Laboratorio 1

IDENTIFICACIN DE FRMACOS POR CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

OBJETIVOS DEL PRCTICO :

Conocer la cromatografa de adsorcin.

Aprender la tcnica y el lenguaje cromatogrfico.
Aprender a aplicar muestras en una cromatografa.
Determinar los Rf de diferentes compuestos.
Identificacin de una sustancia orgnica por c.c.f y patrones de referencia

INTRODUCCION:
Actualmente, la cromatografa es una tcnica analtica que se utiliza para identificar y /o separar
los componentes de una mezcla de sustancias.
Esta tcnica tiene gran aplicacin prctica, como por ejemplo, en laboratorios farmacuticos,
dnde se utiliza para analizar y purificar medicamentos; en laboratorios de criminologa, para
determinar metabolitos, o drogas, en el torrente sanguneo y, en el mbito de la agronoma,
para la deteccin y anlisis de pesticidas y otras sustancias.
La cromatografa es una tcnica de separacin de una mezcla de solutos, basndose esta
separacin en la diferencia de velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a travs
de un medio poroso (fase estacionaria), arrastrados por un disolvente en movimiento (fase
mvil). La fase estacionaria puede estar sujeta a un soporte slido.
Existen diversos tipos de cromatografa.
Dependiendo de la naturaleza de las fases, se pueden distinguir distintos tipos de cromatografa:
Cromatografa slido-lquido: la fase estacionaria es un slido y la mvil un lquido.
Cromatografa lquido-lquido: ambas fases son lquidos y en la estacionaria el lquido se ancla a
un soporte slido.
Cromatografa lquido-gas: la fase estacionaria es un lquido no voltil sobre soporte slido y la
fase mvil un gas.
Cromatografa slido-gas: la fase estacionaria es un slido y la mvil un gas.
La mezcla a separar se deposita sobre la fase estacionaria y la fase mvil atraviesa el sistema
desplazando los componentes de la mezcla a distintas velocidades que dependen de la afinidad
de los mismos por cada una de las fases. Se denomina elucin a la migracin de los
componentes de la mezcla a lo largo de la fase estacionaria impulsados por la mvil.

M. Patricia Arias

M. Florencia Gonzlez Jara

1.Aplicacin de mezcla
en la fase estacionaria

2. Elucin de la mezcla en la
fase mvil, comienza la
separacin de los
compuestos

3. Separacin adecuada, el
compuesto representado
por crculos, tiene menos
afinidad con la fase
estacionaria.

Existen otras clasificaciones para los distintos tipos de cromatografa:

1 En funcin de la interaccin que se establece entre los componentes de la mezcla y las fases
mvil y estacionaria:
Cromatografa de adsorcin: se producen interacciones de tipo polar siendo la fase estacionaria
un slido.
Cromatografa de particin: la separacin se basa en las diferencias de solubilidad de los
componentes de la mezcla entre las dos fases siendo ambas lquidas. Cuando la estacionaria es
menos polar que la mvil se denomina cromatografa en fase inversa.
Cromatografa de intercambio inico: se producen intercambios entre iones presentes en la
fase estacionaria y los del compuesto orgnico solubilizado e ionizado en la fase mvil
2 En funcin del tipo de soporte empleado para la fase estacionaria:
Cromatografa en columna: utiliza como soporte una columna de vidrio
Cromatografa en capa fina: el soporte es una placa de vidrio, aluminio o plstico
CROMATOGRAFA DE ADSORCIN
La cromatografa de adsorcin emplea una fase estacionaria slida de carcter polar,
ADSORBENTE y una fase mvil lquida, ELUYENTE. Se utiliza tanto con fines analticos como
preparativos y la separacin de los componentes de la mezcla viene determinada por las
interacciones polares de los componentes de la misma con las fases estacionaria y mvil. Por lo
tanto, los compuestos ms difciles de separar mediante este tipo de cromatografa, sern
aquellos que tengan una polaridad muy similar.
FASE ESTACIONARIA: ADSORBENTE
Est constituida por un slido poroso, finamente granulado, con centros activos polares en su
superficie donde se adsorben las molculas de los compuestos que se van a cromatografiar.
Cuanto menor sea el tamao de partcula de este material mayor ser la capacidad de adsorcin.

M. Patricia Arias

M. Florencia Gonzlez Jara

La adsorcin se debe a interacciones intermoleculares del tipo dipolo-dipolo, dipolo-dipolo

inducido o enlaces de hidrgeno entre el adsorbente y el soluto. El adsorbente ms utilizado es
gel de slice donde las interacciones tienen lugar entre los grupos
SiOH y SiOSi; tambin se emplea con relativa frecuencia almina (Al2O3).
El adsorbente debe ser inerte con las sustancias a cromatografiar. El gel de slice presenta
carcter cido y la almina puede adquirirse con carcter neutro, cido o bsico.
FASE MOVIL: ELUYENTE
Es un disolvente en el que los componentes de las mezcla son, al menos, parcialmente solubles.
Al aumentar la polaridad del disolvente aumenta la velocidad de elucin de los compuestos de la
mezcla.
Se puede utilizar un nico disolvente o una mezcla de disolventes e incluso llevar a cabo la
elucin con un gradiente de polaridad aumentando progresivamente la proporcin del
disolvente ms polar.
La RETENCIN de las molculas de soluto S se adsorben en los centros polares de la fase
estacionaria X y, a medida que se produce la elucin, van siendo desplazadas por las molculas
de disolvente/s que constituyen la fase mvil M. La retencin de un soluto se puede justificar
por la competencia que se establece entre S y M por adsorberse a los centros polares X, es decir,
depende de los valores de las constantes de los equilibrios:
X + S XS y X + M XM
Que estn en funcin de:
Polaridad del compuesto a eluir que depende de sus grupos funcionales
Naturaleza del adsorbente y Naturaleza del disolvente
ORDEN DE POLARIDAD DE LOS COMPUESTOS ORGNICOS:
cidos carboxlicos > Fenoles > Alcoholes y Tioles > Aminas > steres >
Aldehdos y Cetonas > Hc. Aromticos > Hc. Halogenados > teres >
Hidrocarburos Insaturados > Alcanos
Cuanto ms polar sea un compuesto mas se retendr en la fase estacionaria. Por ejemplo, se
retiene ms un alcohol que un hidrocarburo
ORDEN DE POLARIDAD DE LOS ELUYENTES MS HABITUALES:

H2O > CH3-OH > (CH3)2CH-OH > CH3-CN > Dioxano > CH3COOEt > THF > CH2Cl2
( Cloruro de metileno) > CHCl3 (Cloroformo) > CCl4 (Tetracloruro de carbono) >
CH3(CH2)4CH3

Para compuestos poco polares, que se retienen poco en el adsorbente, se utilizan

eluyentes apolares o poco polares como, por ejemplo, hexano
Para compuestos muy polares, que quedan muy retenidos en el adsorbente, se emplean
eluyentes muy polares como, por ejemplo, metanol o mezclas metanol diclorometano
Para compuestos de polaridad media se emplean eluyentes de polaridad intermedia y son muy
aconsejables en estos caso las mezclas en distintas proporciones de hexano acetato de etilo
CROMATOGRAFA ANALTICA EN CAPA FINA (CCF)
La fase estacionaria (adsorbente) se encuentra depositada, formando una capa fina de un
espesor uniforme sobre una placa de vidrio, plstico o una lmina metlica. La mezcla a analizar
se deposita con un capilar a una pequea distancia del borde inferior de la placa como se
muestra en la figura 2. En la figura 3 se ve la elucin de la mezcla en un disolvente.

M. Patricia Arias

M. Florencia Gonzlez Jara

Figura 2

Figura 3

Este tipo de cromatografa permite la separacin de una mezcla de solutos basndose en la

diferencia de velocidad con que stos se mueven a travs de una fase estacionaria activa (slica
gel o almina) debido a la diferente capacidad de adsorcin que presentan los diferentes solutos
en dicha fase estacionaria.

Determinacin del Rf

Se conoce como Rf (rate factor) la relacin entre las distancias recorridas por un compuesto y por
el disolvente desde el origen del cromatograma..

Cada compuesto en unas condiciones cromatogrficas determinadas: adsorbente, disolvente,

temperatura, etc..., tiene un valor constante y caracterstico de Rf. Sin embargo, solo se pueden
establecer comparaciones entre los Rf de dos compuestos cuando los dos se eluyan juntos en la
misma placa. La distancia recorrida por el compuesto se mide desde el centro de la mancha.
Figura 4

Figura 4

M. Patricia Arias

M. Florencia Gonzlez Jara

Visualizacin del Cromatograma

Con luz UV (ultravioleta).- Las placas suelen llevan incorporado un indicador fluorescente que
absorbe luz UV y emite luz visible, generalmente verde. Cuando se
cromatografan sustancias que absorben en el UV donde se encuentra el compuesto no absorbe
el indicador y como resultado vemos una mancha que indica su presencia.
Con un agente revelador.- Se emplea cuando las sustancias no absorben radiacin UV. El
revelador reacciona con los productos absorbidos dando lugar a compuestos coloreados y por
tanto se utilizar uno u otro en funcin del compuesto que se quiera visualizar.
Algunos ejemplos: H2SO4 concentrado en etanol para azcares, ninhidrina para aminocidos y
yodo para compuestos insaturados y aromticos.
ACTIVIDAD EXPERIMENTAL
Traspase su Muestra Problema a un vaso de 100 mL, agregue 3 mL de una mezcla
Metanol/Diclorometano 1:1 y tape con un parafilm y agite por algunos minutos. Deje decantar y
con un capilar se toma una muestra del lquido sobrenadante, se aplica la muestra en la
cromatoplaca de acuerdo a las instrucciones que se indican mas adelante *. En las mismas
cromatoplacas y separadas alrededor de 0,5 cm aplique de la misma forma las sustancias de
referencia o patrones (Dipirona, Ibuprofeno y Paracetamol).

*Cromatografa en capa fina:

En las placas cromatogrficas (1,0 cm x 6,7 cm) marque la lnea de origen (1.0 cm del borde) y
la del frente del eluyente a 0.5 cm del borde superior. En la lnea de origen marque con una cruz
donde colocar los frmacos (trabaje con lpiz grafito).
Aplique 2 a 3 veces la muestra con un capilar sobre la cruz. Deje secar cada vez.
Coloque la cromatoplaca en un vaso de precipitado que contiene el eluyente tapado con un
vidrio reloj o cpsula Petri (el vaso debe ambientarse 5 a 10 min. antes con el eluyente). Figura 5
y figura 6.
Deje eluir hasta aproximadamente 0,5 cm del borde superior de la placa.
Saque cuidadosamente la placa y luego djela secar.
Proceda a eluir las placas que contienen la muestra patrn y las respectivas a la muestra
problema hasta la marca indicada en las placas usando dos mezclas de solvente que poseen
polaridades diferentes:
Mezcla 1: Metanol/diclorometano (1:1)
Figura 5

M. Patricia Arias

M. Florencia Gonzlez Jara

Mezcla 2 : Acetato de Etilo/Metanol (1:1) Figura 6

Una vez que la fase mvil (eluya) alcance la marca dada (frente del solvente).
Se procede a revelar las placas de la siguiente manera.
Las placas cromatogrficas revelarlas con Lmpara U.V, y una vez revelada dibuje marcando
suavemente con un lpiz grafito todas las manchas que observe.
Una de las placas revelarlas con Cmara de Yodo, y la otra revelarla pulverizando la muestra con
una mezcla de cidos (4 mL de H2SO4 (c), 80 mL CH3COOH, 16 mL de H2O) y luego calcinarla
suavemente.
Una vez reveladas las placas cromatogrficas dibuje marcando con un lpiz grafito todas las
manchas que observe.
Proceda a calcular los Rf y comprelos con los patrones de los posibles frmacos .
Los Posibles frmacos Son:
Dipirona, Ibuprofeno y Paracetamol.

Discuta con su grupo la polaridad de los solventes usados, el solvente que mejor los
separa.

Con toda la informacin concluya cuales son los frmacos presente en su muestra
Problema (dos Como Mximo).
Cuestionario de Cromatografa

1.- En que se basa la separacin de los componentes de una muestra en la cromatografa de

adsorcin.
2.- En que consiste la cromatografa de capa fina.
3.- Como se define el Rf.
4.- Se tienen la siguiente mezcla de compuestos, en fase slida, a la cual se les realizo una
cromatografa en capa usando como adsorbente slica gel y como eluyente CHCl3.

HO

O
Vitamina A

M. Patricia Arias

O Me COCH2OH
Me
H H

Cortizona

-caroteno

M. Florencia Gonzlez Jara

a) Cul de estas tres sustancias es ms polar?. Fundamente su respuesta.

b) Asigne a cada mancha el compuesto correspondiente.
c) Explique brevemente como procedera con las mezclas slidas para poder realizar las
cromatografas.

M. Patricia Arias

M. Florencia Gonzlez Jara