Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
FLORIANPOLIS
SEMESTRE 2009.2
Sumrio
Normas de trabalho no laboratrio de microbiologia............................................ 03
Aula 1 Meios de cultura..................................................................................... 04
Aula 2 Tcnicas de cultivo................................................................................. 06
Aula 3 Gram Gram positiva e Gram negativa................................................. 07
Aula 4 Esterilizao e Desinfeco....................................................................09
Aula 5 Microscopia a fresco.............................................................................. 11
Aula 6 Antibiograma.......................................................................................... 12
Aula 7 Cocos Gram positivos............................................................................ 13
Aula 8 Anlise do ndice colimtrico da gua.................................................... 16
Aula 9 Enterobactrias.......................................................................................19
Aula 1
Meios de Cultura
Ainda, alm dos nutrientes, o meio de cultura deve suprir algumas condies
ambientais:
- pH
- Atmosfera
- Presso osmtica
1. Quanto origem:
a) Naturais
b) Artificiais
2. Quanto composio:
a) Complexos
b) Sintticos
3. Quanto ao estado fsico:
a) Lquido
4
b) Semi-slido
c) Slido
4. Quanto finalidade:
a) Meios Bsicos
b) Meios Seletivos
c) Meios Diferenciais
d) Meios de enriquecimento
e) Meios enriquecidos
f) Meios de manuteno
g) Meios de transporte
Aula 2
Tcnicas de Cultivo
Procedimentos
Aula 3
Gram Gram positiva e Gram negativa
As bactrias coradas pela tcnica de Gram pertencem a duas categorias
distintas: Gram-positivas e Gram-negativas. As diferenas entre os dois grupos
resultado da estrutura de suas paredes celulares, visto que as paredes das clulas
Gram-negativas possuem um contedo lipdico mais elevado que das Gram
positivas.
Preparao do esfregao
1. Material: Bico de Bunsen
Meio de Cultura (Meio lquido ou slido)
Lmina LSD
Ala de platina
2. Tcnica:
a) Esterilizar a ala no Bico de Bunsen
b) Esfriar a ala
c) Meio lquido: pegar 2 aladas e colocar sobre a lmina.
Meio slido: encostar levemente a ala sobre a colnia retirando parte da mesma
e colocar sobre a lmina fazendo movimentos circulares.
d) Reesterilizar a ala no Bico de Bunsen.
e) Fixar o esfregao aproximando a lmina na chama do Bico de Bunsen fazendo
movimentos lentos, at secagem do mesmo.
Tcnica de colorao
1. Colocar a lmina sobre o suporte que est na pia.
2. Pingar sobre o esfregao a soluo cristal violeta cobrindo-o
completamente, deixando durante 1 minuto. Retirar o excesso com um filete
de gua corrente. Os microrganismos adquirem tonalidade azul escura ou
prpura.
3. Recolocar a lmina sobre o suporte. Cobrir o esfregao com soluo iodoiodetada por 1 minuto. Esta soluo mordente fixa o cristal violeta produzindo
um complexo violeta-iodo.
4. Descolorao: soluo de lcool etlico a 95% juntamente com acetona
(700 mL de lcool + 300 mL de acetona) aplicada por gotejamento at que
no aja mais desprendimento do corante. As bactrias gram(+) sofrem
desidratao dos carboidratos das paredes celulares promovendo a reteno
dos corantes. As gram(-) pela dissoluo dos lipdeos, tem a porosidade ou a
permeabilidade da parede celular aumentada no retendo o corante.
5. Contraste: soluo de fucsina (ou safranina) corante secundrio. Aplicar
sobre o esfregao por um perodo de 30s. Se as clulas permitem o
7
Aula 4
Esterilizao e Desinfeco
Esterilizao: o ato ou processo de destruir ou eliminar todas as formas vivas de
um material, ambiente ou objeto. Este processo inclui os endsporos, que so
formas de resistncia ao meio. Esta pode ser feita atravs de diferentes processos,
empregando-se agentes fsicos (calor, radiao, filtrao, gases) e agentes
qumicos. Os mtodos mais utilizados so:
Calor mido
- Autoclavao: desnaturao de protena
- Vapor fluente: desnaturao de protenas
- Tindalizao: desnaturao de protenas
Calor seco
- Fornos (forno de Pasteur): oxidao
- Flambagem: oxidao
- Incinerao: oxidao
Radiao ionizante
- Radiao gama: destruio de DNA forma radicais superativos.
Radiao no-ionizante
- Lmpada UV: altera DNA, atravs da formao de dmeros.
Filtrao
Glutaraldedo
10
Aula 5
Microscopia a fresco
Duas tcnicas em geral so empregadas em preparaes microscpicas:
preparaes a fresco e preparaes fixadas e coradas. A preparao a fresco
permite o exame de organismos nas condies normais de vida e so
preferencialmente utilizadas:
Quando a morfologia da clula pode estar danificada em preparaes fixadas
e coradas;
Durante a verificao da mobilidade;
Observaes de processos fisiolgicos;
Observao de corpsculos (vacolos e material graxo).
Ainda, as preparaes a fresco podem ser realizadas com ou sem colorao e
podem ser realizadas de acordo com as seguintes tcnicas:
1. Entre lmina e lamnula:
1.1 Bactrias cultivadas em meio lquido podem ser avaliadas, colocando-se,
com uma ala de platina esterilizada, uma gotcula da cultura no centro da
lmina, recobrindo-a com lamnula.
1.2 Para culturas filamentosas, o procedimento denomina-se entre lmina e
lamnula comprimida. retirado um pequeno fragmento da cultura em meio
slido, que comprimido entre lmina e lamnula.
2. Tcnica da Gota Pendente: mtodo mais seguro que o anterior leva
diminuio no tempo de observao e a concluses errneas, particularmente
em relao mobilidade bacteriana.
2.1 Procedimento: Untar a borda de uma lmina escavada com vaselina.
Transferir uma gotcula da cultura lquida para o centro de uma lamnula, e
em seguida unir a lmina e a lamnula. Examinar ao MO no aumento de 40x
para observar o movimento prprio ou direcional, alm do movimento
brawniano dos microrganismos, sem esquecer de diminuir a intensidade de
luz.
11
Aula 6
Antibiograma
Aula 7
Cocos Gram positivos
Tipos de Hemlise :
- Hemlise parcial
- Hemlise total
- No apresenta hemlise
Uma vez identificado o gnero Staphylococcus, a diferenciao entre as 3
espcies feita atravs de 2 testes: a pesquisa da enzima coagulase e a
resistncia a novobiocina. As caractersticas das colnias tambm podem ajudar na
13
diferenciao, uma vez que somente a espcie S. aureus pode produzir hemlise
em meio gar sangue, e apresentar colnias de colorao variando do branco ao
amarelo fraco.
Grupo
Hemlise
Bacitracina
CAMP
Negativo
B
C
D
Enterococo
Pneumococo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
15
Aula 8
Anlise do ndice colimtrico da gua
Fazer o clculo
N de UFC/mL = mdias das contagens das placas x diluio.
16
2. Pesquisa de coliformes
No que diz respeito potabilidade, o aspecto mais importante o carter
qualitativo da populao. A maioria das doenas veiculadas pelas guas tem sua
origem na contaminao fecal, como o caso da shigelose, hepatite A, rotavrus,
giardase, entre outras. Como a liberao dos microrganismos algumas vezes pode
ser em pequenas quantidades ou de forma descontnua, seria impossvel avaliar a
presena de todos eles em uma amostra de gua. Por isso, escolheu-se um
microrganismo que indicasse a contaminao patognica, a Escherichia coli. Ela
constante no intestino humano e no dos animais de sangue quente, abundante nas
fezes, cresce facilmente em meios de cultura e vive bastante tempo na gua. No
entanto, apresenta baixa resistncia clorao e menor viabilidade na gua do mar.
A Escherichia coli faz parte do grupo de microrganismos denominados coliformes,
constituindo 95% dos coliformes nas fezes.
Alm da potabilidade, a qualidade microbiolgica da gua que vai decidir
sobre seus possveis usos.
2.1 Pesquisa de Coliformes totais: baseada nas caractersticas do grupo
bastonete Gram-negativo, que produz cido e gs atravs da lactose.
Incubar a 37 C por 24 h;
Usar a tabela para verificar o nmero mais provvel de coliformes por 100 mL.
17
2.1.2 Teste confirmativo: inocular uma alquota de cada tubo positivo do teste
anterior em caldo lactosado bile e verde brilhante. Os sais de bile inibem o
crescimento de bactrias no-entricas e o verde brilhante de bactrias Grampositivos, selecionando, assim, os coliformes.
Procedimento
Aps o teste presuntivo, transferir com uma ala de platina uma alquota de
cada tubo positivo para tubos contendo caldo lactosado bile verde brilhante e
tubinhos de Durham invertidos;
Incubar a 37 C por at 48 h;
Usar a tabela para verificar o nmero mais provvel de coliformes por 100 mL.
Aps a leitura do teste presuntivo, transferir com a ala de platina uma poro
de cada tubo positivo para tubos contendo Caldo EC (Escherichia coli) e
tubinhos de Durham;
Usar a tabela para verificar o nmero mais provvel de coliformes por 100 mL.
18
Aula 9
Enterobactrias
19
3. Meio Teague (EAM): eosina azul de metileno: meio utilizado para isolamento e
diferenciao de enterobactrias. Promove uma distinta diferenciao entre as
colnias de microrganismos fermentadores de lactose e os que no fermentam
lactose.
- O meio ligeiramente inibidor para Gram +.
- E. coli colnias elevadas de 2 a 3 mm de dimetro. Apresentam um centro azulnegro com borda estreita e clara, e brilho azul metlico azul esverdeado luz
refletida (algumas linhagens podem no ter brilho).
- Salmonella e Shigella colnias ligeiramente elevadas de 1 a 2 mm de dimetro,
transparentes, desde incolor at mbar.
A partir de colnias caractersticas e isoladas deste meio, inocular no meio
TSI (Trplice Sugar Iron) com agulha de nquel cromo, por estria de esgotamento e
em profundidade.
Meio TSI (gar ferro trplice acar glicose, sacarose e lactose): um meio
diferencial, recomendado para identificao de bacilos entricos, baseado na
fermentao da glicose, lactose e sacarose e na produo de sulfeto hidrognio
(H2S).
Leitura do TSI
Local
Cor
Vermelho forte
Vermelho claro
Amarelo
Amarelo e bolhas
Preta
Significado
Reao alcalina
Reao neutra
Reao cida
Formao de gs
Produo H2S
Interpretao
pice e base amarela = glicose (+); lactose e/ou sacarose (+).
pice vermelho e base amarela = glicose (+); lactose e/ou sacarose (-).
pice e base vermelho = glicose, sacarose e lactose (-).
TSI
Lactose
Sacarose
Glicose
Gs
H2S
Salmonella
Shigella
E.coli
20
21
Glicose
Lactose
Sacarose Maltose
cidos ou
cidos com gs
Manitol
formiase
Glicose -----> c. Pirvico ----> c. Frmico ------------------------> H2 + CO2
Glicose
Glicose 6P
Frutose 6P
Frutose 1,6 PP
Ac, propinico
Gliceraldedo 3P
Ac. Succnico
Ac. Pirvico
Ac. Ltico
Acetaldedo
lcool etlico
22
cido lctico
enzimas
cido actico
pH 4,5
cido succnico
cido etlico
Glicose
2 c. pirvico
Acetilmetilcarbinol (acetona)
0,6 mL de alfa-naftol + 0,2 mL de KOH
40%
Diacetila + nclea guanidina
Composto vermelho
Interpretao: teste positivo rosa a vermelho
teste negativo cobre
23
Provas
Indol
Nitrati
Citrato
Malonato
Uria
Glicose
Lactose
Sacarose
Maltose
Manitol
Lisina
VM
VP
Salmonella
Shigella
E. coli
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
V
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
24
Referncias Bibliogrficas
25