La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una corriente

elctrica controlada con la finalidad de separar biomolculas segn su tamao

y carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa.
Fue empleado por primera vez por en el ao 1937, pero su importancia vino a
incrementarse cuando en los aos cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius ,
impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asign a la separacin de
materiales en un campo elctrico en presencia de algn tipo de soporte;
aunque este trmino se limit originalmente al anlisis de coloides y partculas
submicroscpicas , se ha convertido en estos ltimos aos en una metodologa
aplicada a sustancias de bajo peso molecular.
Fundamento.
Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas
en un campo elctrico, estas experimentan una fuerza de atraccin hacia el
polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las molculas
cargadas positivamente se desplazaran hacia el ctodo (el polo negativo) y
aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el nodo (el polo
positivo)
El movimiento de las molculas est gobernado tambin por dos fuerzas
adicionales; inicialmente la friccin con el solvente dificultar este movimiento
originando una fuerza que se opone , por otro lado las molculas tienen que
moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen
energa cintica propia denominado difusin. La energa cintica de las
molculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor
difusin.
La suma de todas estas
fuerzas provoca que las
molculas no migren de una
manera homognea, de tal
manera que, si las molculas
son colocadas en un cierto
lugar de solucin, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya
anchura aumentara con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las
molculas empleando un medio que oponga ms resistencia a dicho
movimiento. Una forma comn de hacer esto es formar un gel. El gel consiste
de un polmero soluble de muy alto peso molecular que atrapa molculas de
agua y forma un tamiz
que dificulta el movimiento de los solutos,
consecuentemente, la migracin electrofortica de las molculas ser ms
lenta, pero el ensanchamiento del frente se ver reducido tambin.
1.2 Mtodos electroforticos zonales.

Son los ms comunes, dada su alta aplicabilidad en diferentes campos. Son

tiles para lograr la separacin de mezclas complejas. Se aplican pequeas
cantidades de la disolucin de protenas a un soporte slido, que se impregna
con una solucin tampn. Los soportes son en general polmeros y forman un
gel poroso que restringe el movimiento de las molculas a travs del medio
durante la electroforesis y disminuyen los flujos de conveccin del solvente.
Como soporte han sido utilizados papel (celulosa), almidn, poliacrilamida,
agarosa y acetato de celulosa, entre otros. Este mtodo tiene gran poder
resolutivo porque se aplica una cantidad pequea de protena a una zona
estrecha, mientras que la longitud del trayecto es mucho mayor que la zona
de aplicacin. El equipamiento requerido es simple, fuente de poder, cubeta
vertical u horizontal donde se colocan el soporte y dos electrodos Los ms
utilizados son:
1.2.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida.
Los geles de poliacrilamida se forman por polimerizacin de la acrilamida por
accin de un agente entrecuzador, es qumicamente inerte, de propiedades
uniformes, capaz de ser preparado de forma rpida y reproducible. Forma,
adems, geles transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua,
relativamente no inicos y que permiten buena visualizacin de las bandas
durante un tiempo prolongado. Adems tiene la ventaja de que variando la
concentracin de polmeros, se puede modificar de manera controlada en el
tamao del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico
debido a su neurotoxocidad.
1.2.2

Electroforesis

en

geles

de

gradientes.
El uso de geles de poliacrilamida que tienen
un gradiente creciente de concentracin de
archilamida
+
bisacrilamida,
y
en
consecuencia un gradiente decreciente en
el tamao del poro, pueden tener ventajas
sobre
los
geles
de
concentraciones
uniformes de acrilamida. En un gel en gradiente la protena migra hasta
alcanzar una zona donde el tamao de poro impida cualquier avance. Una vez
se alcanza el lmite del poro no se produce una migracin apreciable aunque no
se detiene completamente. Una de las ventajas de este tipo de geles es que
resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones ms estrechas,
adems de incrementar el rango de pesos moleculares que se pueden resolver
en un mismo gel comparado con los de una concentracin fija. (Diapositiva n 9)

1.2.4
en

Electroforesis
geles
de

agarosa.
La agarosa es un
polisacrido
(originalmente
obtenido de algas,
como el agar-agar,
pero de composicin
homognea), cuyas
disoluciones
(tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por
encima de 50 grados C y formar un gel, semislido al enfriarse. Este gel est
constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras polimricas
embebida en gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso de las
molculas, se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor
20.000 nucletidos.
1.2.5 Electroforesis capilar.
La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las tcnicas
electroforticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnologa distinta
que nos permiten obtener una serie de ventajas al respecto, Esta separacin
de pptidos realizada sobre un
capilar de silica fundida a
potenciales elevados 20 a 30 Kv
en un campo de 400 a 500 v/cm
refrigerados por aire.
La corriente electroendosmtica
(FEO) generada por los grupos
silanol de la superficie interna del
capilar da como resultado una
corriente plana del frente del
lquido que contrasta con el frente
parablico de la cromatografa lquida de alta resolucin.
La ventaja de esta tcnica es que el capilar de silica fundida que generalmente
se cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia, tiene
una ventaja a travs de ella que permite el pasaje de la luz UV de tal manera
que
la
visualizacin
es
on-line.
Con esta tcnica descripta es posible separar cationes, aniones, protenas,
macromolculas y sustancias no cargadas en forma simultnea.

1.2.6. Isoelectroenfoque.
Esta tcnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa en el
desplazamiento de las molculas en un gradiente de pH. Las molculas
anfotricas, como los aminocidos, se separan en un medio en el que existe
una diferencia de potencial y un gradiente de pH. La regin del nodo es cida
y la del ctodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal
que las molculas que se han de separar tenga su punto isoelctrico dentro del
rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH
inferior a su punto isoelctrico estarn cargadas positivamente y migraran
hacia el ctodo, mientras aquellas que se encuentran en medios con pH ms
bajos que su punto isoelctrico tendrn carga negativa y migraran hacia el
nodo. La migracin les conducir a una regin dnde el pH coincidir con su
punto isoelctrico, tendrn una carga neta nula y se detendrn. De esta forma
las molculas amfotricas se sitan en estrechas bandas donde coincide su
punto isoelctrico con el pH.
1.2.7 Electroforesis bidimensional.
La electroforesis bidimensional se basa en
separar las protenas en una mezcla segn
sus dos propiedades moleculares, una en
cada dimensin. El procedimiento ms usado
se basa en la separacin en una primera
dimensin mediante isoelectroenfoque y la segunda dimensin segn peso
molecular mediante electroforesis
en poliacrilamida.
1.3 Fuentes de
electroforesis.

error

en

la

La electroforesis es una tcnica

muy sensible y puede ser
afectada por muchos errores
experimentales,
como
la
temperatura
durante
la
polimerizacin y la corrida del
gel, velocidad de la polimerizacin, niveles de catalizador, pureza del reactivo,
tiempo de corrida y preparacin de las muestras.

Electroforesis
La mayora de las biomolculas
poseen una carga elctrica,
cuya magnitud depende del pH
del medio en el que se
encuentran.
Como
consecuencia, se desplazan
cuando se ven sometidas a un
campo elctrico.
Se denomina electroforesis a la tcnica mediante la cual se separan las
biomolculas en disolucin cuando se ven sometidas a un campo elctrico. Se
trata de una tcnica fundamentalmente analtica, aunque tambin se puede
realizar con fines preparativos.
En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente movilidad de
cada molcula definir su separacin en el espacio; al ir transcurriendo el
tiempo, se van separando progresivamente unas de otras.
Al ser el medio de soporte a su vez un polielectrolito, est constituido por
iones, que son atrados y as recubren los iones de la muestra, lo que altera el
comportamiento de stos en el campo. Todo ello hace que el tratamiento
terico cuantitativo de la electroforesis sea muy difcil y que esta tcnica
resulte poco til para obtener informacin precisa sobre la estructura de las
molculas. Sin embargo, es enormemente til como tcnica analtica y
preparativa.
Se suele hablar de 3 tipos de electroforesis:
De frente mvil: los componentes de la muestra estn presentes en toda la
disolucin y se determina pticamente la posicin del frente de avance o
frontera con el disolvente.
Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes
migran a travs de un disolvente, utilizando adems un medio que da soporte
a ste. En este caso no se determina la movilidad, sino que el nico objetivo de
la tcnica es separar los componentes de la muestra.
Continua: la muestra se aplica tambin en una zona, pero se suministra
continuamente a lo largo del proceso (para ms informacin, vanse las
pp.250-2 de Freifelder, 1999).
Medios de soporte para realizar la electroforesis

La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte, principalmente para

evitar perturbaciones mecnicas y corrientes de conveccin durante la
separacin. En algunos soportes (papel o similares) la muestra queda sobre la
superficie y avanza a lo largo de ella, con escasa friccin, por lo que el
mecanismo principal de separacin es la magnitud de la carga de cada
componente de la muestra. Otros medios de soporte (geles, medios
semislidos o gelatinosos) estn formados por polmeros que forman una
malla, matriz o red tridimensional a travs de la cual deben avanzar las
molculas de la muestra, que queda embebida en el medio de soporte
electrofortico. Como consecuencia, la friccin es notable y los factores de
forma y tamao adquieren una alta relevancia en la separacin.
Medios de baja friccin
Papel
Acetato de celulosa

Medios de elevada friccin

Gel de almidn
Gel de poliacrilamida
Gel de agarosa + Gel de
Gel de agarosa
poliacrilamida

Separacin
principalmente por
Separacin por carga, tamao y forma
carga
Papel: sencillo, pero con elevada adsorcin debido a los grupos hidroxilo de la
celulosa.
Acetato de celulosa: los grupos OH estn acetilados, lo que reduce la
adsorcin; baja tincin de fondo; es posible transparentarla o disolverla para
detectar y recuperar, respectivamente, los componentes separados.
Almidn: pasta de almidn cuyos granos se han disgregado en un tampn
caliente (se hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la
poliacrilamida.
Agarosa: polisacrido, producto purificado de algas (composicin similar al
agar-agar). Se disuelve en caliente (50-60C) y al enfriar solidifica formando un
gel, de alta porosidad.
Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerizacin qumica de una
mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentracin de ambas y
su proporcin se consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de
los geles de agarosa.

Agarosa+ poliacrilamida: se consigue una porosidad intermedia.

Poliacrilamida con SDS: el dodecilsulfato sdico (Sodium Dodecyl
Sulphate; sinnimo: laurilsulfato sdico) es un detergente aninico que
se une a las protenas, desnaturalizndolas en una conformacin

extendida recubierta de molculas de SDS. Como consecuencia, el

tamao de la molcula de protena es directamente proporcional a su
longitud en aminocidos y su carga queda enmascarado por la mayor
carga del SDS que la recubre, que es tambin proporcional a la longitud.
Por lo tanto, la movilidad electrofortica de la protena depende
exclusivamente de su masa molecular.
Modos de disposicin del soporte
Horizontal
En papel, para aminocidos u otras
molculas pequeas; en soportes
similares (especialmente, acetato
de celulosa), para protenas.
En gel de almidn o de agarosa,
para protenas y especialmente
para
cidos
nucleicos.
Casi
siempre el tampn cubre el gel
(para evitar que se seque debido al
calentamiento sufrido al pasar la
corriente), denominndose por ello electroforesis submarina.
El soporte se impregna por capilaridad de disolucin tampn, que disuelve la
muestra y mantiene el contacto elctrico.
Se aplica la muestra depositndola (con pipeta o un aplicador especfico) como
una gota sobre el soporte (papel, acetato de celulosa) o dentro de un pocillo
creado en el gel.
Vertical
Se usa casi exclusivamente con gel de poliacrilamida (ms resistente
fsicamente, no se desliza), para protenas o para cidos nucleicos de pequeo
tamao.
El gel puede rellenar tubos de vidrio (este formato ya apenas se usa) o estar
contenido entre 2 placas rectangulares.
Contacto elctrico y disolvente gracias al tampn que embebe el gel y llena las
cubetas o compartimentos del nodo y ctodo.
La muestra se deposita con micropipeta llenando un pocillo creado al
polimerizar el gel.

En cuanto a la composicin del gel hay dos variantes: electroforesis

continua (un solo tipo de gel) y electroforesis discontinua (2 tramos de gel de
composicin ligeramente diferente).

Ejemplos de separacin electrofortica

Separacin de protenas por SDS-PAGE discontinua vertical
SDS-PAGE = SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, electroforesis en gel de
poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sdico.
Gel de poliacrilamida, en placa, vertical.
Separacin de acuerdo con la masa molecular (estrictamente, con la longitud
de la cadena polipeptdica).
La muestra se trata con SDS (a mayor concentracin que en la composicin del
gel) y se calienta brevemente a 90-100C, para provocar la desnaturalizacin.
Se suele aadir tambin -mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro,
separando as las subunidades de la protena y permitiendo que se extiendan
por efecto del SDS.
En la preparacin del gel se mezclan:

un tampn de pH (comnmente Tris-HCl)

acrilamida y bisacrilamida

un agente iniciador de la polimerizacin, como

el persulfato amnico (genera radicales libres)

un agente catalizador de la polimerizacin,

como
el
TEMED
(N,N,N,Ntetrametiletilenodiamina)

SDS

Permite obtener una estimacin de la masa molecular

de las protenas separadas. Para ello es preciso
analizar en la misma electroforesis unas protenas
patrn, de tamao conocido, con las que se construye
una curva de calibrado, representando movilidad
frente a logaritmo de masa molecular.
Permite obtener una estimacin de la masa molecular
de las protenas separadas. Para ello es preciso
analizar en la misma electroforesis unas protenas patrn, de tamao conocido,
con las que se construye una curva de calibrado, representando movilidad
frente a logaritmo de masa molecular.
Para controlar el avance del frente de electroforesis (posicin de mxima
movilidad) se aade a la muestra un colorante marcador (tracking dye),
molcula cargada y de pequeo tamao que avanza ms que cualquier
componente de la muestra; el ms habitual es el azul de bromofenol.
Para mejorar la resolucin (obteniendo bandas ms compactas) se suele
emplear electroforesis discontinua:
En la parte superior, un gel acumulador o concentrador (stacking gel), que
tiene como efecto concentrar la muestra en una banda estrecha.
Ocupando la mayor parte de la placa, un gel separador (resolving gel) en el
que tiene lugar la separacin de los componentes.
El efecto concentrador se debe a una mayor porosidad del gel acumulador
combinada con una diferente composicin de los tampones de cubeta (Trisglicina) y de gel (Tris-HCl) y distinto pH para ambos geles.
Nota: Tris es tris (hidroximetil) aminometano, una sustancia habitual para
preparar disoluciones tampn de pH prximo a 7.

Inmunoensayo (Western)
En caso de disponer de ellos, los anticuerpos permiten la deteccin selectiva
del componente de inters (protena o grupo marcador unido qumicamente a
la protena o al cido nucleico antes de la electroforesis). La permeabilidad de
los geles para el acceso del anticuerpo es limitada, por lo que se hace una
transferencia de las molculas separadas en el gel hacia una membrana de
nitrocelulosa o de nailon, la cual se somete luego a la disolucin que contiene
el anticuerpo. Los detalles de esta tcnica de inmunotransferencia o ensayo
Western blot se tratarn en un tema posterior.
Deteccin de cidos nucleicos con sondas (Southern y Northern)
Las molculas con una secuencia determinada de nucletidos se pueden
detectar mediante hibridacin con sondas especficas, pequeas molculas de
cido
nucleico
monocatenario
(oligonucletidos)
con
la
secuencia
complementaria a la buscada y marcadas con un istopo radiactivo, un grupo
fluorescente, etc. Para llevar a cabo con xito la hibridacin se requiere
tambin la transferencia desde el gel a una membrana de nitrocelulosa o
nailon. Los detalles de estos ensayos (Southern blot para DNA y Northern blot
para RNA) se estudian en un tema posterior.
Tcnicas especiales
Isoelectroenfoque
(Tambin se llama enfoque isoelctrico o IEF, de isoelectrofocusing). Se trata
de una variante de electroforesis en la que el gel (poliacrilamida) posee un
gradiente de pH fijado en su estructura. Esto se consigue incluyendo en su
preparacin molculas ionizables con valores de pK diferentes. Como
consecuencia, al avanzar los componentes de la muestra a lo largo del gel se
encuentran en entornos de pH diferente, y eventualmente alcanzan una regin
en la cual el pH local es igual al punto isoelctrico de la molcula muestra y, en
consecuencia, sta detiene su avance. Se alcanza, pues, un equilibrio y se
consigue la separacin de los componentes de la muestra de acuerdo con su
punto isoelctrico, que adems se puede medir, pues se conoce la geometra
del gradiente de pH fijado al gel.

Electroforesis bidimensional
Tras realizar una primera separacin su resultado se somete a otra de diferente
mecanismo en direccin perpendicular. Generalmente la primera es un
isoelectroenfoque en un gel cilndrico estrecho que luego se coloca como
muestra para una SDS-PAGE. Se obtienen as mapas complejos de bandas, muy
caractersticos de cada muestra, cuya utilidad principal es la comparacin con
el obtenido de otra muestra similar pero conocida.

Electroforesis de campo pulsante

Las molculas o fragmentos de DNA de longitud superior a 20-40 kb no se
pueden resolver (separar) empleando la electroforesis convencional en gel de

agarosa. Esto se debe, en primer lugar, a la dificultad de manejo de los geles

preparados con las bajas concentraciones de agarosa que requeriran (inferior
al 0,4%). Adems, las molculas de DNA, que adoptan una conformacin ms o
menos globular, poseen un tamao excesivamente grande para atravesar los
poros del gel y no se separan en funcin de su tamao. Para solventar este
problema se ha ideado una modificacin de la tcnica, conocida
como electroforesis de campo pulsante (o pulsado, pulsed-field gel
electrophoresis, PFGE). Se emplean geles de agarosa al 1%, pero se altera
peridicamente la orientacin del campo elctrico aplicado, activando
alternativamente dos pares de electrodos. El frecuente cambio de direccin del
campo elctrico consigue que las molculas se desplieguen y avancen a travs
de los poros en conformacin extendida. A mayor tamao, se reorientan con
ms dificultad, por lo que avanzan ms despacio.

As se consigue separar fragmentos de DNA de hasta varias megabases, lo que

supone un avance significativo pero an no sirve para estudiar los cromosomas
humanos enteros (de 50 a 250 Mb cada uno). S se han podido analizar as los
cromosomas de levadura (figura derecha).
Las muestras han de contener el DNA sin fragmentar, por lo se requiere una
preparacin especial (al purificar el DNA por los mtodos habituales se
fragmenta por debajo de 100 kb). Para obtener preparaciones con los
cromosomas intactos se mezclan las clulas con agarosa caliente (37C) y se
vierte en pequeos moldes de unos milmetros, de forma que al solidificarse la
agarosa (4C) forma bloques (insertos) que incluyen las clulas intactas. En
stos se realiza la lisis celular y la digestin de las protenas (p.ej., con EDTA,
SDS y proteinasa K, que difunden a travs de los poros del gel) sin que se
alteren las grandes molculas de DNA. Tras una dilisis para eliminar los restos
de la digestin, se consigue un bloque de agarosa con el DNA intacto en su
interior, y se deposita el bloque entero en un pocillo del gel de electroforesis.