Sunteți pe pagina 1din 21

LP 1 Parazitologie

Examenul coproparazitologic

Paraziii cu localizare intestinal sau biliar pot fi localizai prin examinarea materiei fecale al
aparatului duodenal sau sigmoidian.
-

Sunt uniform raspndite n masa fecal datorit motilitii colonului care asigur o
amestecare a coninutului

Exist forme - vegetative (forme sensibile) sau chistice a unor protozoare

Formele vegetative pot fi gsite n poriunea final a bolului fecal fa de prima care este
mai veche

Deoarece cel puin n infeciile cronice eliminarea diferitelor stadii nu este continu se
recomand recoltri i examinri reepetate (3 examinri- 24-48h)

RECOLTAREA
-

n recipiente speciale bine nchise

Acestea sunt prevazute cu mici dispozitive

Se face din mai multe puncte ale materiei fecale, zone cu puroi, sange, mucus

Se recomand ca materialul fecal sa nu fie amestecat cu urina (urina distruge prin


aciditate formele vegetative)
Ex: o infecie cu amoebe pot fi mai uor puse n eviden dac scaunul nu este
amestecat cu urina

Scaunele formate pot fi duse la laborator n 1h sau un interval mai mare de timp cu
condiia ca scaunul sa fie supus fixrii

Fixarea: - rolul de a prezerva forma i pstra structura elementelor parazitare pentru a fi mai uor
recunoscute dar i pentru a realiza o inactivare a lor.
Modaliti de fixare: cea mai utilizat formol 5%

Formolul uor de preparat


-

Bun fixator

Nu interfer cu kiturile de diagnostic folosite

Examinarea Macroscopic:
-

Obligatorie

Precede examinarea microscopic

Asectul materialului fecal

Aprecierea estimativ a eventualelor forme vegetative existente

In scuanele apoase va fi posibil prin examinarea microscopic ulterioar evidenierea


formelor vegetative

In scaunele formate se pot evidenia forme chistice

Oochitii, sporii, microporii, oule de helmini se vor putea gasi n oricare tip de scaun

Evidenierea unor parazii ntregi (Ascari lumricoides, oxyuris vermicularis) sau


fragmente (proglote) de taenia sorium, saginata, botriocefalul

Evidenierea poriunilor mucosangvin_________ din care se va recolta proba pentru


laborator.

Examinarea Microscopic:
I.

Examenul direct pe preparate proaspete

II.

Tehnici de concentrare

III.

Preparate fixe i colorate

I. Examenul direct pe preparate proaspete


1. Ser fiziologic
2. Soluie lugol

1. Materiale necesare: NaCl 8,5g


Apa distilat 1000ml
Lame pentru microscop si lamele
Pipete pasteur

Tehnica de lucru:
-

NaCl + apa distilat se amestec (8,5g/1000ml)

Pe o lama de microscopie se pune o picatura de ser fiziologic

Cu ajutorul unei baghete se recolteaz proba fecal, un mic fragment, se disociaz prin
micri circulare

Nu se recomanda oiective mici cu imersie 90, 100

Pot fi recunoscute oule helminilor, chisturile, formele vegetative ale protozoarelor

O observaie atent permite evidenierea micrilor caracteristice amoebilor daca lama i


serul fiziologic au fost nclzite la 37C atunci forma pseudopodelor este mai uor
vizibil.

LP 2 Parazitologie
Examenul coproparazitologic intre lama si lamela

Materiale
-

Iod metallic 5g

Iodura de potasiu 10g

Apa distilata 100ml

Lame pentru microscopie+ lamele

Pipete Pasteur

Mod de lucru
Preparatia Lugol
Intr-un recipient se pune iodura de k peste care se adauga incet iodul metallic.
Dupa ce iodul metalic s-a dizolvat se adauga apa distilata 100ml
Pe o lama de microscopie se pipeteaza 1 picatura de Lugol, se recolteaza un mic fragment de
material fecal, se disociaza fragmente prin miscari circulare repetate
Se acopera cu o lamella
Se examineaza cu obiective mici apoi se evita folosirea obiectivelor 90-100 cu imersie.
Tehnica permite evidentierea unor elemente de structura ale formelor vegetative sau chistice ale
protozoarelor si ouale helmintilor dar nu permite observarea eventualelor forme de miscare.
Amidonul nedigerat violet
Amidonul digerat roz
Vacuolele iodofile negru
Rezultatul obtinut chiar daca sunt evidentiate eventualele forme parazitare au doar character
provizoriu.Un rezultat complet se face in urma probelor de concentrare.

Tehnicile de concentrare
1. Prin sedimentare
2. Prin flotatie
-

Au menirea sa completeze examenul direct in cazul infectiilor usoare cu numar


redus de elemente parazitare

1. Tehnica de concentrare prin sedimentare


Principiul de baza este acela ca chisturile si oochistii protozoarelor, ouale helmintilor au greutate
specifica mai mare decat al mediului in care materiile fecale sunt suspensionate, mediul in
general reprezentat de apa sau solutie fiziologica. Din acest motiv au tendinta de a se depune.
Deparazitarea poate fi grabita prin tratamentul chimic sau priin centrifugare usoara, astfel
inlaturandu-se resturile nedigerate.
Sedimentarea cu formol 10% si eter sau acetat de etil
-

Formol10%

Apa distilata

Solutie Lugol

Lame, lamele

Sita de material textile

Tuburi de centrifuga cu fund conic

Pipete Pasteur
Formol 10%

100ml formol

900 ml apa distilata


Solutia de formol poate fi folosita 2 ani.

Tehnica de sedimentare

Se recolteaza din mai multe puncte de materie fecala o cantitate de dimensiunile unei nuci de
marime medie

Se omogenizeaza si se suspensioneaza in 10 ml ser fiziologic

Se filtreaza suspensia printr-o sita de material textile (tifon) intr-un tub de centrifuga conic2000 rpm.

Supernatantul se inlatura

Sedimentarea se repeat

Se recentrifugheaza pana cand supernatantul devine limpede

Dupa ultima spalare sedimentul obtinut se omogenizeaza si se lasa cateva minute sa se


depuna

Se adauga 1-2 ml acetat de etil, se inchide tubul si se agita puternic

Se centrifugheaza din nou la 1500 rpm

La sfarsit vor aparea 4 straturi la suprafata :


-

Primul strat - acetat de etil

Al doilea strat elemente nedigerate

Al treilea strat - formol 10% (formalina)

Al patrulea strat - sedimentul

LP 3 Parazitologie

Coloratia Ziehl- Nielsen

Pentru evidentierea bacilului Koch

Folosit in bacteriologie pentru evidentierea oochistilor Cryptosporidium parvum

Materiale
1. Fucsina fenica
2. Formol 10%
3. Sol. HCl- etanol
4. Sol. Glicerol- verde- malahit sau Albastru de metilen
5. Sol HCl-Metanol
6. Apa

1. Solutia fucsina fenica


-

Fucsina bazica 10g

Etanol 100ml

Fenol 50g

Apa distilata 1l

Fucsina bazica se introduce intr-un flacon de 1,5l


-

Se adauga etanolul

Se agita usor pana la dizolvarea colorantului

Se dizolva separate fenolul in putina apa distilata

Se adauga fenolul dizolvat

Se adauga restul de apa si se agita

Reactivul poate fi folosit indefinit.

2. Formol 10% se foloseste pentru conservarea materiilor fecale


3. Solutia HCL-Etanol
-

Hcl concentrate-1ml

Etanol-95%- 100ml

Etanolul 95% se introduce intr-un flacon de 250ml


-se adauga HCl- se amesteca incet
4. Glicerolul verde - malachit/ Albastru de Metilen
- glicerol 100 ml
- verde malachite/albastru de metilen- solutie apoasa 3% 1ml
- apa distilata- 100ml
Intr-un flacon se introduce 3g v-m/a-m peste care se adauga 100ml apa distilata
Intr-un alt flacon se introduce 1ml din Solutia 3% preparata anterior peste care se adauga 100ml
glicerol si 100ml apa distilata.
Se amesteca inainte de utilizare
5. HCl- methanol
- HCl- 3 ml
- methanol- 100 ml
Se introduce metanolul absolut intr-un flacon
Se adauga HCL
Se amesteca si se inchide ermetic.
Tehnica:
-

Se executa frotiuri subtiri

Se usuca la aer si se fixeaza cu methanol/HCl methanol (5)- 3 min

Se acopera frotiurile cu fucsina fenica rece (1) 5 min

Se adauga HCl-Etanol pana cand colorantul se mai difuzeaza

Se spala cu apa de la robinet

Se contracoloreaza cu solutie 3% verde malachite/ albastru de metilen 30sec

Se spala cu apa

Se usuca

Se examineaza

Se evidentiaza oochistii- colorati in rosu pe verde deschis sau albastru


Se recomanda examinarea cu obiective de imersie (cu ulei de cedru) in scopul recunoasterii unor
particularitati de structura a oochistilor

LP 4 Parazitologie
Coprocultura pe mediul Loffler
Metoda este utilizata in scopul izolarii si cultivarii unor protozoare cu localizare intestinala:
Entonoba histolytica dar si pentru alte protozare precum Trichomonas vaginalis.
Protozoarele sunt puse in conditii favorabile de crestere si inmultire favorizand diagnosticul.
Materiale:
-

Termostat 37C

Eprubete cu mediu Loffler- ser coagulat de bou

Ser fiziologic

Amidon de orez (reactive de laborator- f mult agreat de amibae

streptomicina

Tehnica:
-

cu cateva ore inaintea insamantarii, tuburile cu mediul Loffler sunt scoase de la frigider
unde se pastreaza pentru a nu se usca si se pun la thermostat pentru a ajunge la 37 C

la fel serul fiziologic

se recolteaza intr-un recipient cu ajutorul unei baghete de sticla cateva fragmente din
materialul fecal ce urmeaza a fi investigat

se recolteaza din zonele cu mucus, sange, puroi

se adauga ser fiziologic si se omogenizeaza

cu ajutorul unei pipete Pasteur cu para de cauciuc se recolteaza o cantitate din suspensia
obtinuta

se depun cateva picaturi pe mediul Loffler

se adauga amidon de orez + streptomicina (un varf de ansa)

se adauga ser fiziologic astfel incat in coloana de lichid sa nu depaseasca limita


superioara a serului coagulat

se pastreaza la termostat 37 C- 3 zile (minim)

examinarea- la fiecare 24h

dupa primele 24h tuburile se scot de la termostat

se inlatura cu pipeta Pasteur faza lichida a mediului, pastrandu-se sedimentul, stergand


fin suprafata cheagului de ser

se pune o picatura intre lama si lamella si se examineaza maxim cu obiectiv de 40X

se poate recunoaste Entamoba dupa:

aspect refringent al citoplasmei

aspectul nucleului cu nucleolul din, central si cromatina fina la periferie

aspectul pseudopodelor formate exploziv, cate unul in fiecare directive

dupa recolta se adauga iar streptomicina, amidon si se pastreaza la termostat 37 C inca cel
putin 24H

o cultura bogata in amobae face ca amidonul sa fie consumat repede

in lipsa lui, cultura poate fi pierduta

amobaele fara amidon emit concomitant mai multe pseudopode- declin al culturii

Coprocultura pe carbune
Utilizata atunci cand datele clinice, de laborator sugereaza o infectie cu:
-

Acylostoma duodenale

Strongyloides stercoralis

Necator americanus

Larve: strongyloide; rhabditride

Permite:
-

formarea si eclozarea larvelor rhabditride de Ancylostema duodenale

Naparlirea lor

Trecerea in stadiul de larve strongyloide

Evolutia larvelor catre stadiul de adult, inmultirea lor altor generatii de larve

Foloseste unele tactisme ale larvelor- geotropism negative, hidrotropismul pozitiv

Materiale:
-

Carbine medicinal

Placi sau recipiente de plastic asemanatoare cu placile, neaparat cu capacul transparent

Baghete de sticla

Tehnica:
-

Cu bagheta de sticla se recolteaza materialul fecal

Se amesteca pana la omogenizare o cantitate de carbine medicinal

Amestecul se introduce in placi, modelandu-se intr-o formatiune conica

Peste capac se pune o bucata de vata umeda

Se urmareste intervalul de timp

Prin evaporarea apei din vata, cutia se raceste putin, apa din materialul fecal condenseaza
in interiorul cutiei

Larvele existente prin geotropism lor negativ au tendinta sa se indeparteze catre varf

Datorita hidrotropismului pozitiv se vor aduna in picatura de apa de condens

Examinarea se face cu o lupa prin transparenta capacului cutiei

Larvele se pot recunoaste dupa agiliatate.


Tehnica amprentei anale

Tehnica utilizata pentru evidentierea oualelor oxiuris. Femelele depun ouale in pliurile mucoasei
anale, tehnicile de depistare a acestora direct din materialele fecale, de obicei sunt ineficiente
Material:
-

banda adeziva transparenta

baghete de sticla

eprubete de sticla

lame pt microscopie+ lamele

ser fiziologic/ ulei de cedru/ glicerina

Tehnica:
-

cu un capat al baghetei de sticla se acopera pe o distanta de 1-2 cm cu banda adeziva

bagheta se introduce in eprubeta de sticla fiind utilizata cu un dop de vata

se scoate bagheta din eprubeta

se apropie de zona perianala a pacientului introducand capul baghetei in anus

se roteste din baghet astfel incat eventualele oua fiind desprinse sa adere de ceolofanul de
pe bagheta si se depune pe o lama de microscopie

se acopera cu o picatura de ser fiziologic + o lamella

Recoltarea se face dimineata inainte de utilizarea toaletei. In situatia unui rezultat pozitiv se
recomanda testarea si celorlalti membri ai familiei.

Examenul parazitologic al bilei


Permite evidentierea unei eventuale infectii cu Giardia duodenalis, oua de Fasciola hepatica
si larve de strongyloides stercoralis.
-..
- produsul este centrifugat si examinat apoi cu obiective uscate
- timp scurt in afara intestinului- se recomanda ca examinarea sa se faca in cel mai scurt timp
de la recoltare.
Metoda capsule enterotest:
Permite depistarea infectiei cu Giardia duodenalis fara sa fie necesara examinarea mai multor
probe
-

capsula este asemanatoare cu medicamentele care prezinta un fir compactat/ strans in


capsula

capsula este inghitita de pacient care tine capatul firului astfel incat sa nu se depaseasca
duodenul

seb actiunea sucului intestinal capsula este dizolvata iar firul liber va pluti in lumenul
intestinului

de acest fir in cele 2 h vor adera larvele care se gasesc libere in duoden

se scade firul dupa cele 2 h

se spala cu ser fiziologic

se centrifugheaza si se examineaza microscopic folosind obiective uscate (40X)

LP 5 Parazitologie
Examenul parazitologic al sangelui

Exista 4 grupe de paraziti care pot fi identificati prin examenul parazitologic al sangelui:
-

prima grupa: parazitii malariae (plasmodii): plasmodium: - falcifarum


- vivax
- Ovale
- Malariae

A doua grupa babesiile (babesioza)

A treia grupa trypanosome cruzi


- Brucei

A patra grupa filariile: 1. Sanguine si limfatice: Wucherelia bancrofti; Brugia malayi


2. Cutanate: Loa Loa (Loaiaza)

Tehnica frotiului de sange


-

Se dezinfecteaza pulpa degetului

Se inlatura surplusul de dezinfectant prin evaporare

Se punctioneaza cu ac steril de unica folosinta

Se pune o picatura pe lama fara a apasa

Cu marginea unei alte lame se etaleaza sangele pe toata suprafata lamei astfel incat frotiul
de sange sa se termine in franjuri

Se lasa sa se usuce

Picatura groasa:
-

Primele trei etape sunt identice

Se lasa pe lama la capete sau in centru cateva picaturi de sange

Cu o lamella prin miscari circulare 1 min se omogenizeaza si se defribineaza

Se lasa sa se usuce sangele departe de posibili agenti

Dupa cateva ore lamele cu picaturi groase se scufunda in apa distilata pentru hemoliza
sangelui

O picatura groasa bine hemolizata apare pe lama sub forma unei pete fumurii

Daca operatiile nu sunt executate correct, hemoliza nu se va mai face in totalitate iar stratul gros
de hematii nu va permite vizibilitatea microscopica, lamele sunt compromise.

Coloratia Gemsa
Materiale: Fosfat acid de sodiu 1g
Fosfat acid de potasiu o,7g
Apa distilata
Solutii Gemsa
Tampon
-

Se dizolva primii doi reactivi in apa distilata obtinandu-se un tampon la pH 7,2

Daca pH-ul < 7,2 se adauga cateva picaturi din Solutia 2% a primului reactive

Daca pH-ul > 7,2 se adauga cateva picaturi din sol 2% al celui de-al doilea reactive

Tamponul poate fi pastrat cateva saptamani intr-un flacon inchis ermetic

Prepararea colorantului: in momentul intrebuintarii se adauga cateva picaturi din Solutia Gemsa
la 1 ml de tampon. Ex: la 10 ml de solutie tampon se pun 15 picaturi Gemsa.
Tehnica de lucru:
-

Frotiurile dupa uscare se fixeaza cu alcool metilic 3 min

Se inlatura fixatorul si se acopera cu Gemsa 30-45 min

Se spala cu apa distilata si se usuca inaintea examinarii

In cazul picaturii groase, prima etapa nu este necesara (fixarea).

Examinarea:
-

Frotiurile si picaturile groase se examineaza cu obiective cu imersie

In cazul infectiei malarice si babesiozele:


-

Nr parazitilor

Nr hematiilor parazitate

Aspectul hematiilor parazitate

Marimea hematiilor

Triposemiozele - Parazitii au aspect contorsionat si se remarca prezenta membrane ondulante


Filariozele - Larvele sunt recunoscute dupa aspectul contorsionat si prezinta repartitia nucleilor
somatici
Parazitii malariei, babesiile, trypanosomele colorate Gemsa au nucleul colorat rosu, citoplasma
albastru, granulatiile specifice, portocaliu, hematiile- nuante de la roz la violaceu

Diagnosticul pneumocistozei
-

Pe frotiuri, amprente si sectiuni de material bioptic sau necroptic

Cele mai des folosite sputa indusa si secretia laringo-traheala

Coloratiile uzuale: gemsa si albastrul de toluidine

Gemsa permite punerea in evidenta a trofozoizilor cat si a chistilor

Trofozoizii apar ca aglomerari de puncte de cultura albastru-violacee - nucelii


trofozoizilor

Chistii nu se coloreaza la nivelul peretilor dar se coloreaza cei 8 nuclei ai corpilor


intrachistici

Toluidina completare a solutiei Gemsa

Prepararea sputei in vederea colorarii


-

Dupa recoltare trebuie debarasata de mucus

Se face prin folosirea unui preparat pregatita din 100 ml hidroxid de sodium

2g N-acetil-1cisteina

1 vol din sputa de cercetat se amesteca cu 9 volume sputa

Produsul nevascos se filtreaza prin tifon

Se centrifugheaza 3000rpm

Se obtine un sediment ce se spala in ser fiziologic

Se recentrifugheaza

Se pune pe lame

Coloratia Toluidina
Materiale: - acid acetic
- Acid sulfuric concentrate
- Albastru de toluidine
- Alcool etilic absolut
- Alcool metilic
- Xilol
- Apa distilata
Tehnica de lucru:
-

Dupa prima fixare timp de cateva secunde cu alcool metilic frotiurile sunt introduce in
solutie fixatoare 5 min

Se scot din solutie fixatoare si se spala cu apa de robinet

Dupa spalare frotiurile sunt introduce 5 min in solutie albastru de toluidine

Dupa colorare 3 bai alcool etilic

Se pastreaza in xilol 1-2 min

Se examineaza cu obiective 90X cu ulei de imersie

Diagnosticul Leishmaniozei
-

Evidentierea parazitilor pe material bioptice sub forma de frotiuri colorate Gemsa

In cazul leishmaniozelor cutanate materialul bioptic se recolteaza din profunzime

Exista riscul de a izola germenii de supra infectie

In leishmaniozele viscerale recoltele bioptice se obtin prin punctii osoase

Punctiile splenice dau procentul cel mai ridicat de rezultat pozitiv

Dupa recoltare materialul este recoltat pe lame

Colorat Gemsa

Probele positive apar elemente cel care contine parazitul in forma amazigota
NNN contine geloza si ser defribinat de iepure
Prima examinare cel putin 4 zile
Daca dupa 8 zile de ciltivare rezultatul este negativ:

Se recomada o repicare in mediu nou

Continuarea- 8 zile

In cazul unei culture positive parazitul va creste pe mediu promastigota.

Diagnosticul parazitologic al Trichomonazei uro-genitale


Se recolteaza la femei:
-

Secretie vaganiala

Sediment urinar

Secretie uretrala

Secretia vaginala
-

Se recolteaza pre si post menstrual

24-48h dupa ultimul contact sexual

24-48h dupa ultima toaleta

Cat mai posterior si lateral cu putinta

Secretia uretrala la femeile cu leziuni vaginale


Sediment urnar: dimineata. Prin centrifugare se depune sedimentul.
Se recolteaza la barbat:
-

Secretia uretrala (matinala)

Sediment urinar

Lichid spermatic

Trebuiesc examinate pe preparate proaspete pe lama si lamela

In cazul.. se recomanda fixarea si colorarea gemsa

Examinarea secretiilor poate da rezultat favorabil numai la 50% din cazuri, atunci cand nr
parazitilor depaseste..

Secretiile cu nr mic de paraziti se recomanda a fii inoculate pe un mediu de cultura in


scopul imbogatirii

Insamantarea pe mediu de cultura a materialului biologic cea mai sigura metoda de


diagnostic

Se foloseste un mediu bogat in tripticaza, extract de ciuperci cu adaos de fier, amestec de


vitamin

Poate fi utilizat cu success si mediul Loffler sau alte medii pe baza de ser de bou dar cu
adaos de factori nutritive extractul de splina.