Transformacin gentica por Agrobacterium tumefasciens

La biologa molecular y le ingeniera gentica en plantas se inician con el

descubrimiento y el estudio de Agrobacterium tumefasciens. Esta bacteria Gram
negativa induce la formacin de tumores denominados agalla de la corona,
generalmente en la unin del tallo con la raz, en numerosas dicotiledneas y en muy
pocas monocotiledneas y gimnospermas. Esta bacteria del suelo infecta a
dicotiledneas como parte de su ciclo vital insertando genes forneos en las misma
consiguiendo que se expresen en forma de protenas.
El principio tumorgeno responsable de la formacin de la Crown gall (en ausencia de la
bacteria) era la transferencia de una fragmento de DNA llamado T DNA que a su vez
se localizaba en un plsmido al que se denomin Ti (de inductor de tumores). Tras la
trasferencia el T-DNA se integraba en el genoma nuclear de la planta y su expresin
induca el fenotipo tumoral.

Estructura del genoma de Agrobacterium tumefasciens

Gen op
Este gen produce las opinas, son derivados de aminocidos que sirven como fuente de
carbono y nitrgeno para el Agrobacterium que indujo el tumor.

Genes onc
Los genes onc del plsmido T-DNA son los responsables de la sntesis anormal de
hormonas de crecimiento por parte de la planta, los altos niveles de estas auxinas y
citoquininas eran los que permitan una diferenciacin anormal de las clulas de la
planta y provocaban un crecimiento neoplsico. Estos genes son iamM (codifica la
triptfano monooxigenasa) y iaaH (codifica la iodoacemida hidrolasa) codifican
enzimas que inician la sntesis de una nueva auxina biosinttica. Actan para convertir
el triptfano en indol-3- acetamida y luego en indol 3 actico (IAA). El gen ipt
(codifica la isopenteniltransferasa) que el responsable de la sntesis de citoquininas.

Bordes flanqueantes del T-DNA

A la izquierda y derecha del T-DNA existen dos secuencias de unos 24 -25 pb que
flanquean y definen el T- DNA. Estos bordes son secuencias en cis necesarias para la
transferencia, de todo el DNA contenido entre los mismos, a la planta. El borde derecho
es crtico en la transferencia del DNA y en el proceso tumorgeno mientras que el
izquierdo no afecta a la formacin del tumor. El borde derecho es importante para la
insercin del T- DNA en el DNA cromosmico de la planta.

Origen de replicacin
El ori permite que el plsmido Ti sea mantenido de forma estable en Agrobacterium
tumefasciens.

Genes Vir
Una vez que se ha producido el reconocimiento y la unin a la clula vegetal
susceptible, el siguiente paso en la transformacin es el corte del gen TDNA por la
protena VirD1 y VirD2 quedando esta ltima protena unida al extremo 5, Luego las
protenas VirE2 cubren la hebra de ADN.
Luego el complejo de la hebra con las protenas Vir D2 y VirE2 es transportada a travs
de la membrana bacteriana. Luego con ayuda de las protenas Vir B forman el pili T y el
canal de secrecin para para transportar el ADN T a la clula vegetal. La integracin del

ADN-T dentro del cromosoma de la planta esta mediada por la protena VirD2 que
contiene dominios con actividad para la recombinacin y ligacin

Vectores utilizados para la transformacin gentica

Vectores co-integrados
Estos vectores son construidos por la recombinacin entre un plsmido Ti desarmado
que contiene el borde izquierdo y un pequeo vector que contiene el gen de inters
flanqueado por el borde derecho y una regin homloga al borde izquierdo. La
recombinacin se lleva a cabo por un evento de entrecruzamiento de regiones
homlogas de los dos plsmidos. Algunos vectores co-integrados han sido modificados
para tener una recombinacin sitio especfica como el sistema cre/lox). En este sistema
la cepa de Agrobacterium contiene un plsmido que codifica para una recombinasa, una
secuencia para el control de su expresin, genes vir y un sitio de recombinacin. Este
plsmido se recombina con otro plsmido, que contiene el gen de inters flanqueado por
el borde derecho, generando un plsmido co-integrado sitio especfico.

Vectores binarios
Estos son los vectores ms usados para la transformacin de plantas y se encuentran en
una gran variedad. En este sistema Agrobacterium tiene dos vectores: uno que contiene
la regin del T-ADN con el gen de inters y otro vector que contiene la regin vir. Los
vectores binarios Ti tienen sitios de replicacin para Escherichia coli y A. tumefaciens,
permitiendo el desarrollo de tcnicas de manipulacin in vitro en E. coli. Dentro de los
vectores simples binarios se encuentran pBIN 19, pC22, pGA482, pPCV001, pGreen y
pCAMBIA entre otros. Su principal diferencia radica en el tamao, el nmero de sitios
de restriccin del ADN-T, la presencia de genes reporteros, los orgenes de replicacin y
el antibitico de seleccin en bacterias y plantas. Se han realizado modificaciones de
estos vectores mediante la introduccin en el cromosoma de Agrobacterium ya sea la
regin del ADN-T o la regin vir. Cuando la regin T est integrada en el cromosoma, la
region vir es parte el plsmido Ti y viceversa. Estos vectores binarios modificados han
permitido la transformacin de plantas de las familias Amaryllidaceae (como cebolla y
ajo) y Liliaceae (como esprragos). Otras modificaciones tambin han permitido
obtener cepas hipervirulentas de Agrobacterium capaces de mediar la transformacin de
cereales. Las cepas hipervirulentas contienen en el vector binario un cassette extra de
genes vir B, C y G. La construccin de vectores binarios con sitios de reconocimiento

de endonucleasas permite el ensamblaje de cassettes flanqueados por estas secuencias,

para la construccin de vectores de transformacin de plantas que contienen mltiples
cassettes de expresin. Este sistema permiti la transformacin y expresin de seis
genes en Arabidopsis thaliana. En la actualidad estn disponibles una amplia variedad
de vectores Ti que los investigadores pueden escoger de acuerdo a sus necesidades y
capacidad tecnolgica.

Factores a tomar en cuenta para la transformacin con Agrobacterium

tumefasciens
Edad de la planta, tipo de tejido a transformar, cepa de Agrobacterium seleccionada para
transformar, tiempo y condiciones de inoculacin del tejido con Agrobacterium,
densidad y perodo de precultivo de la bacteria y presencia de necrosis en el tejido de la
planta causada por Agrobacterium.
Recientemente se ha descrito que la exposicin de lneas celulares de Nicotiana
tabacum, A. thaliana y Ageratum conyzoides a sustancias inhibidoras de la sntesis de
purinas y pirimidinas como la azaserina y acivicina eleva hasta 180 veces la frecuencia
de transformacin enc omparacin con aquellas lneas que no haban sido tratadas con
estos compuestos. Los mecanismos moleculares involucrados en esta respuesta son
desconocidos. (Roberts et al., 2003).

La transferencia del ADN-T en algunos explantes ha sido fuertemente disminuida por la

produccin por parte de la planta de especies reactivas de oxgeno las cuales
probablemente activan procesos de muerte celular programada o necrosis tisular
generando una barrera de clulas muertas alrededor del tejido infectado. Aunque estos
compuestos promueven el necrosamiento del tejido, se han introducido diferentes
inhibidores de enzimas que participan en este proceso para aumentar los porcentajes de
plantas transformadas. Algunos tratamientos antinecrticos aplicados durante el proceso
de transformacin incluyen la adicin de agentes reductores, inhibicin por calor de
enzimas que participan en el proceso oxidativo, reduccin del pH y la adicin de
inhibidores de enzimas. Los compuestos ms ampliamente utilizados son: inhibidores
de etileno (AgNO3), inhibidores de oxidasas y peroxidasas (Quelantes de cobre y

hierro, compuestos tilicos como L-cistena, tiosulfato de sodio y glutation, DTT). La

transferencia del ADN-T fue ptima a una temperatura de 19 C.

Tcnica de transformacin gentica utilizando Agrobacterium tumefasciens

La tcnica de transformacin gentica de meln utilizada se bas en el co-cultivo de
explantes con Agrobacterium tumefaciens y posterior regeneracin in vitro de plantas
transgnicas, adaptado del mtodo descrito por Ellul y col. (2003).
En los experimentos de transformacin gentica se emplea un sistema de vector binario
que contiene dos plsmidos: el Ti desarmado y un plsmido de menor tamao con la
construccin de inters. Adems, este mini-plsmido es portador de un gen que confiere
resistencia a kanamicina en bacterias (KanR ), lo cual permite seleccionar las bacterias
genticamente modificadas portadoras de la construccin de inters.
3.4.1. Preparacin del cultivo bacteriano para la transformacin
Agrobacterium tumefaciens se cultiva a partir de un inculo glicerado (mantenido a
-20C) en medio LB slido selectivo (Maniatis et. al., 1982) suplementado con 100 mg/l
de kanamicina (evitando as el crecimiento de bacterias que no contengan el plsmido) y
40 mg/l de rifampicina (seleccin de la cepa LBA4404 de A. tumefaciens). Las colonias
que crecen en este medio se utilizan como inculo para el cultivo en medio lquido de la
misma composicin. El primer cultivo se realiza en matraces de 100 ml de capacidad
con 10 ml de medio nutritivo: en los posteriores subcultivos, se emplean matraces de
crecimiento bacteriano de 250 ml. Los matraces se tapan con algodn graso
(hidrofbico) para favorecer la aireacin y se incuban en oscuridad a 28C en agitador
orbital a 250r.p.m. A las 24 horas despus de la siembra se toma una alcuota de 2.5 ml
del cultivo bacteriano y se transfiere de nuevo a matraces de 250 ml con 25 ml de medio
LB fresco.
En todos los subcultivos, el medio nutritivo utilizado para el crecimiento bacteriano es
suplementado con kanamicina (50 100 mg/l). Adems, se siembran placas control en
medio LB slido sin antibiticos, para detectar posibles contaminaciones exgenas. Para

la transformacin de las plantas hemos utilizado la cepa LBA4404 de Agrobacterium

tumefaciens transformadas con las diferentes construcciones en orientacin sentido del
gen Npt-II y uidA, con el promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de la coliflor
(CaMV) en el vector binario pROKII (Baulcome y col., 1986). Las construcciones
adecuadamente caracterizadas se conservaron en un stock con DMSO a -80 C hasta
su utilizacin. Una alcuota del stock de bacterias transformadas se creci en un
medio lquido LB suplementado con kanamicina 100 mg/l y fue incubado en oscuridad
a 28C, con agitacin orbital a 240 rpm durante 48 h. 6 ml de este cultivo se tomaron
para inocular un matraz con 300 ml de medio LB sin antibitico y se incub en las
mismas condiciones ya descritas durante 3-4 horas hasta obtener un valor de DO a 600
nm comprendido entre 0,2-0,4.
3.4.2. Mtodo de transformacin: seleccin y regeneracin de plantas transgnicas
La transformacin gentica se realiz siguiendo el mtodo descrito por Horsh et al.,
(1984) con las modificaciones propuestas por Fischer y Guiltinan (1995) y Ellul y col.
(2003). En nuestro trabajo se han utilizado plntulas de meln del tipo MR1, obtenidas
a partir de cultivo in vitro en un medio de germinacin (MG). Los explantes aislados
dispuestos en placas con medio de induccin organognico (IK) se inocularon
sumergindolos en el cultivo de Agrobacterium (DO600 de 0,2-0,4) durante 6 min. Tras
la inoculacin, los explantes se transfirieron a un medio de cocultivo, similar al de
induccin suplementado con acetosiringona (35-dimethoxy-4-hidroxyacetophenona) a
una concentracin final de 200 M. Este es un compuesto fenlico inductor de los genes
de virulencia (VIR) de las cepas de A. tumefaciens (Stachel y col., 1985).
Los explantes infectados se incubaron durante un periodo de 1-2 das, en oscuridad, a
28C. Pasado este tiempo, se procede al lavado del material sumergindolo en un medio
de lavado (MB), suplementado con 500 mg/l de cefotaxima durante 10 minutos, con el
fin de limitar el crecimiento bacteriano. Una vez lavados los explantes se transfieren al
medio de regeneracin selectivo (IKCK), con kanamicina (para seleccionar las clulas
transformadas) y cefotaxima (para controlar el crecimiento de Agrobacterium). Los
cultivos se incubaron en cmaras de crecimiento a 25C, bajo condiciones de
fotoperiodo de da largo (16 horas de luz y 8 horas de oscuridad). Los brotes
regenerados que iban apareciendo se cortaban evitando el callo y se transferan a frascos

con medio de enraizamiento (ME) selectivo con 50 g/ml de kanamicina. Con los
brotes enraizados podemos obtener nuevas plantas mediante la propagacin clonal. La
propagacin se lleva a cabo por multiplicacin de meristemos caulinares y yemas
axilares. A partir de plantas crecidas durante 15-20 das en ME se aslan segmentos que
contienen el meristemo caulinar o segmentos de tallo con yemas axilares, y se
subcultivan en el mismo medio. El procedimiento de propagacin, multiplicacin puede
continuar indefinidamente.
3.6. ANALISIS DEL NIVEL DE RESISTENCIA A KANAMICINA EN
TRANSFORMANTES PRIMARIOS
El gen bacteriano Npt-II codifica el encima Neomicina fosfotransferasa que inactiva por
fosforilacin a antibiticos aminoglicsidos como kanamicina. La expresin de este gen
confiere resistencia a este antibitico que es txico para las clulas vegetales y, al
transferirse a la planta, hace que sea un mtodo eficaz de seleccin. La evaluacin del
grado de inhibicin del enraizamiento de los pices trangnicos se realiz a una
concentracin del 100 mg/l de kanamicina en el medio de enraizamiento (ME).