PRATICA DE LABORATORIO N 2

COLORACION GRAM
I.

INTRODUCCIN

Es de gran importancia en Microbiologa porque permite diferenciar dos

grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), segn se comporten
ante esta tincin. El fundamento radica en la diferente estructura de la
pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa
capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gramtienen una capa de peptidoglicano ms fina y una capa
lipopolisacardica externa. Tras la tincin con el primer colorante (Cristal
violeta) se efecta un lavado con etanol que arrastrar al colorante slo
en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda
retenido y las clulas permanecern azules. Las clulas Gram (-) se
teirn despus con un colorante de contraste (safranina) para que
puedan observarse.
II.

III.
III.1.

OBJETIVOS
Llevar a cabo la coloracin gram para su respectivo
reconocimiento del tipo de coloracin que se llev a cabo.
FUNDAMENTO TERICO
COLORACION O TINCION

Es el proceso por el cual las molculas de un colorante se adsorben a

una superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las
clulas de los microorganismos y poder realizar la observacin en
microscopio ptico.
Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con
el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden
observarse claramente sin algn tratamiento previo.
III.2.

Colorantes

Los colorantes ms utilizados: azul de metileno, cristal violeta,

safranina, son catinicos y se combinan fuertemente con componentes
celulares cargados negativamente, como los cidos nucleicos y los
polisacridos cidos (las envueltas externas de los microorganismos
estn por lo general cargadas negativamente).
3.3. Tincin diferencial de Gram:
Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian
Gram, quien la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la
tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, gram
positivas y gram negativos (en este caso, los trminos positivo y
negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente
designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias).
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta
debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes
celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y
forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material
de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano.
La pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias

capas interconectadas de peptidoglicano as como algo de cido

teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula grampositiva es peptidoglicano. La pared de la clula gram-negativa, por
otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de
peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta
de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la
pared de la clula gram-negativa es peptidoglicano.

Descripcin de la tincin de
GRAM:
Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con
una solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan
efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante.
En este estado, todas las clulas, tanto las grampositivas como las
gramnegativas, estn teidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro
potsico. El ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente hace
soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo
insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas
grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma
situacin.
Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de
alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal
violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras
que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos
dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin;
esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de
bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un
solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la
clula (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se
une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de
retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora. Las
clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas
(tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al
disolvente, provocando que el de complejo cristal violeta-yodo
quede atrapado dentro de la pared celular.
Despus
de la
decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero las
gramnegativas son incoloras.

Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una

coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color
rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la coloracin
de contraste las clulas gramnegativas son rojas, mientras que las
grampositivas permanecen azules.

B
a
c
il
l
u
s
a
n
t
hracis (Gram positivo)
negativo)

Pseudomonas aeruginosa (Gram

Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:

1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con
yodo. El yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas.
2) EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un
clculo preciso del tiempo para evitar que pierdan la tincin las
clulas grampositivas.
3) Cultivos de ms de 24 horas de teidos pueden perder su
habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo.
3.4. Tincin diferencial: Mtodo cido resistente (ZIEHL-NEELSEN)
Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen
cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de
carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con
alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se
denominan cido-alcohol resistente.
El frotis se tie durante unos 5 min con Fucsina fenicada aplicando
calor suave. Lavar con agua. Decolorar con alcohol etlico 95% con un
3% de ClH concentrado. Lavar y teir durante 30-60 seg con Azul de
Metileno (color de contraste). Lavar y secar.
3.5. Tincin diferencial para revelar estructuras celulares. Mtodo de
Wirtz.
Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium
y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas
esporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son
desfavorables
(agotamiento
de
los nutrientes, temperaturas
extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose una
espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de
esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al
exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina

generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar

perdura durante aos.
La tincin especfica de esporas requiere dos colorantes:
1.- Verde malaquita: capaz de teir las esporas
en caliente.
2.- Safranina: colorante de contraste que tie las formas
vegetativas.
Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el
lavado con agua, y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn
teidas con el segundo colorante.

IV. MATERIALES Y METODOS

4.1. MATERIALES

III.3.

Portaobjetos
Cubreobjetos
Microscopio ptico
cristal violeta
glucol
safranina
futxina
Cultivo (caldo o agar) a teir.
Cocina elctrica
Alcohol etlico
METODOS
Se toma un portaobjetos previamente desengrasado y se
coloca en el centro del mismo una gota del cultivo lquido.
se coloc primero una gota de solucin fisiolgica sobre el
portaobjeto. Luego se toma una colonia del medio slido y se
emulsiona con la solucin fisiolgica.
Se procede a la fijacin del extendido. Para ello se pasa
lentamente el portaobjeto, en forma horizontal, sobre la cocina
elctrica caliente la operacin se repetitivamente hasta que
seque total.
Sobre el extendido seco se colocan unas gotas de cristal
violeta y se deja actuar 1 minuto. Se elimina el exceso de
colorante lavando con agua de forma suave, se seca el
extendido.
Sobre el extendido seco se colocan unas gotas de glucol y se
deja actuar 1 minuto. Se elimina el exceso de colorante lavando
con agua de forma suave, se seca el extendido.
Sobre el extendido seco se colocan unas gotas de safranina y
se deja actuar 1 minuto. Se elimina el exceso de colorante
lavando con agua de forma suave, se seca el extendido.
Sobre el extendido seco se colocan unas gotas de futxina y se
deja actuar 1 minuto. Se elimina el exceso de colorante
lavando con agua de forma suave, se seca el extendido.

IV.

Finalmente se pasa lentamente el portaobjeto, en forma

horizontal, sobre la cocina elctrica caliente manteniendo la
operacin repetidamente hasta que seque total.
Finalmente una vez secado se lleva al microscopio con alcohol
para observar el tipo de qu tipo de coloracin
RESULTADOS
Se observ una coloracin del tipo gram negativo ya que
despus de la coloracin de contraste las clulas se pudo
observar de color rojo.

V.

ANEXOS

coloracion
de la
colonia con
safranina

coloracion
de la
colonia con
futxina

colocacion
de la
colonia en
el porta
objetos

coloracion
de la
colonia con
glucohol

secado de
la colonia al
aire libre

colonia con
solucion
fisiologica

coloracion
de la
colonia con
cristal
violeta

vista
microscopic
amente de
las colonias

seleccion de
la colonia

secado del
porta
objetos

prueba del
calentamien
to del porta
objeto