CINTICA ENZIMTICA

BRYAN GARCA MUNVAR

COD. 6152590

PRESENTADO A:
LUZ B. PARDO R.

FUNDACION UNIVERSIDAD DE AMRICA

FACULTAD DE INGENIERAS
INGENIERA QUMICA
BIOQUMICA GR.1
2016

INTRODUCCIN
Las enzimas son polmeros biolgicos que catalizan las reacciones qumicas, es decir aceleran dichas
reacciones, para el funcionamiento normal del organismo. La accin cataltica de una enzima, o sea
su actividad, se mide cuantificando el incremento de la velocidad en condiciones perfectamente
definidas.
Es por esto que surge la cintica enzimtica, que es el estudio de la velocidad de las reacciones
qumicas que son catalizadas por las enzimas. Este estudio permite explicar los detalles de los
mecanismos catalticas, el papel en el metabolismo, cmo es controlada su actividad en la clula y
como puede ser inhibida o potenciada su actividad por diversas sustancias qumicas.
Para medir la actividad de una enzima es necesario partir de un tejido o material que la contenga.
Por lo general se rompen todas las clulas del tejido mediante diversos procedimientos en un medio
lquido a una temperatura entre 0 y 4C con objeto de evitar la desnaturalizacin de las protenas.
A este proceso de le llama homogenizacin, a partir del homogenizado es posible separar partculas
subcelulares, o bien seguir los pasos habituales para la purificacin de protenas y purificar la
enzima.
La manera ms usual de medir la actividad de una enzima es incubar la preparacin enzimtica,
generalmente a 37C por periodos variables de tiempo y medir el producto de la reaccin enzimtica
en un tiempo dado (mediante espectrofotometra o radiometra). Si la reaccin es lineal en el
tiempo, hasta un periodo determinado, se puede expresar la actividad enzimtica en trminos de
velocidad, es decir la cantidad de producto formado por unidad de tiempo. A medida que avanza la
reaccin, se va agotando la cantidad de sustrato y va disminuyendo la cantidad de producto que se
genera por unidad de tiempo (disminuye la velocidad de la reaccin), lo que se manifiesta en forma
de curva asinttica en la grfica. Dependiendo de las condiciones del ensayo y del tipo de enzima,
el perodo inicial puede durar desde milisegundos hasta horas. Los ensayos enzimticos suelen estar
estandarizados para que el perodo inicial dure en torno a un minuto, para llevar a cabo las medidas
ms fcilmente.
La mayora de los estudios de cintica enzimtica se centran en el perodo inicial, es decir, en la zona
lineal de la reaccin enzimtica. Sin embargo, tambin es posible medir toda la curva de la reaccin
y ajustar estos datos a una ecuacin no lineal. Esta forma de medir las reacciones enzimticas es
denominada anlisis de la curva de progreso.
Para estandarizar el fenmeno de las reacciones enzimticas surge la cintica de Michaelis-Menten,
que propuso un modelo que describe la velocidad de mltiples reacciones de este tipo. Para
determinar la velocidad mxima de una reaccin enzimtica, la concentracin de sustrato ([S]) se
aumenta hasta alcanzar una velocidad constante de formacin de producto. Esa es la velocidad
mxima (Vmax) de la enzima. En ese caso, los sitios activos de la enzima estn saturados con
sustrato.

Grfica 1. Curva de Michaelis

La velocidad V indica el nmero de molculas del sustrato que se convierten en producto por
segundo. Con concentraciones crecientes de sustrato [S], la enzima va acercndose asintticamente
a su velocidad mxima Vmax, pero nunca la alcanza. A partir de esta definicin se establece que las
enzimas pueden caracterizarse mediante la concentracin de sustrato a la cual la velocidad de
reaccin es la mitad de la velocidad mxima. Esta concentracin de sustrato se conoce como
constante de Michaelis-Menten (KM).

A continuacin se muestran los resultados experimentales de una curva de progreso y su

correspondiente tabla.
Tiempo (s)

mol
mol
sustrato
sustrato
0
100
0
5
90
10
10
81
19
15
72,9
27,1
20
65,6
34,4
25
59
41
30
53,1
46,9
35
47,8
52,2
40
43
57
45
38,7
61,3
60
34,9
65,1
Tabla 1. Datos Tabla de Progreso

120
100

[A] o [P]

80
60
40
20
0
0

10

20

30

40

50

60

70

Tiempo (s)
mol sustrato

producto
mol sustrato

Grfica 2. Curva de Progreso

Para determinar la velocidad inicial se calcula la pendiente de la tangente en el origen, (lnea roja
en la grfica 1).
=

2 1 10 0
=
2 1
5 0

 = = 2

Posteriormente se realiz el estudio de las velocidades iniciales para cada concentracin, de la que
se obtuvieron los siguientes datos:
A
Vo
1/A
1/Vo
A/Vo
Vo/A
0
0
10
28,6
0,1000
0,0350
0,3497
2,8600
20
44,4
0,0500
0,0225
0,4505
2,2200
30
54,5
0,0333
0,0183
0,5505
1,8167
40
61,5
0,0250
0,0163
0,6504
1,5375
50
66,7
0,0200
0,0150
0,7496
1,3340
60
70,6
0,0167
0,0142
0,8499
1,1767
70
73,7
0,0143
0,0136
0,9498
1,0529
80
76,2
0,0125
0,0131
1,0499
0,9525
90
78,3
0,0111
0,0128
1,1494
0,8700
100
80,0
0,0100
0,0125
1,2500
0,8000
Tabla 2. Datos de Velocidad inicial respecto a la concentracin del sustrato
A partir de estos datos se muestra la curva de Michaelis.
90
80
70

Vo

60
50
40
30
20
10
0
0

20

40

60

80

100

120

[A]

Grfica 3. Curva de Michaelis

Suponiendo que a una velocidad de 80 la enzima alcanz su velocidad mxima, la primera
apreciacin que se puede hacer para la contante de Michaelis es el valor de la concentracin de
sustrato a 40.
Esto debido a que se cumple que:
1
= , = []
2

Sin embargo el resultado obtenido para la contante es inexacto, dependiente de la apreciacin del
que ejecute el clculo. Por esta razn se procede a determinar los valores de la constante de
Michaelis, Ka; y la velocidad mxima Vm a partir de distintas linealizaciones de la ecuacin de
Michaelis.

SISTEMA DE LINEWEAVER BURK

1
1
1
=
+
[]
0,04
0,035

0,03
y = 0,2498x + 0,01

1/Vo

0,025
0,02
0,015
0,01
0,005
0
0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

1/[A]

Grafica 4. Linealizacin por sistema de Lineweaver-Burk

A partir de los valores de la pendiente y el intersecto se calculan la constante de Michaelis y la

velocidad mxima:
=
=

1
0,01

= 100

=
= 0,2498 100
= 24,98

SISTEMA DE HANES
[]
1

=
[] +

1,4
1,2

[A]/Vo

1
y = 0,01x + 0,2502

0,8
0,6
0,4
0,2
0
0

20

40

60

80

100

120

[A]

Grafica 5. Linealizacin por sistema de Hanes

A partir de los valores de la pendiente y el intersecto se calculan la constante de Michaelis y la
velocidad mxima:
=

1
1
=
= 100
0,01

= = 100 0,2502 = 25,02

SISTEMA DE HOFSTEE

Vo

=
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0,0000

+
[]

y = -25,007x + 100,01

0,5000

1,0000

1,5000

2,0000

2,5000

3,0000

Vo/[A]

Grafica 6. Linealizacin por sistema de Hofstee

3,5000

A partir de los valores de la pendiente y el intersecto se calculan la constante de Michaelis y la

velocidad mxima:
= = 100,01
= = 25,007

Los resultados obtenidos se resumen en la siguiente tabla:

SISTEMA

Lineweaver
100,00
24,98
Hanes
100,00
25,02
Hofstee
100,01
25,01
Promedio
100,00
25,00
Tabla 3. Resultados sistemas de linealizacin para el clculo de velocidad mxima y constante de
Michaelis

INHIBIDORES

Posteriormente se realiza el anlisis de un inhibidor, los resultados se muestran a continuacin:

[I] nm
0
10
20
30
Vo moles /minuto
[A] mM
V0
V10
V20
V30
0
0
0
0
0
1
100
66,7
50
40
2
133,3
88,9
66,7
53,3
3
150
100
75
60
4
160
106,7
80
64
5
166,7
111,1
83,3
66,7
6
171,4
114,3
85,7
68,6
7
175
116,7
87,5
70
8
177,8
118,5
88,9
71,1
9
180
120
90
72
10
181,8
121,2
90,9
72,7
Tabla 4. Resultados del efecto de la concentracin de un inhibidor

Para el clculo de las constantes de Michaelis y velocidades mximas se realiza una linealizacin de
los datos obtenidos por el sistema de LINEWEAVER BURK, posteriormente se graficaron.

0,03
y = 0,0125x + 0,0125

0,025

y = 0,01x + 0,01

1/V

0,02

y = 0,0075x + 0,0075

0,015

y = 0,005x + 0,005

0,01
0,005
0
0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1/[A]
1/Vo

1/V10

1/V20

1/V30

Grfica 7. Linealizacin por sistema de Lineweaver- Burk, para estudio de efecto de inhibidor.
Los valores determinados se muestran en la siguiente tabla:
m
b
Vm
Ka
Vo
0,005
0,005
200
1
V10
0,0075
0,0075
133,333333 1
V20
0,01
0,01
100
1
V30
0,0125
0,0125
80
1
Tabla 5. Constantes de Michaelis y Velocidades mximas por efecto de inhibidor
A partir de los datos de la tabla se observa que la velocidad mxima disminuye con el aumento de
la concentracin y la constante de Michaelis se mantiene constante. Teniendo en cuenta esto, se
establece que el inhibidor es de tipo no competitivo y est regido por la siguiente ecuacin:
1

1
1

=
(1 +
)
+
(1 +
)

[]

Donde Kis es la constante de inhibicin que afecta la pendiente y Kii es la constante de inhibicin
que afecta la interseccin. Para hallarlas se grafica la pendiente obtenida vs la concentracin de
inhibidor.

0,014
y = 0,0003x + 0,005

0,012
0,01

Pendiente

0,008
0,006
0,004
0,002

0
-30

-20

-10

-0,002

10

20

30

40

[I]

Grfica 8. Pendiente vs concentracin de inhibidor

El valor de intersecto con el eje x ser el valor de la constante de inhibicin que afecta la pendiente,
Kis. En este caso, este valor se determina as:
= 0,0003 + 0,005
=
=

0,005
0,0003

0 0,005
= 16,667
0,0003
= 16,667

Se realiza un procedimiento similar para obtener el valor de la constante de inhibicin que afecta la
interseccin.
0,014
y = 0,0003x + 0,005

0,012
0,01

Interseccin

0,008
0,006
0,004
0,002
0

-30

-20

-10
-0,002

10

20

30

[I]

Grfica 9. Interseccin vs concentracin de inhibidor

40

 = 0,0003 + 0,005
=
=

0,005
0,0003

0 0,005
= 16,667
0,0003
= 16,667

CONSIDERACIONES DEL ESTUDIO ENZIMATICO E IMPORTANCIA

A partir de los datos se determinaron mltiples parmetros de importancia para el entendimiento
general de la cintica de una enzima determinada. A partir de la curva de progreso se pudo ver el
comportamiento del sustrato y del producto con respecto al tiempo. Trazando una lnea tangente a
la lnea del producto se pudo determinar la velocidad inicial de la reaccin, la cual fue de 2mol/s.
Posteriormente se realiz la curva de Michaelis para determinar los valores de la constante de
Michaelis y la velocidad mxima, sin embargo el valor obtenido estaba sujeto a posibles errores, de
modo que se realiz una linealizacin por tres mtodos, Lineweaver-Burk, Hanes y Hofstee, de los
que se puede determinar con exactitud los valores de Vmax y KM. Estos procedimientos arrojaron
resultados similares, de modo que el uso de cualquiera de los tres no representa un cambio
significativo en las constantes halladas.
Por ltimo se estudi el efecto del inhibidor en la velocidad de reaccin de la enzima. A partir de la
grfica de linealizacin Lineweaver-Burk, se observa que a medida que la concentracin del
inhibidor aumentada, la velocidad de la reaccin disminua. Adems, se estableci el tipo de
inhibidor a partir de dicha grfica, en este caso de tipo no competitivo, pues se mantuvo contante
el valor de KM pero la velocidad mxima disminuy. Se determin el valor de las constantes de
inhibicin (que afecta la interseccin y la pendiente), para cuantificar como se ve afectada la accin
de la enzima por el inhibidor.
Conocer el efecto de inhibicin de una sustancia es de vital importancia en mltiples reas, ya que
a veces la inhibicin de una sola enzima que forma parte de una cadena de reacciones metablicas
puede inhibir por completo a todo el proceso metablico involucrado y ejercer en esa forma un
efecto profundo y a veces fatal sobre el organismo . El efecto de un inhibidor puede matar

organismos patgenos o corregir desequilibrios metablicos. Sin embargo para su aplicacin es

necesario conocer parmetros de dichos inhibidores, como lo es su especificidad, (capacidad de
unirse a ciertas enzimas) y su potencia (capacidad de disociacin, que indica la concentracin
necesaria para inhibir una enzima). Si el medicamento tiene alta especificidad y potencia asegura
que va a tener pocos efectos secundarios y una baja toxicidad.
Conocer el tipo de inhibidor tambin es de vital importancia ya que determinar el tiempo de
inhibicin, inclusive puede llegar a modificar la estructura de la protena de modo que nunca volver
a su estado original (irreversible).
Puesto que las enzimas han evolucionado para unirse a sus sustratos fuertemente, y la mayora de
los inhibidores reversibles se unen al sitio activo de las enzimas, es poco sorprendente que algunos
de estos inhibidores sean muy similares en estructura a los sustratos de sus dianas. Como ejemplo
de estos imitadores de sustratos cabe destacar los inhibidores de la proteasa, una clase muy efectiva
de frmacos antirretrovirales usados para tratar el VIH.