V.

METODOLOGA
1.

TIPO Y DISEO GENERAL DE ESTUDIO:

La presente investigacin segn la ocurrencia de los hechos es
prospectiva, segn el periodo y secuencia del estudio es de tipo
transversal, segn el anlisis de los resultados es de tipo
experimental.
La investigacin experimental fue aleatorizada. Sin medicin basal,
por lo que fue un experimento aleatorizado incompleto.

2.

POBLACIN Y MUESTRA :
El universo muestral estuvo constituido por las cepas aisladas de
Staphylococcus aureus que se sembraron en el laboratorio de
Microbiologa de la facultad de Medicina de la Universidad Nacional
Federico Villarreal.
UNIDAD DE ANLISIS
La unidad de anlisis la constituy cada repeticin realizada( con
discos de Origanum vulgare o el frmaco utilizado como control:
vancomicina, oxacilina y trimetoprim (TMP)+sulfametoxazol) en cada
placa Petri con la cepa de Staphylococcus aureus.
TAMAO MUESTRAL
Al ser un trabajo experimental se emple la frmula estadstica para
hallar el nmero de repeticiones necesarias que validen la
investigacin.
Se obtuvo aplicando la siguiente frmula estadstica *

n= (Z/2 +Z)222
2
= 1.96 para un nivel de confianza del 95%

Z/2
Z= 0.84 para una potencia de prueba del 80%, Asumiendo que
no se conoce la varianza y que 2 = 2. Luego se tiene que:
n = (Z/2 +Z)22

n = (1.96 + 0.84)2x2
n = 15.68 = 16 repeticiones como mnimo.

Para efectos de este trabajo se form 3 grupos para la

evaluacin:
-

Grupo control A: 24 repeticiones en placa Petri con siembra de

Staphylococcus aureus , utilizando disco de difusin de
Vancomicina.
Grupo experimental A: 24 repeticiones en placa Petri con siembra
de Staphylococcus aureus , utilizando disco de difusin de
Vancomicina y aceite esencial de Origanum vulgare.
Grupo control B: 24 repeticiones en placa Petri con siembra de
Staphylococcus aureus , utilizando disco de difusin de Oxacilina.
Grupo experimental B: 24 repeticiones en placa Petri con siembra
de Staphylococcus aureus , utilizando disco de difusin de
Oxacilina y aceite esencial de Origanum vulgare.
Grupo control C: 24 repeticiones en placa Petri con siembra de
Staphylococcus aureus , utilizando disco de difusin de
trimetoprim (TMP)+sulfametoxazol.
Grupo experimental C: 24 repeticiones en placa Petri con siembra
de Staphylococcus aureus , utilizando disco de difusin de
trimetoprim (TMP)+sulfametoxazol y aceite esencial de Origanum
vulgare.
Grupo control D: 24 repeticiones en placa Petri con siembra de
Staphylococcus aureus , utilizando aceite esencial de Origanum
vulgare.

CRITERIOS DE INCLUSIN
-

Se incluy a todos los cultivos de Staphylococcus aureus que no

estuvieron contaminados.

CRITERIOS DE EXCLUSIN
-

3.

El estudio excluy a todos los cultivos de Staphylococcus aureus

que no estuvieron contaminados.

ENTORNO:
La investigacin se realiz en el mes de junio en el laboratorio de
Microbiologa de la facultad de Medicina de la Universidad Nacional
Federico Villarreal.

4.

MATERIALES
MATERIAL DE LABORATORIO:

28 placas Petri
Agar Mueller Hinton
24 discos de papel filtro Whatman N4

Hisopos esterilizados
Pinzas esterilizadas
Mecheros
Plumones indelebles
Reglas
Vernier

MATERIAL BOTNICO:
5 kilos de hojas frescas de de Origanum vulgare fueron recolectadas
en un mercado local, para luego ser procesadas en el laboratorio de
la facultad de Farmacia y Bioqumica de la Universidad Nacional
Mayor de San Marcos, Per.
CEPAS BACTERIANAS:
Las cepas de Staphylococcus aureus fueron obtenidas del laboratorio
de Microbiologa de la facultad de Medicina de la Universidad
Nacional Federico Villarreal, Per.
FRMACOS ULTILIZADOS COMO CONTROL
Discos de difusin de Oxacilina 25 ug, vancomicina 30ug y
trimetoprim (TMP)+sulfametoxazol 1ug.
5.

INTERVENCIONES:
5.1.

Elaboracin del aceite esencial de Origanum vulgare

Recoleccin de la planta:
La planta se adquiri en un mercado local, para luego ser
procesada en el Laboratorio de la facultad de Farmacia y
Bioqumica de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
Extraccin del aceite esencial:
Para la obtencin del aceite la planta fue sometida a extraccin
por hidrodestilacin en aparato de Clevenger, segn la
Farmacopea Brasilea
5.2.
Obtencin de la cepa:
Las cepas de Staphylococcus aureus fueron obtenidas del
laboratorio de Microbiologa de la facultad de Medicina de la
Universidad Nacional Federico Villarreal.
5.3.

Preparacin de la cepa:

Una vez obtenidas las cepas, se cultivaron en un tubo de ensayo

con tapa rosca, el cual contena el Agar TSA para Staphylococcus
aureus, se incub a 37C durante 24 horas.
Luego de las 24 horas, se tom una muestra de cada cultivo con
el asa de Kolle y se realiz la suspensin directa de la colonia en
solucin salina al 0.9 % hasta alcanzar una turbidez equivalente
al estndar 0,5 de la escala de Mc. Farland
( 1.5 x 108 UFC/ml)

a.

Preparacin del cultivo

El anlisis de la sinergia de Origanum Vulgare y vancomicina se realizar

mediante el mtodo de disco de difusin Kirby Bauer(1). La cepa de
Staphylococcus aureus ser sembrada utilizando el asa de kolle por estra por
agotamiento, en 40 placas Petri con agar Mueller Hinton , posteriormente se
inocular los discos individuales sobre la superficie del agar con la ayuda de
una pinza estril, presionando suavemente sobre cada disco para asegurar un
contacto completo con la superficie del agar. La placa ser divida en 6
regiones, en cada una de ellas se colocar un disco. En el caso del grupo
control los discos de difusin sern de Vancomicina de 30ug. En el caso del
grupo experimental los discos de difusin de Vancomicina de 30ug sern
embebidos previamente con 5uL de aceite esencial de Origanum Vulgare. Se
incubarn las placas a 35C durante 16 a 18 horas. Despus de este tiempo se
proceder a realizar la medicin de los halos de inhibicin.
1.
http://www.ins.gob.pe/repositorioaps/0/4/jer/-1/manua_l
%20sensibilidad.pdf
b.

Preparacin del aceite esencial de Origanum Vulgare

6.

Procedimiento para recoleccin de informacin

Se usar fichas de recoleccin de datos donde se indicar el nmero de la

placa Petri, la medida del halo de inhibicin y los indicadores para la medicin
de halos en las placas (sensible, resistente).

7.

Mtodo de control de calidad de los datos

Para evaluar un medio de cultivo se realiza frecuentemente una tcnica

llamada Mtodo Ecomtrico, el cual fue descrito por Mosselt et al., 1983, y que
permite medir la Productividad y control que es la capacidad de los medios de
cultivo para favorecer el crecimiento y desarrollo de un microorganismo, esta
caracterstica se determina a travs de la comparacin que se realiza entre el
medio por evaluar y un medio control (Soler, 2006). Otro aspecto es la
Selectividad referida a la resistencia que genera el medio de cultivo a la
colonizacin por microorganismos interferentes o indeseados al aplicarse las
placas de antibiticos.

8.

Aspectos ticos:

Para la realizacin del trabajo se tomara en cuenta todo lo establecido en

el Manual de procedimientos para la prueba de sensibilidad antimicrobiana del
instituto nacional de salud del Per (INS).

Las cepas de las muestras sern proporcionadas por la encargada del

laboratorio de microbiologa de la facultad de medicina de la UNFV con previa
autorizacin de las autoridades pertinentes.

Usaremos una prueba piloto para tener ya una idea del posible resultado
como base necesaria ante el desarrollo del experimento. La prueba piloto
consistir en 2 placas Petri inoculadas con S,aureus una con vancomicina y
otra con sinergia de vanco

VI.

PLAN DE ANALISIS DE RESULTADOS

Se trabajar con muestras de aceite de Oreganum Vulgare y con discos de

Vancomicina, la cepa Staphylococcus aureus fue proporcionada por el
Laboratorio de Microbiologa de la Facultad de Medicina Hiplito Unanue y fue
inoculada en placas Agar Manitol Salado.
Los resultados sern registrados en el software Microsoft Office Excel 2013
para la formacin de una base de datos. El anlisis estadstico de los resultados
se realizar mediante el programa SPSS 22,0. Para determinar la distribucin

normal de los resultados se emplear la prueba de kolmogorov Smirnof. Para

determinar la significancia estadstica se emplear la prueba de T de Student.