PRACTICA N 4: DEMOSTRACION DE LA DISTRIBUCION INTRACELULAR DE LAS

ENZIMAS DE OXIDO- REDUCCION

SISTEMA I: Usando 2,6-diclorofenolindofenol
I.

PROCEDIMIENTO:
Colocar en cada uno de los 5 tubos de ensayo, los respectivos reactivos, de acuerdo
al siguiente cuadro:
COMPONENTES (ml)
Buffer fosfato 0.1M, pH 7.4
2-6 diclorofenolindofenol
Succinato de Sodio
Fraccin nuclear
Fraccin mitocondrial
Fraccin microsomal-soluble
Homogenizado total

I
1.0
1.0
0.2
-

II
0.5
1.0
0.2
0.5
-

III
0.5
1.0
0.2
0.5
-

IV
0.5
1.0
0.2
0.5
-

V
0.5
1.0
0.2
0.5

Luego de formado el sistema, se mezcla y se deja en reposo a temperatura ambiente.

Observar constantemente y anotar los cambios de color, para interpretar los
resultados.
II.

OBSERVACIONES:
TUBO N I:
En este tubo de ensayo, se encuentra la sustancia buffer, el indicador (2-6
diclorofenolindofenol) y el sustrato (succinato de sodio); al no encontrarse el complejo
enzimtico, no se produce reaccin, ya que no se puede formar el complejo E-S y por tanto,
tampoco existe formacin del producto; esto se evidencia en que en el tubo de ensayo
aparece un color azul oscuro.
TUBO N II:
En este tubo de ensayo, se encuentra la sustancia buffer, el indicador (2-6
diclorofenolindofenol), el sustrato (succinato de sodio) y la fraccin nuclear. Observamos
que aparece un color azul oscuro, con lo que podemos deducir que en la fraccin nuclear no
existen enzimas que se unan al sustrato y formen el complejo E-S , por lo que no se produce
la reaccin

TUBO N III:
En este tubo encontramos la sustancia buffer, el indicador (2-6 diclorofenolindofenol), el
sustrato (succinato de sodio) y la fraccin mitocondrial (complejo enzimtico). Observamos
que el color azul oscuro se decolora, lo que es indicador de que existe una reduccin y por
tanto se ha producido la reaccin. De esto deducimos que en la fraccin mitocondrial s
podemos encontrar enzimas que se unan al sustrato, formen el complejo E-S y por tanto,
formen el producto.
TUBO N IV:
En este tubo encontramos la sustancia buffer, el indicador (2-6 diclorofenolindofenol), el
sustrato (succinato de sodio) y la fraccin microsomal (organelas pequeas tales como:
ribosomas, REL, RER) . Observamos que el color que aparece es azul oscuro, lo que indica
que no se ha producido la reaccin, es decir, que en las organelas presentes en la fraccin
microsomal, no se encuentran enzimas para poder formar el complejo E-S y posteriormente
el producto.
TUBO N V:
En este tubo encontramos la sustancia buffer, el indicador (2-6 diclorofenolindofenol), el
sustrato (succinato de sodio) y el homogenizado total (donde se encuentran todas las
fracciones ya mencionadas). Se observa un cambio de color, ya que el azul se decolora; lo
que nos indica que se ha producido una reduccin y por tanto, una reaccin. Esto quiere
decir que en el homogenizado total s existen enzimas para poder formar el producto.

SISTEMA II: Usando p-fenilendiamina.

I.

PROCEDIMIENTO:

 Colocar en cada uno de los 5 tubos de ensayo, los respectivos reactivos, de acuerdo
al siguiente cuadro:
COMPONENTES (ml)
Buffer fosfato 0.1M, pH 7.4
P-fenilendiamina 1%
Fraccin nuclear
Fraccin mitocondrial
Fraccin microsomal-soluble
Homogenizado total

I
1.5
0.5
-

II
1.0
0.5
0.5
-

III
1.0
0.5
0.5
-

IV
1.0
0.5
0.5
-

V
1.0
0.5
0.5

Luego de formado el sistema, se mezcla y se deja en reposo a temperatura ambiente.

Observar constantemente y anotar los cambios de color, para interpretar los
resultados.
II.

OBSERVACIONES:
TUBO N I:
En este tubo de ensayo encontramos sustancia buffer y la p-fenilendiamina que actuar
como indicador y sustrato. Observamos que se torna un color marrn claro, por lo tanto este
color evidenciara que no se ha producido reaccin, ya que en este tubo de ensayo no existe
ningn complejo enzimtico para poder formar el producto.
TUBO N II:
En este tubo de ensayo encontramos sustancia buffer, la p-fenilendiamina (indicador y
sustrato) y la fraccin nuclear. Observamos que el color que aparece en este tubo de ensayo
es el color marrn claro y comparndolo con el tubo n1 nos damos cuenta que este color es
indicador de que no se ha producido reaccin; por lo tanto deducimos que en la fraccin
nuclear no existen enzimas para poder llevar a cabo la reaccin de xido-reduccin y por
tanto formar el producto.

TUBO N III
En este tubo de ensayo encontramos sustancia buffer , la p-fenilendiamina (indicador y
sustrato) y la fraccin mitocondrial (complejo enzimtico). Observamos que aparece un
color marrn oscuro, lo que indica que s se produce formacin de producto y por tanto, s

hay reaccin. Esto debido a que en la fraccin mitocondrial s existen enzimas para poder
formar el producto y llevar a cabo la reaccin.
TUBO N IV:
En este tubo de ensayo encontramos sustancia buffer, la p-fenilendiamina (indicador y
sustrato) y la fraccin microsomal. Observamos que existe un color marrn claro, que
indica que no se ha formado el producto y por tanto no se ha producido la reaccin. Esto
debido que en la fraccin microsomal (organelas pequeas: REL, RER y ribosomas) no
existen enzimas capaces de catalizar reacciones de xido-reduccin.
TUBO N V:
En este tubo de ensayo encontramos sustancia buffer , la p-fenilendiamina (indicador y
sustrato) y el homogenizado total. Observamos que en este tubo el color se torna marron
oscuro y esto debido a que si se produce la reaccin, ya que en el homogenizado, existe
tambin fraccin mitocondrial donde se encuentran las enzimas.

CONCLUSION:
Las enzimas de xido-reduccin se encuentran distribuidas en la mitocondria y en el
experimento, tambin se encuentran en el homogenizado total, esto debido a que en dicho
homogenizado tambin se encuentra la fraccin mitocondrial.
CUESTIONARIO:

1. Qu es el 2,6 diclorofenolindofenol y cmo acta en la cadena respiratoria?

El 2,6 diclorofenolindofenol es una sustancia indicadora que es azul en su forma oxidada y
se decolora cuando se reduce. ste acta entre la FMN y la CoQ
As, si un inhibidor impide que el 2,6 diclorofenolindofenol se reduzca, quiere decir que
dicho inhibidor esta actuando en alguna regin anterior a la FMN, pero si el indicador se
reduce, quiere decir que el sitio de inhibicin esta en algn lugar posterior a la
CoQ,inclusive.

2. Qu es el p-fenilendiamina y como acta en la cadena respiratoria?

La p-fenilendiamina es una sustancia indicadora que tambin puede actuar como sustrato.
Cuando se oxida, es decir
cede electrones, cambia de color a
marrn oscuro; de lo
contrario, mantendr un color
marrn muy claro. De esta
manera se puede verificar si la
cadena comprendida entre
el citocromo C y el O 2 es o no
permeable al flujo de
electrones
proveniente
del
indicador.
Si se aplica un inhibidor en algn punto de esta porcin de la cadena, la p-fenilendiamina no
se oxidara, pero si el inhibidor no impide su reduccin quiere decir que esta actuando en
algn sitio anterior al citocromo C o de la cadena.

3. Grafique, usted en una cadena de xido-reduccin biolgica a la accin de los indicadores

redox 2,6 diclorofenolindofenol y p-fenilendiamina.

SUCCINAT
O

NADH

FMN,
Fe-S

FAD
Fe-S

Cit b, Fe-S,
Cit c1

Cit
C

Hem a
hem
a3

O2

2,6 diclorofenolindofenol

ADP +
Pi

ATP

ADP +

p-fenilendiamina

ATP

Pi

ADP +

ATP

Pi

4. Qu es un homogenizado de hgado y como se obtienen las fracciones celulares por

centrifugacin diferencial?
Es un preparado que contiene fracciones mitocondrial, microsomal y nuclear. Se prepara
mediante los siguientes pasos (T = 0 C 4 C):
Colocar el hgado en petri y eliminar su capsula y otros tejidos perifricos.
Pesar 10 g de hgado y cortar en fragmentos pequeos.
Colocar en un homogenizador potter y agregar solucin de KClO 154M.
Hacer presin manual con el embolo girando hacia el fondo.
El homogenizado es centrifugado a 800 revoluciones por 10 minutos colocndolo en
tubos de polietileno, previa calibracin en la balanza, se emplea una centrifuga
refrigerada.
El sobrenadantes separado por un beaker de 500 ml
El sedimento constituye la fraccin nuclear y se coloca en un beaker de 100 ml.
El sobrenadante anterior es centrifugado a 1500 revoluciones por 15 minutos en la
centrifuga retirada.
Se separa el sobrenadante en un beaker, constituyendo la fraccin microsomal con el
citosol.
El sedimento se separa en otro beaker y constituye la fraccin mitocondrial.
5. En qu fracciones celulares se encuentran las enzimas de xido-reduccin?

Fraccin mitocondrial
Homogenizado total

6. Haga un esquema de la centrifugacin diferencial.