UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS

FACULTAD DE CIENCIAS BSICAS E INGENIERIA

LABORATORIO DE BIOLOGA
GUIA DE LABORATORIO
PRACTICA N 3:

TECNICAS DE AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

OBJETIVOS O PROPOSITOS

Obtener colonias de bacterias en cultivo puro mediante la tcnica de estriado en agar

nutriente.
Obtener cultivos puros de hongos en agar PDA
Obtener colonias individuales a partir de la tcnica de diluciones.
Ejercitar tcnicas de trabajo asptico y manipulacin de microorganismos.

INTRODUCCIN

FUNDAMENTO TEORICO
En la naturaleza los microorganismos viven casi siempre en mezclas. No obstante para poder
determinar las caractersticas de microorganismos en particular, este debe ser aislado de un
cultivo puro. El procedimiento general consiste en usar un medio de cultivo y condiciones de
incubacin que estimulen el crecimiento que se desea y reduzca el crecimiento de los dems
componentes de la microbiota. Una vez que el organismo deseado ha aumentado en
cantidad, con respecto a otros, se purifica de modo que el cultivo contenga solo
microorganismos del tipo deseado, es decir cultivo axnico o puro.
El aislamiento se puede dar por las siguientes tcnicas:

Siembra en estra o siembra por agotamiento.

Siembra a partir de una serie de diluciones. Pueden ser:
Siembra en profundidad: Se usa 1 ml de inoculo y posteriormente se agrega el medio.
Siembra en superficie: Se usa 0,1 ml de inoculo y este se vierte sobre el medio de
cultivo previamente solidificado.
Siembra en sndwich: Se vierte una capa de agar sobre la caja petri, se adiciona la
muestra 1ml y posteriormente se aaden15 ml de agar. Se usa para microorganismos
lipolticos.

Tcnica de cultivo por enriquecimiento: El sustrato es especfico para el crecimiento del

microorganismo.

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MATERIALES Y REACTIVOS
MATERIALES Y EQUIPOS

CANTIDAD

SUSTANCIAS Y
REACTIVOS

CANTIDAD

Cajas Petri con agar PDA

Cajas Petri con agar Nutriente
Cajas Petri con agar King B
Tubos de ensayo con 9 ml de agua
peptonada 0,1% estril
Erlenmeyer con 90 ml de agua
peptonada 0,1% estril

2
2
3
3

Agar PDA
Agar Nutriente
Agar King B
Peptona universal

Para 250 ml
Para 250 ml
Para 250 ml
0,5 gr

Glicerina

De
acuerdo
al
requerimiento para
el agar King B

Pipetas
Pasteur
plsticas,
estriles
Pipetas de vidrio de 1ml
Asas redondas
Aguja de diseccin recta
Gradillas
Pipeteadores
Perlas de vidrio
Balanza

1
1
1
1
1
1
1 por el
curso
Nota: Es necesario contar con las cajas usadas en la prctica No 2. (Hongos y bacterias
crecidas.
Los estudiantes deben llevar una muestra de suelo frtil o compost con el fin de obtener
Pseudomonas fluorescens.

METODOLOGIA
Aislamiento de microorganismos por agotamiento y puncin
1. Desinfecte la superficie con papel absorbente y alcohol. Use guantes.
2. Encienda el mechero y disponga el material requerido.
3. Marque la colonia seleccionada para el aislamiento. Describa la colonia
macroscpicamente.
4. Marque la caja petri con agar nutriente y PDA teniendo en cuenta, nombre del medio,
fecha, cdigo de los estudiantes.
5. Siembre el Agar nutriente por medio por la tcnica de estriado agotamiento de la
muestra de la caja de Agar nutriente obtenida en la prctica anterior.
6. Lleve la caja sembrada a incubar de 24 a 48 horas a temperatura ambiente.

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7. Siembre la caja de Agar PDA por puncin con un asa recta, tomando como muestra
las cajas de PDA de la prctica anterior con crecimiento de hongos. Llevelo a incubar
de 24 a 48 horas a temperatura ambiente.
8. Despus de la incubacin verifique el crecimiento de las colonias en Agar Nutriente.
Describa las caractersticas macroscpicas de las colonias. Realice la misma
observacin con el Agar PDA.

3.4.2. Aislamiento de microorganismos por dilucin.

Tome la muestra de suelo y pese 10 gr y agrguela a un erlenmeyer con 90 ml de

agua estril. Rotule frasco con 100
Tome el frasco 100 . Con una pipeta Pasteur tome 1 ml y agrguelo a un tubo de
ensayo con 9ml de agua estril marcada con 10 -1, homogenice y repita el
procedimiento hasta llegar a la dilucin 10-4
Siembre la dilucin 10-3 en agar King B, adicionando 0,1ml de suspensin y agregue
las perlas de vidrio. Coloque la caja en el mesn y muvalas para permitir que las
perlas esparzan homogneamente la muestra sobre el medio.
Cerca del mechero destape la caja y vierta las perlas sobre el recipiente indicado.
Cierre inmediatamente la caja y lleve a incubar a 35C de 24 a 48 horas y realice el
conteo de colonias.
Para determinar la presencia de Pseudomonas fluorescens se realiza en presencia de
luz negra. Las colonias deben observarse con pigmentos fluorescentes.

Describa macroscpicamente todas las colonias aisladas del aislamiento a partir de

muestras de suelo.

Realice el recuento de colonias e informe como UFC/gr de suelo.

Cuente solo las colonias que presenten pigmentos.

Preguntas de complementacion
Se tiene un cultivo mixto con bacilos Gram positivos endoesporulados y
bacilos Gram positivos no formadores de endosporas. Como podra aislar
el bacilo formador de endosporas? Consulte una metodologa para este
tipo de microorganismos.
Qu tipo de mciroorganismos es posible aislar en el medio King B.
Por qu se observan pigmentos de fluorescencia en el King B y que
microorganismos lo producen.

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Cul es la importancia agroindustrial de Pseudomonas fluorescens?

BIBLIOGRAFIA
Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. 1997 Brock Biologia de los microorganismos.
Decima edicin. Prentice Hall, New Jersey.
Carrascal, A., Pez, A., Burbano, M.2003. Manual de laboratorio: Microbiologa de
alimentos. Ceja.
Manual de medios de cultivo Merck. Editorial Merck Alemana. 1994.