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Julio 2013
El presente trabajo realizado por Ana Martos Lpez se ha presentado para la obtencin
del ttulo correspondiente al Mster de Residuos de plaguicidas y contaminantes.
Control alimentario y ambiental.
NDICE
I.
PRESENTACIN .....................................................................................6
II.
I.
PRESENTACIN
Por ltimo, se han estudiado las distintas tcnicas cromatogrficas tanto de gases
como de lquidos, as como, el acoplamiento con la espectrometra de masas y
detectores convencionales. Adems, se evaluaron los diferentes parmetros que influyen
en el proceso de separacin cromatogrfica y optimizacin del sistema de deteccin.
II.
MEMORIA CIENTFICA
Este trabajo tiene por objetivo la determinacin del contenido de cido clorognico
en distintas variedades de berenjena (Solanun melongena L.) ya que, el cido
clorognico es bien conocido como eficaz antioxidante, posee una importante actividad
antitumoral, anticolertico, antiinflamatoria, antimicrobiana y antimutagnica, adems
de otras acciones farmacolgicas, mediante cromatografa de lquidos de ultra presin
(UHPLC) acoplada a espectrometra de masas en tndem de triple cudruplo (QqQMS/MS). Para tal fin se han llevado a cabo tres objetivos diferentes:
Primer Objetivo:
Puesta a punto de la metodologa analtica para la determinacin de cido
clorognico en berenjena.
Determinacin del contenido de cido clorognico en diferentes
variedades de berenjena.
Segundo Objetivo:
Determinacin de la concentracin de cido clorognico en hbridos
derivados de cruces de las variedades anteriores.
10
Tercer Objetivo:
Evaluacin de la variabilidad intraplanta.
Evolucin en el contenido del cido clorognico.
La heredabilidad del contenido en cido clorognico a siguientes
generaciones.
2. INTRODUCCIN
2.1. Berenjena y su importancia
11
12
13
14
15
Los cidos fenlicos son metabolitos secundarios que son comnmente encontrados
en plantas. Los derivados sustituidos del cido hidroxibenzoico y del cido
hidroxicinmico son los cidos fenlicos predominantes en plantas [18].
16
cido parahidroxibenzoico
cido vanlico
cidos protocatquicos
17
Propiedades qumicas
Procedencia
Efectos biolgicos
18
C16H18O9
Estructura qumica
Nmero CAS
327-97-9
3-quinato
cido 3-quinico
Sinnimos
3-cafeonilquinato
cido 3-cafeoilquinico
3-CQA
cido 3-orto-cafeoilquinico
cido clorognico
cido 3-trans-cafeoilquinico
Peso molecular
354.31g/mol
Densidad
1.28g/cm3
Punto de fusin
207-209 C
19
20
configuraciones estructurales diversas han sido aislados desde fuentes naturales [38].
Los cidos fenlicos existen en mltiples formas como libres, esterilizados, glicosilados
o polimerizados y adems coexisten como complejos con protenas, carbohidratos,
lpidos u otros compuestos de plantas [34]. As, la polaridad de los cidos fenlicos
vara significativamente, y esto dificulta el desarrollo de un mtodo de extraccin
uniforme para extraer diferentes cidos fenlicos de varias matrices. Estos mltiples
factores imponen mayores desafos en el desarrollo de un procedimiento de preparacin
de muestra uniforme, eficiente y exacto [2].
Los procedimientos usados por varios grupos de investigaciones para la extraccin
de cidos fenlicos en berenjena variaban significativamente y son resumidos en la
Tabla 2.
Se puede observar que se emplearon distintos tipos de disolventes como, acetona,
etanol, metanol y disolucin acuosa de metanol en proporciones diferentes (50% de
metanol, 80% de metanol) empleando distintas tcnicas de extraccin como
ultrasonidos [1,4], agitador rotatorio [39], agitacin mecnica [40], agitador [41], reflujo
[42], y extraccin con lquidos presurizados [2].
21
Matriz de
muestra
Objetivo del
estudio
Tejido en polvo
liofilizado
cido
fenlico
contenido y
composicin
Liofilizado y
planta
sin
liofilizar
Influencia de
la actividad
antioxidante
en
el
almacenamie
nto de cidos
fenlicos
Influencia de
la actividad
antioxidante
en
el
almacenamie
nto de cido
fenlico
Liofilizado y
planta
sin
liofilizar
Cantida
d de
muestra
200 mg
Nsa
50 g
Planta
ultracongelada
steres
de
cido fenlico
y
anlisis
glucsidos
Ns
Planta
Variacin en
la
composicin
qumica y
Actividad
antioxidante
25 g
Pulpa
homogeneizada
de la planta
Liofilizado,
Procedimient
planta
sin o
de
liofilizar
y optimizacin
tamizado
para
la
(partculas
preparacin
tamao
< de muestras
825m)
a
Ns: Datos no suministrados
Tcnica de
extraccin
Extraccin de
disolvente
Sonicacin
Agitador
rotatorio
Homogeneiza
do hirviendo
etanol
y
mezclar
Agitacin
Reflujo
Metanol con
0.5% de
butilhidroxitolu
eno
50% Metanol
Cantidad
de
disolvente
10 mL (
dos veces)
Tiempo de
extraccin
15 minutos
(dos veces)
Temperatu
ra
de
extraccin
T
Ambiente
Ref
Ns
30 minutos
4C
39
78C
40
30 minutos
(dos veces)
T
Ambiente
41
1h
65C
4,1
nr
Etanol
100 mL (
dos veces)
80% Metanol
Ns
Metanol
100 mL
42
Ns
200 mg
Centrifugado
y
residuo
extrado con
acetona
Extraccin de
fluidos
a
presin
Acetona
Ns
30 minutos
Ambiente
43
Metanol/Agua
(80:20% v/v)
20 mL
30 minutos
100C
22
23
Mtodo de
Disolvente
determinacin
deteccin
empleado
Observaciones
Referencia
ESI (-)
210-400 nm
500 nm
57
empleado
HPLC-MS
Espectrometra
Metanol en
de masas
cido
fosfrico
acuoso
HPLC-UV
UV-visible
Metanol en
cido
fosfrico
/cido frmico
Electrofresis
Detector de
Solucin de
capilar
diodos en lnea
hidrxido
(DAD)
sdico
24
3. EXPERIMENTAL
3.1.1. Reactivos
3.1.2. Equipos
25
Tiempo (min)
4.5
5.5
% Eluyente A
25
100
100
25
25
Temperatura de la columna: 30 C
Volumen de inyeccin: 5 L
El modo de ionizacin utilizado para detectar el cido clorognico fue ESI en modo
positivo. Los valores ptimos de trabajo con la sonda ESI fueron: voltaje de capilar: 3.5
kV; temperatura de la fuente 120 C; temperatura de desolvatacin 350 C; flujo del gas
de cono 80 L/h y flujo de gas de desolvatacin 550 L/h. El ion precursor [M-H]+ fue m/z
355.2 obteniendo un voltaje de cono de 25 V, mientras que los dos iones productores
motorizados fueron m/z 163.2 y 145.2.
26
4. RESULTADOS Y DISCUSIN
La linealidad y el rango de linealidad nos dan idea del ajuste de la seal analtica con
la concentracin de cido clorognico a una funcin lineal, as como el intervalo de
concentraciones en que es posible utilizar dicha funcin. Este parmetro es fundamental
a la hora de cuantificar con fiabilidad las muestras. As una seal analtica que estuviera
fuera del rango lineal, por encima del lmite superior, no puede ser cuantificada con la
funcin lineal establecida en el rango de concentraciones, ya que ms all de dichos
lmites el comportamiento de la seal analtica instrumental no es conocido o bien dicha
27
funcin cambia. La solucin en ese caso sera diluir la muestra de forma adecuada hasta
que la seal analtica se encuentre en el intervalo adecuado.
28
Los resultados obtenidos para los parmetros de validacin fueron los siguientes:
-
El uso de un mtodo validado no implica que este funcione correctamente cada vez
que se aplica. Es necesario establecer un control de calidad interno que constate que los
resultados estn bajo control estadstico cada vez que el mtodo es aplicado.
Generalmente el control de calidad interno consiste en introducir una serie de muestras
29
control en la misma tanda que las muestras a analizar, sometindolas a los mismos
procedimientos analticos.
30
355.4>163.2
6.857e+004
100
%
0
355.4>145.2
1.246e+004
100
%
0
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.0
3.50
4.00
4.50
min
31
Muestra
Concentracin de cido
clorognico (mg/kg)
301
3748
302
2623
303
2235
305
2700
308
2075
309
3497
310
5667
318
2597
319
2209
320
1443
323
5138
324
1894
325
2035
327
1905
329
1579
330
1981
331
1886
6000,0
j
5500,0
5000,0
4500,0
4000,0
3500,0
3000,0
fg
efg
2500,0
cde
cde
2000,0
cd
bc
1500,0
bc
bc
ab
bc
1000,0
301 302 303 305 308 309 310 318 319 320 323 324 325 327 329 330 331
32
clorognico (mg/kg)
301
2222
327
1850
310
2894
323
1872
324
2427
40
2905
303
1941
329
1318
308
1254
331
1968
33
Adems durante el estudio realizado en este segundo anlisis, se llev a cabo el cruce
de algunas de las variedades analizadas, con la finalidad de obtener hbridos y estudiar
en ellos su contenido en este tipo de cido. Los cruces realizados con las variedades
utilizadas en el primer anlisis, as como, las referencias asignadas, se indican en la
Tabla 6.
Hibrido
Madres (Md)
Padres (Pd)
117
331
323
118
310
331
124
303
308
127
301
323
159
323
329
167
327
331
Md_(Nmuestra)
Pd_(Nmuestra)
1778 (117)
1968 (331)
1872 (327)
2535 (118)
2894 (310)
1968 (331)
1704 (124)
1941 (303)
1254 (308)
1934 (127)
2222 (301)
1872 (323)
2072 (159)
1872 (323)
1318 (329)
1632 (167)
1850 (327)
1968 (331)
34
Al igual que en el primer anlisis, se podran dividir las muestras en tres grupos
segn la concentracin de cido clorognico que presentan, pero disminuyendo los
rangos ya que las concentraciones obtenidas son menores: muestras con elevado
contenido en cido clorognico (> de 2000 mg/kg), muestras con contenido medio
(entre 2000 y 1800 mg/kg) y muestras con bajo contenido (< 1800 mg/kg). Segn esto
los resultados de los cruces podran ser:
-
118 (alto): hibrido entre una variedad de alto y otra de contenido medio.
124 (bajo): hibrido entre una variedad de medio y otra de bajo contenido.
127 (medio): hibrido entre una variedad de alto y otra de medio contenido.
159 (alto): hibrido entre una variedad de medio y otra de bajo contenido.
Adems de los datos mostrados anteriormente, se puede evaluar si hay una diferencia
significativa entre la variabilidad obtenida entre los parentales con los hbridos y entre
stos y la variabilidad intraplanta. Para el anlisis de esta ltima se tomaron 5 muestras
de una de las variedades (nmero de referencia 308). En la Tabla 8 se recogen los datos
junto con el valor medio obtenido, valor de desviacin estndar (SD) y desviacin
estndar relativa (RSD) de las muestras parentales, hbridos y las muestras tomadas para
la variabilidad intraplanta.
35
Parentales:
Referencia
Hbridos:
Concentracin
(mg/kg)
Referencia
Variabilidad intraplanta:
Concentracin
(mg/kg)
Referencia
Concentracin
(mg/kg)
14
2222
117
1778
308 a
1713
23
1850
118
2535
308 b
1757
33
2894
124
1704
308 c
1759
34
1872
127
1934
308 d
1451
39
2427
159
2072
308 e
1602
40
2905
167
1632
media
1656
42
1941
media
1943
RSD
52
1318
RSD
17
SD
131
54
1254
SD
331
56
1968
media
2065
RSD
27
SD
565
36
10
1.656,38
2.065,18
Varianza
17.301,452
319.243,07067
Desviacin Tpica
131,53498
565,01599
58,82423
178,67374
18,45181
5,99878
nivel p 1 cola
0,00648
nivel p 2 cola
0,01296
Tamao muestral
Media
Resumen
H0 (5%)?
rechazado
1.656,38
1.942,56667
Varianza
17.301,452
109.673,48267
Desviacin Tpica
131,53498
331,16987
58,82423
135,19953
6,33898
6,25606
nivel p 1 cola
0,04891
nivel p 2 cola
0,09783
Tamao muestral
Media
Resumen
H0 (5%)?
rechazado
37
10
1.942,56667
2.065,18
109.673,48267
319.243,07067
Desviacin Tpica
331,16987
565,01599
135,19953
178,67374
2,91085
4,77247
nivel p 1 cola
0,12598
nivel p 2 cola
0,25195
H0 (5%)?
aceptado
Tamao muestral
Media
Varianza
Resumen
38
Concentracin
Referencia
(mg/kg)
129a
1874
129b
1775
129c
1780
129d
1716
129e
1674
Media (mg(kg)
1768
77
4.4 %
b) Evaluacin del contenido de cido clorognico durante los tres aos del proyecto.
39
Ao 2011
Ao 2012
Concentracin
Concentracin
Referencia
(mg/kg)
Referencia
(mg/kg)
127
1934
132
1666
124
1704
134
2193
167
1632
135
1860
117
1778
136
2190
159
2072
137
2088
118
2535
Ao 2010
Ao 2011
Concentracin
Ao 2012
Concentracin
Concentracin
Referencia
(mg/kg)
Referencia
(mg/kg)
Referencia
(mg/kg)
301
3747
14
2222
138*
1452
303
2235
42
1941
139
1397
327
1905
23
1850
144
1473
331
1886
56
1968
146
1771
323
5138
34
1872
142
2276
310
5667
33
2894
141
2396
40
Ao 2010
Ao 2011
Concentracin
Ao 2012
Concentracin
Concentracin
Referencia
(mg/kg)
Referencia
(mg/kg)
Referencia
(mg/kg)
323
5138
34
1872
142
2276
308
2075
54
1254
140
1664
331
1886
56
1968
146
1771
329
1579
52
1318
145
1559
2012
Media
1824
1999
Varianza
31.7
53.1
t calculado
1.274
nivel p 2 colas
0,272
Tamao muestral
Resumen
H1 (5%)?
2.776
No se rechaza
41
De igual forma, se evala la variacin del contenido de cido clorognico para las
muestras Md (Madre), que se han muestreado en los tres aos de duracin del proyecto
(datos procedentes de Tabla 14). Para ello se lleva a cabo un anlisis de la varianza
(ANOVA) de dos vas, en la que se tiene en cuenta tanto la variabilidad de la variedad
como del ao en el que se realiza el anlisis. La Tabla 17 muestra los resultados
obtenidos, y se puede observar que el ao es un efecto significativo, obteniendo en el
ao 2010 mayores concentraciones de cido clorognico que en los aos 2011 y 2012,
donde se obtuvieron concentraciones similares (Figura 8). En relacin a la variedad de
berenjena, se puede indicar que no hay diferencia significativa.
Media de cuadrados
Valor p
Grados de libertad
Variedad
9133269
1826654
0,086
Ao
8974881
4487440
0,015
Error
6798017
10
679802
Total
24906166
17
Concentracin
(mg/kg)
Suma de cuadrados
Ao
Figura 8: Variacin del contenido de cido clorognico en Md en los tres aos
muestreados.
42
Media de cuadrados
Valor p
Suma de cuadrados
Grados de libertad
Variedad
4768002
1589334
0,180
Ao
2545782
1272891
0,241
Error
4193364
698894
Total
11507148
11
43
F2
F1
Madres (Md)
Padres (Pd)
126
132
138
142
128
134
139
140
129
135
144
146
130
136
146
142
131
137
142
145
127
141
146
DHLs
F1
Madres (Md)
Padres (Pd)
151-158
135
144
146
160-166
136
146
142
167
137
142
145
147-150
141
146
44
Lnea
Ref
Con (mg/kg)
a
1561
1649
128c
1402
1464
128e
1487
129
126
Ref
Con (mg/kg)
Ref
Con (mg/kg)
138
1452
142
2922
134
2194
139
1397
140
1664
1768
135
1861
144
1473
146
1771
130
2350
136
2190
146
1771
142
2922
1582
1624
137
2088
142
2276
145
1559
127
1628
141
2396
146
1771
151
2519
152
2141
153
2368
154
2012
155
1548
156
2448
157
2252
158
1890
160
1953
161
1507
162
1964
163
1929
164
1709
165
2157
166
1980
167
2456
147
2437
148
2280
149
2259
131
131
150
a
Con (mg/kg)
Pd
1667
128
DHLs
Ref
Md
132
126
F2
Hbrido F1
135
1860
144
1473
146
1771
136
2190
146
1771
142
2275
137
2088
142
2275
145
1559
141
2396
146
1771
2092
b
Variedad larga; Variedad ovalada; c Variedad morada; d Variedad rosada; e Variedad verde; f Variedad
45
ANOVA una va
Estadstica Descriptiva
VAR
F2
F1
Md
Pd
10
Media
1651
2000
1794
2101
Desviacin Tpica
129,8
183,6
167,6
167,6
Tamao muestral
Resumen
Fuente variabilidad
Suma de cuadrados
Grados de libertad
Media de cuadrados
Tipo de muestra
904602
301534
Error
3875451
23
168498
Total
4780053
26
Valor p
0,177
46
Concentracin
(mg/kg)
Variedad
Figura 9. Variacin del contenido de cido clorognico en funcin de los cruces
realizados.
De igual forma se realiz un ANOVA de una va para comparar los contenidos de
cido clorognico de las lneas DHLs con sus hbridos F1 y sus respectivos parentales
(Md y Pd), mostrndose los resultados obtenidos en la Tabla 23.
ANOVA una va
Estadstica Descriptiva
VAR
DHLs
F1
Md
Pd
20
Media
2095
2046
1979
1844
Desviacin Tpica
68,5
176,9
153,2
153,2
Tamao muestral
Resumen
Fuente variabilidad Suma de cuadrados Grados de libertad Media de cuadrados
Tipo de muestra
229127
76375
Error
2534452
27
93869
Total
2763579
30
Valor
p
0,497
47
Concentracin
(mg/kg)
F1
DHL
Md
Pd
Variedad
Figura 10. Variacin del contenido de cido clorognico en funcin de los cruces
realizados.
Adems, y puesto que se muestrearon distintas plantas provenientes del mismo cruce,
se ha realizado una ANOVA evaluando si el contenido de cido clorognico en las
distintas lneas depende del cruce realizado. En este sentido, se ha decidido mantener la
lnea DHL 167, procedente del Hbrido F1 137. Los resultados se muestran en la Tabla
24.
Tabla 24. Comparacin del contenido de cido clorognico en lneas DHLs
respecto al cruce.
ANOVA una va
Fuente variabilidad
Suma de cuadrados
Grados de libertad
Media de cuadrados
DHL-Hbrido
577520
192507
Error
1061387
16
66337
Total
1638907
19
Valor p
0,067
48
Concentracin
(mg/kg)
Hbrido F1
Figura 11. Variacin del contenido de cido clorognico para las lneas DHLs.
Abreviatura: DES corresponde al hbrido F1 correspondiente a la referencia 118
del ao 2011.
49
Tabla 25. Comparacin del contenido de cido clorognico en los dos tipos de
lneas obtenidas.
ANOVA una va
Estadstica Descriptiva
VAR
F2
DHLs
10
20
Media
1651
2095
Desviacin Tpica
90,2
63,8
Tamao muestral
Resumen
Fuente variabilidad Suma de cuadrados Grados de libertad Media de cuadrados
1311577
1311577
Error
2279183
28
81399
Total
3590761
29
Concentracin
(mg/kg)
Tipo lnea
Valor
p
0,0004
Tipo de lnea
Figura 12. Variacin del contenido de cido clorognico para las lneas.
Se puede observar que hay una diferencia significativa en el contenido de cido
clorognico en funcin del tipo de lnea obtenida, proporcionando mejores resultados de
cido clorognico las lneas DHLs.
Finalmente, se comparan los resultados obtenidos para las lneas DHLs, a partir de
los datos mostrados en la Tabla 26.
50
Lnea
Variedad
Ref
Con (mg/kg)
151
2519
152
2141
153
2368
154
2012
155
1548
156
2448
157
2252
158
1890
160
1953
161
1507
162
1964
163
1929
164
1709
165
2157
166
1980
167
2456
147
2437
148
2280
149
2259
150
2092
Hbrido F1
Ref
Con (mg/kg)
Md
Pd
Ref
Con (mg/kg)
Ref
Con (mg/kg)
135
1860
144
1473
146
1771
136
2190
146
1771
142
2275
137
2088
142
2275
145
1559
141
2396
146
1771
Al realizar el ANOVA de una va se puede observar (Tabla 27) que no hay diferencia
significativa entre las 4 variedades evaluadas (p > 5).
51
Tabla 27. Comparacin del contenido de cido clorognico en las lneas DHLs
obtenidas.
ANOVA una va
Estadstica Descriptiva
VAR
Var 1
Var 2
Var 3
Var 4
Media
2147
1886
2456
2267
Desviacin Tpica
91,1
97,3
257,6
128,8
Tamao muestral
Resumen
Fuente variabilidad Suma de cuadrados Grados de libertad Media de cuadrados
Tipo de muestra
577520
192507
Error
1061387
16
66337
Total
1638907
19
Valor
p
0,067
Concentracin
(mg/kg)
Figura 13. Variacin del contenido de cido clorognico para las lneas DHLs.
52
5. CONCLUSIONES
Tras la elaboracin de este Trabajo Fin de Mster, las principales conclusiones que
se pueden extraer son:
53
54
55
6. REFERENCIAS
56
[17] Winter, C.k., & Davis, S. F. (2006). Organic foods. Journal of Food
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