PRACTICA # 2

TEMA: Tcnica de Tincin Simple y Tincin de Gram Fundamentos.

Objetivo: observacin de la clulas por tincin simpe y tincin diferencia de
Gram.
Diferencia entre Microscopio y Estereoscopio.
El llamado comnmente microscopio te permite aumentos hasta 100X (al
menos lo ms comunes) y te permite contemplar bacterias. El estereoscopio
(llamado microscopio estereoscpico) te permite aumentar hasta de 45X (al
menos lo ms modernos), pero no puedes apreciar bacterias por su factor
lumnica, adems otra diferencia es que los estereoscopio utilizan una visin
a travs de dos lentes (vista en estreo), por eso se le dice as.
El estereoscopio ocular dual permite a una imagen en 3-D para ser
claramente retratado con un sentido exacto de la profundidad. Un
microscopio no tiene esta capacidad. En su lugar, un microscopio
tpicamente ser capaz de aumentar una imagen en cualquier lugar de 40 a
1.000 veces el tamao original. Habilidades de un estereoscopio de
aumento suele rematar hacia fuera en alrededor de 20 veces. Sin embargo,
la percepcin de la profundidad permanece intacta y permite objetos 3-d
que se desea ampliar preservando al mismo tiempo sus propiedades fsicas
a simple vista.

Extendido previa a la coloracin:

Se toma un portaobjetos previamente desengrasado y se coloca en el

centro del mismo una gota del cultivo lquido, mediante asa de
platino. Si el cultivo es sdico, se coloca primero una gota de solucin
fisiolgica o agua destilada estril sobre el portaobjeto. Luego, con
ansa de platino se toma una colonia del medio slido y se emulsiona
con la solucin fisiolgica. Se extiende con el ansa en forma de capa
delgada y uniforme.
Se procede a la fijacin del extendido. Para ello se pasa lentamente el
portaobjeto, en forma horizontal, sobre la llama del mechero
manteniendo el extendido hacia arriba. La operacin se repite hasta
sequedad total, cuidando evitar la combustin del extendido.

Tincin simple.
Sobre el extendido seco se colocan unas gotas de azul de metileno y se deja
actuar unos minutos. Se elimina el exceso de colorante lavando con agua de
forma suave, con ayuda de piseta. Se seca el extendido se observa al
microscopio.

Diagrama de Flujo de Procesos

Grafico 3.1. Diagrama de flujo de la preparacin del fruto chontaduro
(Bactris Gasipaes H.B.K.).

RECEPCIN

LAVADO

SELECCIN Y
CLASIFICACI
COCCIN

Cascaras
Semillas
Mesocarpio

PELADO

PESADO

Temperatura 121
c
Presin = 15 psi

Tincin Diferenciada o de Gram.

La tincin de Gram se basa en colocar como colorante primario cristal
violeta, el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana.
Posteriormente, se coloca lugol, el cual sirve como mordiente e impide la
salida del cristal violeta por la formacin de un complejo cristal violeta-yodo
que satura los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana. En
seguida, se coloca una mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la
pared bacteriana y cierra los poros de la misma, tambin destruya la
membrana externa de las bacterias Gram negativas debido a que esta es
soluble a la accin de solventes orgnicos, como la mezcla de alcoholacetona. Las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de
peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este complejo, mientras que las
Gram negativas no lo pueden retener por tener menos cantidad de
peptidoglicano.
La tincin diferencial requiere el uso de al menos 3 reactivos qumicos que
se aplican en secuencia a un frotis fijado por calor. El primer reactivo es
llamado tincin primaria o colorante primario. Su funcin es impartir color a
todas las clulas. Con el objetivo de establecer un contraste de color, el
segundo reactivo usado es una gente decolorante, el cual puede decolorar
la clula completa o solo parte de ella. El reactivo final, el colorante de
contraste, le da a las clulas decoloradas un color que contrasta con el del
colorante primario. El colorante de contraste no puede ser absorbido por
clulas que no han perdido el colorante primario. De esta manera, tipos de
clulas o sus estructuras se pueden distinguir unas de otras en funcin del
colorante que es absorbido.

Tincin Primaria: Se utiliza Cristal Violeta, que tie todas las clulas
moradas.
Mordiente: Yodo o lugol. El yodo, aparte de matar bacterias,
incrementa la afinidad del colorante primario con la clula, formando
complejos insolubles con este. El complejo cristal violeta-yodo sirve
para intensificar el color del teido.
Agente decolorante: se utiliza alcohol etlico al 95%. El etanol tiene
doble funcin: deshidratante de protenas y solvente de lpidos. El
alcohol disuelve los lpidos de la parte externa de la pared celular
Gram-negativa, haciendo la pared ms porosa. De esta manera, el
complejo Cristal violeta-yodo es removido de la capa de mureina ms
fina de las bacterias Gram negativas, mientras que la pared ms
gruesa de las Gram-positivas retiene el tinte en su interior.
Tincin de Contraste: Safranina. Este tinte se utiliza para teir de rojo
las clulas previamente decoloradas, o sea, las Gram-negativas.

Diagrama de Flujo de Procesos

Grafico 3.2. Diagrama de flujo de la obtencin de harina del fruto
chontaduro (Bactris Gasipaes H.B.K.).

RECEPCIN
LAVADO
SELECCIN Y
CLASIFICACIN
Temperatura 121
c
Presin = 15 psi

COCCIN
PELADO
PELADO
DESHUESAD
O

Cascaras
Semillas
Mesocarpio

SECADO
MOLIENDA
SECADO
Procedimiento:
1. Colocar muestra
2. Secado
3. Teir con cristal violeta por 1 minuto.
4. Lave con agua
5. Aplique yodo o lugol por 1 minuto
6. Lave con agua
7. Aplique alcohol al 95%
8. Lave con agua
9. Aplique safranina por 1 minuto
10.Lave con agua
11.Seque al aire

Temperatura 121
c
Presin = 15 psi

Diagrama de Flujo de Procesos

Grafico 3.2. Diagrama de flujo de la obtencin de yogurt a base del fruto
chontaduro (Bactris Gasipaes H.B.K.).

PREPARACIN DE
MEZCLA BASE
PREPARACIN DE
MEZCLA BASE
INCORPORACION DE
ADITIVOS

Adicin de leche
en polvo

ENFRIAMIENTO A
TEMPERATURA DE
INCUBACIN
INOLULACIN DEL
CULTIVO
INCUBACIN
INCORPORACION DE
ADITIVOS

Temperatura
44,6 c
Tiempo = 4
Adicin
de Coulis

MEZCLA
ENVASADO

TINSION SIMPLE

INSTRUMENTOS Y REACTIVOS A UTILIZAR

TOMANDO LA MUESTRA

SECANDO EL EXTENDIDIO

COLOCANDO GOTAS DE AZUL DE METILENO

ELIMINANDO EXCESO DE COLORANTE

SECANDO EXTENDIDO

TINSION DIFERECIANDA O DE GRAM

REACTIVOS A UTILIZAR

TOMANDO MUESTRA

SECANDO EXTENDIDO

COLOCANDO AZUL DE METILENO

COLOCANDO LUGOL

COLOCANDO ALCOHOL AL 95%

COLOCANDO ZAFRANINA

SECANDO EXTTENDIDO

MUESTRAS VISTAS ATRAVEZ DEL MICROSCOPIO

CONCLUSIONES

Finalmente podemos mencionar que a pesar que la bacteria es una estructura

muy pequea, por medio de la tincin con verde de malaquita, el cual requiri
del calor para la penetracin; se pudo observar la estructura interna de la clula
bacteriana, particularmente las endosporas. En este experimento se utiliz una
tincin simple debido a que la misma permite que se coloree toda la clula
excepto la espora que se observa de un tamao bien aceptable
Aunque las bacterias no aparecen en diferentes medio que las rodea, difieren
mucho qumicamente esta diferencia qumica es los que permite distinguir las
bacterias por Tincin, pues generalmente, el colorante reacciona con la clula
bacteriana, pero no reacciona con su medio exterior

PRACTICA # 3
TEMA: Esterilizacin y produccin de agares.
Objetivo: Conocer el fundamento de la esterilizacin y la preparacin de
agares.
Esterilizacin: eliminacin o muerte de todos los microorganismos que
contienen un objeto o sustancia y que se encuentra acondicionados de tal
forma que no pueden contaminarse nuevamente.
Agentes esterilizantes

Provocan perdida de viabilidad en los microorganismos

Calor: son los microorganismos son susceptibles es distinto grado a la

accin del calor.
El calor provoca la desnaturalizacin de las protenas, fusin y
desorganizacin de las membranas y/o procesos oxidativos irreversibles en
los microorganismos.
La efectividad del calor depende de:
1. Temperatura
2. Tiempo de exposicin
Calor Hmedo
El calor hmedo produce desnaturalizacin y coagulacin de protenas se
fundamenta en la accin del calor transmitido por el vapor saturado a
presin superior a la normal.
Agente Esterilizante: vapor de agua saturado a presin a la normal
Equipos autoclave (tipo sorel).
Variables

Temperatura-presin
Tiempo
Nmero inicial de microorganismos
Caractersticas de la carga

El autoclave es el aparato ms comnmente utilizado en los laboratorios

para esterilizar cultivos y soluciones que no formen con el agua y que no se
desnaturalicen a temperatura mayor a 100c una temperatura de 121
c/250 F a 15 psi con un tiempo mayor a 15min para destruir organismos
formadores de espora.
Ventajas

Rpido calentamiento y penetracin

Destruccin de bacterias y esporas en corto tiempo
No deja residuos txicos
Hay un bajo deterioro del material expuesto
Econmico

Desventajas

No penetra bien en grasas polvos y vaselina

Ciertos materiales pueden deteriorarse por
(corrosivo sobre ciertos instrumentos metlicos)

altas

temperatura

Calor seco
S basa en la accin oxidante del aire seco caliente que circula por
conveccin forzada a travs de los productos produce desecacin de la
cdula procesos oxidativos y fusin de membranas.
Se utiliza para-, vidrios, instrumentos quirrgicos, objetos metlicos, aceites,
vaselina, polvos.
LA ESTUFA DE ESTERILIZACIN
Es el artefacto utilizado en los laboratorios para esterilizar por calor seco se
requiere mayor temperatura y tiempo de exposicin que el autoclave.
La temperatura vara entre 120 c y 180 c requiere distintos tiempos de
exposicin
A 140 c se requiere por lo menos 5 horas de exposicin a 160 c se
requiere 3,5 horas de exposicin.
160c 3,5 horas
180c 2 horas
Ventajas

No es corrosivo para metales e instrumentos

Permite esterilizar sustancias como grasas aceites y polvos.

Desventajas

Largos periodos de exposicin

La alta temperatura puede acelerar el deterioro del material

RADIACIN
Su accin depende de

Tipo de radiacin
Tiempo d exposicin
Dosis

Rayos gamma: las radiaciones tienen muchas energas y son emitidas por
ciertos isotopos radiactivos como el cobalto 60, pero son difciles de
controlar ya que este isotopo emite constantemente los rayos gamma en
todas direcciones estos rayos gamma pueden penetrar las materiales por lo
que un producto puede empaquetarse primero.

CONCLUSIONES

De acuerdo con lo realizado en la presente prctica se concluye que es de gran

importancia preparar adecuadamente los medios de cultivo, aadir la cantidad
de solucin exacta y disolverla correctamente para obtener los resultados
esperados

RECOMENDACIONES

Despus de la incubacin es necesario la esterilizacin del material para

eliminar microorganismos que pudieran hacernos dao a nuestra salud
Lvate las manos con agua y jabn antes de salir del laboratorio

PRACTICA #4
TEMA: Mtodos de siembra
Objetivo: practicar los fundamentos de la siembra microbiana
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra
(inoculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano
para su desarrollo y multiplicacin una vez sembrado el medio de cultivo se
incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.
Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen

Que se realice aspticamente

Que los medios de cultivo y el instrumenta a utilizar estn
esterilizados
Que se realicen solo las manipulaciones indispensables
Que se trabaje fuera de toda corriente de aire de ser posible utilizar
un mechero o bien flujo laminar

Tcnica asptica

El asa se caliente hasta incandescencia y se enfra al aire cerca del

mechero o un costado del agar.
Se extrae la muestra con el asa esterilizada
Se realiza la siembra en un medio estril
Se vuelve a esterilizar el asa.
METODOS DE SIEMBRA

El mtodo de siembra a emplear depender de los objetivos que se

pretendan alcanzar con el cultivo ya que en ocasiones se requiere que el
desarrollo del microorganismo se produzca de forma masiva mientras que el
otras resulta indispensables que las colonias queden aisladas o que as
manifestaciones de los microrganismos se realicen en privacin de oxigeno
los mtodos de siembra ms usado son los siguientes.

1.
2.
3.
4.

Siembra
Siembra
Siembra
Siembra

por estras
por puncin
volumtrica
masiva

Siembras por estras: este mtodo de siembra se realiza sobre las

superficies de los medios de cultiv solidos distribuidos en placas de Petri o
en tubos de ensayo solidificados en forma de cua (slam) para la siembra
de estras se utiliza el asa de platino o el hisopo en algunos ocasiones se
utilizan ambos instrumentos en la misma siembra.

Procedimiento
Con la mano opuesta a la sujeta de platino tome la placa de petry de
manera que la tapa quede hacia arriba con la ayuda del dedo pulgar abra
parcialmente la placa.
Introduzca el asa con la muestra y proceda a deslizarla suavemente en la
forma de zigzag desde la pared hasta cubrir a aproximadamente un tercio
de toda la superficie.
Cierre la placa y grela varios cm en contra de las manecillas de reloj
procediendo a abrirla nuevamente el asa y haya un segmento al anterior de
manera que las bacterias sembradas en el primer segmento sean remo
vidas para el segmento.
Repita esta operacin varias veces.
Finalmente cierre la placa y colquela sobre la mesa de trabajo boca abajo y
esterilice el asa a la llama del mechero.
SIEMBRA POR PUNCIN
El instrumento de siembra a emplear ser la aguja de platino y el medio de
cultivo slido generalmente en tubo de ensayo la particularidad que tiene
este mtodo es la aguja (o con el inoculo) debe atravesar
perpendicularmente el medio de cultiv.
SIEMBRA VOLUMTRICA
Este mtodo de siembra consisti en sembrar una muestra lquida cuyo
volumen no puede ser predeterminado en medio de cultivo slido o lquido.
Lquido: muestra de exudado vaginal tomadas con pipeta pasteur no
poseen escala de graduacin.

Ejemplo: muestra de orine en el graduacin Uro cultivo o la sangre para el

hemocultivo se puede determinar con pipeta o jeringuilla respectivamente
el volumen que ser sembrado.
SIEMBRA MASIVA
Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede utilizar la esptula
de drigalsky. En este caso la gota de muestra lquida se esparce por toda la
superficie del medio de cultivo slido imprimiendo un movimiento en espiral
la siembra masiva tambin se puede utilizar con un hisopo grueso embebido
en un cultivo liquido procediendo a su deslizamiento sobre toda la superficie
de una placa de agar.

CONCLUSIONES

desarrollo de microorganismos anaerobios facultativos en un medio lquido se

manifiesta a travs de la turbidez.

El crecimiento bacteriano realizado en la siembra en placas por estra no fue

claramente observable.

El crecimiento microbiano obtenido en la siembra por puncin manifiesta la

existencia de microorganismos aerobios.

En la siembra por puncin y estra se desarroll un tipo de crecimiento filiforme.

El desarrollo de colonias formadas a partir de las diluciones seriadas presentan
caractersticas que difieren en forma, borde, elevacin, superficie y estructura
interna, lo cual es notablemente influenciado por las concentraciones de carga
microbiana del medio en el cual dichas colonias se desarrollan.
RECOMENDACIONES

Usar guantes y tapa boca para evitar contaminaciones.

Esterilizar el rea antes de iniciar el trabajo.

No colocar materiales sobre el mesn de trabajo