UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS FSICAS Y MATEMTICAS

DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA Y BIOTECNOLOGA

SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS:

RNA 16S COMO INDICADOR DE IMPACTO

Memoria para optar al Ttulo de Ingeniero Civil en Biotecnologa

PATRICIA ALEJANDRA CONTRERAS ARANEDA

Profesor Gua: Sr. Leandro Herrera Z.

2005

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS FISICAS Y MATEMATICAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUMICA Y BIOTECNOLOGA

SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS:

RNA 16S COMO INDICADOR DE IMPACTO

PATRICIA ALEJANDRA CONTRERAS ARANEDA

COMISION EXAMINADORA

CALIFICACIONES
Nota (N)

Nota (Letras)

PROFESOR GUIA:
SR.LEANDRO HERRERA
PROFESOR CO-GUIA:
SRA. BLANCA ESCOBAR
PROFESOR INTEGRANTE:
SR. CSAR SAZ

NOTA FINAL EXAMEN DE TITULO:

MEMORIA PARA OPTAR AL TITULO DE

INGENIERO CIVIL EN BIOTECNOLOGA
SANTIAGO DE CHILE
DICIEMBRE 2004

ii

Firma

Mami, esto es por ti y para ti.

Pelu

iii

"El estado del medio ambiente de cualquier pas

es un reflejo de la clase de gobierno que hay,
y sin buen gobierno no puede haber paz"
Wangari Maathai

iv

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar gracias a Rodri por todo su apoyo, tanto durante la memoria
como durante todos estos aos, lo logramos!!!.

Gracias a mis padres por haberme enseado a luchar en la vida, y a entender

que la educacin es la mejor herencia que me pudieron dejar. Gracias por sobre
todo a mi mami por haber estado ah en espritu apoyndome en estos aos de
universidad, y durante toda mi vida. A la Tante por su sabidura y su cario.
Esta memoria se la dedico a todos ustedes.

Gracias al profesor Leandro Herrera por su paciencia ante las miles de

inquietudes que tuve. A los profesores de la comisin, profesora Blanca
Escobar y profesor Csar Sez, por su paciencia ante los variados cambios de
enfoque del trabajo y constante apoyo en las decisiones tomadas durante el
transcurso de la memoria.

Finalmente debo dar gracias a todos aquellos que creyeron en mi y me dieron

todo su apoyo. Mil Gracias!!!

INDICE

Agradecimientos ..................................................................................................v
Resumen ........................................................................................................... vii
CAPITULO 1 . Introduccin ................................................................................ 9
1. 1 Propiedades del Suelo Natural............................................................... 11
1. 2 Suelos Contaminados ............................................................................ 14
1.2.1 Gestin ambiental del sitio contaminado .......................................... 19
1. 3 Biodiversidad y su importancia en el suelo............................................. 21
1. 4 El suelo como hbitat microbiano........................................................... 23
1.4.1 Fijacin de Nitrgeno ........................................................................ 25
1. 5 Suelos contaminados y microorganismos .............................................. 26
1. 6 Objetivos y Alcances .............................................................................. 29
1.6.1 Objetivo General: .............................................................................. 30
1.6.2 Objetivos Especficos:....................................................................... 30
1.6.3 Metodologa ...................................................................................... 30
1.6.4 Alcance de la memoria ..................................................................... 31
CAPITULO 2 . Identificacin de microorganismos ............................................ 32
2. 1 Diversidad Biolgica ............................................................................... 33
2.1.1 RNA ribosomal.................................................................................. 34
2.1.2 Reaccin de la Polimerasa en Cadena............................................. 38
2. 2 Tcnicas de anlisis de diversidad microbiana ...................................... 41
2.2.1 RFLP................................................................................................. 41
2.2.2 T-RFLP ............................................................................................. 42
CAPITULO 3 . Bacterias como indicador de impacto ....................................... 46
3. 1 Metodologa de evaluacin:.................................................................... 48
CAPITULO 4 . Discusiones y conclusiones ...................................................... 54
4. 1 Discusiones ............................................................................................ 54
4. 2 Conclusiones.......................................................................................... 57
CAPITULO 5 . Bibliografia ................................................................................ 59
Apndice A: Protocolos de anlisis................................................................... 66
Apendice B : Glosario de Abreviaciones........................................................... 72
Apndice C: Actividades y sus contaminantes relacionados ............................ 73
Apndice D: Seleccin de patrones segn ISO 10381 ..................................... 75

vi

RESUMEN

Considerando al suelo como el sustrato slido de la superficie de la tierra, en

que se desarrollan las principales actividades humanas (urbanas, agrcolas,
forestales, mineras, etc.), se estudiaron los fundamentos cientficos y
metodolgicos que permitiesen utilizar la biodiversidad como indicador de la
calidad de los suelos. El objetivo de esta memoria fue, entonces, estudiar la
utilizacin de la diversidad microbiana, medida con tcnicas moleculares (en
particular T-RFLP), como indicador biolgico de la sustentabilidad e impacto
ambiental de las actividades desarrolladas en los suelos.

Se observ que en los estudios acerca de la importancia del suelo para el

desarrollo de la sociedad, sea este entendido tanto como recurso econmico o
como fuente de alimento, no se suele enfatizar el rol que juegan los
microorganismos (microbiologa de suelos), ignorando as el principal factor de
aporte de los suelos a la sustentabilidad del planeta: el reciclaje de orgnicos y
la fijacin de inorgnicos.

La errnea gestin de instalaciones y procesos industriales ha llevado a la

contaminacin de los suelos en gran parte del mundo y Chile no ha sido una
excepcin. Esto se traduce en una prdida de calidad del suelo y sus funciones
e impacta directamente a las actividades que se desarrollan en l,
principalmente en la agricultura, el turismo y los recursos naturales; el impacto
sobre futuros proyectos destaca, precisamente, que el manejo de suelos ha
sido no sustentable hasta ahora.

La contaminacin de suelos est siendo abordado por la mayora de los pases

desarrollados y por las agencias internacionales con injerencia ambiental o

vii

comercial. Chile, que recientemente se ha convertido en un actor notable de la

comunidad internacional, se empieza a preocupar de los suelos, pero an no se
han decretado normativas especficas al respecto.
Se concluy que la posibilidad de evaluar la salud de un suelo a travs de su
riqueza y variedad de microorganismos es factible, pero se constat que las
tcnicas moleculares estn en pleno desarrollo y no es posible an obtener
resultados cuantitativos ni de buena reproducibilidad. Tampoco en el caso que
la investigacin en biodiversidad de suelos haya llegado a un consenso de
mtodos cuantitativos prcticos.

En este trabajo se propone que se realicen seguimientos anuales del impacto

sobre la biodiversidad en cada nuevo proyecto de inversin industrial, llevando
hacia el futuro la posibilidad de construir una lnea de base de la biodiversidad
en el pas.
.

viii

CAPITULO 1 . INTRODUCCIN

En el planeta ocurren una serie de flujos tanto energticos como de materia,

igual que en un proceso industrial, donde se distinguen flujos de entrada, de
salida, y desechos. La tierra acta como receptor de todos esos flujos,
convirtindose en una especie de fuente de materiales y de vertedero, como
tambin de reciclaje; ya que las materias primas provienen de la tierra, los
desechos van a ella, y se degradan naturalmente tambin ah. Sin embargo
estas capacidades del planeta son finitas, y en la actualidad estn siendo
sobreexplotadas por el ser humano.

Entendiendo lo anterior, Naciones Unidas en 1987, y mediante el informe de la

Comisin Mundial sobre Medio Ambiente y Desarrollo, el grupo de trabajo,
conocido como Comisin Brundtland, public el documento llamado Nuestro
Futuro Comn (Brundtland et al. , 1987). En este documento se adverta que la
humanidad deba cambiar las modalidades de vida y de interaccin comercial,
si no deseaba el advenimiento de una era con niveles de sufrimiento humano y
degradacin ecolgica inaceptables.
Se defini as el concepto de Desarrollo Sostenible que se refiere: "al desarrollo
que satisface las necesidades del presente, sin comprometer la capacidad para
que las futuras generaciones puedan satisfacer sus propias necesidades"
(Enkerlin, 2004).
Sin embargo, Daly (2004) expone que El desarrollo que no-crecimiento
sostenible supone una gestin de recursos renovables sometida a dos
principios: las tasas de recoleccin deben ser iguales a las tasas de
regeneracin (produccin sostenible) y las tasas de emisin de residuos deben
ser iguales a las capacidades naturales de asimilacin de los ecosistemas
donde se emiten los residuos. Los recursos no renovables se deben gestionar
9

de manera que su tasa de vaciado se limite a la tasa de creacin de sustitutos

renovables. Otros factores, como la tecnologa o la escala de la economa,
tambin tienen que armonizarse con el desarrollo sostenible y que las
capacidades de regeneracin y asimilacin deben ser consideradas como
capital natural. El no-mantenimiento de estas capacidades debe ser
considerado como consumo de capital y, por tanto, como no sostenible

De esta exposicin se deduce la importancia que tiene conservar la tierra, y en

particular sus capacidades tanto de vertedero como de reciclaje, ambas
estn relacionadas, como se ver mas adelante, con la existencia de
microorganismos, en particular en el suelo, lugar donde se realizan muchos de
los ciclos biogeoqumicos involucrados en las capacidades del planeta.

A continuacin se detalla la importancia del suelo y de los microorganismos

presentes en l, as como las consecuencias en las comunidades microbianas
expuestas a distintos tipos de contaminantes.

10

1. 1 PROPIEDADES DEL SUELO NATURAL

El suelo es un recurso natural definido generalmente como la capa superior de

la corteza terrestre, est formado por partculas de minerales, materia orgnica,
agua, aire y all nacen y se desarrollan miles de seres vivos, desde
microorganismos hasta plantas y animales superiores [COM 2002]. Los suelos
se clasifican en distintos tipos de acuerdo al porcentaje de cada uno de los
componentes mencionados. Segn el reporte sobre la proteccin del suelo de la
Comisin Europea, se pueden distinguir 320 tipos distintos de suelos en Europa
[COM, 2001].
Los suelos se constituyen en capas, llamadas horizontes1. Cada horizonte
difiere en una o ms caractersticas del superior o del inferior. Usualmente se
reconocen cinco tipos de horizontes. Los horizontes se observan en la figura 1,
y se detallan a continuacin, segn Castro-Lpez (2004) :

Horizonte O: primeros centmetros del suelo

Horizonte A: generalmente rico en materia
orgnica
Horizonte B: contiene elementos minerales
finos trasladados por la accin percolante del
agua. De coloracin ms intensa que el
horizonte superior
Horizonte C: formado por las fragmentaciones
de la roca madre
Finalmente se encuentra la roca madre pura
Figura 1: Horizontes del Suelo
Fuente: NRCS, USA
1

normalmente se nombra con la letra D.

No todos los horizontes se encuentran en todos los suelos

11

El suelo cumple un rol muy importante y esencial para el sustento de la vida en

este planeta. Segn la definicin de la Comisin para la Comunidad Europea
(2002) entre las propiedades del suelo estn:

Ser fuente de alimentos para la produccin de biomasa

Ser actuar como medio filtrante y buffer

Ser hbitat de miles de organismos

Ser el escenario donde ocurren los ciclos biogeoqumicos

Ser fuente de materia prima indispensable para el ser humano como los
minerales

Ser el lugar donde se realizan la mayora de las actividades humanas

como por ejemplo la agricultura y las actividades forestales

Dentro de las propiedades nombradas del suelo, est su capacidad de actuar

como tampn y de servir de acopio de materiales, ambas caractersticas
dependen

fuertemente

del

contenido

de

materia

orgnica

presente,

correspondiendo a la propiedad de vertedero antes nombrada. Esta propiedad

se aplica, no solo al agua, sino tambin a los minerales, gases e incluso a una
gran cantidad de sustancias qumicas, incluidos algunos contaminantes [COM,
2002]. Cuando la capacidad de almacenar del suelo, se ve sobrepasada,
ocurren muchos de los desastres naturales como son las inundaciones; en
particular cuando se excede la dosificacin de reactivos, o bien derrames, se
impide el correcto actuar de la capacidad tampn que presenta el suelo,
convirtindose en un riesgo para la salud no solo de las personas, sino tambin
de todos los organismos que dependen y viven en l.

12

Como se menciona, la materia orgnica2 es uno de los componentes centrales

del suelo y juega un rol muy importante, pues se encarga de mantener las
funciones del suelo, en particular la capacidad de resistir a la erosin y de
mantener la fertilidad del suelo. Adems de asegurar la capacidad tampn
mencionada y de adhesin que posee el suelo, primordial para limitar la difusin
de contaminantes.

El suelo adems es un medio rico en vida, con una gran diversidad de

microorganismos que viven en l, siendo esto central para todas las funciones
naturales que posee. La riqueza en diversidad otorga la estructura y fertilidad
del suelo, incluida la produccin de alimentos.

A pesar de haber sido considerado por muchos aos un recurso infinitamente

renovable, por su apariencia sana, el suelo superior es netamente un recurso
NO RENOVABLE, y actualmente posee altas tasas de degradacin y tasas
extremadamente lentas de regeneracin debido principalmente a la accin
humana.

La Comisin para la Comunidad Europea seala que est compuesta principalmente por una
mezcla de material orgnico, tanto races de plantas como heces de animales, microorganismos
y humus, siendo ste ltimo el producto final de la accin de los microorganismos del suelo.

13

1. 2 SUELOS CONTAMINADOS

Se

entiende

como

suelo

contaminado,

segn

muchos

organismos

internacionales3, aquel que represente una amenaza para la salud humana y el

medio ambiente, debido a las sustancias presentes en o bajo el suelo,
generalmente debido a un mal uso previo. Adems se puede decir que un sitio
contaminado segn Moraga (2003) es aquel con presencia de componentes
que no son atribuibles a la condicin natural del sitio. En Chile no existe una
normativa que indique la definicin de suelo contaminado; si bien existe un
consenso dentro de las autoridades de su significado, no hay ninguna definicin
oficial de este concepto.

La introduccin de contaminantes o material exgeno al suelo puede traducirse

en un dao o prdida de algunas o varias de las funciones antes mencionadas,
repercutiendo directamente en la calidad del suelo y su funcin. Adems no
solo perjudica al suelo, sino tambin puede tener implicancias en aguas
superficiales y subterrneas al ser arrastrados los contaminantes de ese lugar
ya sea por medio de lluvias o simple infiltracin. Adems la presencia de
contaminantes por sobre ciertos niveles implica mltiples consecuencias
negativas para la cadena alimenticia y por lo tanto para la salud humana.

Existe tambin un efecto esttico de la contaminacin, ms all de la prdida de

capacidad de soporte al crecimiento vegetal, que impacta negativamente sobre
el valor econmico, desde el punto de vista de la tasacin comercial, puesto
que el uso que se le dar a este suelo est restringido a la capacidad de ste, y
si est contaminado, su calidad y por tanto capacidad, se ve disminuida.

EPA Australia, Environmental Agency UK, entre otras

14

La contaminacin de suelos donde se desarrollan actividades industriales,

agrcolas y humanas en general, se debe principalmente a la inadecuada
gestin del mismo, la cual ha llevado a la disposicin deliberada o accidental de
desechos sobre l, tanto de materia orgnica, solventes o residuos peligrosos,
perjudicando a su vez cualquier actividad posterior relacionada con este
recurso, traducindose finalmente en un problema mundial de contaminacin de
los suelos.

La problemtica comenz a fines del siglo XIX, con la revolucin industrial, pues
una de las principales fuentes de contaminacin fueron las instalaciones
industriales tanto en operacin como despus de su cierre, las que causaron
derrames y filtraciones, tanto por accidentes o debido al mal manejo de las
operaciones.

Se pueden relacionar algunas actividades industriales con los contaminantes

comnmente encontrados en sus instalaciones, entre ellas se puede mencionar
la asociacin de industrias como la produccin de gas desde carbn,
manufactura de cueros y pieles, estaciones de servicio y refineras de petrleo,
entre otras, a la presencia de hidrocarburos como contaminantes. En el
Apndice C se mencionan los contaminantes encontrados normalmente en
terrenos industriales.

Esta ha sido una de las problemticas ambientales que ha sufrido mayor

crecimiento en los ltimos aos en comparacin con otras reas de los estudios
ambientales, debido principalmente a que el suelo haba sido considerado por
aos como un recurso renovable, sin embargo a medida que pasan los aos se
ha revertido este pensamiento, y hoy se considera al suelo como un recurso
esencialmente no renovable, debido principalmente a que presenta una rpida
degradacin

tambin

una

extremadamente

15

lenta

regeneracin.

Si

antiguamente se crea que depositar contaminantes o basura en el suelo era la

solucin para los desechos hoy se sabe que los nicos perjudicados al realizar
estas acciones son los propios seres humanos. Los slidos que se abandonan
ambientalmente siguen en reaccin, ya sea fsica, qumica o biolgica, que
finalmente lleva a la generacin de compuestos en fase acuosa que impactan el
suelo donde se han dispuesto.

La metodologa usada normalmente para detectar suelos contaminados, es

mediante anlisis qumicos. Hoy en da existe la intencin, tanto en el medio
cientfico, como en organizaciones internacionales y en los propios gobiernos
[Bchs, 2003a] [Duelli et al., 1998] [Bchs , 2003b] de usar indicadores
biolgicos, en particular para determinar la salud del suelo, en trminos de
fertilidad. Pues aluden a que riqueza de especies significa calidad de vida, no
solo enfocado en suelos contaminados sino en la salud de la tierra en su
conjunto. Estos indicadores biolgicos pueden ser comunidades biolgicas,
entendindose como cualquier organismo vivo presente en el lugar, o bien una
especie determinada.

En Europa, especficamente Inglaterra, existe un programa de Calidad del

suelo, donde se ha propuesto determinar la cantidad de sitios contaminados
presentes en el pas, de acuerdo a su Environmental Protection Act de 1990. En
el informe del ao 2002 [EA-UK, 2002] se haban identificado 33 sitios
contaminados, y su remediacin ha comenzado en alguno de ellos. El nmero
de sitios identificados puede ser muy bajo con respecto a las predicciones que
se estiman entre 300 mil y 1.5 millones de sitios, esto se debe a que la mayora
de las autoridades locales se hayan enfocadas en la preparacin de las
estrategias para evaluar los sitios mas que a la inspeccin de tales.

16

Chile, a su vez, comienza a seguir los pasos de la Comunidad Europea; en

estos momentos se realiza un estudio en la CONAMA para detectar los posibles
sitios contaminados, tambin llamados pasivos ambientales4, porque se les
entiende como una deuda con el pas (valor negativo). Sin embargo hasta el
momento no se conoce con exactitud la magnitud que puede tener este
problema en el pas [CONAMA, 2003].

En los estudios de contaminacin, no basta con detectar la presencia de

contaminantes sino que se han de definir los mximos niveles admisibles y
adems se han de analizar posibles factores que puedan influir en la respuesta
del suelo a los agentes contaminantes entre ellos la biodisponibilidad del
contaminante y su carga crtica. La primera variable corresponde a la
asimilacin del contaminante por los organismos, y en consecuencia la
posibilidad de causar algn efecto, negativo o positivo. La carga crtica
representa la cantidad mxima de un determinado componente que puede ser
aportado a un suelo sin que se produzcan efectos nocivos.

Actualmente se trabaja en la puesta en prctica de una correcta gestin

ambiental, de manera de evitar la disposicin de contaminantes a los suelos y al
ambiente en general y en una gestin de riesgo ambiental que est asociada al
estudio de suelos ya contaminados y evaluar el posible riesgo que presenta, as
como las medidas que se deben seguir para minimizar esos riesgos hasta un
nivel aceptable, de manera que el suelo quede en condiciones aceptables para
su posterior uso, cualquiera que ste sea. Es por esto, y por muchas otras
razones, que las grandes potencias han comenzado a preocuparse del tema,
privilegiando la salud del suelo, tendiendo a utilizar suelos ya urbanizados

La definicin de pasivo ambiental est en estudio por CONAMA, pero se refiere a la prdida
de valor o dao en alguno de los siguientes componentes: agua, aire, suelo, paisaje, flora,
fauna, biodiversidad, ecosistema y el dao o riesgo de dao sobre la salud de las personas,
producidos por una accin humana ( Hamel, 2000)

17

para las nuevas instalaciones de manera de crear el menor impacto tanto en el

suelo como en el medio ambiente, para lograr esto se implementa la
remediacin del suelo, de manera de poder ser reutilizado sin peligro alguno
para su posible uso como terreno residencial u otro fin necesario. Si bien esta
es una poltica principalmente Europea, en Chile tambin ocurre algo similar,
aunque en menor medida como es el terreno que posea la ENAP en Las
Salinas donde se debe remediar el sitio para la construccin de viviendas
habitacionales. Otro ejemplo es el gobierno ingles en fomentar la reutilizacin
de sitios contaminados que han sido previamente remediados, para que se
construyan en estos sitios la mayora de las nuevas casas y poblaciones,
incrementando el reuso a un 80% para fines del 2008 [EA-UK, 2002].

18

1.2.1 Gestin ambiental del sitio contaminado

La gestin de riesgo ambiental se basa en el estudio del riesgo debido a

contaminantes, en este caso, presentes en el suelo. El riesgo se define como la
probabilidad que una sustancia o situacin produzca un efecto adverso para
algn elemento sensible, a lo humano o ecolgico y/o econmico, bajo
determinadas condiciones de contacto.

Debido a las normativas de la limpieza de sitios contaminados en pases

desarrollados, se han desarrollado una serie de metodologas, propuestas
principalmente por la agencia estadounidense ambiental (EPA), para la correcta
caracterizacin y definicin del problema, as como las posibles tecnologas
aplicables para su remediacin. Segn la definicin de la EPA un sitio
contaminado (brownfield en ingls) es aquel que es una propiedad cuya
expansin, desarrollo o re-uso puede complicarse por la presencia, verdadera o
percibida, de alguna sustancia peligrosa o algn contaminante [EPA, 2003].

La gestin ambiental de un sitio incluye la recoleccin e interpretacin de

informacin histrica acerca de las actividades realizadas en ese lugar y de los
posibles niveles de contaminantes qumicos que puedan estar presentes en el
sitio [Zynda, 2000]. Para realizar esta gestin se siguen principalmente dos
pasos, la fase I, donde se evala la ocurrencia de contaminacin histrica y una
fase II donde la cantidad y extensin de contaminantes es determinada.

19

Fase I: incluye una investigacin histrica del sitio, que consiste en una
recopilacin histrica de los antecedentes del sitio, determinando las
actividades realizadas en l, as como inspeccionar directamente el lugar.
Luego de completar esta fase se puede definir si existen sustancias peligrosas
en la propiedad y seguir con la fase II, o bien no es necesario seguir otra
accin.

Fase II: El propsito de esta fase es descubrir y entender cuales son los
contaminantes presentes en el sitio, dnde se encuentran especficamente y en
qu niveles. Para esto se tiene una serie de metodologas analticas, que
testean la presencia de qumicos, as como la forma como se obtienen las
muestras que se desean evaluar. Existen varios mtodos para obtener
muestras y analizarlas, los cuales se pueden encontrar en la pgina de la
American Society of Testing and Materials (ASTM) (www.astm.org).

Las normas existentes en algunos pases desarrollados se basan en regular la

concentracin total del contaminante en el suelo. Sin embargo, hay acuerdo en
la comunidad cientfica que la concentracin total del contaminante en el suelo
no tiene relacin con su ecotoxicidad, sino que sta depende de su
biodisponibilidad, es decir la fraccin del contaminante efectivamente disponible
para los organismos.

La biodisponibilidad de un elemento en un suelo cualquiera, es una funcin

compleja de diversos parmetros fisicoqumicos del suelo y de parmetros
propios de los seres vivos presentes en el rea, muchos de los cuales an
estn siendo investigados, actualmente no existen an modelos que permitan
predecirla.

20

1. 3 BIODIVERSIDAD Y SU IMPORTANCIA EN EL SUELO

Se entiende por biodiversidad el conjunto de genes, especies, ecosistemas y

paisajes en un espacio determinado y en un momento dado, considerados en
sus interacciones jerrquicas sucesivas de genes a especies, ecosistemas y
paisajes y viceversa [Di Castri, 2003].

Segn la normativa chilena, en el artculo 2 letra a) de la Ley Base del medio

Ambiente se define biodiversidad como la variabilidad de los organismos vivos,
que forman parte de todos los ecosistemas terrestres y acuticos. Incluye la
diversidad dentro de una misma especie, entre especies y entre ecosistemas
[Ley 19300, 1994].

La biodiversidad es comnmente conocida en trminos de la gran variedad de

plantas, animales y microorganismos. Hasta el momento, han sido identificadas
alrededor de 1.75 millones de especies, la mayora pequeas criaturas como
los insectos, sin embargo los cientficos estiman que hay alrededor de 13
millones de especies distintas, dentro de un rango de 3 a 100 millones [CBD,
2000].

Segn Di Castri (2003) en la actual sociedad es la biodiversidad la que ofrece a

la humanidad los servicios ecolgicos esenciales: el reciclaje de los elementos
nutritivos y la descontaminacin natural de la tierra y del mar, la conservacin
de la calidad del agua, del suelo y del aire, la regulacin de los sistemas
climticos, los mecanismos de reproduccin de animales y plantas, incluyendo
la polinizacin, el control natural de las plagas y de las invasiones biolgicas, la
conservacin de los paisajes donde se incluyen adems todas las propiedades
del suelo, tal como se menciona en el primer capitulo de este trabajo. En este

21

sentido, esta percepcin corresponde a las funciones tanto fuente como

vertedero y reciclaje de Dal y al grupo de trabajo de la comisin Brundtland
(1987).

La biodiversidad promueve y da sustento a actividades econmicas en trminos

mundiales se estima que provee bienes y servicios que fluctan entre US$ 16 y
52 x 1012 anuales, equivalentes a alrededor de 2 veces el producto geogrfico
bruto de todas las economas del mundo combinadas [Constanza et al., 1997].

El papel fundamental de la biodiversidad es mantener el balance y permitir los

procesos funcionales del ecosistema como es el reciclaje. El desbalance que se
observa hoy en da en el planeta, se debe principalmente al mal uso que ha
dado el hombre a los recursos, principalmente en el tema de la biodiversidad.
Encontrndose en la actualidad una gran cantidad de especies en extincin y se
estima que si el uso irracional de los recursos prosigue, la tasa de extincin
aumentar notablemente en los prximos aos.

Hoy existe evidencia de que la base de recursos naturales y ambientales de la

tierra, de los cuales la diversidad gentica, las especies de animales y
vegetales y los ecosistemas forman una parte fundamental, se encuentra
sometida a distintos grados de estrs. Los ecosistemas son fuente de enormes
cantidades de bienes y materias primas provenientes de los distintos ambientes
naturales, que alimentan y hacen posible la actividad econmica de los pases.

22

Debido a lo anterior es que muchos pases como tambin organizaciones

ambientales estn trabajando en recopilar informacin sobre la calidad de los
suelos relacionado con la biodiversidad presentes en estos. Por ejemplo el
Reino Unido cuenta con su Programa para la Biodiversidad en el Suelo (The
Soil Biodiversity Programme) donde ya han dispuesto de 5.85 millones de libras
(alrededor de 11 millones de dlares), de manera de estudiar la biodiversidad y
entender su rol en el suelo.

1. 4 EL SUELO COMO HBITAT MICROBIANO

Tal como se mencion en las propiedades del suelo, los microorganismos

presentes en l son vitales para su fertilidad y para la degradacin de materia
orgnica y contaminantes en suelos y sedimentos [Von Beelen et al., 1997].
Estos microorganismos juegan un papel indispensable refirindose en particular
a sus roles en los ciclos biogeoqumicos, tanto del carbono, del nitrgeno como
de muchos otros elementos.

El crecimiento microbiano ms importante tiene lugar en la superficie de las

partculas del suelo [Madigan et al., 1999] normalmente en la rizosfera (regin
del suelo inmediata a la raz de vegetales superiores). Incluso un pequeo
agregado de suelo contiene microambientes muy diferentes, por tanto, podran
encontrarse diferentes tipos de microorganismos.

23

El recuento de bacterias siempre suele ser mayor en la rizosfera que en zonas

del suelo donde no se encuentran races. Esto de debe a que las races
secretan cantidades considerables de azucares, aminocidos, hormonas y
vitaminas estimulando un crecimiento intenso de bacterias y hongos. Se sabe
que tanto la abundancia como la diversidad de microorganismos en el suelo,
depende directamente del horizonte del suelo que se est estudiando.

Se estima que en un gramo de suelo en buen estado se puede encontrar hasta

600 millones de bacterias, correspondientes entre 15 mil y 20 mil especies
distintas [COM, 2001], aunque segn Ogram (1997) por cada gramo de suelo
hay alrededor de 4 mil especies de microorganismos. No as en suelos
desrticos donde el nmero de bacterias disminuye hasta 1 milln que se
distribuiran entre 5 y 8 mil especies.

Como se menciona en la introduccin de este trabajo los microorganismos

contribuyen de gran manera a la fertilidad del suelo, es decir, a su capacidad
para sostener el crecimiento de las plantas. Tpicamente en el hbitat del suelo
se encuentran de 106 a 109 bacterias por gramo de suelo, encontrndose ms
bacterias Gram positivas que en otros hbitats, si embargo predominan las
Gram negativas en nmeros absolutos, en la Tabla 1 se presentan las bacterias
ms representativas del suelo [Atlas, 2002]:

24

Tabla 1: Composicin de bacterias en el suelo

Especie

Arthrobacter

5-60

Bacillus

7-67

Pseudomonas

3-15

Agrobacterium

1-20

Alcaligenes

1-20

Flavobacterium

1-20

Corynebacterium

2-12

Micrococcus

2-10

Staphylococcus

<5

Xanthomonas

<5

Mycobacterium

<5

1.4.1 Fijacin de Nitrgeno

Muchos de los ciclos biogeoqumicos mencionados son realizados por bacterias
especializadas que no pueden ser reemplazadas por otras. Adems de su
importante participacin en actividades simbiticas, como es con la planta y la
fijacin de nitrgeno, resaltando as que la presencia de estos microorganismos
en el suelo permiten tener un suelo frtil. Por ejemplo la presencia de las
especies Streptomyces da el olor caracterstico al suelo, que se atribuye a un
suelo saludable.

25

La disponibilidad de formas fijadoras de nitrgeno es un importante limitante

factor tanto para la actividad microbiana en el suelo como para el crecimiento
de las plantas superiores, la presencia de estas especies permite el 60% de la
fijacin de nitrgeno que ocurre en la tierra [Madigan et al, 1999] .

Dentro de los principales organismos fijadores de nitrgeno se encuentran

bacterias como Azotobacter, Mycobacterium flavum, Azospirillum lipoferum,
Methylococcus, Thiobacillus y Rhizobium, entre otras.

1. 5 SUELOS CONTAMINADOS Y MICROORGANISMOS

La evaluacin del efecto que producen los contaminantes del suelo en los
microorganismos naturales presentes en l, ha recibido una atencin
considerable en los ltimos aos [Abbondanzi et al., 2003] .

Las comunidades microbianas presentes en suelos contaminados tienden a

estar dominadas por aquellas bacterias que pueden sobrevivir a la toxicidad
presente en el ambiente siendo capaces de utilizar al contaminante para crecer;
en este sentido el contaminante desbalancea, ms que toxifica, las
comunidades ecolgicas del suelo.

Segn Van Beelen (1997) los microorganismos resistentes a los contaminantes

presentes en su hbitat, suelo en este caso, normalmente fracasan en realizar
algunas de sus funciones ecolgicas especificas. Tericamente la diversidad
de especies presentes en el suelo puede ser un indicador de los efectos de la
contaminacin, en particular la aparicin de microorganismos resistentes a sta
en una comunidad, puede ser de utilidad al momento de decidir por un indicador
biolgico de impacto.

26

Segn estudios de Van Beelen (1997) sobre toxicidad, se sabe que algunos
grupos de microorganismos tienen la capacidad de ser ms resistentes a
contaminantes que otros, por ejemplo las bacterias Gram negativas son ms
resistentes en comparacin a las Gram positivas, en particular ante la presencia
de metales.

En el mismo trabajo se estudi y concluy, que la presencia de comunidades

resistentes a metales traa consigo serias consecuencias ecolgicas, pues
estas comunidades presentan bajas tasas de mineralizacin, su capacidad de
biodegradacin decrece as como su resistencia al fro.

Entre los microorganismos que normalmente se encuentran en un suelo

contaminado, con hidrocarburos, est la especie Pseudomonas en particular P.
putida. Esta bacteria pertenece a la subclase proteobacteria [Nelson et al.
2002], especficamente segn Yu (2000) corresponde a una proteobacteria y
asegura que la temperatura ptima para su crecimiento est en el rango de 15 a
22 C, pero observa que pueden crecer a rangos menores entre 4 y 22 C.
Psuedomona es una bacteria propia del suelo, y algunos linajes de esta especie
han

sido

considerados

como

potencial

bacteria

para

aplicaciones

biotecnolgicas como es la biorremediacin de suelos.

Tambin Cheungh y Kinkle (2001) lograron aislar Mycobacterias, que son

bacterias degradadoras de hidrocarburos policclicos (PAH); en este estudio
adems se observa la prdida de diversidad en funcin de la concentracin de
contaminante presente en el suelo. Es posible encontrar la presencia de
Pseudomonas sp., Stenotrophomnas matophilia y Rhodococcus erythropolis en
suelos contaminados con hidrocarburos del petrleo [Duarte et al., 2001].

27

Las bacterias del gnero Sphingomonas tambin son encontradas comnmente

en suelos con las caractersticas mencionadas. Recientemente se ha estudiado
la presencia de esta especie en suelos con distintas concentraciones del
contaminante donde se encontr que a mayor concentracin menor era la
diversidad presente de esta especie [Leys et al., 2004].

As tambin fue demostrado en el estudio de Duarte (2001) donde se observ

que si bien el nmero de bacterias no variaba con respecto a la presencia de
contaminantes, al realizar anlisis de las comunidades a travs de mtodos
moleculares, especficamente DGGE ( ver capitulo 3.2 Tcnicas de anlisis de
diversidad microbiana), se observa que a medida que aumenta la concentracin
de contaminantes en el suelo, el perfil de anlisis de la comunidad disminua.

Segn Duarte (2001) las comunidades microbianas tienden a responder ante la

presencia de contaminantes del petrleo, cambiando su estructura a una que
favorezca los organismos capaces de sobrevivir a las nuevas condiciones a
expensas de otros organismos que son reprimidas.

A raz de la degradacin natural que ocurre en los suelos ante la presencia de

contaminantes como los hidrocarburos, y la actuacin en este proceso que
realizan los microorganismos, en particular, las bacterias, es que se han llevado
a cabo una serie de estudios con respecto a la diversidad microbiana presente
en un sitio antes, durante y despus de su descontaminacin [Abed et al.,
2002][Flynn et al., 2000]. La mayora de estos anlisis se realizan a travs de la
utilizacin

de

tcnicas

moleculares,

como

las

que

se

mencionarn

posteriormente, especficamente, utilizando el gen de rRNA presente en el DNA

de las bacterias y el uso del fingerprinting por medio de T-RFLP. Estas
tcnicas moleculares son explicadas en mayor detalle en la seccin 3.2 de este
trabajo.

28

1. 6 OBJETIVOS Y ALCANCES
En este trabajo se estudiar la posibilidad de determinar en forma cualitativa la
presencia de contaminantes en el suelo, que se traduzca en un potencial riesgo.
Por ende, determinar si el suelo en estudio se encuentra o no contaminado. En
otros trminos, se busca determinar la salud de suelos en general.

En este trabajo se pretende estudiar el comportamiento de ciertas especies

microbianas, especficamente bacterias, presentes normalmente en el suelo
que sirvan como indicadores de contaminacin siendo necesario que estas
bacterias sean sensibles ante la presencia de contaminantes, especficamente
hidrocarburos, de manera de evaluar la biotoxicidad de estos contaminantes.
As se podr determinar la presencia o ausencia de contaminantes y proponer
un plan de acciones para seguir adelante con la remediacin o bien definir que
no hay posibilidad de riesgo ambiental debido a estos contaminantes.

Para esto ser necesario conocer las bacterias, y proponer un mtodo para su
identificacin y seguimiento en presencia de los contaminantes exgenos.

29

1.6.1 Objetivo General:

Estudio de mtodos de medicin de parmetros tiles para la evaluacin de
impacto ambiental en suelos mediante tcnicas de biologa molecular
1.6.2 Objetivos Especficos:
a) Estudiar suelos contaminados
b) Determinar importancia de biodiversidad en suelo
c) Definir parmetros a analizar
d) Revisar metodologas que permitan analizar la biodiversidad en suelos
e) Definir mtodos de control y factibilidad tcnica
f) Establecer metodologa para identificar impacto ambiental en suelos

1.6.3 Metodologa
Para alcanzar los objetivos se seguirn los siguientes pasos :
a) Revisin Bibliogrfica a nivel internacional de antecedentes generales sobre
la contaminacin de suelos
b) Revisin de artculos especializados sobre el tema de biodiversidad en
suelos contaminados.
c) Revisin bibliogrfica sobre mtodos de caracterizacin de microorganismos
en sitios contaminados con hidrocarburos.
d) Redaccin de propuestas de parmetros que podran normarse, por parte de
la autoridad, para controlar el impacto ambiental de un proyecto dado.

30

1.6.4 Alcance de la memoria

Se establecer una propuesta de norma, basada en una nueva metodologa de

evaluacin preliminar de sitios contaminados, como una alternativa ms
econmica y rpida a los anlisis qumicos. Aunque esta alternativa solo podra
llegar a indicar, por el momento, la presencia de contaminante y la composicin
biolgica del lugar, sin llegar a evaluar las concentraciones a las cuales podra
hallarse el contaminante en cuestin.

El mtodo se relacionar, si bien no cuantitativamente, con la conservacin de

la biodiversidad del suelo donde se instale un proyecto.

As tambin servira como antecedente de evaluacin del impacto de

instalaciones industriales sobre el terreno, de manera de poder realizar
actividades tempranas sobre la posible acumulacin de material contaminante
en el terreno, pues estos bioindicadores establecern la salud del suelo actual.
La base ser contrastar estos resultados con pruebas anteriores del mismo sitio
y as evaluar el impacto que ha tenido la actividad en el lugar.

31

CAPITULO 2 . IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS

Hasta la aparicin de tcnicas moleculares avanzadas, la forma de identificar

microorganismos se basaba en diferencias morfolgicas y actividades
especificas, como resistencia a antibiticos, las cuales se llevaban a cabo luego
de cultivar microorganismos presentes en su hbitat natural, sin embargo se
sabe que no es posible cultivar para aislar ms del 1% de los microorganismos
presentes en el suelo [Ritchie et al., 2000] [Muyzer, G., 1999].

Para estudiar una muestra conteniendo microorganismos sin utilizar mtodos de

cultivo se recurre a tcnicas moleculares. Por ejemplo, para calcular el nmero
total

de

microorganismos

presentes

en

el

medio

para

identificar

microorganismos se pueden teir con alguna de las variedades de las distintas

tinciones fluorescentes especificas para clulas vivas, como es el naranja de
acridina que tie el RNA y el DNA. Si se necesita identificar una sola especie,
incluso una cepa concreta de una especie dada, se utiliza la tincin con
anticuerpos fluorescentes especficos, en algunas ocasiones tambin puede
usarse como mtodo cuantitativo

Sin embargo una de los mejores procedimientos para la identificacin y

cuantificacin de microorganismos en la naturaleza es utilizando sondas de
cidos

nucleicos,

siendo

sta

un

pequeo

fragmento

de

cido

desoxirribonulcleco (DNA) o cido ribonucleco (RNA) complementario en la

secuencia de bases, a la parte de un gen con el cual puede hibridarse. A su
vez, utilizando un conjunto de sondas en muestras naturales, es posible
identificar diferentes especies en una misma muestra.

32

2. 1 DIVERSIDAD BIOLGICA

Debido al crecimiento en el rea molecular se utiliza hoy en da tanto para

clasificar como para identificar los microorganismos la subunidad ribosomal del
ARN (SSU rRNA) [Muyzer, 1999]. En particular, es posible estudiar la
biodiversidad utilizando las sondas para esta subunidad. El resultado es una
imagen filogentica de las especies presentes en la comunidad. Para resumir
los mtodos se basan en la extraccin total de DNA o RNA de representantes
de toda la comunidad y a continuacin mediante las sondas especificas de
cidos nucleicos, se obtiene clones de RNA ribosmico. Estos se consiguen por
la amplificacin de los genes RNA ribosmicos mediante la reaccin en cadena
de la polimerasa (PCR), o de manera indirecta , por la produccin de DNA
complementario (cDNA) del RNA ribosmico, que se lleva a cabo por la
transcriptasa reversa.

Hasta el momento segn indica Muyzer (1999), la manera ms exitosa de

estudiar la diversidad microbiana ha sido la clonacin de los fragmentos
amplificados del 16s rDNA y luego determinar las especies presentes en una
comunidad microbiana. Sin embargo, debido a que la clonacin requiere mucho
tiempo, debido a que es muy laboriosa, no se sugiere estudiar los cambios en
una poblacin microbiana por medio de este mtodo.

Para este propsito, estudiar la diversidad microbiana, uno de los principales

objetivos de la microbiologa ecolgica, se utilizan tcnicas como fingerprinting.
Estas tcnicas [Muyzer, 1999] entregan un patrn o un perfil de la diversidad de
la comunidad basada en la separacin fsica de los cidos nucleicos propios de
las especies presentes. Estos mtodos son rpidos y relativamente fciles de
llevar a cabo, pero lo ms importante es que permiten comparar la diversidad
gentica de las comunidades microbianas en hbitats muy dismiles. En la

33

seccin 3.2 se detallan las posibles tcnicas para estudiar comunidades

microbianas.

2.1.1 RNA ribosomal

Hay tres molculas de RNA ribosmico, que en las procariotas tienen una
medida5 de 5s, 16s y 23s. Las molculas de rRNA bacteriano de gran tamao,
que son el 16s y el 23s contienen aproximadamente 1500 y 29000 nucletidos,
respectivamente. Dado que el 16s es ms manejable que el 23S para la
experimentacin, se ha utilizado en la filogenia de los procariotas. [Madigan,
2000].

Los genes correspondientes al RNA ribosomal son tiles como marcadores

biolgicos por las siguientes razones [Microbial Ecology, 1999]
a) Son esenciales para la sntesis de protenas, estando presente en todos los
organismos
b) Contiene regiones variables y otras altamente conservadas, tanto en su
estructura primaria como secundaria
c) Parecen cambiar en su secuencia muy lentamente

En la figura 2 se observa la estructura secundaria del RNA ribosmico 16S

(rRNA) de Escherichia coli .

Las medidas se realizan en unidades Svedberg, indicadas con la letra S

34

Figura 2: Estructura secundaria RNA 16s de E.coli

Fuente: Herrera et al., 2000

La comparacin de las secuencias del rRNA 16S, ha facilitado la identificacin

de bacterias, incluyendo microorganismos no cultivables.

En la figura 3 se ilustra el procedimiento de secuenciacin del SSU 16S rRNA y

su posterior comparacin filogentica.

35

Figura 3: Metodologa de secuenciacin utilizada en la actualidad para la identificacin

de cualquier microorganismo.
Fuente: Herrera et al., 2000

Hoy en da, existen bases de datos como el Ribosomal Database Project, el

GenBank y el Laboratorio Europeo de Biologa Molecular (EMBL), las cuales
pueden consultarse libremente, para realizar una comparacin estadstica de
las secuencias obtenidas de un aislamiento, contra las que ya estn publicadas.

La secuenciacin del rRNA es el mtodo de eleccin para determinar relaciones

taxonmicas altas (arriba del nivel de genero). Debido a que la molcula de
rRNA 16S contiene regiones altamente variables, es usualmente posible
encontrar regiones de 20 a 30 bases que son completamente exclusivas de una
sola especie de bacterias [Madigan et al., 2000]

36

La manera de estudiar una comunidad microbiana se resume en la figura 4:

Comunidad
microbiana

Extraccin
DNA

Extraccin RNA

DNA total de la
comunidad

RNA total de la
comunidad

Multiplicacin por
medio de PCR de
los genes del RNA
16s

Copia, mediante
transcriptasa
reversa del RNA
16s

Clones del DNA

ribosmico

Secuenciacin y diseo
de un rbol filogentico
Figura 4: Resumen de un anlisis de comunidad microbiana
Fuente. Madigan et al., 2000

37

2.1.2 Reaccin de la Polimerasa en Cadena

De manera especifica, la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
se est usando para amplificar los genes del rRNA (es decir, el trozo de DNA
que codifica para el rRNA 16S) usando los moldes de los partidores obtenidos
sintticamente, complementarios de secuencias conservadas en el RNA. La
amplificacin mediante la PCR, del DNA que codifica el rRNA requiere de
menos material celular que la secuenciacin directa del rRNA. El gen del RNA
ribosmico6 16s se encuentra entre las posiciones 1671 y 3229 de la cadena H
del DNA mitocondrial y posee una longitud de 1559 nucletidos.

El mtodo hace uso de la enzima DNA polimerasa que copia molculas de DNA
[Mandigan et al., 2000],. Se requiere conocer la secuencia de nucletidos de
una regin del gen deseado. Esto es necesario porque para que funcione la
PCR

es

preciso

disponer

de

oligonucletidos

iniciadores

cortos,

complementarios de secuencias presentes en el gen.

Cada ciclo de PCR implica las siguientes etapas:

1. Desnaturalizacin por calor del DNA doble hebra que se desea amplificar
2. Enfriamiento para permitir el acoplamiento de los partidores especficos
con el DNA diana
3. Extensin de los partidores por accin de la DNA polimerasa

Fuente: http://www.lab314.com/mitocondria/rrnas/rRNA16s.htm

38

En la figura 5 se esquematiza el proceso y las etapas que ocurren en un ciclo

de PCR, as como el nmero de copias que se obtiene finalmente. En la figura
la enzima polimerasa est indicada como P.

Figura 5: Esquema procedimiento PCR

Fuente: Wikipedia, 2004

39

Se usa la Taq polimerasa, DNA polimerasa aislada de la bacteria termfila

Thermus aquaticus estable a 95C, la que no se ve afectada por el paso de la
desnaturalizacin empleado en el PCR. Su uso tambin increment la
especificidad de las reacciones pues el DNA es copiado a 72, donde raramente
ocurren la hibridacin inespecfica de los partidores con el DNA

La amplificacin por medio de PCR presenta la gran ventaja de poder obtener

suficiente material gentico para poder hacer anlisis posteriores. Tambin
presenta una serie de desventajas [Microbial Ecology, 1999] como las
siguientes:
a) Algunos genes de rRNA presentan preferencia de ser amplificados frente a
otros, todo depender de la calidad del primer utilizado
b) La amplificacin de mezclas de genomas conlleva a la formacin de
quimeras [Muyzer G., 1999] debido a la alineacin de fragmentos de
diferentes genes entre regiones altamente conservadas, crendose
fragmentos completos que finalmente indica presencia de organismos que
no estn presentes en la muestra
c) El nmero de copias de rDNA difiere en varios rdenes de magnitud
menores a las de rRNA, como tambin entre especies, producindose
finalmente una mala interpretacin de la cantidad de la especie presente en
la muestra

Todas las limitaciones son de carcter molecular de modo que desde un punto
de vista de los anlisis ambientales, se puede contar con la pronta aparicin de
partidores ms precisos y reproducibles.

40

2. 2 TCNICAS DE ANLISIS DE DIVERSIDAD MICROBIANA

En particular se pueden dividir entre aquellas que utilizan amplificacin,

llamadas mtodos indirectos, y las que no las utilizan siendo stos los mtodos
directos. Entre los primeros se encuentran diversos mtodos de separacin la
electroforesis en un gel con un gradiente denaturante, DGGE por sus siglas en
ingls (Denaturing gradient gel eletroforesis) o por gradiente de temperatura
(TGGE), aquellas que utilizan enzimas de restriccin como RFLP (restriction
fragment

length

polimorfism)

tambin

llamada

anlisis

de

fragmentos

ribosomales de DNA amplificados ( ARDRA por sus siglas en ingls) o bien TRFLP ( terminal restriction fragment length polimorfism), entre otros. En esta
seccin se explicar en detalles en que consisten las dos ltimas tcnicas
sealadas.

2.2.1 RFLP

Como se mencion esta tcnica consiste en el anlisis de fragmentos

amplificados por medio de PCR. Ha sido utilizada para caracterizar
comunidades microbianas y cambios en la composicin de una comunidad
frente a cambios ambientales, como por ejemplo presencia de contaminantes
en el medio.

Los fragmentos son generados por medio de PCR usando partidores

universales, luego estos fragmentos son digeridos con enzimas de restriccin,
los cuales se cargan en un gel de agarosa o poliacrilamida, que ha sido teido
con bromuro de etidio para poder visualizar los fragmentos de DNA.[Muyzer,
1999]

41

Uno de los problemas que presenta esta tcnica es que los fragmentos
observados en el gel de agarosa, es decir el nmero de bandas en el perfil
entregado es mayor al nmero de fragmentos de DNA amplificados,
estimndose un nmero de miembros de la comunidad mayor al realmente
presente en ella.

2.2.2 T-RFLP

Esta tcnica posee un principio muy similar al descrito anteriormente para RFLP
o ARDRA, pero hace uso de fragmentos marcados con fluorescencia que
tambin han sido amplificados por medio de PCR. Estos productos han sido
marcados en su terminal durante la amplificacin con PCR utilizando un partidor
fluorescente. Los genes amplificados son posteriormente separados en un gel
de electroforesis, luego visualizados por medio de la excitacin del compuesto
fluorescente identificando peaks de fluorescencia y correlacionndolo con la
abundancia de le especie, por ltimo pueden ser secuenciados en un
secuenciador automtico. Y solo se detectan las bandas fluorescentes, es decir
el fragmento terminal de la digestin con enzimas de restriccin. Evitndose as
el mayor problema descrito para RFLP .[Muyzer, 1999]. La figura 6 esquematiza
el procedimiento descrito.

42

Figura 6: Procedimiento del mtodo T-RFLP

Fuente: Michigan State University

Las ventajas de este mtodo segn Muyzer (1999) son:

a) La alta resolucin de la separacin en un secuenciador automtico de DNA
b) El uso de marcadores con diferente fluorescencia, permitiendo un anlisis y
comparacin entre muestras
c) La posibilidad de cuantificar bandas o peaks por intensidad de fluorescencia

Una de las desventajas ms grandes es el alto costo de la secuenciacin

automtica, es por esto que muchas veces solo se analiza el patrn de
fluorescencia entre bandas y el tamao del fragmento, encontrndose patrones
como se muestran en la figura 7. Donde en el eje y se encuentra la intensidad
de la fluorescencia del fragmento. Este caso la digestin se ha realizado con la
enzima HaeIII.

43

Figura 7: Perfil fragmentos T-RFLP

Sin embargo no es lo nico, estudios recientes han demostrado que la

acumulacin de productos amplificados por PCR puede llevar a obtener
grandes sesgo en los anlisis posteriores, entregando proporciones erradas en
la composicin de la comunidad original, principalmente debido a las
desventajas que presenta la utilizacin de PCR como mtodo de amplificacin,
desventajas que han sido analizadas anteriormente al explicar el procedimiento
de amplificacin en la seccin 2.1.2 no se podra hablar de cuantificar especies
presentes en una comunidad como se puede inferir en el punto c) anterior. Para
cuantificar algunos autores proponen utilizar PCR pero con un mnimo nmero
de ciclos de manera de evitar dichos errores [Suzuki et al., 2000].

Esta tcnica ha sido utilizada para el anlisis de muchas comunidades

microbianas tanto en ambientes acuticos como en suelos contaminados con
metales como el mercurio [Bruce, K., 1997]. A su vez ha sido utilizada y
perfeccionada de manera de evitar los errores tipo II [Blackwood et al., 2003],
los cuales ocurren cuando al analizar no se encuentran diferencias entre los
perfiles de fluorescencia, cuando en realidad si existen.
44

Al ser secuenciados los fragmentos, pueden posteriormente ser analizados para

obtener un rbol filogentico, utilizando alguna base de datos que contenga
secuencias de bacterias ya analizadas y comprobadas, como es el caso del
Ribosomal Database Project el cual contiene cerca de 16300 SSU de rRNA de
procariontes [Maidak et al., 2001].

45

CAPITULO 3 . BACTERIAS COMO INDICADOR DE IMPACTO

El principal objetivo del presente trabajo es estudiar una forma de evaluar la

presencia de contaminantes en el suelo sin utilizar las metodologas comunes
basadas en anlisis qumico de los componentes del suelo, puesto que estos
anlisis entregan el contenido total de las sustancias y no la biodisponibilidad de
stos

para

los

microorganismos

presentes.

La

importancia

de

la

biodisponibilidad es que puede encontrarse la sustancia absorbida en un grano

de tierra o bien en sus poros, sin producir dao alguno a los organismos de ese
hbitat en particular, traducindose en un menor impacto en el ser humano y la
sociedad.

Es por eso que se propone la utilizacin de bacterias como indicadores de

presencia de contaminantes, pues stas demostraran la biodisponibilidad de la
sustancia as como la toxicidad real que presenta, finalmente puede llevarse al
concepto de riesgo asociado al sitio en cuestin. As lo proponen otros autores
[Van Beelen et al., 1997] debido principalmente a las funciones que cumplen los
microorganismos en los suelos, donde adems la presencia de especies
resistentes a algn contaminante especifico, puede ser usado como un
indicador ecolgico viable y sensible al deterioro del medioambiente

La palabra bioindicador est siendo cada da mas usado, Paoletti (1999) define
este concepto como una especie o un conjunto de especies que se pueden
relacionar con factores o rasgos especficos del paisaje y/o reaccione a
impactos y cambios

Bchs (2003b) intenta describir y explicar que es un bioindicador y cuales son

las cualidades que deben presentar, sin embargo llega a una conclusin

46

bastante importante y nada de trivial que es casi imposible crear reglas bsicas
para indicadores de biodiversidad debido a la gran diversidad de objetivos que
deben cumplir los indicadores, en particular en este estudio se refieren a
insectos y arcnidos como bioindicadores, y no nombran en su estudio la
posibilidad de usar microorganismos para tal efecto.

A pesar de que los anlisis qumicos son cada vez ms verstiles, no entregan
informacin directa sobre el efecto de los compuestos txicos, contaminantes,
sobre los microorganismos presentes en el medio. El uso de bioensayos, puede
predecir la presencia de compuestos txicos, incluso no especificados y el
impacto biolgico que producen [Abbondanzi et al., 2003]

Para esto, primero se debe definir cual sera la metodologa a utilizar para
evaluar el comportamiento de las bacterias, luego definir que tipos de bacteria
utilizar y luego especificar el procedimiento y sus resultados.

Segn los antecedentes recopilados se sabe que Europa, uno de los

continentes donde el tema ambiental siempre est en la agenda de los
gobiernos, durante el ao 1998 se advierte la importancia de encontrar
parmetros que sirvan como indicadores ambientales en el tema de la
agricultura, refirindose explcitamente al cuidado y buen uso que se le debe
dar al suelo como recurso econmico [Bchs, 2003]. As tambin lo demuestran
un sin nmero de publicaciones cientficas donde algunas revistas han dedicado
nmeros completos a este concepto, tal es el caso de Agriculture, Ecosystems
and Environment en su nmero 98, donde se centran en indicadores biolgicos
para una gestin ambiental correcta.

47

3. 1 METODOLOGA DE EVALUACIN:

En la metodologa aqu propuesta, se debe realizar primero una recopilacin de

antecedentes histricos del sitio de manera de poder determinar el estado
actual de su suelo. Luego de esta etapa se podr concluir si el sitio en cuestin
corresponde, segn la nomenclatura implementada por Fundacin Chile7
(2004), a uno de los dos siguientes tipos:
a) Sitio sin contaminacin (SSC): pues puede nunca haber sido utilizado como
terreno de industrias o usos agrcolas, pudindo ser considerado un suelo
sin actividades humanas por consiguiente posee las propiedades propias de
su tipo.
Es tambin posible que no exista un registro histrico pero que exista
evidencia de contaminacin que implicara incluirlo en la siguiente categora,
an sin registro histrico.
b) Sitio potencialmente contaminado (SPC): donde debido a la informacin
recopilada se sabe que han existidos actividades humanas o industriales en
el sector, de esta manera se presume que las caractersticas presentes
naturalmente en este tipo de suelo han sido alteradas.

Luego de recopilados los antecedentes histricos del sitio, se debe realizar una
caracterizacin del lugar. Para esto ser necesario, segn indica Fundacin
Chile (2004), disear un plan de muestreo que indique el medio a muestrear
(matriz), localizacin de los puntos de muestreo ( modelo de distribucin),
nmero de puntos de muestreo, tamao de la muestra y tcnicas de muestreo.

La Fundacin Chile define tres tipos de suelos, pero en este trabajo slo dos son utilizados.

48

Es necesario caracterizar el volumen total del sitio a evaluar, pero generalmente

no es posible examinar el terreno en su totalidad, siendo necesario tomar
muestras lo ms representativas del sitio [Norma ISO 10.381, 2002]

Para realizar un buen muestreo y obtener de esta manera resultados crebles

se recomienda consultar la Norma ISO 10.381 (2002) que trata tanto del
correcto muestreo de suelo como de su almacenamiento y transporte. En esta
norma aconseja la metodologa de muestreo segn el objetivo del estudio, y
presenta un diagrama para determinar el tipo de muestro a realizar, en el
Apndice D se esquematiza el objetivo que presenta este trabajo. Es importante
considerar que es ms confiable, visto desde el punto de vista estadstico, el
muestreo al azar en bloques. Varios trabajos de estudios de comunidades
bacterianas en suelo indican este patrn de toma de muestra como el utilizado
[Rietche et al., 2000] [Duarte et al., 2001] La Figura 8 es un ejemplo de este
patrn, donde los crculos representan el lugar donde se debe tomar la muestra.

Figura 8: patrn de muestreo al azar en bloques

El tamao de la muestra depender de la cantidad de anlisis que se quieran

realizar, Van Elsas (1996) explica que 100 g es suficiente. Si bien hay otros
autores como Miller (1999) y Blackwood (2003) que toman muestras entre 350 y
400 g, es aconsejable seguir la propuesta de Van Elsas(1996) pues la cantidad
de muestra est relacionada con la temperatura a la cual se deben almacenar
las muestras en el laboratorio, antes de realizar los anlisis moleculares.

49

Si bien ninguna norma o estrategia indica la temperatura a la cual debe ser

almacenada la muestra para anlisis microbiolgicos la parte II de la Norma ISO
10.381 seala que tal temperatura debe ser menor a 25 C para evitar
reacciones enzimticas, oxidacin o prdida de materia orgnica. Por lo mismo
muchos

trabajos

en

este

mbito

establecen

como

temperatura

de

almacenamiento 80 C, como es el caso de Edgcomb (2002) y Kaplan (2004).

Estas temperaturas suelen usarse para suelos contaminados, de manera de
evitar un cambio importante en la composicin de los contaminantes,
especialmente en aquellos voltiles. Una temperatura adecuada para
almacenar las muestras es de 40 C, as se asegura que el centro dela
muestra alcance al menos los -25 C indicados por la norma ISO antes
mencionada ( para 100 g de muestra8).

El paso siguiente depender del tipo de sitio que se est analizando. Para el
caso de SSC se debera hacer un seguimiento a travs del tiempo de los
posibles cambios que pueda producir una actividad nueva, ya sea humana o
industrial, en el terreno. Para esto se evaluara la riqueza microbiana en el
suelo, pues como se ha mencionado en este trabajo, este parmetro servira
como indicador para ver tanto las capacidades del suelo, como su deterioro por
alguna sustancia contaminante que se deposite en l, ya sea por accidente o
deliberadamente. Se tratar entonces de establecer una lnea base9 de
biodiversidad.

Si el tamao de la muestra es mayor al sealado la temperatura de almacenamiento deber

ser cercana a los 80C
9
Entindase este trmino segn el artculo 2 letra l de la ley 19300 (1994)como la descripcin
detallada del rea de influencia de un proyecto o actividad, en forma previa a su ejecucin.

50

Para evaluar la riqueza microbiana se propone realizar un anlisis por medio del
uso de tcnicas moleculares, especficamente T-RFLP, de la biodiversidad de
bacterias presente. Los protocolos para los anlisis se encuentran detallados en
el Apndice A.

Para el segundo caso, es decir, cuando el suelo corresponde a un SPC, la

metodologa difiere de la anterior. Primero se deber conseguir, en lo posible,
una muestra similar de suelo10 pero con la certeza de que est libre de
contaminantes, y comparar los perfiles entregados por el anlisis de T-RFLP
que se le realizan a ambos suelos, de manera de poder visualizar la calidad del
suelo potencialmente contaminado. As si ambos perfiles son similares y ricos
en diversidad y abundancia de especies, se podra concluir que el SPC no
representa un riesgo para el medio ambiente, pues la comunidad microbiana ha
permanecido inalterable.

Si lo anterior no fuese posible, es decir no se puede conseguir una muestra

similar del suelo sin contaminar, no se tendra un perfil con el cual comparar los
resultados de los anlisis moleculares del suelo a estudiar.

Por lo tanto, se deber proceder de manera diferente. Se puede estudiar el

crecimiento de alguna cepa bacteriana que est presente normalmente en el
suelo y que presente alguna caracterstica observable (por ejemplo que
degrade o sea txico) de manera de poder evaluar el impacto de un
contaminante.

En particular si por los antecedentes histricos se sabe que los contaminantes

presentes en el lugar son hidrocarburos, la bacteria Pseudomonas putida que
como se ha mencionado es capaz de degradar hidrocarburos, acelerar su
10

Por medio de muestras estadsticamente significativas de sitios aledaos.

51

crecimiento. Para lograr esta evaluacin se inocula la muestra de suelo con la

bacteria de las que se disponga previamente partidores especficos, se
mantiene la muestra a una temperatura y condiciones tpicas del suelo, por
ejemplo aproximadamente entre 10 y 15 C. Y se analizar por medio de un TRFLP con partidores especficamente diseados para P. putida.

Naturalmente como P. putida es una bacteria propia del suelo, es necesario

realizar un anlisis de restriccin la muestra de suelo sin inoculo, para que as
sirva como blanco.

Una vez inoculada la muestra de suelo con P. putida se deber realizar un

anlisis de T-RFLP, al da siguiente de la inoculacin y luego de 10 das de
crecimiento de las bacterias. As se obtendr la tasa de crecimiento de esta
especie dadas las condiciones del suelo.

Los pasos de la metodologa propuesta son los siguientes:

1. Tomar muestra del suelo potencialmente contaminado (100 g)
2. Guardar una muestra de suelo para ser utilizado como blanco en anlisis
posteriores (20 g). Temperatura de almacenamiento de la muestra de
suelo 40C.
3. Inocular 20 g de suelo con P.putida
4. Tomar 1 g de muestra para realizar anlisis despus de 24 horas
5. Cultivar la muestra de bacterias por 10 das en el propio suelo sin
agregar ningn tipo de medio de cultivo.
6. Realizar pruebas de RNA 16s para identificar las poblaciones y poder
relacionar crecimiento de cada especie.
7. Analizar datos y reportar en trminos de diferencia con el blanco. Y en
trminos del avance en 9 das.

52

Los perfiles entregados por el anlisis mediante T-RFLP pueden ser

visualizados como lo muestra la figura 9, donde se comparan los perfiles de dos
sitios distintos.

Figura 9: Ejemplo de comparacin de perfiles pertenecientes

a dos suelos distintos
Fuente: Ritchie at al., 2000

53

CAPITULO 4 . DISCUSIONES Y CONCLUSIONES

4. 1 DISCUSIONES
El planeta tierra puede ser considerado como un flujo de energas, donde el
suelo participa en el reciclaje de stas, y se caracteriza por servir como
vertedero de desechos tanto naturales como producidos por el hombre. Esta
cualidad

de

servir

como

vertedero

reciclador

natural

se

debe

principalmente a la capacidad de buffer y almacenamiento que posee este

recurso. Sin embargo esta capacidad es limitada al contrario de lo que se crey
en algn momento, est determinada en particular por la accin de miles de los
habitantes microbianos presentes en el suelo, principalmente por la funcin que
cumplen stos como degradadores de compuestos orgnicos y su participacin
en los

ciclos biogeoqumicos,

de vital

importancia

para

el

correcto

funcionamiento del planeta (fijacin del nitrgeno, de carbono, produccin de

oxigeno entre otros). Esta capacidad se ve sobrepasada por la constante
destruccin de la vida microbiana debido a las altas dosis de contaminantes
derramados o desechados a propsito en el terreno.

La problemtica descrita anteriormente, adems de las crecientes y mltiples

necesidades del ser humano, tanto alimenticias como econmicas, hacen
indispensable detectar a tiempo la destruccin de las capacidades propias del
suelo.

Los mtodos propuestos para evaluar tanto la calidad del suelo, como la
presencia de algn compuesto exgeno y peligroso en ste han sido biolgicos.
Durante la investigacin bibliogrfica realizada se puede determinar que la
presencia de los microorganismos en el suelo es esencial para mantener
intactas sus funciones naturales.

54

Actualmente los anlisis biolgicos, se basan principalmente en la tcnica de

PCR. Como se menciona a lo largo de este trabajo esta tcnica posee algunas
desventajas que deben ser considerados al momento de realizar los estudios y
posterior anlisis de los datos. Entre estos problemas se menciona la
posibilidad de amplificar ciertos fragmentos frente a otros, la formacin de
quimeras y que el nmero de copias de un gen sea mayor en una especie que
en otra, producindose apreciaciones erradas de las comunidades presentes en
la muestra. Esta limitacin ser prontamente superada porque los mtodos
estn en permanente revisin e innovacin. Actualmente se utiliza Real Time
PCR, el que se basa en los mismos principios de PCR pero el nmero de ciclos
es menor y se realiza un anlisis en tiempo real durante las amplificaciones de
los primeros ciclos, consiguindose as eliminar los errores antes mencionados
y se tiene la posibilidad de evaluar cuantitativamente la cantidad de especies
presentes en la muestra.

Es importante considerar que debido a cambios climticos la poblacin

microbiana presente en un suelo no es constante, y podra cambiar entre un
ao y otro. Se tendr entonces que hacer una evaluacin de los cambios
normales que ocurren en un lugar, obteniendo as un porcentaje de variacin
con respecto al ao anterior que debe considerarse como normal, de manera de
no incurrir en errores de estimacin de contaminacin en un sitio. Para evitar
estos errores se debiera adems, al momento de recolectar la muestra, registrar
la temperatura, el clima, el lugar especfico de muestreo, presencia de plantas y
rboles, etc.

El estudio de un sitio, no solo posee implicancias ecolgicas sino tambin

polticas. Ecolgicas en el trmino que ser necesario contar con una alta
diversidad de especies en el suelo para que sus funciones naturales, de soporte
tanto para vegetacin como para actividades humanas, as como su capacidad

55

de reciclar compuestos, permanezca sin ser alterado. En tanto las implicancias

polticas se refieren a la responsabilidad tanto del estado como de la comunidad
de preocuparse no tanto del aspecto fsico del terreno sino tambin del estado
interno del sitio. Adems ellas tienen la responsabilidad de legislar sobre las
condiciones del suelo actuales y los usos que se le den a este, ya sean
industriales, agrcolas o habitacionales.

Australia ha estado realizando investigaciones sobre metodologas para medir y

cuantificar la biodiversidad de comunidades microbianas tanto en el suelo como
en aguas subterrneas de manera de cuantificar el impacto de los sistemas de
gestin de suelos, en particular agrarios, en la composicin de estos ambientes,
para as mantener sus funciones naturales. Se puede esperar que finalmente
estas tecnologas servirn como monitoreo ambiental de las industrias y la
agricultura desde el punto de vista de la sociedad moderna que busca la
regulacin ambiental. Este pas no solo se preocupa por la biodiversidad
microbiana presente en el suelo, sino tambin por la biodiversidad del paisaje,
incluyendo sus animales, plantas y microorganismos, actualmente se realizan
estudios para identificar un indicador de la calidad tanto del paisaje como del
ambiente [Ludwing et al., 2003]

Se aprecia que la necesidad de estudiar las comunidades del suelo es un tema

reciente pero de gran relevancia a nivel mundial. Pases como Australia y el
Reino Unido poseen polticas sobre el tema, as como tambin la Comunidad
Europea. Chile no se queda atrs, pero las polticas implementadas estn
atrasadas en comparacin con pases desarrollados. Si bien se han firmado
acuerdos internacionales sobre proteccin y conservacin de la biodiversidad,
es difcil poner en prctica estas acciones, pues todava hay un vaco legal con
respecto a suelos y pasivos ambientales.

56

Como una manera de crecer como pas en temas ambientales sera adecuado
contemplar en la normativa nacional la contaminacin del suelo, la necesidad
de instaurar estudios de impacto para los nuevos proyectos industriales, as
podra incluirse en la gestin ambiental el seguimiento temporal de la calidad
del suelo, pudindose evitar la contaminacin total de ste, puesto que si no se
realiza una correcta gestin, finalmente se debera incurrir en altsimos costos
para su remediacin.

4. 2 CONCLUSIONES
El estudio de la biodiversidad del suelo se basa principalmente en concluir el
estado de las capacidades naturales del suelo para funcionar como tal, que
puede ser basado en las tcnicas moleculares reportadas en este estudio, pero
an en trminos cualitativos mas que cuantitativos.

Se puede estudiar tanto la calidad como el impacto debido a acciones humanas

en un suelo por medio de tcnicas moleculares, en particular estudiar la
composicin de las especies bacterianas por medio de T-RFLP, basados en el
comparacin y evolucin dinmica a partir de una lnea base estudiada antes de
la ejecucin de un proyecto industrial. En resumen se pretende utilizar la
diversidad microbiana como parmetro de salud del suelo.

Se propone una metodologa, tanto para evaluar los efectos de una actividad en
el suelo, como para evaluar el estado actual del suelo, en particular detectar la
presencia de contaminantes orgnicos.

57

Se suele concebir que las tcnicas moleculares podran llegar a caracterizar

cuantitativamente la biodiversidad de suelos. Este estudio permiti establecer
que dada la complejidad de la constitucin de suelos, tal posibilidad est an
lejana. La humanidad deber primero incrementar su conocimiento y
caracterizacin de suelos, antes de proceder con relaciones cuantitativas.

Se concluye que el suelo es un recurso imprescindible para las actividades

humanas, y segn las normativas vigentes en el pas, este recurso debe ser
protegido. Una manera de hacerlo es implementando medidas preventivas.
Proponindose el estudio de los parmetros biolgicos como posible indicador
de calidad del suelo.

58

CAPITULO 5 . BIBLIOGRAFIA

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65

APNDICE A: PROTOCOLOS DE ANLISIS

Las muestras de suelo deben ser pasadas a travs de un tamiz de 2 mm, as se

eliminan races y piedras que podran estar presentes. Generalmente se
mezclan todas las muestras de un sector para as homogeneizar el estudio.
Los siguientes protocolos11 sirven para la extraccin de DNA del suelo para
luego ser analizado en un gel de acrilamida para T-RFLP.

El orden de los pasos es:

1. Kit de extraccin de DNA
2. Pequeo volumen de los fragmentos amplificados por PCR ( 25 l) para
observar que el procedimiento de PCR funcion bien. Realizar un gel de
agarosa con bromuro de etidio para chequear el procedimiento.
3. Realizar las amplificaciones de PCR en triplicado ( 100 l) para cada
muestra con los partidores marcados.
4. Utilizar el Kit para purificar los productos de PCR
5. Realizar la digestin con enzimas especificas
Analizar los fragmentos en un gel para T-RFLP

11

Fuente: Protocolo proporcionado por Laura Broughton perteneciente a KBS Biological Station
de la Universidad de Michigan, EEUU.

66

Extraccin DNA
Usando el kit MoBIO (UltraClean Soil DNA Kit) (protocolo indicado por James
Tiedje)
Materiales:

El kit incluye 5 soluciones y todos los filtros y tubos necesarios.

Centrfuga

Balanza, autoclave

Pipetas

Protocolo12
1. Sacar el suelo del refrigerador, a 40C
2. Aadir 0,25 g de suelo a 2 ml en la solucin (bead solution segn
indica el fabricante). Vortex por 10 segundos
3. Aadir 60 l de la solucin 1 e invertir el tubo para mezclar. Agitar
en Vortex por 10 minutos al mximo con los tubos tapados
horizontalmente en un mezclador
4. Centrifugar los tubos por 30 segundos. Transferir el sobrenadante
a un nuevo tubo( previamente autoclavado)
5. Agregar 250 l de la solucin 2. Agitar en vortex por 5 segundos.
Llevar al refrigerador por 5 minutos
6. Centrifugar los tubos por 1 minuto
7. Traspasar 450 l del sobrenadante, evitando tomar el pellet, a un
tubo limpio
8. Agregar 300 l de la solucin 3 y agitar en vortex por 10 segundos
9. Traspasar 700 l de la mezcla a un filtro rotatorio ( spin filter9.
Centrifugar por 1 minuto. Descartar el flujo. Agregar el resto de la

12

Para mayores detalles referirse a la pgina http://www.mobio.com/files/protocol/12800100.doc, donde se detalla el protocolo recomendado por el fabricante

67

mezcla nuevamente a un filtro rotatorio. Centrifugar un minuto y

eliminar el flujo ( flow through)
10. Agregar 300 l de la solucin 4. centrifugar por 30 segundos.
Eliminar el flujo
11. Centrifugar nuevamente por 1 minuto
12. Agregar 50 l de la solucion 5 ( 10mM Tris) en el centro de cada
filtro. Centrifugar por 30 segundos. Extraer el filtro.
13. El DNA es estable en la solucin 5 presente en el tubo. Guardar a
20C

68

Amplificacin utilizando PCR

Para 25 l

Volumen

Concentracin final

2.5 l

1x

DNTP mix ( 2.5 mM de cada dNTP)

2.0

200 M

MgCl2 (50 mM)

0.75

1.5 M

BSA (2500 g/ml)

3.0

200g/ml

H2O

14.5

8Fhex (12.5 M)

0.5

0.25 M

1392R(12.5 M)

0.5

0.25 M

Taq (5U/l)

0.25

10X buffer sin Mg

DNA

Para 100 ul

Volumen

Concentracin final

10 l

1x

8.0

200 M

MgCl2 (50 mM)

1.5 M

BSA (2500 g/ml)

12

200g/ml

H2O

58

8Fhex (12.5 M)

0.25 M

1392R(12.5 M)

0.25 M

Taq (5U/l)

10X buffer sin Mg

DNTP mix ( 2.5 mM de cada dNTP)

DNA

69

1. Limpiar prolijamente el lugar donde se realizara el experimento

2. Si fuese necesario, hacer soluciones stock para BSA (concentracin final
de 2500 g/ml), mix dNTP 810mM, 2.5 mM cada uno), partidor 8F (Hex)
(12.5 M) y para el primer 1392 R ( 12.5 M)
3. Encender el termociclador (al menos 30 minutos antes de ser usado).
Marcar los tubos de PCR ( pero no en las tapas de los tubos porque
desaparecern luego de realizados los ciclos)
4. Hacer el mix maestro en el lugar limpiado. Mantener todo el material en
hielo.
5. Agregar el DNA a los tubos para PCR
6. Agregar los partidores y la taq a la muestra. Vortex.
7. Agregar la mezcla maestra a los tubos que contienen el DNA
8. Si se usa termociclador antiguo se debe agregar aceite mineral 100 l
para evitar que la solucin hierva
9. Hacer funcionar el termociclador
10. Guardar las muestras a 20C

Ciclos en la reaccin de PCR

I.

94 C durante 3 minutos

II.

30 ciclos : 94 C por 1 minuto

60C por 45 segundos
72C por 2 minutos

III.

Mantener a 4C

70

Gel de Agarosa
Materiales necesarios

Buffer de corrida TAE

Gel de agarosa al 1% con TAE (1X)

Tampn de carga

DNA ( fragmentos amplificados por PCR)

Marcador de DNA

Para hacer el gel de agarosa:

1. Disolver en un frasco de 125 ml, 0,5 g de agarosa en 50 ml 1x de TAE
2. Agitar la solucin a bao mara, sin dejar que llegue a hervir
3. Insertar la peineta que servir de moldes para los carriles de carga, en el
molde para el gel.
4. Verter la solucin en el molde para el gel, esperar que se solidifique
5. .Llenar la cmara horizontal de electroforesis con buffer TAE de forma
que el gel quede cubierto
6. Agregar 3 l de DNA en cada carril, incluyendo una muestra que servir
de base.
7. Aplicar corriente entre 70 y 100 volts. Normalmente toma un tiempo entre
30 y 40 minutos.

71

APENDICE B : GLOSARIO DE ABREVIACIONES

EPA : Environmental Protection Agency (Agencia para la proteccin ambiental

estadounidense)
PAH: Polycyclic Aromatic Hydrocarbon (compuestos aromticos policclicos)
PCR: Polimerasa Chain Reaction (reaccin en cadena de la polimerasa)
RFLP: Restriction Fragment Length Polimorfism (tcnica molecular donde se
realiza una medicin de fragmentos de los polimorfismos presentes en las
clulas por medio de enzimas de restriccin)
TRFLP: terminal Restriction Fragment Length Polimorfism (tcnica molecular
similar

la

anterior

pero

el

fragmento

analizar

est

marcado

fluorescentemente)
DNA: DeoxyriboNucleic Acid (cido desoxiribonuclico, polmero de nucletidos
correspondiente

al

material

gentico

de

las

clulas,

cuya estructura

corresponde a una doble hlice)

RNA: Ribonucleic Acid (cido ribonucleico, es una hebra simple de polmero de
nucletidos correspondiente al material gentico de las clulas)
rRNA: ribosomal Ribonucleic Acid (es el cido ribonucleico presente en los
ribosomas celulares)

72

APNDICE C: ACTIVIDADES Y SUS CONTAMINANTES RELACIONADOS

Actividades realizadas
en el sitio

Contaminantes tpicos

Agricultura

Compuestos orgnicos voltiles, (VOCs), arsnico,

cobre, pesticidas, insecticidas.

Reparacin
automviles

de Algunos metales, varios compuestos orgnicos,

solventes, desechos aceitosos, pintura.

Produccin

de Metales pesados, solventes y cidos

cosmticos
Lavasecos y actividades VOCs como cloroformo y tetracloroetano; varios
relacionadas
solventes
Produccin de vidrio

Arsnico; plomo

Produccin y uso de Dioxinas ; metales; herbicidas

herbicidas
Hospitales

Formaldehido; solventes; mercurio;

oxido de
etileno; qumicos para quimioterapia, entre otros.

Incineradores

Dioxinas; varios desechos tanto municipales como

industriales

Rellenos
tanto

sanitarios, Metales; VOCs; compuestos bifenilos policlorados

municipales

industriales

e (PCBs); metano; productos de limpieza domsticos,

pesticidas; varios otros desechos

Manufactura de cueros y Tolueno; benceno

pieles
Fabricacin
de Metales; VOCs; dioxinas; agentes desengrasantes;
maquinarias metlicas
solventes; desechos oleicos
Produccin

de Plomo, explosivos, cobre, antimonio.

73

municiones
Produccin de pinturas

Metales (como cromo, cadmio, plomo, y zinc);

VOCs; cloroformo; etil benceno; solventes; pinturas;
tintas

Produccin
pesticidas

de VOCs; arsnico; cobre; pesticidas; insecticidas;

herbicidas;
fungicidas;
xilenos;
compuestos
orgnicos clorados; solventes

Refineras de petrleo

Hidrocarburos del petrleo; benceno, tolueno,

etilbenceno, xileno (BTEX); , combustibles, aceites
y grasas

Produccin farmacutica plomo; varios

orgnicos
Produccin de plsticos

qumicos orgnicos; solventes

Polmeros; cadmio; solventes; resinas; aditivos

qumicos; VOCs

Imprentas e industrias Plata; Solventes; cidos; residuos aceitosos ; tintas

relacionadas
y tinturas;
Rieles ferroviarios y sus Hidrocarburos del petrleo, VOCs; BTEX;
alrededores
solventes; combustibles; aceites y grasas; plomos;
PCBs
Institutos educacionales cidos inorgnicos, solventes orgnicos; metales;
y de investigacin
desechos aceitosos, pintura, metales pesados,
pesticidas.
Fundiciones

Metales (tales como plomo, cobre y arsnico)

Produccin de pulpa de Compuestos orgnicos clorados, dioxinas; furanos;

madera y papel
Conservantes para
industria maderera

cloroformo
la pentaclorofenol (PCP); Arsnico; Cromo; cobre;
PCB; PAHs; dioxinas y conservantes de madera

Fuente: Guide to Contaminants Found at Contaminated Industrial Properties

(www.EHSO.com)

74

Objetivo investigar
suelos contaminados

la distribucin de las sustancias qumicas en el sitio

que se desea investigar

conocida

distribuida
localmente

Polar
grilla circular

lineal
patrn lineal

diagonal

no conocida

distribuida
uniformemente

casos especiales

*no sistematicamente
*sistematicamente

adapaado
para los casos

Figura 10: Seleccin de patrones de muestreo

APNDICE D: SELECCIN DE PATRONES SEGN NORMA ISO 10381

*no sistemtica
*sistematica