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Captulo 18
Marcadores moleculares
Los marcadores moleculares son una herramienta necesaria en muchos
campos de la biologa como evolucin, ecologa, bio-medicina, ciencias
forenses y estudios de diversidad. Adems se utilizan para localizar y aislar
genes de inters. En la actualidad existen varias tcnicas moleculares que
Isoenzimas/aloenzimas
Las isoenzimas fueron originalmente definidas como formas moleculares
mltiples de las enzimas que tienen funciones idnticas o similares y estn
presentes en el mismo individuo (Market y Moller, 1959).
Las isoenzimas pueden presentar varias formas allicas, conocidas como
aloenzimas (Prakash et al., 1969). En su mayora son selectivamente neutras
y se utilizan como marcadores hereditarios para cuantificar las frecuencias
allicas y genotpicas de los individuos, que son los estimadores bsicos de la
composicin gentica de una poblacin. En estudios de gentica las isoenzimas
fueron usadas desde 1966, cuantificando la variacin gentica en poblaciones
humanas y de Drosophila y un poco ms tarde en estudios de plantas superiores
(Harris, 1966; Johnson et al., 1966; Hubby y Lewontin, 1966; figura 1).
La aplicacin de las isoenzimas est dirigida a la cuantificacin de heterocigosis, diversidad gentica, diferenciacin gentica y otras medidas de variacin
gentica intra e interpoblacional. Tambin han sido aplicadas exitosamente
RAPD s
Los RAPDs (polimorfismos de ADN amplificados al azar) son marcadores
que amplifican aleatoriamente segmentos de ADN en una gran variedad de
especies. Los RAPDs se basan en la probabilidad estadstica de que se presenten sitios complementarios al oligonucletido de 10 pares de bases (pb) a lo
largo del genoma. El polimorfismo de las bandas entre los individuos se debe
a cambios en la secuencia de los nucletidos en los sitios de acoplamiento del
Entre las principales ventajas de los RAPDs esta que amplifican regiones
tanto codificantes del ADN como las no codificantes y revelan niveles de
variacin ms altos que los RFLPs e isoenzimas (Williams et al., 1990; Lynch
y Milligan, 1994; Otero et al., 1997; Russell et al., 1997; Parker et al., 1998);
es una tcnica relativamente fcil que no necesita conocimiento previo de la
secuencia de ADN, no requiere la construccin o el mantenimiento de una
librera genmica, el nmero de loci que puede ser examinado es ilimitado y
no requiere pruebas radiactivas (Reiter et al., 1992; Whitkus et al. 1994).
Sin embargo los problemas prcticos detectados con los RAPDs son la
presencia de bandas errneas (artefactos), la reproducibilidad de los resultados y la comigracin de bandas. Asimismo, muchos de los alelos raros
presentes en las poblaciones estudiadas con RAPDs no son detectados o
pueden ser mal interpretados (Zhivotovsky, 1999). Por otro lado, como los
loci son dominantes, los RAPDs dan menos informacin gentica por locus
que los marcadores codominantes.
Al analizar los datos obtenidos con RAPDs se deben tener en cuenta dos
supuestos: 1) cada uno de los marcadores representa un locus mendeliano en
el cual el marcador visible, el alelo dominante, est en equilibrio de HardyWeinberg con un alelo recesivo y 2) los alelos marcados para diferentes loci
no migran a la misma posicin en el gel (Lynch y Milligan, 1994).
Figura 2. Patrones de bandeo con RAPDs en Ferocactus robustus en gel de agarosa
y tincin con bromuro de etidio (foto de Israel Carrillo).
Microsatlites
Los microsatlites o secuencias simples repetidas (SSRs; Litt y Luty, 1989) son
secuencias de ADN formadas de 1 a 4 pares de bases, por ejemplo mononucletidos (TT)n, dinucletidos (AT)n, o tetranucletidos (AAGG)n. Estos loci se
encuentran en regiones codificantes y no codificantes del ADN y es probable
que se formen por eventos de rompimiento que generan polimorfismos con
valores superiores al 90% (Armour et al., 1994; Coltman et al., 1996; Gupta
et al., 1996; figura 3).
Los microsatlites de ADN nuclear han sido detectados en mltiples
grupos de plantas y animales, y han sido utilizados fundamentalmente para
estudios de variacin gentica intra e interespecfica (Edwars et al., 1991;
Armour et al., 1993; Devey et al., 1996; Queller et al., 1993; Weight y Bentzen,
1994), anlisis de linajes (Queller et al., 1993) y de sistemas reproductivos
(Awadalla y Ritland, 1997). Recientemente se han encontrado microsatlites
en algunos organelos citoplasmticos, como el cloroplasto (SSRc; Powell
et al., 1995a, b; Vendramn et al., 1996; figura 3 ) y la mitocondria (SSRm;
Soranzo et al., 1998) lo que ha enriquecido la fuente de estudios evolutivos,
ya que estos organelos son heredados uniparentalmente y no estn sujetos
a recombinacin, por lo que los cambios acumulados que observamos en
las poblaciones se deben slo a los procesos de mutacin y demogrficos
(Echt et al., 1998). Esto permite contestar preguntas evolutivas muy puntuales relacionadas con el monitoreo del flujo gentico, introgresin (Vendramin et al., 1998), anlisis de paternidad (McCracken et al., 1999), para
hacer inferencias de parmetros demogrficos y para determinar patrones
evolutivos de los procesos histricos del origen de especies, formas o razas
(Golstein et al., 1996).
Los microsatlites han tomado ventaja sobre otros marcadores genticos
como los AFLPs, RAPDs, RFLPs, debido a que: i) tienen el ms alto grado
de polimorfismo; ii) segregan de manera mendeliana y son codominantes;
iii) la presencia de un solo locus gentico por microsatlite hace que la lectura de las bandas sea clara y fcil de interpretar y iv) son selectivamente
neutros (Golstein y Pollock, 1994; Vendramin et al., 1996). Adems, para
trabajar con SRR es necesario conocer la secuencia de la regin a analizar
para contar con primers especficos que amplifiquen la regin repetitiva
(el microsatlite) responsable de la variacin observada, que adems es
homloga para diferentes especies o incluso gneros (Golstein et al., 1996).
Esto es, los microsatlites son especficos para ciertos grupos de especies y
ISSRs
Es un marcador molecular conocido como secuencias repetidas intersimples.
Esta es una tcnica relativamente nueva y es similar a los RAPDs, excepto que
en los ISSRs el primer es un di trinucleotido repetido (Culler y Wolfe, 2001
vase el captulo 19 de este libro).
Los dos mtodos que se utilizan en la electroforesis de ISSRs son: a) gel de
agarosa visualizado con bromuro de etidio, y b) geles de acrilamida teidos
con nitrato de plata.
Las bandas que se obtienen con este marcador van de 100 a 2000 pb. La
variacin allica en los ISSRs consiste de la presencia o ausencia de los productos amplificados.
Comparada con los primers de los RAPDs las secuencias de los ISSRs es
usualmente larga lo que resulta en una mayor reproductibilidad de las bandas.
Los ISSRs han sido utilizado en especies cultivadas desde 1994, pero
slo recientemente se han utilizado en estudios de la variacin poblacional
en especies silvestres (Wolfe y Liston, 1998; Wolfe et al. 1998 a,b). Hasta la
fecha slo existen algunos estudios donde se ha comparado directamente la
variacin gentica, incluyendo estimaciones de la tasa de fecundacin cruzada (que tradicionalmente se estima con marcadores codominantes) y se ha
utilizado esta tcnica en especies donde la variacin poblacional con enzimas
es pequea o no existe. Dada la alta variacin gentica entre individuos de
una misma poblacin, sera recomendable utilizar estos marcadores para
anlisis de paternidad.
Entre las ventajas principales de los ISSRs es que tienen un gran nmero
de bandas polimorficas. En un estudio realizado en Viola pubescens una planta
cleistogamica se report una gran variacin gentica. A nivel de especie, el
100% de los loci fueron polimorficos an cuando los primers (se utilizaron
tres) fueron seleccionados al azar. Dentro de cada poblacin cerca del 71%
de 83 loci fueron polimorficos (Culley y Wolfe 2001). Adems es una tcnica
relativamente fcil de montar, altamente repetible y ya existen primers universales para plantas.
Figura 4. Patrones de ISSRs en Opuntia rastrera en gel de agarosa al 1.5% y tincin con
bromuro de etidio (foto de Lucia Plasencia)
Por otro lado las limitaciones de los ISSRs son: que las bandas son ledas
como marcadores dominantes, es decir cuando tenemos la presencia de la
banda no se sabe si el individuo es homcigo dominante o hercigo, que la
diversidad gentica est basada considerando que cada banda representa un
locus con dos alelos y que el alelo dominante esta en equilibrio de HardyWeinberg con un alelo recesivo y por ltimo que es una tcnica relativamente
cara, ya que involucra el uso de geles de poliacrilamida y para su visualizacin
nitrato de plata.
RFLP s
El anlisis de polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restriccin
(RFLPs) fue el primer marcador de ADN utilizado por bilogos poblacionales
(Parker et al., 1998). Este mtodo expresa diferencias especficas del ADN que
fueron reconocidas por enzimas de restriccin particulares (endonucleasas).
Cada una de las endonucleasas (de origen bacteriano), reconoce y corta solamente una secuencia especfica de bases nitrogenadas en el ADN, siempre
y cuando stas no estn protegidas (metiladas). Por consiguiente cualquier
ADN que no est metilado puede ser reconocido y cortado en fragmentos de
longitud definida; y cualquier mutacin dentro de esos sitios, podra cambiar
el patrn del fragmento y permitir que se detecte un RFLP al comparar dos o
ms genomas (Valadez y Kahl, 2000). Para detectar RFLPs hay dos tcnicas:
southern blots e hibridizacin, y PCR.
Southern blots e hibridizacin
Es necesario en primer lugar aislar el ADN del organismo de inters (vase el
captulo 15 de este libro, purificarlo y cortarlo con una o ms endonucleasas
de restriccin. Los fragmentos resultantes se separan en geles de agarosa por
electroforesis y se transfieren a una membrana que puede ser de nylon o de
nitrocelulosa (southern blotting). La subsecuente hibridacin con una sonda
marcada y deteccin con autorradiografa, luminografa o quimioluminiscencia
har visible un fragmento de ADN especfico, que puede ser comparado con
el fragmento resultante de otros genomas tratados de la misma forma (Parket
et al., 1998). La sonda marcada se obtiene de fragmentos de ADN nuclear, de
organelos o bien de ADN complementario, tambin denominado ADN copia
(ADNc) que es una molcula de una sola hilera producida en el laboratorio
usando mRNA como molde y transcripcin reversa (vase el captulo 15 de este
B
mARN
+ oligo (dT)
AAA
mARN
AAA
Transcriptasa de reversa dNTPs
mARN
AAA
TTT
ARNasa HPolimerasa
de ADN
dNTPs
AAA
TTT
Ligasa Eco Rl
cADN
mARN
cADN
GGAATTCC
CCAATTCC
GGAATTCC
CCAATTCC
Transferencia al filtro
COS
GG
CCAATTCC
Eco Rl dirigido, ? GT 10, Ligasa
de ASDN
Inserto
COS
Autorradiografa
Biblioteca de ? gt 10
AFLP s
Los AFLPs (polimorfismos de longitud de los fragmentos amplificados)
son una tcnica que combina la digestin de dos enzimas de restriccin,
generalmente Mse I que reconoce y corta 4 pb y Eco RI que reconoce y
corta 6 pb dentro de una secuencia, con la unin de secuencias especficas
al nucletido ligado a los extremos de los fragmentos de restriccin y dos
Secuenciacin de ADN
Los anlisis ms detallados de diferenciacin de ADN pueden obtenerse secuenciando la regin de inters para diferentes individuos. Hasta hace poco
tiempo, el uso extenso de secuencias de ADN para los estudios de poblaciones
no haban sido prcticos porque los fragmentos de ADN para cada individuo tenan que ser aislados para libreras de ADN subgenmico despus de
haber sido identificados por southern blotting e hibridizacin. Sin embargo,
actualmente el uso de secuencias es muy comn: se ha aplicado en anlisis
de gentica de poblaciones y problemas taxonmicos.
Este mtodo incluye cuatro pasos: i) identificar secuencias que tenga la
variacin necesaria; ii) aislar y purificar un nmero elevado de la secuencia (ya
sea por clonacin o amplificacin); iii) secuenciar; iv) alinear la secuencia (con
los programas MALIGN, Clustal V para Macintosh ver. 1.5, JACK ver. 4.2).
Las tcnicas que existen para secuenciar son la qumica, la enzimtica y
la automtica.
La qumica diseada por Alan Maxan y Walter Gilbert consiste en dividir el
ADN en cuatro muestras y tratar cada una con agentes qumicos que rompen
el ADN especficamente en una base, bajo condiciones en las que solo unos
pocos nucletidos del fragmento se afectan. Los fragmentos se marcan con
radiactividad y se auto radiografan.
En el mtodo enzimtico de Fred Sanger el ADN a ser secuenciado se utiliza
como patrn de referencia para producir una sntesis in vitro, mediante una
polimerasa y una rplica de ADN que inicia la sntesis del ADN siempre en
el mismo sitio. El punto crtico es el uso de trifosfato de dideoxirribonuclesido: la deoxirribosa no cuenta con el grupo 3-OH, de tal forma que cuando
el nucletido es incorporado a la cadena de ADN, se bloquea la adicin del
siguiente nucletido, por lo que cada molcula de ADN sintetizada va a terminar aleatoriamente en dicho nucletido. Esta sntesis se lleva a cabo en cuatro
muestras; en cada muestra se incorpora un dideoxinuclesido con una base
diferente (ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP) y los otros tres deoxinucletidos
A
A
T
T
C
C
G
G
Polimerasa
ddATP
1
5
3
GGATTG A
CGTAACT
+ dd AT P
C A A G C A
+ dd C T P
+ dd T T P
+ dd G T P
C A A G C C A A G C A T
C A A C G A T
C A A CG A TTG A
A
GT T C T A A C T
C A A
ADN Polimerasa
+ dATP
dCTP
dTTP
dGTP
C A A A
C A A C G A T T G
G
A
G
T
T
A
C
G
Microarrays (microarreglos)
El microarray es un arreglo de cientos de millares de secuencias de ADN inmovilizadas y bien ordenadas en forma de matriz adheridas a una superficie slida,
generalmente de cristal. Cada secuencia corresponde a un gen diferente. Esta
tcnica es utilizada para detectar niveles de expresin de los genes colocados en
el microarray. Esto se logra extrayendo el mARN de la clula de inters o de algn
tejido particular, sometindolo a transcripcin inversa para obtener cADN (vase el captulo 16 de este libro)y combinando ste con un marcador fluorescente
(usualmente los tintes de cianina Cy3 y Cy5) para generar una sonda, que es hibridizada sobre la matriz del microarray, de manera que para cada gen se detecta
el grado de fluorescencia, lo cual da el nivel de expresin del gene.
Los microarrreglos pueden ser divididos en dos tipos principales que difieren en su construccin: spotted microarrays (microarreglos punteados) y
arreglos de oligonucletidos de alta densidad. Los microarreglos punteados
usan generalmente muestras de ADN de 500 a 5000 bases (Ekins et al., 1999)
producidos por PCR a partir de bibliotecas o de bases de datos como GenBank, UniGene, dbEST, etc. Las secuencias son depositadas sobre la superficie
slida por un robot en lugares definidos. Hay dos mtodos de depositar los
puntos:
Distribuidor activo: basado en la tecnologa de las impresoras de inyeccin
de tinta.
Distribuidor pasivo: aplica la solucin de ADN con un alfiler que toca la
superficie slida. Se puede obtener una mayor densidad de manchas usando
este mtodo.
La superficie slida generalmente es un portaobjetos especialmente
cubierto pero tambin se pueden usar membranas de nylon y portaobjetos
cubiertos de oro. El tamao de los puntos de la matriz tpicamente vara de 80
a 150 m de dimetro y en un solo portaobjetos cabe un mximo de 80,000
puntos. En los microarrays punteados es comn comparar las expresiones
genticas de dos muestras biolgicas (tejido con tumor vs. tejido sin tumor,
por ejemplo) en un mismo portaobjetos, as que el mRNA es preparado
para que los dos niveles de expresin puedan ser medidos (Schena et al.,
1995; figura 9).
Por su parte, los microarreglos de oligonucletidos de alta densidad son
construidos comercialmente y tienen una precisin y densidad muy alta al
usar oligonucletidos cortos de 20 a 25 bases.
Dos de las compaas que construyen estas clases de micrroarreglos son
Affymetrix y Agilent Technologies. Los microarreglos de Affymetrix son los
ms populares y son conocidos como GeneChipsTM, producidos sintetizando
decenas de miles de oligonucletidos cortos in situ usando tcnicas de fotolitografa. Affymetrix produce diferentes microarrays, cada uno con diferente
composicin de genes (Lockart et al., 1996).
Los microarreglos necesitan ser ledos por un instrumento apropiado para
convertir la distribucin de florescencia o radioactividad en una imagen de
computadora. En el caso de las sondas fluorescentes, se pueden usar escners
de lser o cmaras CCD. En la imagen de computadora cada intensidad del
punto corresponde a un nivel de expresin de la sonda. Puesto que un punto
contiene mltiples pixeles, es normal promediar todos los pixeles de un mismo
punto junto con los pixeles del borde exterior. Sin embargo, la cuantificacin
Tumor
RT/PCR
Mercado con
compuestos
fluorescentes
Combinar en
cantidades
iguales
Hibridar la sonda
a la micromatriz
SCAN
Tecnologa de micromatrices
Los dos grandes problemas que se presentan con los datos de microarreglos
son por un lado los niveles de expresin, que varan de experimento a experimento, y por las diversas fuentes de errores aleatorios y sistemticos durante
el anlisis. Por otro lado, hay un pequeo nmero de muestras comparado
con el gran nmero de variables, lo que causa que las tcnicas estadsticas
tradicionales fracasen. Otra gran limitante de los microarrays proviene, irnicamente, de su productividad notable, y actualmente los cientficos apenas
pueden hacer frente al volumen enorme de informacin producida por los
microarreglos, adems de tener un alto costo.
Bibliografa
Aagaard J.E., V.K. Krutovskii y H.S. Strauss. 1998. RAPDs and allozymes exhibit
similar levels of diversity and differentiation among populations and races of
Douglas-fir. Heredity 81:69-78.
Armour A. L., R. Neuman, S. Gobert y A.J. Jeffreys. 1994. Isolation of human simple
repeat loci by hybridization selection. Human Molecular Genetics 3(4):599-605.
Ashley C.T. y S.T. Warren. 1995. Trinucleotide repeat expansion and human disease.
Annual Review Genetics 29:703-728.
Ayala F.J. 1984. Gentica Moderna. Fondo Educativo Interoamericano, Barcelona.
Avise, C.J. 1994. Molecular markers, natural history and evolution. Chapman & Hall,
New York.
Backeljau T., L. De Brun, H. De Wolf, K. Jordaens, S. Dongen, R. Verhagen y B. Winnepenninckx. 1995. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) and parsimony
methods. Cladistics 11:119-130.
Berovides V. y M.A. Alfonso. 1995. Biologa evolutiva. Pueblo y Educacin, La Habana.
Brettschneider R. 1998. Molecular tools for screening biodiversity in plants and animals.
Chapman & Hall, Londres.
Brown A.H.D. 1979. Enzyme polymorphisms in plant populations. Theoretical Population Biology 15:1-42.
Brown W.M., M. George Jr. y A. C. Wilson. 1979. Rapid evolution of mitochondrial
DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1967-1971.
Brown, P.O. y D. Botstein. 1999. Exploring the new world of the genome with DNA
microarrays. Nature Genetics 21: 3337.
Coltman D.W., D.W. Bowen y J.M. Weith. 1996. PCR primers for harbour seal (Phoca
vitulina concolour) microsatellites amplify polymorphic loci other pinniped species. Molecular Ecology 5:161-163.
Culley M.T. y A.D. Wolfe. 2001. Population genetic structure of the cleistogamous
plant species Viola pubescens Aiton (Violaceae), as indicated by allozyme and
ISSR molecular markers. Heredity 86:545-556.
Dervey M. E., J.C. Bell, D.N. Smith, D.B. Neale y G.F. Moran. 1996. A genetic
linkage map for Pinus radiata based on RFLP, RAPD and microsatellite markers.
Theor. Appl. Genet. 92:673-679.
Dirienzo A. y C. Wilson. 1991. Branching pattern in the evolutionary tree for human
mitochondrial DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1597-1601.
Echt C. S., L. De Verno, M. Arzide y G.G.Vendramin. 1998. Chloroplast microsatellites
reveal population genetic diversity in red pine, Pinus resinosa. Molecular Ecology
7:307-309.
Eduars A., A. Civetello, H.A. Hammond y T. Caskey. 1991. DNA typing and genetic
mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats. American Journal Human
Genetics 49:746-756.
Ekins R. y F.W. Chu. 1999. Microarrays: their origins and applications. Trends in
Biotechnology 17:217-218.
Golstein D.B. y D.D. Pollok. 1994. Least-squares estimation of molecular distance
noise abatement in phylogenetic reconstruction. Theoretical Applied Genetics
12:432-440.
Golstein D.B., L.A. Ruz, L.L. Cavalli-Sforza y M.W. Feltman. 1995a. An evaluation
of genetic distances for use with microsatellite loci. Genetics 139:463-471.
Golstein D.B., L.A. Ruz, L.L. Cavalli-Sforza y M.W. Felman. 1995b. Genetics absolute
dating based on microsatellites and the origin of modern human. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 92:6723-6727.
Golstein D.B., L.A. Zhivotovsky, K. Nayar, L.A. Ruz, L.L. Cavalli-Sforza y M.W. Feltman. 1996. Stadistical properties of the variation at linked microsatellite loci:
implications for the history of human Y-chromosome. Molecular Biology and
Evolution 13:1213-1218.
Griffiths A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin y W.M. Gelbart 1993. Genetic
Analysis. Freeman. New York.
Gupta M., Y.S. Chyi, J. Romero-Severson y J.L. Own. 1994. Amplification of DNA
markers from evolutionary diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats. Theoretical. Applied Genetics 89:998-1006.
Gwynne P. y G. Page. Microarray analysis: the next revolution in molecular biology.
Science. 1999. Special advertising supplement.
Harris H. 1966. Enzyme polymorphisms in man. Proceedings of the Royal Society
Series B 164:298-31.
Shriver M.D. 1995. A novel measure of genetic distance for hightly polymorphic
tandem repeat loci. Mol. Biol. Evol. 12: 914-920.
Simpson J. 1997. Amplified fragment length polymorphisms. Bol. Soc. Bot. Mx.
60:73-76.
Soranzo N., J. Porvan. y W. Powell. 1999. An example of microsatellite length variation
in the mitochondrial genome of conifers. Genome 42:158-161
Slatkin M. 1995a. A measure of population subdivision based on microsatellite allele
frequencies. Genetics 139:457-462.
Stansfield W.D. 1992. Gentica. McGraw- Hill, Mxico.
Swofford D.L., G.J. Olsen, P.J. Waddell y D.M. Hillis. 1996. Phylogenetic inference. In:
Hillis D.M., C. Moritz y B.K. Mabbe. Molecular Systematics. Sinauer Associates
Inc. Massachusetts. pp. 407-510
Valadez E. y G. Kahl. 2000. Huellas de ADN en genomas de plantas. Universidad
Autnoma Chapingo. Mxico.
Vendramin G.G., L. Lelli, P. Rossi y M. Morgante. 1996. A set of primers for the
amplification of 20 chloroplast microsatellites in Pinaceae. Molecular Ecology
5:595-598.
Vendramin G.G., M. Anzide, Madaghiele y G. Bucci. 1998. Distribution of genetic
diversity in Pinus pinaster Ait. as revelad by chloroplast microsatellites. Theor.
Appl. Gen. 97: 456-463.
Vos P., R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, T. Van de Lee, M. Hornes, A. Frijters, J.
Pot, J. Peleman, M. Kuiper y M. Zabeau. 1995. AFLP: a new technique for DNA
fingerprinting. Nucleic Acids Research 23:4407-4414.
Weber L. y C. Wong. 1993. Mutation of human short tandem repeats. Human Molecular Genetics 2:1123-1128.
Whitkus R., J. Doebley y J.F. Wendel. 1994. Nuclear DNA markers in systematics and
evolution. In: Phillips R.L. y J.K. Vasil (ed.). DNA-based markers in plants. Klumer
Academic Publishers, Netherlands. pp. 116-141.
Wiessenbach, J. y G. Dib. 1992. A second-generation link-age map of the human
genome. Nature 359: 794-801.
Williams J.G.K., A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski y S.V. Tingey. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucl.
Acids Res. 18:6531-6535.
Zhivotovsky L.A. 1999. Estimating population structure in diploids with multilocus
dominant DNA markers. Molecular Ecology 8:907-913.