.

La materia grasa objeto de anlisis se calienta a
reflujo con metanol, hexano y cido sulfrico. Los
steres metlicos que se obtengan se extraern con
ter de petrleo.
3.1. Tubo de ensayo de unos 20 ml de capacidad, con refrigerante de reflujo de aire, de 1 m aproximadamente de longitud, con junta esmerilada.
REACTIVO
cido sulfrico concentrado
ter de petrleo 40-60C
Hexano
Metanol anhidro
Sulfato sdico anhidro
4. REACTIVOS
4.1. Reactivo de metilacin: metanol anhidro,
hexano y cido sulfrico concentrado (d = 1,84)
en la siguiente proporcin: 75:25:1 (V/V/V).
4.2. ter de petrleo 40-60C.
4.3. Sulfato sdico anhidro.
Cdigo Denominacin
131058 Acido Sulfrico 96% PA-ISO
131315 Eter de Petrleo 40-60C PA-ISO
132063 n-Hexano PA-ACS
DS-ACS-ISO
131716 Sodio Sulfato anhidro PA-ACS-ISO
5. PROCEDIMIENTO
48
Pipeta aforada 5 ml.

Ampolla de separacin de 50 ml.
Probetas de 10 y 25 ml.
Tubo de fondo cnico de 15 ml.
5.1. Introducir en el tubo de 20 ml el material

recuperado de la placa y aadir 5 ml de reactivo de
metilacin.
5.2. Acoplar el refrigerante de reflujo y calentar
al bao Mara en ebullicin durante 30 minutos
(nota 2).
5.3. Transferir cuantitativamente la mezcla a una
ampolla de separacin de 50 ml con la ayuda de
10 ml de agua destilada y 10 ml de ter de petrleo.
Agitar enrgicamente y esperar a que se produzca
la separacin de las fases, extraer la capa acuosa y
lavar la capa etrea dos veces con 20 ml de agua
destilada. Aadir a la ampolla de separacin una
pequea cantidad de sulfato sdico anhidro, agitar,
dejar reposar unos minutos y pasar filtrando a un
tubo de fondo cnico de 15 ml.
Evaporar el disolvente al bao Mara haciendo
pasar una corriente de nitrgeno.
Nota 1: En el laboratorio pueden prepararse
fcilmente pequeas cantidades de cido clorhdrico gaseoso por simple desplazamiento de la solucin comercial (r= 1,18), aadiendo algunas gotas
de cido sulfrico concentrado (r= 1,84). El gas
liberado se deseca fcilmente por borboteo a travs
de cido sulfrico concentrado. Dado que el cido
clorhdrico es absorbido por el metanol con mucha
rapidez, se aconseja que se adopten las precauciones necesarias al disolverlo (es decir, introducir el
gas a travs de un embudo pequeo invertido cuyo
borde roce la superficie del lquido). Pueden prepa-
rarse con antelacin cantidades grandes de solucin metanlica de cido clorhdrico, ya que se conserva en perfectas condiciones en la oscuridad
dentro de botellas con tapones de vidrio.
Nota 2: Para controlar la ebullicin, introducir
una varita de vidrio en el tubo y limitar la temperatura del bao Mara a 90C.
ANEXO XI
DETERMINACIN DEL CONTENIDO EN
SOLVENTES HALOGENADOS VOLTILES
EN EL ACEITE DE OLIVA
Anlisis por cromatografa en fase gaseosa segn
la tcnica del espacio de cabeza (head space).
2. EQUIPO
2.1. Cromatografa de gases con detector de
captura de electrones (ECD).
2.2. Equipo para espacio de cabeza (head space).
2.3. Columna de cromatografa en fase gaseosa de vidrio de 2 metros de largo y 2 mm de dimetro, fase estacionaria.
OV 101 al 10% impregnado en cromosorb WAW-DMCS (tierra de diatomeas calcinada lavada
con cido y silanizado (80-100 Mesh).
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M
capilar OPTIMA 624, 50 m long., 0,25 mm ID,
1,40 m espesor.
2.4. Gas portador y gas auxiliar: nitrgeno para
cromatografa de gases de pureza adecuada para
la deteccin por captura de electrones.
2.5. Frascos de cristal de 10 a 15 ml provistos
de septum de tefln y con una cpsula de aluminio
con un orificio para toma de muestras con jeringa.
Recomendacin Panreac: 70205.36 Vial encapsulable N 20-10 DIN, incoloro.
70234 Cpsula de aluminio con disco N 20
TB/oA color aluminio.
2.6. Pinzas capsuladoras para cerrar hermticamente.
Recomendacin Panreac: 735120 Encapsuladora manual, N 20 para tapones encapsulables de
20 mm ID.
2.7. Jeringa para gases de 0,5 y 2 ml.
3. REACTIVOS
Solventes halogenados con una pureza apropiada para su uso en cromatografa en la fase gaseosa.
4. PROCEDIMIENTO DE ANLISIS
4.1. Pesar con exactitud unos 3 g de aceite en
un frasco de cristal (no reutilizable), tapar el frasco
de manera que quede cerrado hermticamente.
Introducir el frasco en un bao con termostato a
70C durante 1 hora. Extraer con precisin, por
medio de una jeringa, un volumen de 0,2 a 0,5 ml
del espacio de cabeza. Inyectarlo en la columna del
cromatgrafo de gases con las siguientes condiciones:
temperatura inyector: 150C
temperatura columna: 70-80C
temperatura detector: 200-250C
Podrn utilizarse otras temperaturas siempre
que los resultados sean equivalentes.
La inyeccin se puede realizar con el equipo
para espacio de cabeza.
4.2. Soluciones de referencia. Preparar solucio-
REACTIVO
Alcohol isoproplico puro para anlisis
Hexano para anlisis
Hidrxido de sodio
Solucin etanlica al 1 % de fenolftalena
nes patrn utilizando aceite de oliva refinado sin trazas de solventes con concentraciones en hidrocarburos halogenados de 0,05 a 1 ppm (mg/kg) segn
el contenido supuesto de la muestra. Para preparar
la solucin de referencia, si es necesario diluir previamente el hidrocarburo halogenado patrn, puede
utilizarse pentano.
Recomendacin Panreac: 362006 n-Pentano
(UV-IR-HPLC) PAI
4.3. Cuantificacin. Se efecta por clculo
mediante la relacin de reas o alturas del pico de
la muestra y de la solucin patrn cuya concentracin sea la ms prxima a la de la muestra. Si la
desviacin es superior al 10%, ser necesario volver
a hacer el anlisis, comparndolo con una nueva
solucin patrn de concentracin tal que se ajuste
a la desviacin relativa antes mencionada. El contenido se establecer efectuando la media de varias
inyecciones.
4.4. Expresin de los resultados. Los resultados
se expresarn en ppm (mg/kg). El lmite de deteccin del mtodo es de 0,01 mg/kg.
ANEXO XIII
1. NEUTRALIZACIN Y
DECOLORACIN DEL ACEITE DE
OLIVA EN LABORATORIO.
(Modificado por el Reglamento
(CE) 183/93)
1.1. Neutralizacin del aceite
1.1.1. Equipo
vaso de 300 ml de forma alta,
centrfuga con tubos de 100 ml,
vaso de 250 ml,
matraces de 100 ml,
ampolla de decantacin de 1 litro.
1.1.2. Reactivos
solucin acuosa de hidrxido de sodio al
12 %,
solucin etanlica al 1 % de fenolftalena,
hexano para anlisis,
alcohol isoproplico puro para anlisis.
Cdigo Denominacin
131090 2-Propanol PA-ACS-ISO
131687 Sodio Hidrxido lentejas PA-ACS-ISO
281327 Fenolftalena solucin 1% RV
49
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50
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1.1.3. Modo de operar

a) Aceites de acidez expresada en cido oleico
inferior al 30%
Introducir en un vaso de 300 ml de forma alta,
50 g de aceite bruto y calentar a 65C al bao
Mara. Agitar lentamente, y aadir una cantidad de
solucin de hidrxido de sodio al 12% que corresponda a la acidez libre del aceite con un exceso del
5%. Continuar agitando durante cinco minutos,
manteniendo la temperatura a 65C.
Trasladar el total a unos tubos de centrfuga de
100 ml, separar la masa jabonosa por centrifugacin.
Verter el aceite decantado en un vaso de 250 ml y
lavar con 50-60 ml de agua destilada hirviendo eliminando durante este proceso la capa acuosa con
la ayuda de un sifn. Repetir los lavados hasta eliminar completamente los restos de jabn residual
(desaparicin de la coloracin rosa en la fenolftalena).
Centrifugar el aceite para eliminar las pequeas
cantidades de agua residual.
b) Aceites de acidez expresada en cido oleico
superior al 30%
Introducir en una ampolla de decantacin de un
litro, 50 g de aceite bruto, 200 ml de hexano, 100 ml
de alcohol isoproplico y una cantidad de solucin
de hidrxido de sodio al 12% que corresponda a la
acidez libre del aceite, con un exceso del 0,3%. Agitar enrgicamente durante un minuto. Aadir 100
ml de agua destilada, agitar de nuevo y dejar reposar.
Despus de la separacin de las capas, dejar
salir la capa inferior que contiene los jabones. Entre
ambas capas (aceitosa por encima y acuosa por
debajo) se forma frecuentemente una capa intermedia constituida por muclagos y sustancias insolubles que deber eliminarse igualmente.
Proceder a continuacin al lavado de la solucin hexnica de aceite neutro con porciones
de 50-60 ml de una solucin de alcohol isoproplico/agua destilada 1/1 (v/v) hasta la desaparicin
de la coloracin rosa en la fenolftalena. Proceder a
continuacin a la eliminacin completa del hexano
por destilacin en vaco (por ejemplo, en el rotavapor).
1.2. Decoloracin del aceite neutro
1.2.1. Equipo
matraz de 250 ml con 3 bocas que permitan la
insercin de:
a) un termmetro graduado en grados que permita hacer lecturas hasta 90C,
b) un agitador mecnico que gire a 250-300
vueltas por minuto equipado para el funcionamiento
en vaco,
c) un rcor hacia la bomba de vaco,
bomba de vaco, provista de un manmetro,
capaz de lograr presiones residuales de 15-30 milibares.
1.2.2. Modo de operar

Pesar en el matraz de 3 bocas cerca de 100 g
del aceite neutralizado. Insertar el termmetro y el
agitador, volver a unir a la bomba de vaco y calentar hasta 90C agitndolo.
Mantener dicha temperatura, siempre bajo agitacin, hasta que el aceite que deba analizarse est
completamente liberado de su humedad (treinta
minutos aproximadamente).
Interrumpir entonces el vaco y aadirle 2 a 3 g de
tierra activada. Restablecer el vaco hasta obtener
una presin residual de 15-30 milibares y, siempre
con una temperatura de 90C, agitar durante 30
minutos a 250 vueltas por minuto aproximadamente.
Filtrar a continuacin en caliente en un bao termoesttico (50-60C).
ANEXO XIV
NOTAS COMPLEMENTARIAS 2, 3 Y 4 DEL
CAPTULO 15 DE LA NOMENCLATURA
COMBINADA
(Modificado por los Reglamentos (CE)
N 183/93, (CE) N 174/94, (CE) 656/95, (CE)
N 2472/97 y (CE) N 2248/98)
1. Nota 2A: Slo pertenecern a las partidas
nos 1509 y 1510 aceites que procedern exclusivamente del tratamiento de las aceitunas y cuyas
caractersticas analticas relativas al contenido de
cidos grasos y esteroles, establecidas mediante
los mtodos que figuran en los anexos V, X A y X B
del Reglamento (CEE) n 2568/91, sean las siguientes:
Cuadro I
Contenido de cidos grasos en porcentaje
de los cidos grasos totales
cidos grasos
cido mirstico
cido linolnico (1)
cido araqudico
cido eicosenoico
cido behnico (2)
cido lignocrico
Porcentajes
0,05
0,9
0,6
0,4
0,3
0,2
(1) 1,0 para los aceites de oliva virgen de las subpartidas 1509 10 10 y 1509 10 90 originarios de
Marruecos hasta el 31 de octubre de 2001.
(2) 0,2 para los aceites del n 1509
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M
Cuadro II
Contenido de esteroles en porcentaje
del total de esteroles
Esteroles
Colesterol
Brasicasterol (1)
Campesterol
Estigmasterol (2)
Beta-sitosterol (3)
Delta-7-estigmasterol
Porcentajes
0,5
0,1
4,0
< Campesterol
93,0
0,5
(1) 0,2 para los aceites de los cdigos NC 1510

(2) Condicin no vlida para el aceite de oliva virgen lampante (subpartida 1509 10 10) ni para el
aceite de orujo de oliva en bruto (subpartida
1510 00 10).
(3) Delta-5,23-estigmastadienol + clerosterol +
Beta-sitosterol + sitostanol + Delta-5 avenasterol + Delta 5,24-estigmastadienol.
No pertenecern a las partidas 1509 y 1510 los
aceites de oliva modificados qumicamente (en particular, los aceites reesterificados) ni las mezclas de
aceite de oliva con aceite de otro tipo. La presencia
de aceite de oliva reesterificado o de aceites de otro
tipo se determinar mediante el mtodo indicado en
el anexo VII del Reglamento (CEE) n 2568/91.
Nota 2B: Slo pertenecern a la subpartida
1509 10 los aceites de oliva definidos en los puntos I
y II siguientes, obtenidos nicamente por procedimientos mecnicos o por otros procedimientos fsicos, en condiciones, especialmente trmicas, que no
alteren el aceite, y que no hayan sido sometidos a
ms tratamiento que el lavado, la decantacin, el
centrifugado y la filtracin. Los aceites obtenidos a
partir de la oliva mediante solventes pertenecern a la
partida 1510.
I. Se considerar aceite de oliva virgen lampante, tal como figura en la subpartida 1509 10 10 y
cualquiera que sea su acidez, el aceite que presente:
a) un contenido de ceras no superior a
350 mg/kg;
b) un contenido de eritrodiol + uvaol no superior
a 4,5%;
c) un contenido de cidos grasos saturados en
la posicin 2 de los triglicridos no superior a un
1,3%;
d) la suma de ismeros transoleicos no superior
a un 0,10% y la suma de ismeros translinoleicos +
translinolnicos no superior a un 0,10%;
e) un contenido de estigmastadieno no superior
a 0,50 mg/kg;
f) una diferencia entre la composicin segn la
HPLC y la composicin terica de los triglicridos
de ECN42 no superior a 0,3;
y
g) una o varias de las siguientes caractersticas:
1) un ndice de perxido igual o superior a 20

meq de oxgeno activo/kg;
2) un contenido de disolventes halogenados
voltiles totales superior a 0,20 mg/kg o por lo
menos uno de ellos, superior a 0,10 mg/kg;
3) un coeficiente de extincin K270 superior a
0,25 y, tras el tratamiento del aceite con almina
activada, no superior a 0,11; en efecto, algunos
aceites con un contenido de cidos grasos libres,
expresado en cido oleico, superior a 3,3 g por
100 g podrn tener, tras el paso por almina activada, con arreglo al mtodo indicado en el Anexo IX
del Reglamento (CEE) N 2568/91, un coeficiente
de extincin K270 superior a 0,10; en ese caso, tras
la neutralizacin y decoloracin efectuadas en laboratorio con arreglo al mtodo indicado en el Anexo
XIII del Reglamento antes mencionado, debern
tener las siguientes caractersticas:
un coeficiente de extincin K270 no superior
a 1,20,
una variacin (K) del coeficiente de extincin
alrededor de 270 nm superior a 0,01 pero no a
0,16, es decir:
K = Km 0,5 (Km-4 + Km+4)
Km = es el coeficiente de extincin a la longitud de
onda del vrtice mximo de la curva de
absorcin alrededor de 270 nm,
Km-4 y Km+4 = son los coeficientes de extincin a
las longitudes de onda inferiores y
superiores en 4 nm a la de Km;
4) caractersticas organolpticas que revelen
defectos perceptibles con una intensidad superior
al lmite de aceptabilidad y con un resultado de anlisis sensorial inferior a 3,5 con arreglo a la puntuacin contemplada en el anexo XII del Reglamento
(CEE) n 2568/91.
II. Se considerar "otro aceite de oliva virgen", tal
como figura en la subpartida 1509 10 90, el aceite
de oliva que presente las siguientes caractersticas:
a) una acidez, expresada en cido oleico, no
superior a 3,3 g/100 g;
b) un ndice de perxidos no superior a 20 meq
de oxgeno activo/kg;
c) un contenido de ceras no superior a
250 mg/kg;
d) un contenido de solventes halogenados
voltiles totales no superior a 0,20 mg/kg y cada
uno de ellos con un contenido no superior a
0,10 mg/kg;
e) un coeficiente de extincin K270 no superior a
0,25 y, tras el paso del aceite por almina activada
no superior a 0,10;
f) una variacin del coeficiente de extincin (K)
en la zona de 270 nm no superior a 0,01;
g) caractersticas organolpticas que revelen
defectos perceptibles con una intensidad inferior al
lmite de aceptabilidad, con un resultado de anlisis
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sensorial igual o superior a 3,5, con arreglo a lo dispuesto en el anexo XII del Reglamento (CEE) n
2568/91;
h) un contenido de eritrodiol + uvaol no superior
a 4,5%;
ij) un contenido de cidos grasos saturados en
la posicin 2 de los triglicridos no superior a un
1,3%;
k) la suma de ismeros transoleicos no superior
a un 0,05% y la suma de ismeros translinoleicos +
translinolnicos no superior a un 0,05%;
l) un contenido de estigmastadienos no superior
a 0,15 mg/kg;
m) una diferencia entre la composicin segn la
de ECN42 no superior a 0,2.
Nota 2C: Pertenecer a la subpartida 1509 90
el aceite de oliva obtenido por tratamiento de los
aceites de las subpartidas 1509 10 10 y/o 1509 10
90, incluso con adicin de aceite de oliva virgen,
que presente las caractersticas siguientes:
a) una acidez, expresada en cido oleico, no
superior a 1,5 g/100 g;
b) un contenido de ceras no superior a
350 mg/kg;
c) un coeficiente de extincin K270 no superior a
1,0;
d) una variacin del coeficiente de extincin (K)
en la zona de 270 nm no superior a 0,13;
e) un contenido de eritrodiol + uvaol no superior
a 4,5%;
f) un contenido de cidos grasos saturados en la
posicin 2 de los triglicridos no superior a un
1,5%;
g) la suma de los ismeros transoleicos no superior a un 0,20% y la suma de ismeros translinoleicos + translinolnicos no superior a un 0,30%;
h) una diferencia entre la composicin segn la
de ECN42 no superior a 0,3.
52
Nota 2D: Se considerarn "aceites crudos", tal

como figuran en la subpartida 1510 00 10, los aceites, principalmente los aceites de orujo de oliva, que
presenten las siguientes caractersticas:
a) una acidez, expresada en cido oleico, superior
a 0,5 g/100 g;
b) un contenido de eritrodiol + uvaol igual o superior a un 12%;
c) un contenido de cidos grasos saturados en la
posicin 2 de los triglicridos no superior a un 1,8%;
d) la suma de los ismeros transoleicos no superior a un 0,20% y la suma de los ismeros translinoleicos + translinolnicos no superior a un 0,10%.
e) una diferencia entre la composicin segn la
HPLC y la composicin terica de los triglicridos de
ECN42 no superior a 0,6.
Nota 2E: Pertenecern a la subpartida 1510 00 90

los aceites obtenidos por tratamiento de los aceites
de la subpartida 1510 00 10, incluso con adicin de
aceites de oliva virgen, y los que no presenten las
caractersticas de los aceites contemplados en las
notas complementarias 2 B, 2 C y 2 D. Los aceites
de la presente subpartida deben tener un contenido
de cidos grasos saturados en la posicin 2 de los
triglicridos no superior a un 2,0%, la suma de ismeros transoleicos inferior a un 0,40% y la de los
ismeros translinoleicos + translinolnicos inferior a
un 0,35% y una diferencia entre la composicin
segn la HPLC y la composicin terica de los triglicridos de ECN42 no superior a 0,5.
2. Nota 3: Se excluirn de las subpartidas
1522 00 31 y 1522 00 39:
a) los residuos procedentes del tratamiento de
grasas que contengan aceite cuyo ndice de yodo,
determinado por el mtodo que figura en el anexo
XVI del Reglamento (CEE) n 2568/91, sea inferior a
70 o superior a 100;
b) los residuos procedentes del tratamiento de
grasas que contengan aceite cuyo ndice de yodo
est comprendido entre 70 y 100, pero en los que
la superficie del pico correspondiente al tiempo de
retencin de beta-sitosterol (1), determinada con
arreglo a lo dispuesto en el anexo V del Reglamento (CEE) n 2568/91, presenta menos del
93,0% de la superficie total de los picos de los
esteroles.
3. Nota 4: Los mtodos que debern aplicarse
para determinar las caractersticas de los productos
antes mencionados son los contemplados en los
anexos del Reglamento (CEE) n 2568/91. A tal fin,
tambin habr que tener en cuenta las notas a pie
de pgina del anexo I del citado Reglamento.
(1) Delta-5,23-estigmastadienol + clerosterol +
Beta-sitosterol + sitostanol + Delta-5-avenasterol +
Delta-5,24-estigmastadienol..
ANEXO XV
1. CONTENIDO EN ACEITE DE LOS
ORUJOS DE ACEITUNA
1.1. Material
aparato de extraccin apropiado tipo soxhlet,
provisto de un matraz de 200 a 250 ml,
bao por calefaccin elctrica (bao de arena,
bao de agua, etc.) o placa calefactora,
balanza analtica,
estufa regulada a 80C como mximo,
estufa de calefaccin elctrica provista de un
dispositivo de termorregulacin regulada a 103C
2C y que permita realizar una insuflacin de aire o
una presin reducida,
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triturador mecnico fcil de limpiar y que permita el triturado del orujo sin calentamiento y sin
disminucin sensible de su contenido en agua y en
aceite,
cartucho de extraccin y algodn hidrfilo o
papel filtro, exentos de productos extrables por el
hexano,
(Consultar Tarifa Panreac. Filtracin-Cartuchos
de extraccin)
desecador,
REACTIVO
n-hexano tcnico
criba con agujeros de 1 mm de dimetro,

piedra pmez en pequeos granos, previamente secada.
Recomendacin Panreac: 211835 Piedra
Pmez grnulos QP.
1.2. Reactivo
n-hexano tcnico cuyo residuo en evaporacin
completa deber ser inferior a 0,002 g para 100 ml.
Cdigo Denominacin
2. MODO DE OPERAR
2.1. Preparacin de la muestra para ensayo
Triturar la muestra para laboratorio, si fuera
necesario, en el triturador mecnico, previamente
bien limpio, para reducirla a partculas que puedan
atravesar completamente la criba.
Utilizar aproximadamente una vigsima parte de
la muestra para completar la limpieza del triturador,
tirar dicha mezcla, triturar el resto, recogerlo, mezclarlo con cuidado y analizarlo sin demora.
2.2. Toma de muestra
Pesar inmediatamente despus del triturado,
alrededor de 10 g de la muestra para ensayo con
una aproximacin de 0,01 g.
2.3. Preparacin del cartucho de extraccin
Colocar la toma de muestra en el cartucho y taparlo
con el tampn de algodn hidrfilo. En caso de
haber utilizado papel de filtro, envolver la muestra
molida en dicho papel.
2.4. Presecado
Cuando el orujo est muy hmedo (contenido en
agua y en materias voltiles superior al 10%), efectuar un presecado colocando durante un tiempo
conveniente el cartucho lleno (o el papel de filtro) en
la estufa calentada a 80C como mximo, para llevar el contenido en agua y en materias voltiles por
debajo del 10%.
2.5. Preparacin del matraz
Pesar con aproximacin de 1 g el matraz que
contenga 1 a 2 granos de piedra pmez, previamente secado en la estufa a 103C 2C y despus
enfriado durante al menos una hora en el desecador.
2.6. Primera extraccin
Colocar en el aparato de extraccin el cartucho
(o el papel de filtro) que contenga la muestra. Verter
en el matraz la cantidad necesaria de hexano.
Adaptar el matraz al aparato de extraccin y colocarlo todo sobre la placa calefactora. Llevar la calefaccin a tal estado que el caudal de reflujo sea al
menos de tres gotas por segundo (ebullicin moderada, no tumultuosa).

Despus de cuatro horas de extraccin, dejar
enfriar. Quitar el cartucho del aparato de extraccin
y colocarlo en una corriente de aire para eliminar la
mayor parte del disolvente que lo impregna.
2.7. Segunda extraccin
Vaciar el cartucho en el microtriturador y triturar
tan finamente como sea posible. Colocar de nuevo
cuantitativamente la mezcla en el cartucho y sta en
el aparato de extraccin.
Empezar de nuevo la extraccin durante dos
horas ms, utilizando el mismo matraz conteniendo
la primera extraccin.
La solucin obtenida en el matraz de extraccin
deber ser lmpida. Si no fuere as, filtrarla sobre un
papel de filtro lavando varias veces el primer matraz
y el papel de filtro con hexano. Recoger el filtrado y
el disolvente en un segundo matraz previamente
secado y tarado aproximadamente a 1 mg.
2.8. Eliminacin del disolvente y pesada del
extracto
Eliminar en el equipo de extraccin la mayor parte
del disolvente. Eliminar los ltimos restos de ste
calentando el matraz en la estufa a 103C 2C
durante 20 minutos. Facilitar dicha eliminacin, ya sea
insuflando aire de vez en cuando o preferiblemente un
gas inerte, o actuando bajo una presin reducida.
Dejar enfriar el matraz en un desecador durante
al menos una hora, y pesarlo con una precisin de
1 mg aproximadamente.
Calentar de nuevo 10 minutos en las mismas
condiciones, dejar enfriar en el desecador y pesar.
La diferencia entre los resultados de estas dos
pesadas deber ser inferior o igual a 10 mg, si no,
calentar de nuevo durante perodos de diez minutos
seguidos de enfriamiento y pesada, hasta que la
diferencia de peso sea, a lo sumo, de 10 mg. Seleccionar la ltima pesada del matraz.
Efectuar dos determinaciones.
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3.1. Modo de clculo y frmula
a) El extracto expresado en peso del producto
tal cual ser igual a:
100
S = m1 x
mo
donde: S
es el porcentaje en peso del

extracto del producto tal cual,
m0 es el peso, en gramos, de la
muestra,
m1 es el peso, en gramos, del extracto
seco.
Tomar como resultado la media aritmtica de las

dos determinaciones, si las condiciones de repetitividad se cumplen.
Expresar el resultado con un solo decimal.
b) El extracto se relacionar con la materia seca
utilizando la siguiente frmula:
100
S x = % grasa sobre extracto seco
100 U
donde: S
es el porcentaje en peso de extracto del producto tal cual ver a),

U es su contenido en agua y en
materias voltiles.
3.2. Repetitividad
La diferencia entre los resultados de las dos
determinaciones, efectuadas simultneamente o
rpidamente la una a continuacin de la otra mediante el mismo anlisis, no deber ser superior a 0,2 g
de extracto de hexano por cada 100 g de muestra.
En caso contrario, repetir sobre otras dos tomas
de muestra. Si esta vez la diferencia es de nuevo
superior a 0,2 g tomar como resultado la media aritmtica de las cuatro determinaciones efectuadas.
ANEXO XVI
DETERMINACIN DEL NDICE DE YODO
54
1. OBJETO
La presente norma internacional especifica un
mtodo para la determinacin del ndice de yodo de
las grasas y aceites animales y vegetales, en lo
sucesivo denominados grasas.
2. DEFINICIN
A los fines de la presente norma internacional,
se aplicar la definicin siguiente:
2.1 ndice de yodo: el peso de yodo absorbido
por la muestra en las condiciones de trabajo que se
especifican en la presente norma internacional.
El ndice de yodo se expresa en gramos de yodo
por 100 g de muestra.
3. PRINCIPIO
Disolucin de la muestra problema y adicin de
reactivo de Wijs. Una vez transcurrido el tiempo que
se especifica, adicin de solucin acuosa de yoduro
potsico y valoracin del yodo liberado con solucin de tiosulfato sdico.
4. REACTIVOS
Todos los reactivos sern de calidad analtica
reconocida.
4.1. Yoduro potsico, solucin de 100 g/l,
exento de yodatos o de yodo libre.
4.2. Engrudo de almidn.
Mezclar 5 g de almidn soluble con 30 ml de
agua, aadir esta mezcla a 1 000 ml de agua en
ebullicin, hervir durante 3 minutos y dejar enfriar.
4.3. Solucin volumtrica patrn de tiosulfato sdico.
c (Na2S2O3. 5H2O) = 0,1 mol/l, valorada como
mximo 7 das antes de su uso.
4.4
Disolvente, preparado mezclando volmenes iguales de ciclohexano y cido actico.
4.5. Reactivo de Wijs, que contenga monocloruro de yodo en cido actico. Se utilizar reactivo
de Wijs comercializado.
Nota: El reactivo contiene 9 g de ICl3 + 9 g de I
en cido actico.
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M
REACTIVO
cido actico
Almidn soluble
Ciclohexano
Engrudo de almidn
Solucin volumtrica patrn de tiosulfato sdico
Yoduro potsico, solucin de 100 g/l
Reactivo de Wijs
Cdigo Denominacin
131008 cido Actico glacial PA-ACS-ISO
121096 Almidn de Patata soluble PA
131250 Ciclohexano PA-ACS-ISO
283146 Almidn solucin 1% RV
181723 Sodio Tiosulfato 0,1 mol/l (0,1N) SV
171543 Potasio Yoduro solucin 10% p/v RE
281590 Reactivo de Wijs 0,1 mol/l (0,2N) RV
5. MATERIAL
Material ordinario de laboratorio y, en particular,
lo siguiente:
5.1. Navecillas de vidrio, apropiadas para la
muestra problema y que puedan introducirse en los
matraces (5.2).
5.2. Matraces erlenmeyer de 500 ml de capacidad con boca esmerilada, provistos de sus correspondientes tapones de vidrio y perfectamente
secos.
6. PREPARACIN DE LA MUESTRA
QUE DEBER ANALIZARSE.
Secar la muestra homogeneizada con sulfato
sdico y filtrarla.
7. PROCEDIMIENTO
7.1. Tamao de la muestra
El peso de la muestra vara en funcin del ndice
de yodo previsto, como se indica en el cuadro 1.
Cuadro 1
ndice de yodo
previsto
Peso de la muestra
problema
menos de 5
5 - 20
21 - 50
51 - 100
101 - 150
151 - 200
3,00 g
1,00 g
0,40 g
0,20 g
0,13 g
0,10 g
Pesar la muestra problema con precisin de

0,1 mg en una navecilla cpsula de pesadas de
vidrio 5.1.
7.2. Determinacin
Introducir la muestra problema en un matraz de
500 ml (5.2). Aadir 20 ml del disolvente (4.4) para
disolver la grasa. Agregar exactamente 25 ml del
reactivo de Wijs (4.5), tapar el matraz, agitar el contenido y colocar el matraz al abrigo de la luz. No
deber utilizarse la boca para pipetear el reactivo de

Wijs.
Preparar del mismo modo un ensayo en blanco
con el disolvente y el reactivo, pero sin la muestra
problema.
Para las muestras con un ndice de yodo inferior
a 150, mantener los matraces en la oscuridad
durante 1 hora; para las muestras con un ndice de
yodo superior a 150, as como en el caso de productos polimerizados o considerablemente oxidados, mantener en la oscuridad durante 2 horas.
Una vez transcurrido el tiempo correspondiente,
agregar a cada uno de los matraces 20 ml de solucin de yoduro potsico (4.1) y 150 ml de agua.
Valorar con la disolucin de tiosulfato sdico
(4.3) hasta que haya desaparecido casi totalmente
el color amarillo producido por el yodo. Aadir unas
gotas de engrudo de almidn (4.2) y continuar la
valoracin hasta el momento preciso en que desaparezca el color azul despus de una agitacin muy
intensa.
Nota: Se permite la determinacin potenciomtrica del punto final.
7.3. Nmero de determinaciones
Efectuar 2 determinaciones de la muestra problema.
El ndice de yodo se expresa del siguiente modo:
12,69 c (V1 V2)
p
siendo:
c : valor numrico de la concentracin exacta,
expresada en moles por litro, de la solucin
volumtrica patrn de tiosulfato sdico (4.3)
utilizada;
V1: valor numrico del volumen, expresado en
mililitros, de la solucin de tiosulfato sdico
(4.3) utilizada para el ensayo en blanco;
V2: valor numrico del volumen, expresado en
mililitros, de la solucin de tiosulfato sdico
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(4.3) utilizada para la determinacin;

p: valor numrico del peso, expresado en gramos, de la muestra problema (7.1).
Se tomar como resultado la media aritmtica
de las dos determinaciones, siempre que se cumpla
el requisito establecido con respecto a la repetibilidad.
ANEXO XVII
MTODO PARA LA DETERMINACIN DE
ESTIGMASTADIENOS EN LOS ACEITES
VEGETALES
1. OBJETIVOS
Determinacin de estigmastadienos en los aceites vegetales que presentan bajas concentraciones
de dichos hidrocarburos, particularmente en el aceite de oliva virgen y en el aceite de orujo de oliva sin
refinar.
2. APLICACIN
Se trata de una norma aplicable a cualquier
aceite de origen vegetal, teniendo en cuenta que
nicamente se obtendrn medidas fiables cuando
el contenido de estos hidrocarburos se halle incluido en un margen de 0,01 a 4,0 mg/kg. El mtodo
resulta especialmente adecuado para detectar la
presencia de aceites vegetales refinados (aceites de
oliva, orujo de oliva, girasol, palma, etc.) en el aceite
de oliva virgen, dado que los aceites refinados contienen estigmastadienos y los aceites vrgenes no.
3. FUNDAMENTO
Aislamiento de la materia insaponificable. Separacin de la fraccin de hidrocarburos esteroideos
mediante cromatografa en columna de gel de slice
y anlisis mediante cromatografa de gases en
columna capilar.
4. INSTRUMENTAL
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4.1. Matraces de 250 ml aptos para colocarles

un refrigerante de reflujo.
4.2. Embudos de decantacin con capacidad
para 500 ml.
4.3. Matraces de fondo redondo de 100 ml.
4.4. Rotavapor.
4.5. Columna de vidrio para cromatografa (1,52,0 cm de dimetro interno por 50 cm de longitud)
provista de una llave de tefln y con una torunda de
lana de vidrio o un disco de vidrio unterizado en el
fondo. Para preparar la columna de gel de slice se
vierte hexano en la columna de cromatografa hasta
que alcance una altura de aproximadamente 5 cm,

llenndose a continuacin con una papilla de gel de
slice en hexano (15 g en 40 ml) mediante la ayuda
de varias porciones de hexano. Se deja sedimentar
la mezcla en reposo, completndose la sedimentacin aplicando una ligera vibracin. Aadir sulfato
sdico anhidro hasta una altura de aproximadamente 0,5 cm y finalmente eluir el exceso de hexano.
de tefln. 20 mm ID x 400 mm longitud. 718002
Fibra de vidrio silanizada.
4.6. Cromatgrafo de gases equipado con
detector de ionizacin de llama, inyector con divisin de flujo o "cold on -column" y horno programable con precisin de 1C.
4.7. Columna capilar de slice fundida (0,25 o
0,32 mm de dimetro interno x 25 m de longitud),
recubierta con una pelcula de 0,25 m de espesor
de la fase 5%-fenilmetilsilicona.
Nota 1.
Pueden utilizarse otras columnas con polaridades similares o inferiores.
capilar para GC, OPTIMA 17, 25 m long., 0,25 mm
ID, 0,25 m espesor
4.8. Integrador-registrador con capacidad para
modo de integracin valle-valle.
4.9. Microjeringa de 5-10 l para cromatografa
de gases con aguja fija.
4.10. Calentador de tipo manta o placa elctrica.
5. REACTIVOS
Salvo indicacin en sentido contrario, nicamente se utilizarn reactivos de calidad para anlisis.
Debe emplearse agua destilada o de pureza al
menos equivalente.
5.1. Hexano o una mezcla de alcanos con un
intervalo de ebullicin de 65-70C, destilados en
columna rectificadora.
Nota 2.
El disolvente debe destilarse para eliminar impurezas.
5.2. Etanol de 96 v/v.
5.3. Sulfato sdico anhidro.
5.4. Solucin alcohlica de hidrxido potsico al
10%. Aadir 10 ml de agua a 50 g de hidrxido
potsico, agitar y diluir seguidamente la mezcla en
etanol hasta un volumen de 500 ml.
Nota 3.
La potasa alcohlica toma color marrn con el
tiempo. Debe prepararse diariamente y se almacenar en botellas de vidrio oscuro cerradas hermticamente.
5.5 Gel de slice 60 para columna de cromatografa, de 70-230 mallas (referencia 7734 de Merck
o similar).
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M
Recomendacin Panreac: 815330 Adsorbente
de slica 60, 0,063-0,2 mm.
Nota 4.
Por lo general, el gel de slice puede utilizarse
directamente a partir del envase sin necesidad de
tratamiento. Sin embargo, algunos lotes de slice
pueden presentar baja actividad produciendo separaciones cromatogrficas inadecuadas. Cuando ello
ocurra debe tratarse el gel de slice de la siguiente
manera: activar el gel calentndolo a 550C durante
un mnimo de cuatro horas. Tras el calentamiento
poner el gel de slice a enfriar en un desecador y
trasvasarlo a continuacin a un matraz con cierre
hermtico. Se aade seguidamente un 2% de agua
agitando hasta que dejen de verse grumos y el polvo fluya libremente.
Si algn lote de gel de slice origina cromatogramas con picos que interfieran, dicho gel ser sometido al tratamiento anteriormente mencionado. Puede considerarse como alternativa la utilizacin de gel
de slice 60 extrapuro (referencia 7754 de Merck).
REACTIVO
Etanol de 96 v/v
Etanol
Hexano
Hidrxido potsico
Sulfato sdico anhidro
Recomendacin Panreac: 711037.1000 POLYGOPREP 60-130, tamao part.63-200 m

5.6. Solucin madre (200 ppm) de colesta-3,5dieno (Sigma, 99 % de pureza) en hexano (10 mg
en 50 ml).
5.7. Solucin patrn de colesta-3,5-dieno en
hexano con una concentracin de 20 ppm, que se
obtiene diluyendo la solucin anterior.
Nota 5.
Si se mantiene la temperatura por debajo de
4C, las soluciones 5.6 y 5.7 permanecern inalteradas durante un mnimo de 4 meses.
5.8. Solucin de n-nonacosano en hexano con
una concentracin aproximada de 100 ppm.
5.9. Gas portador para cromatografa: helio o
hidrgeno de 99,9990 % de pureza.
5.10. Gases auxiliares para el detector de ionizacin de llama: aire purificado e hidrgeno de
99,9990 % de pureza.
Cdigo Denominacin
121085 Etanol 96% v/v PA
132063
121515
131716
6. METODOLOGA
6.1. Preparacin de la materia insaponificable:
6.1.1. Pesar 20 0,1 g de aceite en un matraz
de 250 ml (4.1), aadir 1 ml de solucin patrn de
colesta-3,5-dieno (20 g) y 75 ml de potasa alcohlica al 10%, colocar un refrigerante de reflujo y
calentar a ebullicin suave durante 30 minutos.
Retirar de la fuente de calor el matraz con la muestra y dejar enfriar ligeramente la solucin (el enfriamiento no debe ser total para evitar la decantacin
de la muestra). Aadir 100 ml de agua y pasar la
solucin a un embudo de decantacin (4.2) con
ayuda de 100 ml de hexano. Agitar enrgicamente
durante 30 segundos y dejar decantar.
Nota 6.
Si se produce emulsin, que no desaparece
rpidamente, aadir pequeas cantidades de etanol.
6.1.2. Pasar la fase acuosa inferior a un segundo
embudo de decantacin y someterla nuevamente a
extraccin con 100 ml de hexano. Separar nuevamente la fase inferior y lavar los extractos de hexano
(mezclndolos en otro embudo de decantacin)
con tres porciones de 100 ml cada una de una
n-Hexano PA-ACS
mezcla de agua y etanol (1:1) hasta obtener un pH

neutro.
6.1.3. Pasar la solucin de hexano a travs de
sulfato sdico anhidro (50 g), lavar con 20 ml de
hexano y evaporar a 30C y presin reducida en un
rotavapor hasta sequedad.
6.2. Separacin de la fraccin de hidrocarburos
esteroideos:
6.2.1. Introducir el residuo en la columna de
fraccionamiento con ayuda de dos porciones de
1 ml de hexano, distribuir la muestra en la columna
dejando que el nivel de solucin descienda hasta la
parte superior del sulfato de sodio y comenzar la
elucin cromatogrfica con hexano a un flujo aproximado de 1 ml/min. Desechar los primeros 25-30 ml
de eluido y recoger la fraccin siguiente de
40 ml. Despus, pasar esta fraccin a un matraz de
fondo redondo de 100 ml (4.3).
Nota 7.
La primera fraccin contiene los hidrocarburos
saturados (Figura 1a) y la segunda fraccin los esteroideos. Al proseguir con la elucin se obtiene
escualeno y otros compuestos relacionados. Para
poder obtener una buena separacin entre los
hidrocarburos saturados y los esteroideos, es nece-
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sario optimizar los volmenes de las fracciones. A

tal efecto se debe ajustar el volumen de la primera
fraccin de tal manera que cuando se analice la
segunda, los picos correspondientes a los hidrocarburos saturados sean bajos (Figura 1c); cuando
estos no aparezcan pero la intensidad del pico
correspondiente al patrn sea reducida, debe disminuirse el volumen. De todas formas, puesto que
no se produce solapamiento de los picos durante la
cromatografa de gases, no es precisa una separacin completa entre los componentes de la primera
y segunda fracciones siempre que las condiciones
de la CG estn ajustadas como se indica en 6.3.1.
Por lo general no es necesario optimizar el volumen
de la segunda fraccin, puesto que existe una buena separacin con los componentes que eluyen
posteriormente. Sin embargo, la presencia de un
pico importante a 1,5 min, aproximadamente, por
debajo del tiempo de retencin del patrn se debe
al escualeno y revela una mala separacin.
6.2.2. Evaporar la segunda fraccin en rotavapor a 30C y presin reducida hasta sequedad.
Disolver inmediatamente el residuo en 0,2 ml de
hexano y mantener la solucin en el refrigerador
hasta el momento de su anlisis.
Nota 8.
Los residuos 6.1.3 y 6.2.2 no deben mantenerse
en seco a temperatura ambiente. Una vez obtenidos, es necesario aadirles disolvente y almacenarlos en un refrigerador.
6.3. Cromatografa de gases
6.3.1. Condiciones de trabajo para inyeccin
con divisin de flujo.
temperatura del inyector: 300C,
temperatura del detector: 320C.
integrador-registrador: los parmetros de integracin deben ser fijados de tal forma que la evaluacin de las reas sea correcta. La modalidad de
integracin valle-valle es la ms recomendable,
sensibilidad: aproximadamente 16 veces la
atenuacin mnima,
cantidad de disolucin inyectada: 1l,
programacin de la temperatura del horno:
temperatura inicial constante de 235C durante 6
minutos, seguida de un aumento gradual de
2C/min hasta alcanzar 285C,
inyeccin con una divisin de flujo de 1: 15,
gas portador: helio o hidrgeno a 120 kPa de
presin.
Dichas condiciones pueden modificarse en funcin de las caractersticas del cromatgrafo y de la
columna con objeto de obtener cromatogramas
que respondan a los siguientes requisitos: Pico del
patrn interno situado con una aproximacin de 5
minutos en torno al tiempo citado en 6.3.2; el pico
del patrn interno alcanzar, como mnimo, un 80%
de la escala total.
El sistema de cromatografa de gases deber
comprobarse inyectando una mezcla de la solucin
madre de colestadieno (5.6) y de n-nonacosano

(5.8). El pico del colesta-3,5-dieno deber aparecer
antes que el del n-nonacosano (figura 1c); si esto
no ocurre, pueden adoptarse dos soluciones: reducir la temperatura inicial del horno o sustituir la
columna de cromatografa de gases por otra de
polaridad inferior.
6.3.2. Identificacin de picos
El pico del patrn interno aparece a un tiempo
de retencin de, aproximadamente, 19 minutos, y el
del estigmasta-3,5-dieno lo hace a un tiempo de
retencin relativo de aproximadamente 1,29 (figura
1b). El estigmasta-3,5-dieno suele ir acompaado
de pequeas cantidades de un ismero y, por lo
general, ambos originan un solo pico cromatogrfico. No obstante, si la columna es demasiado polar,
o tiene un gran poder de resolucin, el ismero
puede aparecer en forma de un pequeo pico justo
antes y cerca del estigmasta-3,5-dieno (figura 2). En
estos casos, es preciso sumar las reas de los dos
picos. Con el fin de estar seguro que los estigmastadienos eluyen como un solo pico se recomienda
sustituir la columna por otra de menor polaridad o
de mayor dimetro interior.
Nota 9.
Para obtener una referencia de los estigmastadienos puede utilizarse el anlisis de cualquier aceite vegetal refinado empleando menor cantidad de
muestra (de 1 a 2 g). Los estigmastadienos dan
lugar a un pico importante de fcil identificacin.
6.3.3. Anlisis cuantitativo
El contenido de los estigmastadienos se
determina aplicando la frmula
Ab x Mc
mg/kg de estigmastadienos =
Ac x Mo
en la cual:
Ab = rea del pico de estigmastadienos (si el
pico se halla dividido en dos picos,
smese el rea de los dos picos.).
Ac = rea del pico del patrn interno (colestadieno).
Mc = peso de patrn aadido, en microgramos.
Mo = peso de aceite empleado, en gramos.
Lmite de
0,01 mg/kg.
deteccin:
aproximadamente
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Figura 1
Cromatogramas procedentes del
anlisis de muestras de aceite de oliva
en columna capilar de slice fundida
(0,25 mm de dimetro interno x 25 m)
recubierta con una pelcula de 0,25 mm
de grosor de 5%-fenilmetilsilicona.
a) Primera fraccin (30 ml) de un
aceite virgen marcado con el patrn.
b) Segunda fraccin (40 ml) de un
aceite de oliva que contiene 0,10 mg/kg
de estigmastadienos.
c) Segunda fraccin (40 ml) que
incluye una pequea proporcin de la
primera.
Figura 2
Cromatograma procedente del anlisis de una muestra de aceite de oliva
refinado en una columna DB-5, en el
que se aprecia el ismero del estigmasta-3,5-dieno.
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ANEXO XVIII
(Reglamento (CE) N 2472/97, modificado por
Reglamento (CE) N 282/98)
DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE
TRIGLICRIDOS CON ECN42 (DIFERENCIA
ENTRE EL CONTENIDO TERICO Y LOS
DATOS OBTENIDOS POR HPLC)
1. OBJETO
Determinacin de la composicin de triglicridos
(TG) de los aceites de oliva, expresados en su nmero equivalente de carbonos (ECN) en funcin de las
diferencias existentes entre el contenido terico, calculado a partir de la composicin de cidos grasos,
y los resultados analticos obtenidos mediante cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC).
La presente norma es aplicable a los aceites de
oliva. El mtodo puede utilizarse para detectar la presencia de pequeas cantidades de aceites de semillas (ricos en cido linoleico) en todos los tipos de
aceites de oliva.
3. PRINCIPIO
El contenido terico de triglicridos con ECN42
(calculado sobre la base de la determinacin de la
composicin de cidos grasos mediante GLC) y el
contenido de triglicridos con ECN42 determinado
mediante HPLC se corresponden dentro de unos
lmites en el caso de los aceites puros. Las diferencias superiores a los valores establecidos en el
Reglamento respecto a cada tipo de aceite indican
que el aceite contiene aceites de semillas.
4. MTODO
El mtodo para calcular el contenido terico de
triglicridos con ECN42 y su diferencia respecto a
los datos obtenidos mediante HPLC consiste esencialmente en coordinar los datos analticos obtenidos
por otros mtodos. Pueden distinguirse tres fases:
determinacin de la composicin de cidos grasos
mediante cromatografa de gases en columna capilar, clculo de la composicin terica de triglicridos
con ECN42, y determinacin de los triglicridos con
ECN42 mediante HPLC.
60
4.1. Aparatos
4.1.1. Matraces redondos de 250 y 500 ml.
4.1.2. Vasos de precipitados de 100 ml.
4.1.3. Columna de cromatografa de vidrio, de
21 mm de dimetro interior y 450 mm de longitud,
con grifo y cono (hembra) normalizado en el extremo
superior.
4.1.4. Embudos de decantacin de 250 ml, con

cono (macho) normalizado en el extremo inferior,
para conexin con el extremo superior de la columna.
4.1.5. Varilla de vidrio de 600 mm de longitud.
4.1.6. Embudo de vidrio de 80 mm de dimetro.
4.1.7. Matraces aforados de 50 ml.
4.1.8. Matraces aforados de 20 ml.
4.1.9. Evaporador de rotacin.
4.1.10. Cromatografa de lquidos de alta resolucin, con control termosttico de la temperatura de
la columna.
4.1.11. Sistema de inyeccin de volmenes de
10 l.
4.1.12. Detector: refractmetro diferencial. La
sensibilidad de toda la escala deber ser como mnimo de 10-4 unidades de ndice de refraccin.
4.1.13. Columna de acero inoxidable de
250 mm de longitud y 4,5 mm de dimetro interior,
rellena de partculas de slice de 5 m de dimetro
con un 22-23% de carbono en forma de octadecilsilano (nota 2).
para HPLC, cartucho Chrom Cart, CC250/4.6 Lichrospher 100 RP18,5 m.
4.1.14. Registrador o integrador.
4.2. Reactivos
Los reactivos debern ser de calidad para anlisis. Los disolventes de elucin debern desgasificarse y podrn reciclarse varias veces sin que ello afecte a las separaciones.
4.2.1. ter de petrleo, 40-60C, grado cromatogrfico.
4.2.2. ter etlico, libre de perxidos, recin destilado.
4.2.3. Disolvente de elucin para la purificacin
del aceite por cromatografa en columna: mezcla de
ter de petrleo/ter etlico 87/13 (v/v).
4.2.4. Gel de slice, 70-230 mallas, tipo Merck
7734, con contenido de agua normalizado al 5%
(p/p).
4.2.5. Lana de vidrio.
4.2.6. Acetona.
4.2.7. Acetonitrilo.
4.2.8. Disolvente de elucin para HPLC: acetonitrilo + acetona (las proporciones se ajustarn para
obtener la separacin deseada; comenzar con una
mezcla de 50:50).
4.2.9. Disolvente de solubilizacin: acetona.
4.2.10. Triglicridos de referencia: pueden utilizarse triglicridos comerciales (tripalmitina, triolena,
etc.), en cuyo caso se reflejarn en un grfico los tiempos de retencin frente al nmero equivalente de carbonos, o bien cromatogramas de referencia correspondientes a aceite de soja, a una mezcla de aceite
de soja y aceite de oliva 30:70 y a aceite puro de oliva
(vanse las notas 3 y 4 y las figuras 1, 2, 3 y 4).
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M
REACTIVO
Acetona
Acetonitrilo
ter de petrleo, 40-60C,
grado cromatogrfico
ter etlico
Gel de slice, 70-230 mallas
Lana de vidrio
Tripalmitina
Cdigo Denominacin
361007 Acetona (UV-IR-HPLC) PAI
261881 Acetonitrilo (HPLC-isocrtico-preparativa)
PAI
361315 ter de Petrleo 40-60C (UV) PAI
362551
815330
211376
A10922
4.3. Preparacin de la muestra

Como pueden obtenerse falsos resultados positivos debido a la presencia de diversas sustancias
que interfieren, la muestra debe someterse siempre
a un proceso de purificacin segn el mtodo
IUPAC 2.507, relativo a la determinacin de las sustancias polares en los aceites oxidados.
4.3.1. Preparacin de la columna cromatogrfica
Llenar la columna (4.1.3) con aproximadamente
30 ml de disolvente de elucin (4.2.3); introducir un
poco de lana de vidrio (4.2.5), empujndolo hasta el
fondo de la columna con la varilla de vidrio (4.1.5).
Preparar en un vaso de precipitados de 100 ml una
suspensin con 25 g de gel de slice (4.2.4) en
80 ml de la mezcla de elucin (4.2.3) y transferirla a
la columna con ayuda de un embudo de vidrio
(4.1.6).
Para realizar la transferencia total del gel de slice a
la columna, lavar el vaso de precipitados con la
mezcla de elucin y pasar tambin los lquidos de
lavado a la columna.
Abrir el grifo de la columna y dejar que salga el
disolvente de ella hasta que su nivel se site aproximadamente 1 cm por encima del gel de slice.
4.3.2. Cromatografa en columna
Pesar, con la precisin de 0,001 g, 2,5 0,1 g
de aceite previamente filtrado, homogeneizado y, en
caso necesario, deshidratado, en un matraz aforado de 50 ml (4.1.7). Disolver en 20 ml aproximadamente de disolvente de elucin (4.2.3). Si es necesario, calentar ligeramente para facilitar la
disolucin. Enfriar a temperatura ambiente y enrasar
con el disolvente de elucin.
Introducir con una pipeta aforada 20 ml de solucin en la columna preparada como se indica en
4.3.1, abrir el grifo y hacer eluir el disolvente hasta el
nivel de la capa de gel de slice.
Eluir con 150 ml de disolvente de elucin (4.2.3),
regulando el flujo de disolvente a 2 ml por minuto
aproximadamente (de modo que pasen a travs de
la columna 150 ml en 60-70 minutos).
Recoger el eluido en un matraz redondo de 250 ml
ter Dietlico estabilizado con etanol

(UV-IR-HPLC) PAI
Adsorbente de slica 60, 0,063-0,2 mm
Lana de Vidrio lavada QP
Glicerol tripalmitato, 98%
(4.1.1) previamente tarado y pesado exactamente.

Eliminar el disolvente a presin reducida (Rotavapor)
y pesar el residuo que se utilizar en la preparacin
de la solucin para el anlisis por HPLC y en la preparacin de los steres metlicos.
Tras pasar por la columna, debe recuperarse
como mnimo un 90% de la muestra en el caso de
aceite de oliva de las categoras extravirgen, virgen
y refinado ordinario, mientras que en el de los aceites lampantes y de orujo los porcentajes de recuperacin no pueden ser inferiores al 80%.
4.4. Anlisis por HPLC
4.4.1. Preparacin de las muestras para el anlisis cromatogrfico
Preparar del siguiente modo una solucin al 5% de
la muestra que vaya a analizarse: pesar 0,5 0,001 g
de la muestra en un matraz aforado de 10 ml y
enrasar con el disolvente de solubilizacin (4.2.9).
4.4.2. Procedimiento
Instalar el sistema cromatogrfico. Bombear el
disolvente de elucin (4.2.8) a un ritmo de 1,5
ml/mn para purgar todo el sistema. Esperar hasta
que se obtenga una lnea de base estable. Inyectar
10 l de la muestra preparada como se indica en el
punto 4.3.
4.4.3. Clculo y expresin de los resultados
Utilizar el mtodo de normalizacin interna, es
decir, considerar que la suma de las superficies de
los picos correspondientes a los distintos triglicridos de ECN entre 42 y 52 es igual al 100%. Calcular el porcentaje relativo de cada triglicrido mediante la frmula siguiente:
% de triglicrido = superficie del pico x 100 /
suma de la superficies de los picos.
El resultado se expresa con, como mnimo, dos
decimales.
Nota 1: El orden de elucin puede determinarse
mediante el clculo del nmero equivalente de carbonos, que con frecuencia viene dado por la frmula ECN = CN-2n, siendo CN el nmero de carbonos
y n el nmero de enlaces dobles; puede calcularse
con mayor precisin teniendo en cuenta el origen
61
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del enlace doble. Si no, nl y nln son los nmeros de

enlaces dobles de los cidos oleico, linoleico y linolnico, respectivamente, el nmero equivalente de
carbonos puede calcularse mediante la frmula
siguiente:
ECN = CN dono dlnl dlnnln,
siendo do, dl y dln coeficientes que pueden calcularse mediante los triglicridos de referencia. En
las condiciones que se especifican en el presente
mtodo la frmula obtenida ser similar a la siguiente:
ECN = CN (2,60 no) (2,35 nl) (2,17 nln)
Nota 2: Ejemplos: Lichrosorb (Merck) RP18
Art 50333
Lichrosphere (Merck) 100 CH18
Art 50377 o equivalente.
para HPLC, cartucho Chrom Cart , CC250/4.6
Lichrospher 100 RP18,5 m.
Nota 3: Con varios triglicridos de referencia
tambin es posible calcular la resolucin con respecto a la triolena:
a= TR' / TR triolena
utilizando el tiempo de retencin reducido
TR' = TR TR disolvente.
La representacin grfica del log a frente a f
(nmero de enlaces dobles) permite determinar los
valores de retencin de todos los triglicridos de los
cidos grasos contenidos en los triglicridos de
referencia (figura 2).

Nota 4: La resolucin de la columna debe permitir separar claramente el pico de la trilinolena de los
picos de los triglicridos con un tiempo de retencin
prximo. La elucin se prosigue hasta el pico de
ECN52.
Nota 5: Para obtener un cromatograma que permita la medicin correcta de las superficies de
todos los picos de inters en la presente determinacin, es necesario que el segundo pico correspondiente a ECN50 tenga una altura igual al 50% de la
escala completa del registrador.
4.5. Clculo de la composicin de triglicridos
(% moles) a partir de los datos de GLC de cidos
grasos (% superficie)
4.5.1. Determinacin de la composicin de cidos grasos
La composicin de cidos grasos se determina
con arreglo al mtodo de cromatografa de gases
de la CEE que figura en el Anexo X A del Reglamento (CEE) n 2568/91, utilizando columna capilar. La
preparacin de los steres metlicos se realiza
segn el Anexo X B (solucin alcohlica de metilato
sdico).
4.5.2. cidos grasos considerados para el clculo
Los glicridos se agrupan en funcin de su
nmero equivalente de carbonos (ECN), teniendo
en cuenta las equivalencias que figuran a continuacin entre ECN y cidos grasos. Slo se han considerado los cidos grasos con 16 y 18 tomos de
carbono, ya que son los nicos importantes para el
aceite de oliva.
cido graso (AG)
Abreviatura
Peso molecular
(PM)
ECN
cido palmtico
cido palmitoleico
cido esterico
cido oleico
cido linoleico
cido linolnico
P
Po
S
O
L
Ln
256,4
254,4
284,5
282,5
280,4
278,4
16
14
18
16
14
12
4.5.3. Transformacin del % superficie en moles para todos los cidos grasos
% sup. P
moles P =
PM P
% sup. S
moles S =
PM S
% sup. Po
moles Po =
PM Po
62
(1)
% sup. O
moles O =
PM O
% sup. L
moles L =
PM L
% sup. Ln
moles Ln =
PM Ln
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4.5.4. Normalizacin al 100% de los cidos grasos
moles P * 100
% moles P (1,2,3) =
moles (P + S + Po + O + L + Ln)
moles S * 100
% moles S (1,2,3) =
moles Po * 100
% moles Po (1,2,3) =
moles O * 100
% moles O (1,2,3) =
(2)
moles L * 100
% moles L (1,2,3) =
moles Ln * 100
% moles Ln (1,2,3) =
El resultado proporciona el porcentaje de cada

cido graso en % moles en todas las posiciones (1,
2 y 3) de los TG.
A continuacin se calculan las sumas de los cidos grasos saturados (AGS) P y S y de los cidos
grasos insaturados (AGI) Po, O, L y Ln:
% moles AGS = % moles P + % moles S
% moles AGI = 100 % moles AGS
(3)
4.5.5. Clculo de la composicin de los cidos

grasos en las posiciones 2 y 1-3 de los TG
Los cidos grasos se distribuyen en tres grupos
del siguiente modo: dos idnticos para las posiciones 1 y 3 y uno para la posicin 2, con coeficientes
diferentes para los cidos saturados (P y S) y los
insaturados (Po, O, L y Ln).
4.5.5.1.
cidos grasos saturados en la posicin 2 [P(2)
y S(2)]
% moles P(2) = % moles P (1,2,3) * 0,06
% moles S(2) = % moles S (1,2,3) * 0,06
63
(4)
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4.5.5.2. cidos grasos insaturados en la posicin 2 [Po(2), O(2), L(2) y Ln(2)]

% moles Po(1,2,3)
% moles Po(2) = * [100 % moles P(2) % moles S(2)]
% moles AGI
% moles O(1,2,3)
% moles O(2) = * [100 % moles P(2) % moles S(2)]
% moles AGI
(5)
% moles L(1,2,3)
% moles L(2) = * [100 % moles P(2) % moles S(2)]
% moles AGI
% moles Ln(1,2,3)
% moles Ln(2) = * [100 % moles P(2) % moles S(2)]
% moles AGI
4.5.5.3. cidos grasos en las posiciones 1 y 3

[P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) y Ln(1,3)]
% moles P(1,2,3) % moles P(2)
% moles P(1,3) = + % moles P(1,2,3)
2
% moles S(1,2,3) % moles S(2)

% moles S(1,3) = + % moles S(1,2,3)
2
% moles Po(1,2,3) % moles Po(2)

% moles Po(1,3) = + % moles Po(1,2,3)
2
(6)
% moles O(1,2,3) % moles O(2)
% moles O(1,3) = + % moles O(1,2,3)
2
% moles L(1,2,3) % moles L(2)

% moles L(1,3) = + % moles L(1,2,3)
2
64
% moles Ln(1,2,3) % moles Ln(2)

% moles Ln(1,3) = + % moles Ln(1,2,3)
2
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4.5.6. Clculo de los triglicridos
4.5.6.1. TG con un cido graso (AAA; en este
caso, LLL, PoPoPo)
% moles A(1,3) * % moles A(2) * % moles A(1,3)
% moles AAA =
10 000
(7)
4.5.6.2.
TG con dos cidos grasos (AAB; en este caso,
PoPoL, PoLL)
% moles A(1,3) * % moles A(2) * % moles B(1,3) * 2
% moles AAB =
10 000
(8)
% moles A(1,3) * % moles B(2) * % moles A(1,3)
% moles ABA =
10 000
4.5.6.3. TG con tres cidos grasos diferentes

(ABC; en este caso, OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn)
% moles A(1,3) * % moles B(2) * % moles C(1,3) * 2

% moles ABC =
10 000
% moles B(1,3) * % moles C(2) * % moles A(1,3) * 2

% moles BCA =
10 000
(9)
% moles C(1,3) * % moles A(2) * % moles B(1,3) * 2

% moles CAB =
10 000
4.5.6.4. Triglicridos con ECN42

Los triglicridos siguientes con ECN42 se calculan segn las ecuaciones 7, 8 y 9, por orden previsto de elucin en HPLC (normalmente slo tres
picos).
LLL
PoLL e ismero de posicin LPoL
OLLn e ismeros de posicin OLnL y LnOL
PoPoL e ismero de posicin PoLPo
PoOLn e ismeros de posicin OPoLn y OLnPo
PLLn e ismeros de posicin LLnP y LnPL
PoPoPo
SLnLn e ismero de posicin LnSLn
PPoLn e ismeros de posicin PLnPo y PoPLn
Los triglicridos con ECN42 se obtienen mediante

la suma de los nueve triglicridos, incluidos sus ismeros de posicin. El resultado se expresa con,
como mnimo, dos decimales.
5. EVALUACIN DE LOS RESULTADOS
Se comparan el contenido terico calculado y el
determinado por HPLC. Si la diferencia entre los
datos de HPLC y los datos tericos es superior al
valor establecido para la categora correspondiente
de aceite en el Reglamento, la muestra contiene
aceite de semillas.
Nota: Los resultados se expresan con una cifra
decimal.
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6. EJEMPLO (Los numeros hacen referncia

a las secciones del texto del mtodo)
(4.5.1.) Clculo del porcentaje de moles de los
cidos grasos a partir de los datos obtenidos
mediante GLC (% superficie)
Los datos siguientes de la composicin de cidos grasos se obtienen mediante GLC:
AG
P
PM
256,4
% sup. 10,0
S
284,5
3,0
Po
O
L
Ln
254,4 282,5 280,4 278,4
1,0
75,0 10,0 1,0
0,01054 moles S * 100

% moles S(1,2,3) = = 2,944%
0,35822 moles
Vase frmula (2)
0,00393 moles Po * 100
% moles Po(1,2,3) = =1,097%
0,35822 moles
Vase frmula (2)
0,26549 moles O *100
% moles O(1,2,3) = =74,113%
0,35822 moles
(4.5.3.) Transformacin del % superficie en

moles para todos los cidos grasos
10
moles P = = 0,03900 moles P
256,4
Vase frmula (1)
3
moles S = = 0,01054 moles S
284,5
Vase frmula (1)
1
moles Po = = 0,00393 moles Po
254,4
Vase frmula (1)
75
moles O = = 0,26549 moles O
282,5
Vase frmula (1)
10
moles L = = 0,03566 moles L
280,4
Vase frmula (1)
1
moles Ln = = 0,003594 moles Ln
278,4
Vase frmula (1)
Vase frmula (2)

0,03566 moles L * 100
% moles L(1,2,3) = = 9,956 %
0,35822 moles
Vase frmula (2)
0,00359 moles Ln *100
% moles Ln(1,2,3) = =1,003 %
0,35822 moles
Vase frmula (2)
Total % moles = 100,0 %
Suma de los cidos grasos saturados e insaturados en las posiciones 1, 2 y 3 de los TG:
% moles AGS = 10,888% + 2,944% = 13,831%
Vase frmula (3)
% moles AGI = 100,000% 13,831% = 86,169%
Vase frmula (3)
(4.5.5.) Clculo de la composicin de cidos
grasos en las posiciones 2 y 1-3 de los TG
(4.5.5.1.) cidos grasos saturados en la posicin 2 [P(2) y S(2)]
% moles P(2) = 10,888% * 0,06 = 0,653% moles
Total = 0,35822 moles TG

Vase frmula (4)
(4.5.4) Normalizacin al 100% de los cidos
grasos
66
% moles S(2) = 2,944% * 0,06 = 0,177% moles

Vase frmula (4)
0,03900 moles P * 100

% moles P(1,2,3) = =10,888%
0,35822 moles
Vase frmula (2)
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(4.5.5.2.) cidos grasos insaturados en la posiciones 1 y 3 [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) y Ln(1,3)]
1,097%
% moles Po(2) = * (100 0,659 0,177) = 1,263 % moles
Vase frmula (5)
86,169%
74,113%
% moles O(2) = * (100 0,659 0,177) = 85,295 % moles
86,169%
Vase frmula (5)
9,956%
% moles L(2) = * (100 0,659 0,177) = 11,458% moles
86,169%
Vase frmula (5)
1,003%
% moles Ln(2) = * (100 0,659 0,177) = 1,154% moles
86,169%
Vase frmula (5)
(4.5.5.3.) cidos grasos en las posiciones 1 y 3

[P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) y Ln(1,3)]
10,888 0,659
% moles P(1,3) = + 10,888 = 16,005% moles
2
Vase frmula (6)
2,944 0,177
% moles S(1,3) = + 2,944 = 4,327% moles
2
Vase frmula (6)
1,097 1,263
% moles Po(1,3) = + 1,097 = 1,015% moles
2
Vase frmula (6)
74,113 85,295
% moles O(1,3) = + 74,113 = 68,522% moles
2
Vase frmula (6)
9,956 11,458
% moles L(1,3) = + 9,956 = 9,205% moles
2
Vase frmula (6)
1,003 1,154
% moles Ln(1,3) = + 1,003 = 0,927% moles
2
Vase frmula (6)
(4.5.6) Clculo de triglicridos

A partir de la composicin calculada de los cidos grasos en las posiciones sn-2 y sn-1,3 (vase
el siguiente cuadro):
AG en
P
S
Po
O
L
Ln
Suma
Posicin 1 y 3
16,005%
4,327%
1,015%
68,522%
9,205%
0,927%
100,0%
Posicin 2
0,653%
0,177%
1,263%
85,295%
11,458%
1,154%
100,0%
67
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Se calculan los triglicridos siguientes:

LLL
PoPoPo
PoLL con un ismero de posicin
SLnLn con un ismero de posicin
PoPoL con un ismero de posicin
PPoLn con dos ismeros de posicin
OLLn con dos ismeros de posicin
PLLn con dos ismeros de posicin
PoOLn con dos ismeros de posicin
(4.5.6.1.) TG con un cido graso (LLL, PoPoPo)
Vase frmula (7)
9,205% * 11,458% * 9,205%

% moles LLL = = 0,09708 mol LLL
10 000
1,015% * 1,263% * 1,015%
% moles PoPoPo = = 0,00013 mol PoPoPo
10 000
(4.5.6.2.) TG con dos cidos grasos (PoLL,SLnLn, PoPoL)
Vase frmula (8)
1,015% * 11,458% * 9,205% * 2

% moles PoLL + LLPo = = 0,02141
10 000
9,205% * 1,263% * 9,205%
% moles LPoL = = 0,01070
10 000
0,03211 mol PoLL
4,327% * 1,154% * 0,927% * 2
% moles SLnLn + LnLnS = = 0,00093
10 000
0,927% * 0,177% * 0,927%
% moles LnSLn = = 0,00002
10 000
0,00095 mol SLnLn
1,015% * 1,263% * 9,205% * 2

% moles PoPoL + LPoPo = = 0,00236
10 000
1,015% * 11,458% * 1,015%
% moles PoLPo = = 0,00118
10 000
0,00354 mol PoPoL
(4.5.6.3.) TG con tres cidos grasos diferentes (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn)
68
16,005% * 1,263% * 0,927% * 2

% moles PPoLn = = 0,00375
10 000
0,927% * 0,653% * 1,015% * 2
% moles LnPPo = = 0,00012
10 000
Vase frmula (9)
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M
1,015% * 1,154% * 16,005% * 2
% moles PoLnP = = 0,00375
10 000
0,00762 mol PPoLn
68,522% * 11,458% * 0,927% * 2
% moles OLLn = = 0,14577
10 000
0,927% * 85,295% * 9,205% * 2
% moles LnOL = = 0,14577
10 000
9,205% * 1,154% * 68,522% * 2
% moles LLnO = = 0,14577
10 000
0,43671 mol OLLn
16,005% * 11,458% * 0,927% * 2
% moles PLLn = = 0,03400
10 000
0,927% * 0,653% * 9,205% * 2
% moles LnPL = = 0,00111
10 000
9,205% * 1,154% * 16,005% * 2
% moles LLnP = = 0,03400
10 000
0,06911 mol PLLn
1,015% * 85,295% * 0,927% * 2
% moles PoOLn = = 0,01605
10 000
0,927% * 1,263% * 68,522% * 2
% moles LnPoO = = 0,01605
10 000
68,522% * 1,154% * 1,015% * 2
% moles OLnPo = = 0,01605
10 000
0,04815 mol PoOLn
ECN42 = 0,69540 mol TG
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Figura 1: Representacin grfica del log alfa frente a f (nmero de enlaces dobles)
Nota: La:cido lurico; My: cido mirstico; P: cio palmtico; St: cido esterico; O: cido oleico L: cido linoleico;
Ln: cido linolnico.
70
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M
Figura 2: aceite de soja
Figura 3: aceite de soja/aceite de oliva 30/70
Figura 4 : aceite de oliva
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Pgina 72
Relacin de reactivos
y productos auxiliares
Panreac que se utilizan
en los mtodos de
Anlisis de Aceites y
Grasas
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Pgina 73
M
361007
131007
261881
131881
131008
131019
131020
A17074
131030
131058
121096
283146
121100
A13805
361192
121221
121215
361250
131250
A11470
133606
162714
121085
361315
131315
132770
362551
281327
A10922
142061
A15139
362062
362063
132063
211376
361091
481091
362064
362006
211835
481457
121497
182146
181519
181517
121515
131542
171543
131090
281590
131659
181694
Acetona (UV-IR-HPLC) PAI

Acetona PA-ACS-ISO
Acetonitrilo (HPLC-isocrtico-preparativa) PAI
Acetonitrilo PA-ACS
Acido Actico glacial PA-ACS-ISO
Acido Clorhdrico 35% PA-ISO
cido Clorhdrico 37% PA-ACS-ISO
cido clico, sal sdica, 99%
cido Frmico 98% PA-ACS
Acido Sulfrico 96% PA-ISO
Almidn de Patata soluble PA
Almidn solucin 1% RV
Aluminio xido Bsico PA
Aluminio, virutas, 99+%
Benceno (UV-IR-HPLC) PAI
Calcio Cloruro anhidro, polvo PA
Calcio Cloruro 2-hidrato escoriforme PA
Ciclohexano (UV-IR-HPLC) PAI
Ciclohexano PA-ACS-ISO
Colesterol, 99+%
2',7'-Diclorofluorescena PA-ACS
Dimetilo Sulfato PS
Etanol 96% v/v PA
ter de Petrleo 40-60C (UV) PAI
Eter de Petrleo 40-60C PA-ISO
Eter Dietlico estabilizado con ~6 ppm de
BHT PA-ACS-ISO
(UV-IR-HPLC) PAI
Glicerol tripalmitato, 98%
Goma Arbiga polvo PRS
1,1,1,3,3,3-Hexametildisilazano, 98+%
n-Heptano (UV-IR-HPLC-HPLC preparativa) PAI
n-Hexano PA-ACS
Lana de Vidrio lavada QP
Metanol (UV-IR-HPLC-HPLC preparativa) PAI
Metanol seco (mx. 0,01% de agua)
DS-ACS-ISO
iso-Octano (UV-IR-HPLC) PAI
n-Pentano (UV-IR-HPLC) PAI
Piedra Pmez grnulos QP
Piridina seca (mx. 0,01% de agua)
DS-ACS
Potasio Cromato PA
Potasio Hidrxido 0,1 mol/l (0,1N)
etanlica SV
Potasio Hidrxido 0,5 mol/l (0,5N)
etanlica SV
Potasio Hidrxido 1 mol/l (1N) SV
Potasio Yoduro PA-ACS-ISO
Potasio Yoduro solucin 10% p/v RE
Reactivo de Wijs 0,1 mol/l (0,2N) RV
Sodio Cloruro PA-ACS-ISO
Sodio Hidrxido 0,1 mol/l (0,1N) SV
182415
131687
131699
131716
181723
131745
131252
A13651
131940
281760
Sodio Hidrxido 1 mol/l (1N) SV

Sodio Hidrxido lentejas PA-ACS-ISO
Sodio metal, barras PA-ACS
Sodio Tiosulfato 0,1 mol/l (0,1N) SV
Tolueno PA-ACS-ISO
Triclorometano estabilizado con etanol
PA-ACS-ISO
Trimetilclorosilano, 98+%
Tris (Hidroximetil) Aminometano PA-ACS
Verde de Bromocresol solucin 0,04% RV
815330.1
Adsorbente de Slica 60,

0,063 0,2 mm
704048
Cabina de visualizacin UV.
70234
Cpsula de aluminio con disco N 20
TB/oA color aluminio.
731829
Cartucho SPE, Slica gel,CHROMAFIX
400-SiOH, 400 mg
728032.46 Columna para HPLC, cartucho ChromCart, CC250/4.6 Lichrospher 100
RP18,5 m.
733056.25 Columna capilar de slica fundida (fase
no enlazada qumicamente) FS-SE-54
de 25 m de longitud, 0,25 mm de ID y
0,25 m de espesor de capa
733060.25 Columna capilar FS-CW 20 M, 25 m
long., 0,25 mm ID, 0,25 m espesor.
726022.25 Columna capilar para GC, OPTIMA 17,
25 m long., 0,25 mm ID, 0,25 m espesor
726089.60 Columna capilar para GC, OPTIMA240,
60 m long., 0,25 mm ID, 0,25 m espesor.
726785.50 Columna capilar OPTIMA 624,
50 m long., 0,25 mm ID, 1,40 m
espesor.
723310.10 Columna capilar para GC
PERMABOND SE-52 de 10 m de longitud, 0,32 mm de ID y 0,25 m de
espesor de capa.
710006
Columna de acero inoxidable con relleno
standard, 6' long., 1/8" OD, 2 mm ID.
727401
Columna para cromatografa "flash"
con adaptador y vlvula de tefln. 20
mm ID x 400 mm longitud
704050
Cubeta de desarrollo ranurada con
tapa 20x20 cm.
705103
Chromosorb recubierto con fase estacionaria Dietilenglicol succinato / 10%
en Chromosorb W-AW.
735120
Encapsuladora manual, N 20 para
tapones encapsulables de 20 mm ID.
718002
Fibra de vidrio silanizada.
923 501
pHmetro digital pH 300.
809013
Placa TLC. Slica gel standard. Vidrio
SIL G-25, 0,25 mm espesor, 20x20 cm.
711037.1000 POLYGOPREP 60-130, tamao
part.63-200 m
704054
Spray pulverizador.
70205.36 Vial encapsulable N 20-10 DIN, incoloro.
73
Panreac Aceites
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Pgina 74
Relacin de aditivos y
coadyuvantes
tecnolgicos para
uso alimentario
industrial
PANREAC QUIMICA, S.A., fabrica adems de
los reactivos para anlisis PANREAC, una lnea de
aditivos y coadyuvantes tecnolgicos para uso alimentario industrial, que cumplen las especificaciones de pureza prescritas por The Food Chemicals
Codex IV ed., complementadas con las exigencias
especficas prefijadas por la legislacin espaola y
comunitaria de la CEE.
En la relacin que sigue se indica denominacin
del producto, frmula y nmero de identificacin.
Para mayor informacin, solicite nuestro catlogo
ADITIO 2000.
74
Panreac Aceites
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Pgina 75
M
Cdigo
Producto
201003
204333
201007
201008
202342
201013
202034
202422
201014
201808
201018
201020
201019
202785
202512
Aceite de Vaselina
Acetofenona
Acetona
Acido Actico glacial
Acido Adpico
Acido L(+)-Ascrbico
Acido L-Asprtico
Acido DL-Asprtico
Acido Benzoico
Acido Ctrico anhidro
Acido Ctrico 1-hidrato
Acido Clorhdrico 37%
Acido Clorhdrico 35%
Acido Decanoico
Acido Esterico (mezcla de cidos
grasos)
Acido Etilendiaminotetraactico
Sal Disdica 2-hidrato
Acido Frmico 98%
Acido Frmico 85%
Acido orto-Fosfrico 85%
Acido Fumrico
Acido L-Glutmico
Acido L(+)-Lctico
Acido Lurico
Acido DL-Mlico
Acido Mirstico
Acido Nicotnico
Acido Octanoico
Acido Palmtico
Acido Propinico
Acido Srbico
Acido Succnico
Acido Sulfrico 95-98%
Acido Tnico
Acido L(+)-Tartrico
Agar
L-Alanina
DL-Alanina
Alcohol Benclico
Aluminio Amonio Sulfato
12-hidrato
Aluminio Potasio Sulfato
12-hidrato
Amonaco 30% (en NH3)
Amonaco 25% (en NH3)
Amonio Carbonato
Amonio Cloruro
Amonio Hidrgeno Carbonato
di-Amonio Hidrgeno Fosfato
Amonio di-Hidrgeno Fosfato
Amonio Hierro(III) Citrato pardo
Amonio Hierro(III) Citrato verde
Amonio Sulfato
L-Arginina
L-Arginina mono-Clorhidrato
201669
201030
201029
201032
202344
202042
201034
202368
202051
202591
203389
202786
202345
201810
201055
201883
201058
201065
201066
201792
202043
202035
201081
201102
201103
201130
201129
201119
201121
201116
201127
201126
202912
202028
201140
203464
204653
Sinnimos
Frmula
C8H8O
CH3COCH3
CH3COOH
(CH2CH2COOH)2
C6H8O6
C4H7NO4
C4H7NO4
C6H5COOH
C6H8O7
C6H8O7.H2O
HCl
HCl
C10H20O2
N de
identificacin
E-260
E-355
E-300
E-210
E-330
E-330
E-507
E-507
C18H36O2
Na2H2C10H12N2O8.2H2O
HCOOH
HCOOH
H3PO4
HOOCCHCHCOOH
C5H9NO4
CH3CHOHCOOH
C12H24 O2
C4H6O5
CH3(CH2)12COOH
C6H5NO2
C8H16O2
C16H32O2
CH3CH2COOH
C6H8O2
HOOCCH2CH2COOH
H2SO4
(CHOH)2(COOH)2
E-236
E-236
E-338
E-297
E-620
E-270
E-296
E-375
E-280
E-200
E-363
E-513
E-334
E-406
C3H7NO2
C3H7NO2
C6H5CH2OH
NH4Al(SO4)2.12H2O
AlK(SO4)2.12H2O
NH4OH
NH4OH
~(NH4)3(CO3)2H+NH2COONH4
NH4Cl
(Amonio Bicarbonato) NH4HCO3
(NH4)2HPO4
NH4H2PO4
(NH4)2SO4
C6H14N4O2
C6H15ClN4O2
E-523
E-522
E-527
E-527
E-503i
E-510
E-503ii
E-542ii
E-342i
E-381
E-381
E-517
75
Panreac Aceites
Cdigo
76
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Pgina 76
Producto
204109 L-Asparagina anhidra

202357 Benzolo Perxido humectado con
~25% de H2O
203977 D(+)-Biotina
201082 1-Butanol
201089 iso-Butanol
201429 Butanona
204233 2-ter-Butil-4-Metoxifenol
201202 n-Butilo Acetato
201211 Calcio Acetato x-hidrato
201212 Calcio Carbonato precipitado
201213 tri-Calcio di-Citrato 4-hidrato
201232 Calcio Cloruro 2-hidrato polvo
201214 Calcio Cloruro 6-hidrato
202824 Calcio Cloruro solucin 45% p/p
(en CaCl2.2H2O)
201818 Calcio Estearato
201224 Calcio Formiato
201228 tri-Calcio Fosfato
203290 Calcio D-Gluconato 1-hidrato
201225 Calcio bis-(di-Hidrgeno-Fosfato)
1-hidrato
201227 Calcio Hidrgeno Fosfato anhidro
201226 Calcio Hidrgeno Fosfato
2-hidrato
202400 Calcio Hidrxido, polvo
201230 Calcio Lactato 5-hidrato
203238 Calcio Propionato
201235 Calcio Sulfato 2-hidrato
201237 Carbn Activo polvo
202416 Carboximetilcelulosa
Sal Sdica baja viscosidad
Sal Sdica media viscosidad
Sal Sdica alta viscosidad
203645 L-Cistina
202825 2,6-Di-ter-Butil-4-Metilfenol
201286 1,2-Dicloroetano
201254 Diclorometano estabilizado
con amileno
201877 1-Dodecanol
201303 Estao(II) Cloruro 2-hidrato
201086 Etanol absoluto
201085 Etanol 96% v/v
202695 Etanol 70% v/v
201318 Etilo Acetato
201319 Etilo (S)-(-)-Lactato
202047 L-Fenilalanina
202728 D(-)-Fructosa
202060 Gelatina 80-100 Blooms
204819 Gelatina 220-240 Blooms
201339 Glicerina
202329 Glicerina 87%
201922 Glicerina tri-Acetato
201340 Glicina
Sinnimos
Frmula
N de
identificacin
C4H8N2O3
C14H10O4
C10H16N2O3S
C4H10O
C4H10O
(Metiletilcetona)
C4H8O
(BHA, Butilhidroxianisol) C11H16O2
C6H12O2
Ca(CH3COO)2.xH2O
CaCO3
Ca3(C6H5O7)2.4H2O
CaCl2.2H2O
CaCl2.6H2O
(Calcio Difosfato)
E-320
E-263
E-170i
E-333iii
E-509
E-509
~Ca(C18H35O2)2
C2H2CaO
~Ca3(PO4)2
C12H22CaO14.H2O
E-509
E-470a
E-238
E-341iii
E-578
CaH4(PO4)2.H2O
CaHPO4
E341i
E-341ii
CaHPO4.2H2O
Ca(OH)2
Ca(CH3CHOHCOO)2.5H2O
C6H10CaO4
CaSO4.2H2O
E-341ii
E-526
E-327
E-282
E-516
E-466
E-466
(BHT, Butilhidroxitoluol)
C6H12N2O4S2
C15H24O
ClCH2ClCH2
Cl2CH2
C12H26O
SnCl2.2H2O
CH3CH2OH
CH3CH2OH
CH3CH2OH
CH3COOC2H5
C5H10O3
C9H11NO2
C6H12O6
(Glicerol)
(Glicerol)
C3H8O3
C3H8O3
C9H14O6
H2NCH2COOH
E-466
E-921
E-321
E-512
E-422
E-422
E-1518
E-640
Panreac Aceites
21/10/99 09:24
Pgina 77
M
Cdigo
Producto
201341
203140
202061
201076
201509
D(+)-Glucosa
D(+)-Glucosa 1-hidrato
Goma Arbiga polvo
Hidrgeno Perxido 30% p/v
(100 vol.) estabilizado
Hierro(III) Fosfato x-hidrato
Hierro(II) Sulfato 7-hidrato
L-Histidina
L-Histidina mono-Clorhidrato
1-hidrato
Lactosa 1-hidrato
L-Leucina
D(+)-Limoneno
Magnesio Cloruro 6-hidrato
Magnesio Estearato
tri-Magnesio di-Fosfato
5-hidrato
Magnesio Hidrgeno Fosfato
3-hidrato
Magnesio Hidroxicarbonato
5-hidrato
Magnesio Oxido
Magnesio Sulfato 7-hidrato
Manganeso(II) Cloruro
4-hidrato
Manganeso(II) Sulfato 1-hidrato
D(-)-Manita
Metanol
Metilo Benzoato
Metilo-4-Hidroxibenzoato
4-Metil-2-Pentanona
Parafina P.F. 51-53C
en lentejas
Parafina P.F. 60-65C
Potasio Acetato
Potasio Bromato
Potasio Carbonato
tri-Potasio Citrato 1-hidrato
Potasio Cloruro
Potasio Disulfito
tri-Potasio Fosfato 1,5-hidrato
Potasio Hexacianoferrato(II)
3-hidrato
Potasio Hidrgeno Carbonato
di-Potasio Hidrgeno Fosfato
anhidro
di-Potasio Hidrgeno Fosfato
3-hidrato
Potasio di-Hidrgeno Fosfato
201486
201515
201524
201855
204321
Potasio Hidrgeno Tartrato

Potasio Hidrxido 85% lentejas
Potasio Nitrato
Potasio Nitrito
tetra-Potasio Pirofosfato anhidro
202515
201362
202045
202198
201375
202046
203385
201396
202029
201399
201927
201395
201276
201404
201410
201413
202067
201091
201949
203332
201430
203209
204621
201479
201487
201490
201492
201494
201522
201513
201505
201480
201512
202333
Sinnimos
Frmula
N de
identificacin
C6H12O6
C6H12O6.H2O
E-414
H2O2
FePO4.xH2O
FeSO4.7H2O
C6H9N3O2
C6H10ClN3O2.H2O
C12H22O11.H2O
C6H13NO2
C10H16
MgCl2.6H2O
~Mg(C18H35O2)2
(Magnesio
orto-Fosfato)
Mg3(PO4)2.5H2O
MgHPO4.3H2O
(Magnesio Carbonato) C4H2Mg5O14.5H2O

MgO
MgSO4.7H2O
MnCl2.4H2O
MnSO4.H2O
(Manitol)
C6H14O6
CH3OH
C8H8O2
C8H8O3
(Metil iso Butil Cetona) C6H12O
CH3COOK
KBrO3
K2CO3
K3C6H5O7.H2O
KCl
K2S2O5
K3PO4.1 1/2 H2O
(Potasio Ferrocianuro) K4Fe(CN)6.3H2O
(Potasio Bicarbonato) KHCO3
(di-Potasio
orto-Fosfato)
K2HPO4
(mono-Potasio
orto-Fosfato)
E-511
E-470b
E-343ii
E-504ii
E-530
E-518
E-421
E-218
E-261
E-924
E-501i
E-332ii
E-508
E-224
E-340iii
E-536
E-501ii
E-340ii
K2HPO4.3H2O
E-340ii
KH2PO4
(COO)2KH(CHOH)2
KOH
KNO3
KNO2
K4O7P2
E-340i
E-336i
E-525
E-252
E-249
E-450v
77
Panreac Aceites
Cdigo
21/10/99 09:24
Pgina 78
Producto
201729 Potasio Sodio Tartrato

4-hidrato
201531 Potasio Sorbato
201532 Potasio Sulfato
201533 Potasio Sulfito
201537 Potasio Tartrato 1/2-hidrato
201540 Potasio Yodato
201542 Potasio Yoduro
203646 L-Prolina
201545 1,2-Propanodiol
201090 2-Propanol
201962 Propilo Galato
201633 Sodio Acetato anhidro
201632 Sodio Acetato 3-hidrato
203865 Sodio L(+)-Ascorbato
201637 Sodio Benzoato
201648 Sodio Carbonato anhidro
202032 Sodio Carbonato 1-hidrato
201647 Sodio Carbonato 10-hidrato
201655 tri-Sodio Citrato 2-hidrato
201656 tri-Sodio Citrato 5 1/2-hidrato
201659 Sodio Cloruro
201698 Sodio Disulfito
202363 Sodio Dodecilo Sulfato
201681
201680
201697
201683
201665
201638
201654
tri-Sodio Fosfato 1-hidrato

tri-Sodio Fosfato 12-hidrato
Sodio Fosfinato 1-hidrato
Sodio L-Glutamato 1-hidrato
Sodio Hidrgeno di-Acetato
Sodio Hidrgeno Carbonato
di-Sodio Hidrgeno Citrato
1 1/2-hidrato
201679 di-Sodio Hidrgeno Fosfato anhidro
201678 di-Sodio Hidrgeno Fosfato
12-hidrato
201965 Sodio di-Hidrgeno Fosfato
1-hidrato
201677 Sodio di-Hidrgeno Fosfato
2-hidrato
201709 di-Sodio di-Hidrgeno Pirofosfato
201686 Sodio Hidrxido escamas
201687 Sodio Hidrxido lentejas
203307 Sodio Lactato solucin 50% p/p
201702 Sodio Nitrato
201703 Sodio Nitrito
201711 tetra-Sodio Pirofosfato anhidro
78
201710 tetra-Sodio Pirofosfato

10-hidrato
201684 Sodio Polifosfato
201716 Sodio Sulfato anhidro
201715 Sodio Sulfato 10-hidrato
201717 Sodio Sulfito anhidro
201720 Sodio Tartrato anhidro
201719 Sodio Tartrato 2-hidrato
Sinnimos
(Lauril Sulfato
Sdico)
(Sodio Diacetato)
(Sodio Bicarbonato)
(di-Sodio
orto-Fosfato)
(mono-Sodio
orto-Fosfato)
(tetra-Sodio
Difosfato)
(tetra-Sodio
Difosfato)
Frmula
NaK(COO)2(CHOH)2.4H2O
CH3(CHCH)2COOK
K2SO4
K2SO3
K2(COO)2(CHOH)2.1/2H2O
KIO3
KI
C5H9NO2
CH2OHCHOHCH3
CH3CH2CH2OH
C10H12O5
CH3COONa
CH3COONa.3H2O
C6H7NaO6
C6H5COONa
Na2CO3
Na2CO3.H2O
Na2CO3.10H2O
Na3C6H5O7.2H2O
Na3C6H5O7.5 1/2 H2O
NaCl
Na2S2O5
C12H25NaSO4
Na3PO4.H2O
Na3PO4.12H2O
NaH2PO2.H2O
C5H8NNaO4.H2O
CH3COONaCH3COOH
NaHCO3
N de
identificacin
E-337
E-202
E-515i
E-336ii
E-310
E-262i
E-262i
E-301
E-211
E-500i
E-500i
E-500i
E-331iii
E-331iii
E-223
E-339iii
E-339iii
E-621
E-262ii
E-500ii
C6H6Na2O7.1 1/2 H2O
E-331ii
Na2HPO4
E-339ii
Na2HPO4.12H2O
E-339ii
NaH2PO4.H2O
E-339i
NaH2PO4.2H2O
H2Na2O7P2
NaOH
NaOH
C3H5NaO3
NaNO3
NaNO2
E-339i
E-450i
E-524
E-524
E-325
E-251
E-250
Na4P2O7
E-450iii
Na4P2O7.10H2O
(NaPO3)6
Na2SO4
Na2SO4.10H2O
Na2SO3
Na2(COO)2(CHOH)2
Na2(COO)2(CHOH)2.2H2O
E-450iii
E-452i
E-514i
E-514i
E-221
E-335ii
E-335ii
Panreac Aceites
21/10/99 09:24
Pgina 79
M
201721 Sodio Tiosulfato 5-hidrato
Na2S2O3.5H2O
N de
identificacin
Cdigo
Producto
Sinnimos
Frmula
203064
201733
202475
202101
204644
202049
202048
201786
201788
201787
D(-)-Sorbita
Talco lavado
Tierra Silcea purificada y calcinada
Titanio(IV) Oxido
DL-a-Tocoferol
L-Triptfano
Vainillina
Zinc Oxido
Zinc Sulfato 1-hidrato
Zinc Sulfato 7-hidrato
(Sorbitol)
C6H14O6
E-420i
E-553b
TiO2
C29H50O2
C11H12N2O2
C8H8O3
ZnO
ZnSO4.H2O
ZnSO4.7H2O
E171
E-307
79
Panreac Aceites
21/10/99 09:24
Pgina 80
NOTAS
80
Panreac Aceites
21/10/99 09:24
Pgina 81
M
NOTAS
81
Panreac Aceites
21/10/99 09:24
Editado por:
PANREAC QUIMICA, S.A.
040 -15 - 1000 - 11/99.
Diseo:
Pere Duran
Impresin:
CENTRE TELEMTIC EDITORIAL
Dep. Legal:
B-21.701-99
SRL
Pgina 82

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Los ttulos de las 6 monografas son:

Anexo VI: Determinacin del contenido en

Anexo I: Caractersticas de los aceites

Anexo III: Determinacin del ndice de

Anexo VII: Determinacin de los cidos

Anexo IX: Prueba espectrofotomtrica en

Anexo VIII: Determinacin del porcentaje

Anexo IV: Determinacin del contenido

Anexo X "A": Anlisis de los steres

Anexo X "B": Preparacin de los steres

Principio del mtodo .................................. 48

Neutralizacin y decoloracin del aceite de

Anexo XIV: Notas complementarias 2, 3

Contenido en aceite de los orujos de aceituna

Anexo XVI: Determinacin del ndice

Anexo XVII: Mtodo para la determinacin

Anexo XVIII: Determinacin del contenido

Relacin de reactivos y productos

Relacin de aditivos y coadyuvantes

LA COMISIN DE LAS COMUNIDADES

(1) DO n 172 de 30. 9. 1966, p. 3025/66.

tarn determinados Estados miembros para crear

(3) DO n L 128 de 24. 5. 1977, p. 6.

El anlisis contradictorio ser realizado por el

1. Las caractersticas de los aceites, previstas en

Hasta el 28 de febrero de 1993 (modificado por

(5) Do n L 256 de 7. 9. 1987, p. 1.

3. Aceite de oliva virgen corriente

4. Aceite de oliva virgen lampante

5. Aceite de oliva refinado

7. Aceite de orujo de oliva crudo

8. Aceite de orujo de oliva refinado

9. Aceite de orujo de oliva

2. Aceite de oliva virgen

CARACTERSTICAS DE LOS ACEITES DE OLIVA

1. Aceite de oliva virgen extra

1. Aceite de oliva virgen extra

1.2.2. Solucin etanlica valorada de hidrxido potsico, = 0,1M o, en caso necesario,

Eter Dietlico estabilizado con ~6 ppm de BHT

Potasio Hidrxido 0,1 mol/l (0,1N) etanlica SV

Potasio Hidrxido 0,5 mol/l (0,5N) etanlica SV

Pesar la muestra en el matraz erlenmeyer (1.3.2)

6.4. Solucin acuosa de tiosulfato sdico

Potasio Yoduro PA-ACS-ISO

10 ml de cloroformo (6.1). Disolver rpidamente la

9. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS

Abrir un matraz (5.2) e introducir la navecilla de

El ndice de perxidos (I.P.), expresado en miliequivalentes de oxgeno activo por kg de grasa se

3.3.3. Detector de ionizacin de llama y convertidor-amplificador.

(6) En la Directiva consta errneamente como mm

5.1. Separacin de la fraccin de las ceras

n-Hexano (UV-IR-HPLC) PAI

ensayo (vase la nota). Mantener esta temperatura

6. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS

3.1. Matraz de 250 ml, provisto de refrigerante

3.10. Equipo de cromatografa de gases que

obtenidos de aceites que los contengan.

dos veces: con patrn interno y sin l, o hay que

dos extracciones de la fase acuosa por el mismo

con la microjeringa de 100 l, depositar 0,3 l de

velocidad del papel: 30 a 60 cm/hora,