Cuprins

Abrevieri...................................................................................................................... 5
Introducere.................................................................................................................. 6
I.

PARTE TEORETIC................................................................................................. 7

1. Caracterizarea general a celor dou specii studiate: Plantago arenaria Waldst. &
Kit. i Plantago major L............................................................................................... 7
1.1.

1.1.1.

Carbohidrai........................................................................................... 10

1.1.2.

Lipide..................................................................................................... 10

1.1.3.

Alcaloizi.................................................................................................. 10

1.1.4.

Compui fenolici..................................................................................... 10

1.1.5.

Flavonoide.............................................................................................. 11

1.1.6.

Glicozide iridoide.................................................................................... 11

1.1.7.

Alte terpenoide....................................................................................... 12

1.2.
2.

Compoziia chimic a celor dou specii studiate............................................9

Aciunea farmacologic i utilizarea terapeutic a celor dou specii studiate12

Compuii bioactivi din plante: ageni antioxidani eseniali pentru sntatea noastr
14
2.1.

Generaliti................................................................................................... 14

2.2.

Clasele mari de antioxidani.........................................................................15

2.3.

Metode de determinare a compuilor bioactivi.............................................17

2.4. Metode de determinare a activitii antioxidante.........................................18

3.

Cancerul de colon: boala secolului......................................................................18

3.1.

Speciile reactive de oxigen...........................................................................19

3.2.

Speciile reactive de oxigen i proliferarea celulelor tumorale......................20

3.3.

Terapii anticancer care cresc sau scad nivelul speciilor reactive de oxigen..20

II.

PARTE EXPERIMENTAL....................................................................................... 21

4.

Materiale i metode............................................................................................ 22
4.1.

Material vegetal............................................................................................ 22

4.2.

Metode experimentale utilizate....................................................................22

4.2.1.

Prepararea extractului............................................................................22

4.2.2. Identificarea calitativ i cantitativ a principiilor active din extractele de

Plantago.............................................................................................................. 22
4.2.2. Determinarea eventualilor compui cu caracter antioxidant a extractului de
Plantago
arenaria i Plantago major prin metoda
TLC-DPPH............................................................................................................ 25
4.2.3.

Determinarea capacitii antioxidante totale.........................................26

4.2.4. Determinarea activitii citotoxice a extractelor de Plantago arenaria i

Plantago major asupra celulelor de cancer de colon C26, in vitro......................27
5.

Rezultate i discuii............................................................................................. 29
5.1.

Determinarea coninutului total de flavonoide prin analiz spectrofotometric

29

5.2.

Analiza calitativ a extractelor de Plantago prin cromatografie n strat subire

30

5.3. Determinarea eventualilor compui cu caracter antioxidant a extractului de

Plantago
arenaria i Plantago major prin metoda
TLC-DPPH............................................................................................................... 32
5.4.

Determinarea capacitii antioxidante totale...............................................33

5.5. Determinarea activitii citotoxice a extractelor de Plantago arenaria i

Plantago major asupra celulelor de cancer de colon C26, in vitro.........................34
Concluzii.................................................................................................................... 37
Bibliografie................................................................................................................ 39

Abrevieri

ABTS - Acid 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonic)

BrdU- 5-bromo-2'-deoxyuridine
CCS - Cromatografie n strat Subire
DPPH - 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
NTS - Difenilborat de aminoetanol
POD - Peroxidaz
SRO - Specii reactive de oxigen
TAC - Total Antioxidant Capacity
TLC - Thin-Layer Chromatography
Trolox - acid 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxilic

Introducere

Cunotinele despre utilizarea plantelor n tratamentul unor boli se pare c sunt cel puin
tot att de vechi ca i cele despre plante n general. Exist documente de acum 5000 de ani, nc
de la babilonieni i caldeo-asirieni, care indic faptul c nc de pe aceea vreme se foloseau multe
plante medicinale, iar n capitala lor (Ninive) exista o grdin de cultur a plantelor medicinale
(Radu i colab., 1981).
Un salt calitativ n utilizarea plantelor medicinale i se datoreaz lui Theophratus
Paracelsus. Acesta a fost cel care a pus bazele fitochimiei, artnd c numai o mic parte din
plante este activ i c plantele nu vindec n integritatea lor. Aceast parte este numit
arcanum sau quinta esentia i ea reprezint punctul de plecare n fundamentarea noiunii de
principii active din zilele noastre (Radu i colab., 1981).
Dup definiia actual a Comisiei Europene de fitoterapie, prin fitoterapie se nelege
utilizarea n terapie a plantelor, extractelor de plante, sau a totalului de principii active din plante
standardizate, fr a include n acest domeniu i substana unitar, n stare pur, izolat din plante
(Butur, 1979).
Cancerul este cauza principal a deceselor att n rile n curs de dezvolatare, ct i n
rile dezvoltate. Exist o tendin crescut pentru utilizarea plantelor medicinale n tratarea
cancerului din cauza eficienei lor medicale, a toxicitii sczute i a multor ageni
anticancerigeni derivai din aceste plante (Ozaslan i colab., 2007).
Astzi, mai mult ca oricnd, datorit evoluiei tiinei i a tehnologiei, se constat o
cunoatere tot mai aprofundat a chimismului plantelor, a proprietilor farmacologice i a
efectelor terapeutice ale plantelor medicinale, a posibilitilor oferite de plante n arsenalul
terapeutic, dar totodat i a efectelor secundare datorate mai ales administrrii greite a acestora.
Dei n prezent este utilizat doar un procent mic (10%) din totalul de plante medicinale,cu
siguran pe msur ce metodele de investigaie tiinific evolueaz i se perfecioneaz, un
numr mare de substane active din regnul vegetal i vor aduce contribuia la dezvoltarea
fitoterapiei moderne. Plantele medicinale nu pot nlocui ntotdeauna chimioterapia sau
antibioterapia, drept urmare se recomand o simbioz ntre toate ramurile terapeuticii, criteriul
care se impune fiind acela al cunoaterii att a valorii i a riscurilor asumate de una sau de alta,
ct i a bolii i a bolnavului (Adam, 2003).
4

Ca urmare lucrarea de fa, contine un studiu tiinific comparativ ntre dou specii de
Plantago (Plantago major i Plantago arenaria) cu o larg ntrebuinare n domeniul terapeutic,
datorit coninutului lor bogat n compui antioxidani cu efecte inhibitoare poteniale asupra
unor celule tumorale.

I.

PARTE TEORETIC

1. Caracterizarea general a celor dou specii studiate: Plantago arenaria

Waldst. & Kit. i Plantago major L
Cele dou specii luate n lucru aparin familiei Plantaginaceae, genul Plantago, acest gen
avnd aproximativ 256 de specii. n anul 1937, Pilger, a mprit genul Plantago n dou
subgenuri i anume: Plantago Harms i Psyllium Miller. Specia Plantago arenaria aparine
subgenului Psyllium, n timp ce specia Plantago major aparine subgenului Plantago.
Ptlagina (Plantago major) este o plant peren erbacee care aparine de asemenea
familiei Plantaginaceae. Plantago major poate ajunge la o nlime de 10-15 cm, dar aceasta
variaz foarte mult n funcie de mediul de cretere. Prezint frunze lanceolate sau ovate cu
lungimi cuprinse ntre 5-20 cm i lime cuprins ntre 4-9 cm, iar rareori frunzele pot atinge 30
de cm n lungime i 17 cm lime (Fig. 1). Rdcina este scurt, iar tulpinile florifere drepte, cu
inflorescene terminale n form de spic i cu floricele mici glbui-maro (Moore, Sanford i
Wiley, 2006). Aceast specie se gsete n special pe soluri srace, lipsite de fosfor i potasiu. n
prezena azotului, numrul frunzelor i tulpina i biomasa total cresc, n schimb, prezena
azotului influeneaz negativ creterea rdcinilor (Blacquiere i Koetsier, 1988).

Fig. 1 Plantago major (fotografie preluat de pe ograsradgivaren.slu.se)

Polenizarea se face prin intermediul vntului i se produce o cantitate de aproximativ

20.000 de semine pe plant (Tutin i colab., 1976). Endospermul seminei prezint un perete
celulozic subire cu lumenul celulei umplut cu ulei i proteine. Acesta formeaz cea mai mare
parte a seminei i nconjoar embrionul complet. ntre 8-16 semine sunt nchise n capsule care
pe vreme umed devin lipicioase din cauza umflrii polizaharidelor prezente n nveliul
seminelor. n acest fel, seminele se pot ataa de animale i oameni i pot fi rspndite (Qadry,
1963).
Ptlagina este originar din Eurasia, de aceea indienii o numeau amprenta rasei albe,
deoarece aprea peste tot pe unde clcau europenii (Samuelsen, 2000). n ceea ce privete
ecologia i rspndirea de acum, ptlagina se gseste peste tot n lume, mai ales n zone umede,
pe marginea drumurilor i zone costale, dar unele specii cresc i n habitate precum deert, faleze,
pduri i regiuni tropicale (Velasco-Lezama i colab., 2006).
Plantago major prezint proprieti unice care fac din aceasta una dintre cele mai folosite
plante n medicina tradiional de pe ntregul glob, dei unii oameni continu s o considere doar
o iarb.
Plantago arenaria (sin. P. indica, P. ramosa, P. psyllium) este o plant anual i aparine
familiei Plantaginaceae, aceast familie avnd peste 200 de specii. n ceea ce privete
caracterele morfologice, specia prezint tulpini drepte cu lungimi cuprinse ntre 20-60 cm i
7

frunze linear-lanceolate, opuse, dinate, care au lungimi cuprinse ntre 6-8 cm lungime i laimi
cuprinse ntre 2-4 cm. Plantago arenaria este singurul taxon care prezint tulpina aerian
ramificat (Fig. 2). Rdcina este scurt, iar florile sunt grupate n inflorescene n form de spic.
Toat planta este acoperit cu periori glandulari i simpli. Planta nflorete ncepnd din luna
iulie pn n luna noiembrie, iar polenizarea se face prin intermediul vntului (Hoskovec, 2014).
Plantago arenaria este originar din Eurasia, iar n ceea ce privete ecologia i
rspndirea de acum, ptlagina de nisip se gsete n Europa Central, Europa de Sud i de SudVest, dar i n Asia. Planta crete n special pe soluri srace, uscate i nisipoase (Uphof, 1968).

Fig. 2 Plantago arenaria (fotografie preluat de pe http://botany.cz/en/plantago-arenaria/)

Aceast specie a nceput recent s fie cultivat ca plant medicinal de ctre Filiala de
Plante aromatice i medicinale a Institutului de Cercetri din India. Interesul pentru cultivarea
acestei specii este datorat coninutului mare de mucilagii, uleiuri grase, proteine, aucobozid i
alcaloizi precum plantagonina i indicaina (Manish, 2011). Mucilagiile prezente n nveliul
seminei au proprieti medicinale i sunt folosite pentru tratarea constipaiei (Chevallier, 1996).
1.1.

Compoziia chimic a celor dou specii studiate

Plantago major este o plant medicinal important care conine carbohidrai, lipide,

alcaloizi, compui fenolici (derivai ai acidului cafeic), flavonoide, glicozide iridoide i alte
terpenoide (Mohamed, 2011).
Spre deosebire de specia Plantago major, Plantago arenaria nu a reprezentat principalul
obiect de studiu n cercetrile privind genul Plantago. Aadar, exist puine informaii referitoare
la compoziia chimic a acestei plante. ns, de curnd, aceast specie a nceput s fie cultivat
8

ca plant medicinal de ctre Filiala de Plante aromatice i medicinale a Institutului de Cercetri

din India. Interesul pentru cultivarea acestei specii este datorat coninutului mare de mucilagii,
uleiuri grase, proteine, aucobozid i alcaloizi precum plantagonina i indicaina (Manish, 2011).
1.1.1. Carbohidrai
Seminele de Plantago conin monozaharide precum glucoz, fructoz, xiloz i ramnoz
i dizaharide precum sucroz (Ahmed, 1965). De asemenea, seminele conin i trizaharidul
planteoz, aceasta constituind rezerva de carbohidrai n semine (Rohrer, 1972). nveliul extern
al seminei conine polizaharide care se umfl n contact cu apa i formeaz mucilagii cu
vscozitate mare. n urma unui studiu realizat de Samuelsen i colaboratorii (1999), acesta a
artat c ntr-un extract de Plantago major polizaharidele sunt reprezentate de 39.7% xiloz,
13.1% arabinoz, 17.2% acid galacturonic, 15.5% acid glucuronic, 2.1% ramnoz, 2.5%
galactoz i 9.9% glucoz.
1.1.2. Lipide
Din semine de Plantago major au fost izolate o multitudine de lipide precum: acid
miristic, acid palmitic, acid stearic, acid oleic, acid linoleic, acid linolenic, acid arahic etc.
Conform lui Ahmed, acidul arahic a fost izolat doar din semine de Plantago major, acesta
neputnd fi izolat din nici o alt specie de Plantago (Ahmed, 1968). Dei seminele au un
coninut mare de lipide, din frunzele de Plantago major nu s-a reuit izolarea unui numr aa
mare de lipide. n frunzele de Plantago major cel mai abundent lipid este acidul palmitic
(Samuelsen, 2000).
1.1.3. Alcaloizi
Alcaloizii identificai n Plantago major au fost denumii de ctre Schneider (1990)
indacain i plantagonin. De asemenea, indicaina i plantagonina au fost identificate i n specia
Plantago arenaria (Manish, 2011).
1.1.4. Compui fenolici
Cercettorii Pailer i Hascheke-Hofmeister au izolat esterii etilici i metilici ai acidului
cafeic din extrate metanolice de Plantago major, iar cercettorul Maksyutina a izolat din
extractele apoase acidul clorogenic (Pailer i Haschke-Hofmeister, 1969; Maksyutina, 1971).
Potrivit studiilor efectuale de Skari i colaboratorii (1999), n extractele de etanol 80% au fost
identificate cantiti egale de plantamajozid i verbascozid. Plantamajozidul este principalul
derivat al acidului cafeic i este recunoscut pentru activitile sale biologice. Acesta are activitate
anti-inflamatoare (Murai, 1995), activitate inhibitoare asupra 5-lipoxigenazei (Ravn i colab,
9

1990), 15-lipoxigenazei (Skari, 1999) i cAMP fosfodiesterazei (Ravn i colab., 1990). Pe lng
activitatea anti-inflamatoare i inhibitoare, plantamajozidul are i activitate antioxidant i
antibacterian (Skari i colab., 1999). Verbascozidul prezint activitate antioxidant i activitate
inhibitoare asupra peroxidrii lipidelor, a protein kinazei C i a aldozo-reductazei (Xiong i
colab., 1996, Miyase i colab., 1991; Zhou i Zheng, 1991; Skari i colab., 1999; Herbert i
colab., 1991; Ravn i colab, 1990). De asemenea, verbascozida are efect antibacterian (Shoyama
i colab., 1987), imunosupresor (Sasaki i colab., 1989) i anelgezic (Andary i colab., 1982).
1.1.5. Flavonoide
Conform literaturii de specialitate, specia Plantago major conine un numr apreciabil de
substane flavonoidice: luteolin 7-glucozid, hispidulin 7-glucuronid, luteolin 7-diglucozid,
apigenin 7-glucozid, nepetin 7-glucozid, luteolin 6-hidroxi 4-methoxi 7-galactozid (Kawashty i
colab., 1994).
De asemenea, pe lng seria de flavonoide menionate anterior, Skari i colab., au izolat
plantagina i homoplantagina, acestea avnd structuri care nu au fost gsite anterior n Plantago
major (Skari i colab., 1999).
Dup cum tim, multe flavonoide sunt antioxidante. n Plantago major, baicaleina,
hispidulina i plantagina sunt exemple de asemenea flavonoide. (Skari i colab., 1999b). De
asemenea, aceste flavonoide au i efecte hepatoprotectoare (Lin i Shieh, 1996), antiproliferative
(Inoue i Jackson, 1999), antialergenice (Kawasaki i colab., 1994).
1.1.6. Glicozide iridoide
n Plantago major, glicozida iridoid cea mai important este aucubina, coninutul
acesteia variind n funcie de sezon. Astfel c, n perioada iunie a fost nregistrat cel mai mare
nivel de aucubin n frunzele uscate de P. major (Long i colab., 1995). Aceast glicozid iridoid
a fost identificat i n Plantago arenaria. Aucubina prezint proprieti antiinflamatoare (Recio
i colab., 1994) i hepatoprotectoare (Chang i colab., 1984) . De asemenea, aceasta prezint
activitate antiviral mpotriva virusului hepatitei B (Chang, 1997) i reprezint un antidot pentru
intoxicaiile cu ciuperci din genul Amanita (Chang i colab., 1984).
n anul 1981, cercettorul Popov mpreun cu colaboratorii si (1981) au fost primii care
au izolat glicozida iridoid, plantarenalozidul, din specia Plantago arenaria. Mai trziu, n anul
1984 respectiv 1988, ali cercettori au izolat bartisiozidul i verbascozidul (Andrze-jewskaGolec i Swiatek, 1984; Andary i colab., 1988).

10

1.1.7. Alte terpenoide

Terpenoidul loliolid a fost izolat din frunzele de Plantago major (Pailer i HaschkeHofmeister, 1969). Din ceara din frunze s-au izolat triterpenoide precum: acidul oleanolic, acidul
ursolic i sitosterolul (Hiltibran i colab., 1953; Ringbom et i colab., 1998). Aceste triterpenoide
au activitate hepatoprotectoare, antitumoral i antihiperlipidemic (Liu, 1995).

1.2.

Aciunea farmacologic i utilizarea terapeutic a celor dou specii studiate

Rafturile tuturor farmaciilor i supermarketurilor sunt ocupate de un numr din ce n ce

mai mare de produse naturale i remedii vegetale din moment ce popularitatea din ce n ce mai
larg a automedicaiei cu suplimente naturale continu s creasc, fcnd din beneficiile, dar i
din riscurile acestor preparete o preocupare covritoare (Mihok, 2009).
Frunzele de Plantago major sunt utilizate pentru vindecarea rnilor de sute de ani n
aproape toate prile lumii. De asemenea, sunt utilizate pentru tratarea unor boli care afecteaz
pielea, sistemul respirator, sistemul digestiv, sistemul urogenital, sistemul cardiovascular, dar i
mpotriva cancerului i infeciilor. Plantago major conine compui bioactivi precum:
carbohidrai, lipide, alcaloizi, compui fenolici (derivai ai acidului cafeic), flavonoide, glicozide
iridoide i alte terpenoide. n extractele de P. major au fost identificate o serie de aciuni
farmacologice incluznd: activitate antiinflamatoare, activitate de vindecare a rnilor,
antioxidant, slab antibiotic, imunomodulator i activitate antiulcerogenic. Unele din aceste
efecte pot contribui la utilizarea acestei plante n medicina tradiional (Samuelsen, 2000). Studii
patologice recente au artat ca extractul de Plantago major are efecte inhibitorii asupra tumorii
ascitogene Ehrlich i a prevenit extinderea tumorii. (Ozaslan i colab., 2007). Tabelul 1 prezint
principalele utilizri terapeutice ale plantei Plantago major i referinele corespunztoare
lucrrilor care demonstreaz utilizarea acestei specii n medicina tradiional.
Tab. 1 Utilizarea terapeutic a plantei Plantago major i referinele corespunztoare (dup
Samuelsen, 2000).
Utilizri tradiionale

Partea utilizat

Referine

PIELE
Abcese

Frunze, extract apos

Caceres i colab., 1987; Tabata

i colab., 1994

Acnee

Frunze, extract apos

11

Caceres i colab.,1987b

Antiinflamator

Frunze, suc

Rivera i Obon , 1995

ntreaga plant, extract apos Rodriguez i colab., 1994;

Gupta i colab., 1979; GuribFakim i colab., 1993
nepturi de albin, vispe, urzic Frunze, suc

Joshi i colab., 1982; Zagari,

1992; Brndegaard, 1987;
Heg, 1974

Vnti

Arsuri

Dermatite

ntreaga plant

Hussey, 1974

Frunze

Zagari, 1992

ntreaga plant,

Saklani i Jain, 1989

Frunze

Caceres i colab., 1987; Zagari,

Frunze, extract apos

1992, Heg, 1974

Caceres i colab., 1987

SISTEMUL RESPIRATOR
Antitusiv

Frunze, extract apos

Zagari, 1992

Astm, Bronite

Frunze, extract apos,

Zagari, 1992

Expectorant

rdcini
Frunze, extract apos

Guillen i colab., 1997

Rceli

Frunze, extract apos

Heg, 1974

Inflamarea gtului

Frunze, extract apos

Guillen i colab., 1997

SISTEMUL DIGESTIV
Holer

Frunze, extract apos

Weniger i colab, 1986

Constipaie

Extract apos

Bocek, 1984

Semine

Jain, 1991

Nespecificat

Ponce-Macotela i colab., 1994

Frunze, extract apos

Darias i colab., 1986

Frunze, extract apos

Zagari, 1992

Gastrite i colite

Extract cu alcool

Mironov i colab., 1983

Dureri de stomac

ntreaga plant, extract apos Spring, 1989

Ulcer

Frunze, extract apos

Diaree

Heg, 1974

ntreaga plant, extract apos Gupta i colab., 1979

12

Frunze, extract apos

Mironov i colab., 1983

SISTEMUL UROGENITAL
Contraceptiv

Frunze, extract apos

Hunte i colab., 1975

Pietre la rinichi

Frunze, extract apos + mix

Lawrendiadis, 1961

Tulburri mentruale

cu alte plante
Suc

Eli Lilly, 1898

Infecii ale tractului urinar

Frunze, extract apos

Zagari, 1992

Probleme ale uterului

ntreaga plant, extract apos Gurib-Fakim i colab., 1993

Vaginite

Frunze

Darias i colab., 1986

SISTEMUL CARDIOVASCULAR
Diabet

ntreaga plant, extract apos Houghton i Manby, 1985;

Edeme

+ Frunze, extract apos

Frunze

Rodriguez i colab., 1994

Yesilada i colab., (1995)

Hemoroizi

Frunze, extract apos

Guillen i colab., 1997

Hipertensiune

Frunze, extract apos

Nagata, 1971

Specia Plantago arenaria este folosit n medicina tardiional ca expectorant, antitusiv,

antibacterian i diuretic. De asemenea, aceast plant se utilizeaz n tratarea reumatismului, a
durerilor cauzate de gut i n bronite (WHO, 1999; WHO, 2007). Ceaiul din aceast plant este
folosit n cazul tuselor seci i a durerilor de stomac, iar unguentul este folosit pentru tratarea
ulciorului i a furnculilor (Kuhn i colab., 2000). Din seminele de Plantago arenaria se prepar
tre care sunt utilizate pentru slbire i ca laxative (Leung, 1980).
2. Compuii bioactivi din plante: ageni antioxidani eseniali pentru sntatea
noastr
Acest capitol va ncepe printr-o caracterizare general a antioxidanilor, iar apoi se va
prezenta o scurt clasificare i caracterizare a claselor mari de antioxidani i n final cteva
informaii legate de metodele de determinare a acestora i a activitii antioxidante.
2.1.

Generaliti
n ultimii 30-40 de ani a nceput studiul unui nou factor agresiv cu impact negativ asupra

sntii i anume radicalii liberi, dar a cror aciune poate fi contracarat de antioxidani. tim
c oxigenul este absolut esenial pentru sistemele vitale, ns transformarea sa ntr-o form
13

reactiv genereaz principalul factor agresiv. Astfel c, compuii biologic activi din numeroase
legume i fructe au atras atenia cercettorilor din cauza abilitii ridicate ale acestora de a aciona
ca ageni antioxidani i de a reduce astfel nivelul stresului oxidativ.
Antioxidanii sunt substane capabile de a ntrzia sau inhiba procesele de oxidare a
diferitelor sisteme cu oxigen. Rolul esenial al antioxidanilor n procesele vitale este strns
corelat cu meninerea unui echilibru ntre procesele pro-oxidative iniiate i catalizate de ctre
radicalii liberi i funcionarea corespunztoare a metabolismului (Albulescu, Alexa i Chiriac,
2005).
Radicalii liberi sunt formai n organismul uman n mod fiziologic, natural, n mitocondrii,
peroxizomi i n citosol (Magder, 2006).
Un dezechilibru ntre producia de antioxidani i radicalii liberi ai oxigenului i efectul
duntor pe care acetia l produc se numete stres oxidativ (Doelman, 1989). Deoarece n unele
boli precum cele neurodegenerative, cardiovasculare, Alzheimer, cancere, diabet etc., s-au
constatat cantiti mult prea mari de radicali liberi, se consider c stresul oxidativ reprezint
agentul patogenic al acestora (Jang i colab., 2010).
Recent, a crescut interesul pentru antioxidani naturali, acetia fiind folosii n industria
alimentar, farmaceutic i cosmetic n defavoarea celor artificiali care sunt adesea considerai
ca fiind carcinogeni (Djeridane i colab., 2006; Wannes i colab., 2010).
n continuare, vor fi prezentate clasele mari de antioxidani.
2.2.

Clasele mari de antioxidani

Exist antioxidani endogeni i exogeni. Antioxidanii endogeni pot fi compui enzimatici

precum superoxid dismutaza, glutation-peroxidaza sau compui neenzimatici precum cidul uric,
bilirubina, albumina, metalotioninele etc. Antioxidanii exogeni pot fi naturali sau sintetici
(Albulescu, Alexa i Chiriac, 2005).
Exemple de antioxidani naturali sunt compuii fenolici (tocoferolii, flavonoidele i acizii
fenolici), compuii cu azot (alacalozii, aminoacizii i aminele), carotenoizii i acidul ascorbic.
BHA (hidroxianizol butilat), BHT (hidroxitoluen butilat) i P (n-propil galat) sunt doar cteva
exemple de antioxidani artificiali (Velioglu i colab., 1998). Datorit activitii lor antioxidante,
polifenolii i flavonoidele sunt compuii cei mai studiai i utilizai n farmacologie.
Polifenolii sunt metabolii secundari care au n structura lor un inel benzenic i grupri
hidroxil ataate direct de el (Vladimir-Kneevi i colab., 2012). Metaboliii secundari sunt
secretai de plante cu rolul fie de a se apra mpotriva atacurilor patogene i a radiailor UV, fie de
a atrage ageni de polenizare i/sau polenizare, simbioni i prdtori ai patogenului care le atac
(Naczk i Shahidi, 2004). Polifenolii sunt antioxidani importani datorit potenialului redox
pronunat. Activitatea lor antioxidant este considerat a fi mult mai mare dect a vitaminelor
14

eseniale, contribuind astfel semnificativ la efectele manifestate de produsele naturale care i

conin (Tsao i Deng, 2004). Pe lng rolul de antioxidani, polifenolii prezint i capacitate
antimicrobian (Boyanova i colab., 2006). Datorit efectelor terapeutice ale polifenolilor, deja
demonstrate de studii de specialitate, interesul pentru disponibilitatea acestora este tot mai
crescut, sursele naturale fiind cele preferate. n ceea ce privete structura compuilor fenolici,
exist compui fenolici simpli care prezint un schelet carbonic constituit dintr-un nucleu
benzenic i o caten lateral cu trei atomi de carbon i compui fenolici compleci cu scheletul
carbonic mult mai elaborat. Exemple de astfel de compui fenolici compleci sunt: lignina,
flavonoidele i taninurile.
Flavonoidele reprezint ansamblul de compui fenolici alctuit din flavonoli, flavone,
catechine, izoflavone, fenoli existeni n produsele vegetale i care prin structura lor posed
proprieti antioxidante ce le confer capacitatea de a interveni activ n controlul reaciilor
oxidative din organism (Hollman i Katan, 1997). Aciunea lor este fie direct, de inhibare a
radicalilor liberi, fie indirect prin protecia sau regenerarea antioxidanilor primari (-tocoferol)
(Becker, Nissen i Skibsed, 2004). Sursa de bioflavone o reprezint plantele i produsele derivate,
astfel c prin aceti compui biologic activi pot interveni eficient n reducerea peroxidrii
lipidelor, ntrziind declanarea sau evoluia multor boli cronice precum: ateroscleroz, infarctul
miocardic, cancerul, tromboza etc. (Stephens, 1997). Compuii flavonici pot s menin la nivel
sczut excesul de acid arahidonic, pot s reduc agregabilitatea trombocitelor, precum i
tendinele de instalare a trombozei. Din aceste considerente, exist un interes crescut fa de
consumul unor alimente sau buturi pe baz de plante, n care se gsesc flavonoli, flavone,
catechine, a cror aciune biologic este dovedit n prevenirea acumulrii radicalilor liberi i n
controlul reaciilor oxidative ce intervin n aterogenez (Schwenke, 1998). n ceea ce privete
aciunea antitumoral, pentru o serie de compui flavonici i flavonolici, a fost stabilit o relaie
ntre aciunea antitumoral i capacitatea de a preveni metastazele n unele sarcoame. Aciunea
antitumoral depinde de structura chimic, gradul de polimerizare al flavonoidelor, molecula
activ fiind monomerul (Steinberg, 1993). Compuii flavonici din plante pot s amelioreze o serie
de etape n dezvoltarea carcinogenezei, a mecanismelor care implic modelarea reaciilor de
peroxidare a lipidelor (Ness i Powles, 1997).
La ora actual exist dovezi care indic c starea nutriional joac un rol esenial n
aprarea antiradical. (Franchel i colab., 1993). De aceea, o suplimentare moderat i bine
controlat n flavonoide combinate cu ali antioxidani naturali (vitamina C, -tocoferol) poate
diminua frecvena de apariie a anumitor boli legate de agresiunea oxidant. (Albrecht, 1994).
15

Datorit faptului c autooxidarea lipidelor duce pe lng scderea valorilor nutritive a

alimentelor i la deteriorarea aromei i gustului, i la cauzarea multor boli precum: ateroscleroza,
ischimia, inflamaia, carcinogeneza i mbtrnirea (Aruoma i Halliwell, 1991), este evident c
aceste efecte duntoare ale oxidrii lipidelor trebuie prevenite. Astfel c, n industria alimentar,
pentru a asigura calitatea nutriional i sigurana alimentelor, se adaug antioxidani sintetici
pentru a ntrzia oxidarea lipidelor din alimente. ns, din cauza creterii constante a dorinei
populaiei de a consuma mncruri naturale, a existat o dorin general de a nlocui aditivii
sintetici din mncruri cu alternativele naturale. (Howell, 1986). Din pcate, tocoferolul, unul
dintre antioxidanii naturali cunoscui, este mult mai puin eficient dect cei artificiali. Aceast
problem a condus la dorina i nevoia de a identifica noi antioxidani naturali care s fie eficieni
i siguri (Aruoma, 1994, Wanasundara i colab., 1994). Aadar, este nevoie de metode eficiente
pentru determinarea compuilor antioxidani naturali.
2.3.

Metode de determinare a compuilor bioactivi

Dup cum am menionat, compuii bioactivi din numeroase legume i fructe au atras

atenia cercettorilor din cauza abilitii ridicate ale acestora de a aciona ca ageni antioxidani i
de a reduce astfel nivelul stresului oxidativ. Pentru determinarea calitativ i cantitativ a acestor
compui bioactivi cel mai frecvent se utilizeaz metode de cromatografie i spectrofotometrie.
Unul din domeniile n care cromatografia pe strat subire i gsete o larg aplicabilitate
ca metod de analiz este cel pentru extractele de plante medicinale. n toate Pharmacopeile este
recunoscut ca fiind metoda de analiz oficial, cromatograma fotografiat constituind amprenta
extractului respectiv. Pe baza acestei amprente obinut dintr-un extract de plant atestat de un
botanist pot fi identificate extractele contrafcute, prin compararea cromatogramelor (Gocan,
2005). Aadar, metodele cromatografice sunt foarte importante deoarece sunt capabile de a
separa i identifica compuii activi din amestecuri att de complexe cum sunt plantele i
extractele acestora, folosind echipamente de laborator cu costuri minime (European
Pharmacopoeia, 2012).
Pentru determinarea compuilor bioactivi din extracte de plante, de exemplu a
polifenolilor, cel mai adesea se utilizeaz tehnica Folin-Ciocalteau, o tehnic bazat pe
spectrofotometrie (Pelozo, 2008). Aceasta metod este descris n Pharmacopoeie (Council of
Europe, 2007; Farmacopeia Brasileira, 2010). Polifenolii din extractele de plante pot reaciona cu
reactivi redox specifici i formeaz complexe colorate care se pot cunatifica prin msurarea la
spectrofotometru. Astfel c, cel mai des, pentru determinarea coninutului total de polifenoli se
folosete reactivul Folin-Ciocalteu sau reactivul Arnow (Schofield, 2001).
16

2.4. Metode de determinare a activitii antioxidante

Dup cum am menionat anterior, din cauza implicrii stresului oxidativ n numeroase
boli i a dorinei de a nlocui antioxidanii artificali cu cei naturali, exist numeroase cercetri
care se focuseaz pe cuantificarea i determinarea compuilor din extracte naturale care pot
atenua efectele radicalilor liberi.
Diversele metode existente i aplicate n vederea determinrii activitii antioxidante sunt
utilizate pentru monitorizarea i compararea activitii antioxidante a produselor vegetale.
Metodele care utilizeaz specii de generatori de radicali liberi au avantajele c sunt
rapide, uoare, simple i nu necesit echipamente speciale. Aceste metode sunt des utilizare
pentru testarea capacitii compuilor de a aciona ca i inhibitori de radicali liberi sau ca donatori
de hidrogen (Aruna, 2001).
Trebuie avut n vedere faptul c, msurarea individual a antioxidanilor, prin separare, nu
permite cunoaterea cu certitudine a capacitii antioxidante totale a unui produs datorit
efectelor sinergetice care pot s se stabileasc ntre compuii prezeni n acesta. (Pineda i colab.,
1999).
Alte metode de determinare a capacitii antioxidante utilizeaz fenomene de
chemiluminescen folosind diverse substane care detecteaz radicalii liberi i msoar
activitatea antiradical a antioxidanilor mpotriva radicalilor liberi ai oxigenului.
3. Cancerul de colon: boala secolului
ncidena la nivel global al cancerului colorectal este diferit la barbai i la femei. n
timp ce n rndul brbailor acest tip de cancer este al treilea cel mai diagnosticat cancer, la femei
cancerul colorectal ocup al doilea loc. Se estimeaz c numrul decesurilor pe an cauzate de
cancerul colorectal depeste o jumtate de milion, ceea ce nseamn c reprezint a patra cauza
de mortalitate din cauza cancerului din lume (Ferlay i colab., 2010; Boyle Peter, 2008; Jemal i
colab., 2011). Pentru a putea preveni cancerul de colon este indicat s cunoatem att factorii de
risc care duc la apariia acestuia ct i factorii care pot scdea riscul lui de apariie. Obezitatea,
consumul n exces de alcool, carne roie, carne procesat, fumatul, amidonul i consumul sczut
de legume i fructe, toate acestea reprezint factori de risc ale cancerului de colon. Pentru a
scdea riscul de apariie a cancerului de colon se recomand consumul de carne alb (pui sau
pete), nlocuirea grsimilor saturate cu cele nesaturate i cel mai important, consumul de fructe
i legume (Chan i Giovannucci, 2010; Center, Jemal i Ward, 2009). ntr-un studiu realizat de La
Vecchia (2013), s-a demonstrat c exist o strns legtur ntre o diet bogat n fructe i legume
17

i un risc sczut de cancer colorectal. Potrivit acestui studiu, reducerea riscului de cancer
colorectal este mai degrab datorat capacitii antioxidante totale din diferitele surse de legume
i fructe dect nivelului individual de antioxidani.
De mult vreme se cunoate faptul c exist o asociere foarte complex i n acelai timp
paradoxal ntre speciile reactive de oxigen (SRO) i stresul oxidativ i cancer. Aceast
conexiune nc nu este pe deplin neleas, dar reprezint obiectul de studiu pentru multe cercetri
privind noi metode terapeutice pentru diferite tipuri de cancer.
n subcapitolele ce urmeaz, pentru a putea nele care sunt dedesupturile care stau la
baza tratamentelor pentru cancer cu antioxidani sau cu ageni terapeutici care mresc
concentraia SRO, am nceput prin a explica ce sunt speciile reactive de oxigen i care este
legtura dintre ele i cancer.
3.1.

Speciile reactive de oxigen

Speciile reactive de oxigen sunt radicali, ioni sau molecule care au un electron

nemperecheat n orbitalii atomici sau moleculari. Speciile reactive de oxigen (SRO) sunt
reprezentate de radicali de oxigen, precum: superoxidul (O2), hidroxilul (OH), peroxid (ROO)
precum i de derivai non-radicalici ai oxigenului, cum ar fi: peroxidul de hidrogen (H2O2),
oxigenul singlet (1O2) i peroxinitritul (ONO) (Liou i Storz, 2010). Aceste specii reactive de
oxigen sunt formate inevitabil n organismele aerobe, astfel c acestea s-au adaptau situaiei
formnd sisteme puternice de antioxidani care s neutralizele efectele SRO.
Dup cum am menionat anterior, relaia dintre SRO i cancer este foarte complex si
paradoxal. Se tie c apoptoza i cancerul sunt dou fenomene total diferite, totui SRO induc
unele schimbri n secvenele de ADN care duc fie la iniierea apoptozei, fie la activarea unor
prooncogene i/ sau activarea unor gene tumorale supresoare. Astfel, am putea spune c aceste
molecule att de simple precum speciile reactive de oxigen controleaz att viaa ct i moartea
celulelor canceroase (Mates i Sanchez-Jimenez, 1999). Faptul c apoptoza poate fi indus de
SRO este dovedit prin cercetrile care au artat c mediatori cheie din calea de apoptoz fie
induc formarea de SRO intracelular, fie sunt inhibai de antioxidani (Rollet-Labelle, 1998). SRO
contribuie la carcinogenez prin interferarea cu unele ci de semnalizare. Ca mesager n calea de
traducere a semnalului, ROS interfereaz cu molecule de semnalizare precum: MAPK (mitogenactivated protein kinases), protein fosfataze i factori de transcriere (Zhang i Chen, 2004).
3.2.

Speciile reactive de oxigen i proliferarea celulelor tumorale

Rolul speciilor reactive de oxigen nu este limitat doar la efectele mutagenice care duc la

iniierea cancerului. Dup cum am spus anterior, s-a demonstrat c SRO, ca mesageri de
18

traducere a semnalului, influeneaz semnalele de cretere i activeaz exprimarea genelor, ceea

ce duce la proliferarea sau moartea celulelor canceroase (Filomeno, Rotilio i Ciriolo, 2005).
S-a demonstrat c celulele canceroase supuse la un stres oxidativ endogen i exogen
persistent dezvolt un rspuns adaptativ asociat cu activarea sistemului antioxidant (Portokal i
colab., 2000). Aadar, celulele tumorale sunt protejate n timpul evoluiei lor de sisteme
antioxidante i anti-apoptotice (Benhar, Engelberg i Levitzki , 2002).
n unele experimente, s-a demonstrat c producerea SRO n tumori i stresul oxidativ
rezultat sunt la nivele subletale i contribuie la progresia cancerului printr-o reea de semnale
interconectate (Burdon, 1995). n plus, semnalele de proliferare mediate de SRO sunt corelate cu
o susceptibilitate mic a celulelor tumorale la aciunea pro-apoptotic a unor terapii
antineoplazice (Lee i Shacter, 1999).
n concluzie, dup transformare, multe celule canceroase prezint o cretere a producerii
de specii reactive de oxigen care duce la progresia tumorii.
3.3.

Terapii anticancer care cresc sau scad nivelul speciilor reactive de oxigen
Speciile reactive de oxigen i tumorile sunt foarte strns legate ntre ele, fapt ce face
foarte dificil de neles dac oxidanii sunt necesari pentru creterea tumorilor i dac stresul
oxidativ poate fi exploatat n scop terapeutic (Schumacker, 2006).
Cercetrile arat c, dei celulele tumorale prezint o rezisten intrinsec la moartea
celular indus de SRO, terapiile care genereaz un stres oxidativ mare s-au dovedit a fi eficiente
(Sreevalsan, 2013). Acest fapt se poate explica prin faptul c probabil nivelul speciilor reactive de
oxigen trebuie s treac de o anumit limit pentru a induce moartea celulelor tumorale (Manda,
Nechifor i Neagu, 2009).
Aadar, dac lum n considerare faptul c semnalele de proliferare ctre celulele
canceroase sunt livrate de ROS i c celulele canceroase sunt rezistente la semnale proapoptotice, este posibill ca moartea celulelor tumorale indus de ROS s fie provocat de terapii
antineoplazice generatoare de SRO care cresc statusul oxidativ peste valoarea prag critic
necesar morii celulare (Manda, Nechifor i Neagu, 2009).
Multe studii indic faptul c un numr crescut de specii reactive de oxigen intracelular
contribuie la iniierea i progresia cancerului. Aadar, spre deosebire de metod discutat anterior,
s-a ncercat folosirea antioxidanilor pentru a epuiza celulele tumorale de SRO folosit pentru cile
de semnalizare de supravieuire, deci s-a ncercat scderea nivelului de SRO sub pragul n care
celulele tumorale funcioneaz optim. Un asemenea tratament ar putea avea i un rol preventiv
(Liou i Storz, 2010).

n unele cazuri, celulele tumorale atacate de terapiile antineoplazice pot dobndi

rezisten la stresul oxidativ, de aceea o combinie de terapii pare s fie cea mai bun idee. n
19

momentul dezvoltrii unor terapii antineoplazice trebuie luat n considerare c nu toi

antioxidanii vor avea acelai impact asupra celulelor canceroase (Conklin, 2004). De asemenea,
trebuie s fim contieni de faptul c elimind radicalii liberi din organismul nostru putem
interfera cu unele mecanisme de aprare cum ar fi apoptoza i fagocitoza sau ci de semnalizare
responsabile de homeostazie (Salganik, 2001). De asemenea, utilizarea antioxidanilor n terapii
combinate, poate avea un efect advers asupra medicamentelor anticancer care acioneaz asupra
tumorii prin creterea nivelului de SRO. Se presupune c utilizarea terapiei cu antioxidani n
combinaie cu o terapeutice care induc apoptoza independent de stresul oxidativ ar putea fi
eficient (Liou i Storz, 2010).
n concluzie, celulele canceroase funcioneaz optim ntr-un interval de concentraii ale
speciilor reactive de oxigen. Aadar, o terapie care scade SRO sub acest prag sau o terapie care
crete SRO peste acest prag, ar putea fi folosit pentru a omori celulele canceroase. Alegerea
folosirii uneia dintre aceste terapii poate fi dependent de tipul i stadiul tumorii, tipul i nivelul
SRO endogene i ci de supravieuire induse de SRO (Liou i Storz, 2010).

II. PARTE EXPERIMENTAL

Scopul acestor studii este determinarea potenialului antioxidant a dou extracte alcoolice
de Plantago i a efectului citotoxic asupra unor celule tumorale de cancer de colon murin, C26.
Datorit listei lungi de valori terapeutice descoperite de-a lungul anilor i discutate
anterior, cele dou specii de Plantago prezint un mare interes pentru cercetrile care privesc
carcinogeneza i identificarea unpor compui cu potenial citotoxic. Astfel c, prin studierea
intens a acestor specii, s-ar putea descoperi proprieti medicinale care nc nu au fost studiate n
totalitate. Avnd n vedere aceste aspecte, am selectat specia Plantago major care a fost intens
20

studiat n ceea ce privete potenialul su antioxidant (Kawashty i colab.,1994; Skari i colab.,

1999; Samuelsen, 2000) i specia Plantago arenaria despre care se gsesc puine date n
literatur, pentru a realiza un studiu comparativ n ceea ce privete cantitatea de flavonoide,
capacitatea antioxidant total i efectul citotoxic al compuilor antioxidani asupra unor celule
de cancer de colon murin, C26.
4. Materiale i metode
4.1.

Material vegetal
Plantago major L. i Plantago arenaria Waldst. & Kit. au fost colectate din Gradina

Botanica A. Borza din Cluj-Napoca (464536N i 233513E) i au fost identificate de Dr. M.

Parvu, de la Universitatea Babes-Bolyai din Cluj-Napoca. Un voucher specimen (CL 663369 i
respectiv CL 663373) este depozitat la Herbarul Universitii "Babes-Bolyai" din Cluj-Napoca.
4.2.

Metode experimentale utilizate

Partea experimental a constat n prepararea extractelor de Plantago major i Plantago

arenaria n Laboratorul de Micologie al Facultii de Biologie i Geologie condus de domnul

Prof. Dr. Marcel Parvu, i efectuarea unor analize spectrofotometrice, analize cromatografice i
analize pentru determinarea caracterului antioxidant n Laboratorul de Chimie Analitic (Lect. Dr.
Simona Cobzac) al facultii de Chimie i Inginerie Chimic. Analizele pentru determinarea
capacitii antioxidante totale a celor dou extracte precum i a efectului citotoxic s-au realizat la
Centrul de Biologie Molecular condus de domnul Academician Profesor Dr. Octavian Popescu,
din cadrul Institutului de Cercetri Interdisciplinare n Bionanotiine al Universitii BabeBolyai din Cluj-Napoca.
4.2.1. Prepararea extractului
Fragmente mici (0.5-1 cm) de Plantago major L. i Plantago arenaria Waldst. & Kit. au
fost extrase cu alcool etilic 70% (Merck, Bucuresti, Romania) n Laboratorul de Micologie al
Universitii "Babes-Bolyai" din Cluj-Napoca, prin metoda repercolrii la rece (Mishra i Verma,
2009; Sundaram i Gurumoorthi, 2012), la temperatura camerei, pentru 3 zile (Sundaram i
Gurumoorthi, 2012). Coninutul de extract de frunz (cu 35% alcool etilic) a fost (w/v; g/ml)
1:1.3.
4.2.2. Identificarea calitativ i cantitativ a principiilor active din extractele de Plantago
4.2.2.1. Determinarea coninutului total de flavonoide prin analiz spectrofotometric
Pentru determinarea concentraiei de flavonoide totale exprimate n rutin s-a realizat o
analiz spectrofotometric. Rutinul (sau rutozidul) este un flavonoid din clasa flavonolilor
21

glicozidici alctuit din quercitin i rutinoz (o dizaharid) care are proprieti antioxidante (Lucci
i Mazzafera, 2009).
Principiul metodei
Principiul metodei se bazeaz pe formarea unui compus colorat galben-portocaliu prin
reacia dintre flavonoide i AlCl3, acest compus solubil n ap absoarbe lumin la lungimea de
und de 430 nm. n determinarea concentraiei de flavonoide s-a utilizat metoda curbei de
calibrare, iar rezultatele au fost exprimate n mg/mL rutin.
Reactivi, aparatur i soluii
- soluie metanolic de rutin 25.9mg/25mL
- soluie apoas de clorur de aluminiu (AlCl3) 25g/L
- soluie apoas de acetat de sodiu (NaAc) 100g/L
- spectrofotometru Jasco V-530
Metoda de lucru
Pentru prepararea etalonului de rutin a fost nevoie de 0,00125 g rutin, dar n timpul
msurrii, cantitatea msurat a fost mult mai mare dect cea dorit (0,01552g). Aceast cantitate
a fost dizolvat n 25 mL metanol, iar apoi s-a realizat o diluie 1:10, obinndu-se 0,06208
g/mL.
Cte 1 ml din extractul de Plantago major i Plantago arenaria s-a amestecat cu 2,5 ml
clorur de aluminiu i 1,5 ml acetat de sodiu i totul s-a adus la 10 ml cu metanol. Dup 30 de
minute s-au citit absorbanele la 430 nm. Ca i soluie de comparaie s-a folosit un amestec care
nu coninea clorur de aluminiu, ci doar 1 ml extract, 1,5 ml NaAc i adus la 10 ml cu metanol.
Dup cum am menionat, ca standard s-a folosit o soluie de rutin din care s-au luat cte 1,
2, 3, 4 respectiv 5 ml i s-au amestecat cu 2,5 ml clorur de aluminiu i 1,5 ml acetat de sodiu i
apoi toate soluiile s-au adus la 10 ml cu metanol. Dup 30 de minute s-au citit absorbanele la
430 nm, n cuve de cuar de 1 cm, dup fiecare citire cuvele s-au splat cu ap i metanol.
Pe baza absorbanelor citite pentru soluiile standard s-a construit o curb de calibrare
pentru determinarea concentraiei de flavonoide totale exprimate n rutin n extractele studiate.
4.2.2.2. Analiza calitativ a extractelor de Plantago prin cromatografie n strat subire
Pentru analiza calitativ a extractelor s-a utilizat cromatografia n strat subire. Conform
literaturii de specialitate, specia Plantago major conine un numr apreciabil de substane
fenolice: luteolin 7-glucozid, hispidulin 7-glucuronid, luteolin 7-diglucozid, apigenin 7-glucozid,
nepetin 7-glucozid, luteolin 6-hidroxi 4-metoxi 7-galactozid (Kawashty i colab., 1994).
22

Principiul metodei
Principiul metodei se baseaz pe separarea pe un suport de material adsorbant a unor
compui dintr-un extract. n cromatografia pe strat subire separarea are loc de-a lungul unei faze
staionare solide depus ntr-un strat subire pe un suport solid sub aciunea fazei mobile lichide
numit eluent. Faza staionar este de obicei un solid polar, ca de exemplu silicagelul sau alumina
care acoper o plac subire de sticl, material plastic sau aluminiu. n acest caz procesul de
separare este bazat n primul rnd pe absorbie. Sistemul de solveni acetat de etil : toluen : acid

formic : ap = 60 : 3 : 8 : 6 este folosit cel mai frecvent ca faz mobil pentru compuii fenolici.
Reactivi, aparatur i soluii
plci Silica Gel F254
aplicator semiautomat Camag Linomat 5
standard apigenin 0,67mg/mL
standard cuercitrin 1 mg/mL MeOH
standard cuercitin 1 mg/10 mL MeOH
standard kaempferol 1 mg/mL
standard hiperozid 1 mg/mL CH3OH
standrad acid cafeic 1,05 mg/mL MeOH
standard acid clorogenic 0,98 mg/mL MeOH
standard acid transcumaric 1,08 mg/mL MeOH
standard acid ferulic 1,17 mg/mL MeOh
standard acid galic 1,16 mg/mL CH3OH
standard luteolin 1,01 mg/mL MeOH
standard luteolin 7-glucozid 2 mg/mL
standard miricetin 1 mg/mL MeOH
standard rutin 1,02 mg/mL MeOH
camer de developare
reactiv NTS
Metoda de lucru
Extractele de Plantago arenaria respectiv Plantago major obinute prin metoda
repercolrii la rece au fost supuse analizei prin CSS. Analizele au fost realizate pe plci silicagel
F254. nainte de utilizare, plcile au fost condiionate cu metanol i uscate la 1100 C timp de 3 ore.
Probele au fost aplicate cu un aplicator semiautomat Camag Linomat 5, sub form de benzi de 5
mm. Aparatul Linomat 5 este complet controlat prin winCATS-Planar Cromatography Manager
software. Cu acest sistem pot fi selectai o mulime de parametri cum ar fi: numrul i lungimea
benzilor i volumele aplicate secvenial, poziia x pe plac i distanele ntre benzi. Am aplicat 18
probe, fiecare band avnd 0,5 cm. Volumele aplicate au fost de 10 L (n godeu 8) respectiv 20
L (n godeele 9, 11 i 12) pentru extractele de plante i 5 L pentru standarde.
Standardele folosite au fost: apigenin, cuercitrin, cuercitin, kaempferol, hiperozid, acid
cafeic, acid clorogenic, proba 1 de Plantago arenaria, proba 2 de Plantago arenaria, acid
23

transcumaric, proba 1 de Plantago major, proba 2 de Plantago major, acid ferulic, acid galic,
luteolin, glucozid, miricetin, rutin. Dup fiecare aplicare microsiringa a fost spalat manual cu
etalon de splare.
Developarea s-a realizat ntr-o camer normal, n atmosfer saturat, utilizndu-se ca i
faz mobil sistemul de solveni acetat de etil : toluen : acid formic : ap = 60 : 3 : 8 : 6 (v/v).
Dup developare, plcile au fost uscate, iar nainte de puleverizare cu NTS, placa a fost
vizualizat la 254 nm (Fig. 3).
Ulterior, vizualizarea plcilor s-a realizat prin pulverizare cu difenilborat de aminoetanol
(NTS), iar fiindc reactivii de pulverizare sunt nocivi, operaia s-a efectuat ntr-o ni (Fig. 4).
Poza s-a realizat n lumin UV-366 nm, cnd sunt vizualizai compuii care prezint
fluorescen.
4.2.2. Determinarea eventualilor compui cu caracter antioxidant a extractului de Plantago
arenaria i Plantago major prin metoda TLC-DPPH
Pentru a evidenia eventualii compui cu caracter antioxidant din cele 2 extracte studiate
s-a folosit metoda TLC-DPPH. Astfel c, s-a utilizat DPPH (1, 1-difenil-2 picrilhidrazil), un
compus organic cu o coloraie violet nchis.
Principiul metodei
Aceast metod se bazeaz pe msurarea activitii de donare a unui electron a
compuilor dintr-o mixtur. Orice molecul care poate dona un electron sau un proton va
reaciona cu DPPH i va decolora cromatograma.
Reactivi, aparatur i soluii
- cromatogram
- reactiv DPPH
Metoda de lucru
Determinarea caracterului antioxidant s-a realizat folosit un pulverizator electropneumatic acionat de o baterie proprie cu ajutorul cruia s-a sprayat cromatograma cu 0,02 %
DPPH n etanol. Cromatograma a fost obinut prin metoda descris n capitolul anterior.
Prezena compuilor antioxidani a fost detectat prin spoturile galbene pe fundalul
albastru-violet al cromatogramei pulverizat cu DPPH.
Culoarea DPPH-ului este albastru-violet, aceasta culoare modificndu-se pn la galben
cnd electronul nepereche capteaz un proton de la antioxidant, formndu-se astfel forma redus
DPPH-H. Rezultatul decolorrii este stoechiometric cu respectarea numrului de electroni captai.
(Miliauskas i Venskutonis, 2004). Poza a fost realizat la lumina zilei.
4.2.3. Determinarea capacitii antioxidante totale
Pentru determinarea capacitii antioxidante totale s-a folosit metoda TAC. n aceast
metod Trolox este folosit ca antioxidant standard, capacitatea antioxidant a extractului fiind
24

msurat n mmoli echivaleni Trolox/L. Troloxul (Acid 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2carboxilic) este un analog al vitaminei E.
Principiul lucrrii
Principiul metodei const n capacitatea antioxidanilor, din extracte, de a decolora
ABTS+, acesta avnd o culoare albastru-verzuie. Forma redus a moleculei de ABTS este oxidat
ntr-un mediu acid la ABTS+ folosind peroxidul de hidrogen (tamponul acetat 30 mmol/L pH
3.6). n tamponul acetat, moleculele de ABTS+ rmn stabile o perioad mai ndelungat. n timp
ce este diluat cu un tampon acetat mai concentrat (tamponul acetat 0,4 mol/L pH5.8), culoarea va
ncepe s se decoloreze. Antioxidanii din extracte vor accelera decolorarea cu o rat care va fi
proporional cu concentraia lor. Aceast reacie poate fi monitorizat cu ajutorulul unui
spectrofotometru la 660 nm. Rata decolorrii va fi invers proporional cu capacitatatea
antioxidant total a extractului. Rata reaciei este calibrat cu Trolox, analog al vitamilei E, care
este adesea folosit ca antioxidant standard pentru metoda de determinare a capacitii
antioxidante total. Aadar, principiul se bazeaz pe capacitatea de neutralizare a radicalului
ABTS+ de ctre antioxidani comparativ cu un antioxidant standard (antioxidant hidrosolubil
derivat din vitamina E, Trolox).
Reactivi i aparatur
- Trolox (Acid 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-carboxilic)
- ABTS (Acid 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonic)
- R1 (tampon acetat 0.4 M, pH 5.8)
- R2 (10 mM ABTS+ n 30 mM tampon acetat, pH 3.6)
- Spectrofotometru FLUOstar Omega
Metoda de lucru
S-a scos din frigider soluia de ABTS i a fost lsat s se echilibreze la temperatura
camerei.
S-a preparat solventul (etanol 35%) folosind 350 l de etanol i 650 l ap. S-a dizolvat
Trolox n tampon fosfat (30mml / l, pH 7.4) i s-au preparat diluii seriale (de la 4 M pn la
0,0625 M) de Trolox pentru curba standard. La fiecare diluie succesiv s-a dublat volumul i sa njumtit concentraia.
Pentru analiz s-a folosit o plac cu 96 de godeuri, aceasta avnd 12 coloane (numerotate
de la 1-12) i 8 rnduri (numerotate de la A-H). S-au pipetat 5 l de Trolox n duplicat i 5 l din
probele de analizat. Dup aceasta, s-au adugat 200 l din R1 i placa a fost supus primei citiri
(proba blanc). Dup prima citire, pentru a ncepe analiza, s-au adugat 20 l din R2 (Erel, 2004;
Sepp i colab., 2010). Citirile au fost fcute folosind spectrofotometrul FLUOstar Omega la 660
nm la intervale de timp de 5/10/15/20 de miute. Pentru vizualizarea datelor s-a folosit Mars Data
Analysis Software.
25

Pe baza absorbanelor citite pentru soluia standard s-a construit o curb de calibrare
pentru determinarea capacitii antioxidante totale exprimate n mmol echivaleni Trolox/g
flavonoid n extractele studiate.
4.2.4. Determinarea activitii citotoxice a extractelor de Plantago arenaria i Plantago major asupra
celulelor de cancer de colon C26, in vitro
Efectul extractului de Plantago major i Plantago arenaria asupra proliferrii celulelor de
cancer de colon murin C26 a fost testat folosind un kit pe baz de BrdU (Cell Proliferation
ELISA, BrdU, Roche). BrdU (5-bromo-2'-deoxiuridin) fiind un nucleozid sintetic, analog al
timinei (Lehner i colab., 2011).
Principiul lucrrii
Principiul acestui test se bazeaz pe msurarea ncorporrii BrdU n locul timinei n ADNul nou sintetizat n timpul proliferrii celulare, folosind un anticorp anti-BrdU conjugat cu POD.
Dup ce celulele au fost cultivate n plci de culturi de celule cu 96 de godeuri i incubate la 370,
se adaug soluia de BrdU, n vederea nlocuirii timinei i se las la incubat. Dup ce soluia
BrdU se ndeprteaz, se adaug soluia FixDenat pentru a fixa celulele i a denatura ADN-ul.
Denaturarea ADN-ului are ca scop creterea accesibilitii BrdU-ului ncorporat pentru a putea fi
detectat i legat de ctre Anti-BrdU-Pod, acesta fiind adugat dup etapa de denaturare. Pentru a
detecta anticorpul legat se folosete o reacie de substrat. Pentru cuantificare se realizeaz o citire
a absorbanelor la 450 nm folosind un spectrofotometru. Valoarea absorbanei va fi proporional

cu cantitatea de BrdU ncorporat.

Reactivi i aparatur
Mediu de cultur RPMI 1640
Soluie BrdU (10 mM 5-bromo-2'-deoxiuridin n PBS, pH 7.4)
Soluie FixDenat
Soluie Anti-BrdU-POD
Soluie de diluare anticorpi
Tampon de splare
Soluie de substrat
Spectrofotometru FLUOstar Omega
Metoda de lucru
Celulele de carcinom murin C26 obinute de la CLS CELL LINES SERVICE GMBH,
Germania au fost meninute n cultur folosind mediu de celule animale RPMI 1640 complet (cu
L-glutamin, HEPES, i antibiotice mbogit cu 10% ser fetal bovin (FBS)). Ulterior, celulele au
fost cultivate n plci de culturi de celule cu 96 de godeuri la o densitate de 1x104 celule/godeu
(100 l) i incubate 24 de ore la 370 C, n vederea aderrii la substrat. A doua zi s-au adaugat
extractele de Plantago, cea mai mica diluie a extractelor fiind de 5X, iar cea mai mare de 250x,
n mediu de cultur RPMI-1640 complet i s-au incubat celulele tumorale 48 de ore cu aceste
26

extracte. Dup cele 48 de ore de tratament, celulele au fost tratate cu 10 l BrdU/godeu (cu
concentraie final de 10 M BrdU) i reincubate timp de 4 ore, n vederea ncorporrii BrdU n
locul timinei. Dup cele 4 ore, mediul de etichetare a fost nlturat i s-au adugat 200 l de
soluie FixDenat/godeu i s-a lsat la incubat 30 de minute. Dup ce soluia de FixDenat s-a
nlturat, s-au adugat 100 l de soluie Anti-BrdU-POD/godeu (diluat 1:100 n soluie de diluare
anticorpi) i s-a lsat la incubat 60 de minute. Pentru ndeprtarea anticorpului conjugat, s-au
realizat 3 splri cu 200 l tampon de splare/godeu. Dup splare s-au adugat 100 l soluie
substrat/godeu i s-a lsat la incubat 5 minute. Pentru oprirea reaciei enzimatice s-au adugat
cte 25 l de H2SO4 1M n fiecare godeu i s-a lsat la incubat 1 minut, dup care placa a fost
supus citirii absorbanelor probelor la 450 nm folsind un spectrofotometru FLUOstar Omega.
Pentru experiment a fost ales un eantion de celule care au fost prelucrate n aceleai condiii cu o
singur excepie, n mediul lui de cultur nu a fost aplicat tratament, acest eantion a fost
considerat control pozitiv i a fost ultilizat pentru interpretarea rezultatelor.
Pentru a ne asigura c potenialul citotoxic al extractelor nu este determinat de etanolul
din extracte am testat diferite concentraii ale etanolului. Concentraia de 7% etanol corespunde
diluiei de 5x a unei probe, cea de 0.088% corespunde diluiei de 400x a unei probe.
5. Rezultate i discuii
Pe baza studiului informaiei tiinifice i a rezultatelor obinute n experimentele
comparative folosind dou specii de Plantago n vederea determinrii efectelor citotoxice asupra
unor celule de cancer de colon murin C26, s-au obinut urmtoarele rezultate:
5.1.

Determinarea coninutului total de flavonoide prin analiz spectrofotometric

Coninutul (g/ml) n rutin al extractelor de Plantago, conform determinrii
spectrofotometrice i curbei de calibrare este prezentat n Tabelul 2.
Tab. 2 Valorile concentraiei de flavonoide totale exprimat n rutin
Specie
Plantago arenaria
Plantago major

Concentraia de flavonoide exprimat n rutin

0,320 g/ml
0,352 g/ml

n concluzie, n ceea ce privete coninutul de flavonoide a celor dou extracte, se observ

c acesta este similar.
5.2.

Analiza calitativ a extractelor de Plantago prin cromatografie n strat subire

Cromatogramele nainte i dup pulverizare cu NTS, prezint benzi de compui separai
similare n aceeai prob.

27

Fig. 3 Cromatograma extractelor de Plantago arenaria i Plantago major nainte de pulverizare cu NTS
Faza staionar: Placa Sil G F254. Faza mobil: acetat de etil:toluen:acid formic:ap=60:3:8:6 (v/v). Standarde:
apigenin (1), cuercitrin (2), cuercitin (3), kaempferol (4), hiperozid (5), acid cafeic (6), acid clorogenic (7), acid
transcumaric (10), acid ferulic (13), acid galic (14), luteolin (15), luteolin 7- glicozid (16), miricetin (17), rutin (18).
Probe: Plantago arenaria (8,9), Plantago major (11,12). Vizualizare: fr pulverizare cu NTS n UV

Fig. 4 Cromatograma extractelor de Plantago arenaria i Plantago major pulverizat cu NTS

Faza staionar: Placa Sil G F254. Faza mobil: acetat de etil:toluen:acid formic:ap=60:3:8:6 (v/v). Standarde:
apigenin (1), cuercitrin (2), cuercitin (3), kaempferol (4), hiperozid (5), acid cafeic (6), acid clorogenic (7), acid
transcumaric (10), acid ferulic (13), acid galic (14), luteolin (15), luteolin 7- glicozid (16), miricetin (17), rutin (18).
Probe: Plantago arenaria (8,9), Plantago major (11,12). Vizualizare: NTS n UV

Se observ benzi n dreptul rutinului, acidului transcumaric, miricitinului, acidului cafeic,

apigeninului, luteolin 7-glicozidului i n dreptul acidului ferulic. Confirmarea se bazeaz pe
compararea valorilor Rf a etalonului cu a compusului separat din probe respectiv pe compararea
aspectului benzii etalonului cu cea a compsului separat din probe.
28

Aadar, pentru confirmarea compuilor din cele dou extracte se calculeaz valorile Rf..
Factorul de retenie Rf are valori cuprinse ntre 0 i 1. Factorii de retenie depind de temperatura,
grosimea stratului, gradul de saturare cu solvent din camera de separare, mrimea probei, tipul de
faza mobil i staionar. Formula pentru calculul Rf este:
Rf =

distan a migrat de compus

distan a migrat de frontul solventului
Msurarea distanei se face de la mijlocul godeelor pn la mijlocul compusului i de la

mijlocul godeelor pn la mijlocul liniei de stop (Tab. 4).

Tab. 4. Valorile necesare pentru calcularea factorilor de retenie Rf i valoarea Rf pentru fiecare
compus
Godeu

Distana migrat de
compus

1 (apigenin)
2 (cuercitrin)
3 (cuercitin)
4 (kaempferol)
5 (hiperozid)
6 (acid cafeic)
7 (acid
clorogenic)

8 (Plantago
arenaria)

Rf

6,1
3,8
6
6,1
2,3
5,8
2

0,96
0,60
0,95
0,96
0,34
0,92
0,31

Compus 1

0,9

0,14

Compus 2

2,1

0,33

Compus 3

4,5

0,71

Compus 4

5,6

0,88

Compus 5

9 (Plantago
arenaria)
10 (acid
transcumaric)

11 (Plantago
major)

Distana
migrat de
front

Idem
6

6,3

0,95
Ide
m
0,95

Compus 1

0,15

Compus 2

1,8

0,28

Compus 3

2,5

0,39

Compus 4

3,5

0,55

Compus 5

0,95

29

12 (Plantago
major)
13 (Acid ferulic)
14 (acid galic)
15 (luteolin)
16 (luteolin 7glicozid)
17 (mirecitin)
18 (rutin)

Idem

idem
6
5,4
5,8
2,3

0,95
0,85
0,92
0,36

5,8
0,9

0,92
0,14

Conform acestor date, se poate afirma faptul c extractul de Plantago arenaria (godeul 8)
conine rutin, acid transcumaric, mirecitin, acid cafeic i apigenin. Se observ c, dei n cazul
probei din godeul 9 s-a folosit o cantitate mai mare de extract de Plantago arenaria (20 L n loc
de 10 L), compuii sunt aceeai. n ceea ce privete extractul de Plantago major, compuii 1, 2
i 4 din godeul 11 respectiv godeul 12 nu pot fi identificai deoarece nu corespund niciunui
standard utilizat. n schimb, compusul 3 a fost identidicat ca fiind luteolin 7-glicozid i compusul
5 ca fiind acidul ferulic.
Se poate observa c cele dou extracte conin compui total diferii, astfel c ne putem
atepta ca activitatea asupra celulelor tumorale s fie diferit. Rutinul i mirecitinul fac parte din
grupa flavonolilor, acidul transcumaric, acidul cafeic i acidul ferulic fac parte din grupa acizilor
hidroxicinamici, iar apigeninul i luteolin 7-glicozidul fac parte din grupa flavonelor. De
asemenea, se observ c amprentele celor dou extracte sunt diferite.
5.3.

Determinarea eventualilor compui cu caracter antioxidant a extractului de Plantago

arenaria i Plantago major prin metoda TLC-DPPH
Analiznd cromatograma pulverizat cu DPPH, se poate observa ca extractul de Plantago
arenaria are mai muli compui cu caracter antioxidand dect Plantago major (Fig. 5). Aceast
diferen este vizibil mai ales n partea superioar a cromatogramei. n ceea ce privete
standardele, apigeninul, luteolin 7-glucozidul i rutinul au activitate antioxidant mai slab, iar
acidul cafeic, acidul ferulic i acidul galic au cea mai puternic activitate antioxidant.

30

Fig. 5 Cromatogram pulverizat cu DPPH pentru evidenierea caracterului antioxidant

5.4.

Determinarea capacitii antioxidante totale

S-au obinut urmtoarele rezultate care au fost convertite n uniti Trolox cu ajutorul
graficului de calibrare i sunt prezentate n figura 6.

Fig.6 Capacitatea antioxidant total a extractelor de Plantago arenaria (P1) i Plantago major (P2)
n alcool. Datele obinute reprezint media deviaia standard a dou msurtori individuale.
p=0.0.0014
n concluzie, se poate observa c diferena n ceea ce privete TAC pentru cele dou
extracte este semnificativ, extractul de Plantago arenaria avnd o capacitate antioxidant mai
mare dect extractul de Plantago major cu aproximativ 30%. Pentru efectuarea comparaiei ntre
cele dou specii studiate n ceea ce privete activitatea antioxidant total, s-a realizat
normalizarea la aceeai cantitate de flavonoide.

31

5.5.

Determinarea activitii citotoxice a extractelor de Plantago arenaria i Plantago major

asupra celulelor de cancer de colon C26, in vitro.
Dup cum am precizat anterior, pentru a ne asigura c potenialul citotoxic al extractelor
nu este determinat de etanolul din extracte am testat diferite concentraii ale etanolului.
Concentraia de 7% etanol corespunde diluiei de 5x a unei probe, cea de 0.088% corespunde
diluiei de 400x a unei probe. Rezultatele privind efectul etanolului asupra celulelor tumorale sunt
redate n figura 6.

Fig. 6 Efectul etanolului asupra proliferarii celulelor de cancer de colon C26

6.
Dup cum se observ, la cea mai mic diluie a etanolului (concentraie 7%), acesta a
determinat o inhibiie de pn la 20% din celulele netratate. Concentraia minim inhibitoare
identificat pentru etanol a fost de 0,070%. n intervalul de concentraii 0.35% - 0,08% etanolul a
determinat o proliferare a celulelor de pn la 25% din celulele netratate
Rezultatele privind efectul de inhibiie a proliferrii celulelor in vitro a diferitelor
concentraii ale extractului de Plantago arenaria sunt prezentate n figura 7.

32

Se
Fig. 7 Efectul extractului P1- extract frunze Plantago arenaria alcool 35% (1:1,8), asupra proliferarii
celulelor de carcinom de colon, C26
poate
observa

c, la

concentraii ale flavonoidelor mai mari de 0,006 g/ml s-a obinut o inhibiie aproape total a
proliferrii celulelor tumorale (de peste 95% din procentul de proliferarii celulelor netratate).
Rezultatele obinute privind efectul citotoxic al extractului de Plantago major sunt
prezentate n figura 8.

Fig. 8 Efectul extractului P2-extract frunze Plantago major alcool 35% (1:1,3), asupra
proliferrii celulelor de cancer de colon, C26

33

Se poate observa c, incubarea celulelor tumorale cu extractul de Plantago major

determin o scdere major a proliferrii celulare doar la concentraia cea mai mare testat, de
0,070 g/ml determinnd o inhibiie de peste 95% comparativ cu proliferarea celulelor netratate.

Concluzii

Flavonoidele din dou specii de Plantago, Plantago arenaria i Plantago major, colectate
din Grdina Botanic Alexandru Borza din Cluj-Napoca, au fost extrase cu alcool 35% i
supuse unor analize chimice privind capacitatea lor antioxidant i citoxicitatea lor antitumoral.
Principalele concluzii ale acestor studii au fost:

Coninutul total de flavonoide al celor dou extracte este similar.

Compoziia calitativ n flavonoide ale celor dou extracte este urmtoarea: rutinul, acidul
transcumaric, mirecitinul, acidul cafeic i apigeninul n extractul de Plantago arenaria, i

luteolin 7-glicozidul i acidul ferulic n extractul de Plantago major.

Extractul de Plantago arenaria prezint o activitate antioxidant mai ridicat dect

extractul de Plantago major.

Extractul de Plantago arenaria s-a dovedit mult mai eficient n inhibarea celulelor
tumorale, C26. Astfel o concentraie de flavonoide din Plantago arenaria de aproximativ
10 ori mai mic dect n cazul speciei Plantago major determin o inhibiie de peste 95%

a celulelor tumorale.
Studiile viitoare vor urmri determinarea cantitativ a diferitelor tipuri de flavonoide i
identificarea mecansimelor moleculare care stau la baza acestor efecte citotoxice.

34

Bibliografie

1.

Adam, M., Principii active cu proprietate antioxidant din unele specii ale familiei Lamiaceae,
Tez de doctorat, Universitatea de Medicin i Farmacie, Facultatea de Farmacie, Trgu-Mure,

2.

2003
Ahmed, Z.F., Rizk, A.M., Hammouda, F.M., Phyto- chemical studies of egyptian Plantago

3.

species (Glucides), J. of Pharmaceutical Sciences, 54, 1965, 10601062.

Ahmed, Z.F., Hammouda, F.M., Rizk, A.M., Wassel, G.M., Phyochemical studies of

4.

egyptian Plantago species, Planta Medica, 4, 1968, 404410

Albrecht, R., Aspects nutritionnels de la protection anti redicalaire, Med. et Nutr., 30 (1), 1994,

5.

19-24.
Albulescu, M., Alexa, N., Chiriac, A., Metode clasice i moderne de extracie din plante a

6.

substanelor active din clasa flavonoidelor, Ed. Eurobit, Timioara, 2005.

Andary, C., Wylde, R., Lafte, C., Privat, G., Winternitz, F., Structures of verbascoside and
oroban choside, cafeic acid sugar esters from Orobanche rapum-genistae, Phytochemistry, 21,

7.

1982, 11231127.
Andary, C., Motte-Florac ,M.E., Gargadennec, A., Wylde, R., Heitz, A., Les esters cafeiques du
genre Plantago. Identication et valeur chimiotaxinomique, PlantesMedicinales et Phytotherapie,

8.

22, 1988, 17-22.

Andrzejewska-Golec, E., Swiatek, L., Chemotaxonomic studies on the genus Plantago. I.

9.

Analysis of the iridoid fraction, Herba Polonica, 30, 1984, 9-16.

Aruna, P., Antioxidant Activity, Medalion Laboratories Analytical Progress, 19 (2), 2001, 103-

10.
11.

198.
Aruoma, O.I., Food Chem. Toxic. 32, 1994, 671-683.
Aruoma, O.I., Halliwell, B., Free Radicals and Food Additives. Taylor & Francis Ltd., London,

12.

1991, pp. 77-119.

Becker, E.M., Nissen, L.R., Skibsed, L.H., Antioxidant evaluation protocols: Food quality or
health effects, Eur. Food. Res. Technol., 219, 2004, 561-571.
35

13.

Benhar, M., Engelberg, D., Levitzki, A., ROS, stress-activated kinases and stress-signaling in

14.

cancer, EMBO Reports, 3, 2002, 420-5.

Blacquiere, T., Koetsier, C., The response of Plantago lanceolata and P. major to nitrate

15.

depletion, Pland and soil, 107, 1988, 197-206.

Bocek, B.R., Ethnobotany of Costanoan indians, California, based on collections by John P.

16.

Harrington, Economic Botany, 38, 1984, 241255.

Boyanova, L., Kolarov, R., Gergova, G., Mitov, I., In vitro activity of Bulgarian propolis against

17.
18.

94 clinical isolates of anaerobic bacteria, Anaerobe, 12, 2006, 173-177.

Brndegaard, V.J., Folk og Flora, Vol. 4. Rosenkilde and Bagger, Kobenhavn, 1987, pp. 68-77.
Burdon, R.H., Superoxide and hydrogen peroxide in relation to mammalian cell proliferation.

19.

Free Radic. Biol. Med., 18, 1995, 775- 94.

Butur, V., Enciclopedie de etnobotanic romneasc, Ed. tiinific i Enciclopedic, Bucureti,

21.

1979, pp. 201.

Caceres, A., Giron, L.M., Alvarado, S.R., Torres, M.F., Screening of antimicrobial activity of
plants popularly used in Guatemala for the treatment of dermatomucosal diseases J. of
Ethnopharmacol., 20, 1987, 223237.
Center, M.M, Jemal, A,, Ward, E., International trends in colorectal cancer incidence

22.

rates, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 18 (6), 2009, 16881694.

Chan, A.T, Giovannucci, E.L., Primary prevention of colorectal cancer. Gastroenterology, 138

23.

(6), 2010, 20292043.

Chang, I.M., Yun, H.S., Kim, Y.S., Ahn, J.W., Aucubin: potential antidote for alpha-amanitin

24.

poisoning, Clinical Toxicology, 22, 1984, 7785.

Chang, I.M., Antiviral activity of aucubin against hepatitis B virus replication. Phytotherapy

25.
26.

Research, 11, 1997, 189192.

Chevallier, A., The Encyclopedia of Medicinal Plants, Dorling Kindersley, London, 1996.
Conklin, K.A., Free radicals: the pros and cons of antioxidants. Cancer chemotherapy and anti-

20.

28.

oxidants, J. Nutr., 134, 2004, 3201-3204.

Council of Europe. Determination of tannins in herbal drugs. In European Pharmacopoeia,
6th ed.; European Directorate for the Quality of Medicines, Strasbourg, France, 2007, p. A286
Darias, V., Bravo, L., Barquin, E., Herrera, D.M., Fraile, C., Contribution to the

29.

ethnopharmacological study of the Canary Islands. J. of Ethnopharmacol., 15, 1986, 169193.

Djeridane, A., Yousfi, M., Nadjemi, B., Boutassouna, D., Stocker, P., Vidal, N., Antioxidant

27.

activity of some algerian medicinal plants extracts containing phenolic compounds, Food
30.

Chemistry, 97 (4), 2006, 654-660.

Doelman, C.J., Antioxidant Therapy and Preventing Medicine, Plenum Press, New York, 1989,

31.

pp. 9.
Eli, L., Lillys Handbook of Pharmacy and Therapeutics, 5th rev. Eli Lilly and Company,

32.

Indianapolis, In 46206, USA, 1898.

Erel, O., A novel automated direct measurement method for total antioxidant capacity using a
new generation, more stable ABTS radical cation, Clin. Biochem., 37, 2004, 277-285.
36

33.

European Pharmacopoeia, Monografia 2371: Metode de preparare a suelor homeopatice i

34.
35.

potenarea, Ed. 7, Brussel: Council of Europe - EDQM, 2012.

Farmacopeia Brasileira, 5th ed.; Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria: Braslia, Brazil, 2010.
Ferlay, J., S.H., Bray, F., Forman, D., Mathers, C., Parkin, D.M., Globocan, vo1.2, Cancer

36.

Incidence and Mortality Worldwide, 2010.

Filomeno, G., Rotilio, G., Ciriolo, M.R., Disulfide relays and phosphorylative cascades: partners

37.

in redox-mediated signalling patways, Cell Death Differ., 12, 2005, 1555-63.

Franchel, E.N., Kanner, J., German, J.B., Parks, E., Kinssela, J.E., Inhibition of oxidation of
human low-density lipoprotein by phenolic substances in red wine, Lancet, 341 (8843), 1993,

38.
39.

454-457.
Gocan, S., Cromatografia de nalt performan, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca, 2005.
Guillen, M.E.N., Emim, J.A.S., Souccar, C., Lapa, A.J., Analgesic and antiinammatroy activities

40.

of the aqueous extract of Plantago major L., Intern. J. of Pharmacognosy, 35, 1997, 99104.
Gupta, M.P., Arias, T.D., Correa, M., Lamba, S.S., Ethnopharmacognostic observations on

41.

Panamanian medicinal plants. Part I, Quarterly J. of Crude Drug Research, 17, 1979, 115130.
Gurib-Fakim, A., Sewrey, M., Gueho, J., Dulloo, E., Medical ethnobotany of some weeds of

42.

Mauritius and Rodrigues, J. of Ethnopharmacol., 39, 1993, 175185.

Herbert, H.M., Maffrand, F.P., Taoubi, K., Augereau, J.M., Fouraste, I., Gleye, J., Verbascoside
isolated from Lantana camara, an inhibitor of portein kinase C, J. of Nat. Prod., 54, 1991, 1595

43.
44.

1600.
Hiltibran, R.C., Wadkins, C.L., Nicholas, H.J., J. of the Amer. Society, 75, 1953, 5125.
Hollman, P.C.H., Katan, M.B., Absorption, metabolism and health effects of dietary flavonoids in

45.

man, Biomed. Pharmacather, 51, 1997, 305-310.

Hoskovec, L., Plantago arenaria Waldst. et Kit. Sand Plantain, Branched Plantain, French Psyllium,
Botany.Cz, 2014.

46.

Houghton, P.J., Manby, J., Medicinal plants of the Mapuche. J. of Ethnopharmacol., 13, 1985,

47.
48.

89103.
Howell, J.C., Food and Chemical Toxicology. 24, 1986, 997-1002.
Hunte, P., Sa, M., Macey, A., Kerr, G.B., Indigenous methods of voluntary fertility regulation in
Afghanistan.National Demographic Family Guidance Survey of Settled Population Afghanistan.

49.
50.
51.

4, 1975, 1.
Hussey, J.S., Some useful plants of early New England, Economic Botany, 1974, pp. 311.
Heg, O.A., Planter og Tradisjon, Universitetsforlaget, Oslo, 1974, pp. 507511.
Inoue, T., Jackson, E.K., Strong antiproliferative effects of baicalein in cultured rat hepatic

52.

stellate cells, Eu. J. of Pharmacol., 378, 1999, 129135.

Jain, S.K., Dictionary of Indian Folk Medicine and Ethnobotany. Deep Publications, New Delhi,
1991, pp. 145.

37

53.

Jang, I.C., Jo, E.K., Bae, M.S., Lee, H.J., Jeon, G.I., Park, E., Yuk, H.G., Ahn, G.H., Lee, S.C.
Antioxidant and antigenotoxic activities of different parts of persimmon (Diospyros kaki cv.

54.
55.

Fuyu) fruit, J. of Medicinal Plants Research, 4 (2), 2010, 155-160.

Jemal, A., i colab., Global cancer statistics, CA Cancer J. Clin.,61 (2), 2011, 6990.
Joshi, D.N., Sah, B.C.L., Suri, R.K., Some medicinal plants of Rudranath Bugyal (dist. Chamoli),

56.

U.P., Bulletin of Medicoethnobotanical Research, 3, 1982, 2742.

Kawasaki, M., Toyoda, M., Teshima, R., i colab., In vitro antiallergenic acitivity of avonoids in
histamine-release assay using rat basophilic leukemia (RBL-2H3) cells, J. of the Food Hygienic

57.

Society of Japan, 35, 1994, 497503.

Kawashty, S.A., Gamal-el-din, E., Abdalla, M.F., Saleh, N.A.M., 1994. Flavonoids of Plantago

58.

species in Egypt. Biochemical Systematics and Ecology, 22, 1994, 729733.

Kuhn, M.A i colab., Herbal therapy & supplements: A scientific & traditional approach,

59.

Lippincott, Philadelphia, 2000, pp. 262-267.

La Vecchia C, i colab., Dietary total antioxidant capacity and colorectal cancer: A large case-

60.

control study in Italy, Int. J. Cancer., 27 (10), 2013, 28133.

Lawrendiadis, G., Contribution to the knowledge of the medicinal plants of Greece, Planta

61.

Medica, 9, 1961, 164169.

Lee, Y., Shacter, E., Oxidative stress inhibits apoptosis in human lymphoma cells, J. Biol. Chem.,

62.

274, 1999, 19792-19798.

Lehner, B., Sandner, B., Marschallinger, J., Lehner, C., Furtner, T., Couillard-Despres, S., Rivera,
F.J., Brockhoff, G., Bauer, H-C., Weidner, N., Aigner, L., The dark side of BrdU in neural stem
cell biology: Detrimental effects on cell cycle, differentiation and survival, Cell and Tissue

63.

Research, 345 (3), 2011, 31328.

Leung, A.Y., Encyclopedia of common natural ingredients used in food, drugs and cosmetics.

64.

John Willey i Sons, New York, 1980.

Lin, C.C., Shieh, D.E., In vivo hepatoprotective effect of baicalein, baicalin and wogonin from

65.
66.
67.

Scutellaria rivularis, Phytotherapy Research, 10, 1996, 651654.

Liou, G.Y., Storz, P., Reactive oxygen species in cancer, Free Radic. Res., 44(5), 2010.
Liu, J., Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid, J. of Ethnopharmacol., 49, 1995, 5768.
Long, C., Moulis, C., Stanislas, E., Fouraste, E., Lucuboside et le catapol dans les feuilles de
Plantago lanceolata L., Plantago major L. et Plantago media L. J. de Pharmacie de Belgique,

68.

50, 1995, 484488.

Lucci, N., Mazzafera, P., Rutin synthase in fava danta: Purification and influence of stressors,

69.

Canad. J. of Pl. Scien. 89 (5), 2009, 895902.

Magder, S., Reactive oxygen species: toxic molecules or spark life? Critical Care, 10 (1), 2006,

70.

1-8.
Maksyutina, N.P., Hydroxycinnamic acids of Plantago major and Pl. lanceolata, Chemistry of
Natural Compounds, 7, 1971, 795.
38

71.

Manda, G., Nechifor, M.T., Neagu, T.M., Reactive Oxygen Species, Cancer and Anti-Cancer

72.

Therapies, Current Chem. Bio., 3, 2009, 342-366.

Manish, D., Growth, photosynthetic efficiency, yield and swelling factor in Plantago indica
under semi-arid condition of Gujarat, India, Intern J. of Pl Physiol. and Biochem., 3 (12), 2011,

73.

205-214.
Mihok, C.., Cercetri fitochimice ale unor specii indigene de Aconitum, Tez de doctorat,

74.

Universitatea de Medicin i Farmacie, Facultatea de Farmacie, Trgu-Mure, 2009.

Miliauskas, G., Venskutonis, P.R van Beek T.A., Screening of radical scavenging activity of some

75.

medicinal and aromatic plant extracts, Food Chemistry, 85 (2), 2004, 1123-1131.
Mironov, V.A., Vasilev, G.S., Matrosov, V.S., i colab., Physiologically active alcohols from great

76.

plantain, Khimiko-farmatsevticheskii Zhurnal, 17, 1983, 13211325.

Mishra, R., Verma, D.L., Antifungal activity and flavonoid composition of Wiesnerella denudata.

77.

Steph Academia Arena, 1, 2009, 42-45.

Miyase, T., Ishino, M., Akahori, C., Ueno, A., Ohkawa, Y.,Tanizawa, H., Phenylethanoid

78.

glycosides from Plantago asiatica, Phytochemistry, 30, 1991, 20152018.

Mohamed, I.K., Osama, M. A., Samiha, M. A., Zahrat, E.M., Biochemical studies on Plantago
major L. and Cyamopsis tetragonoloba L., Intern. J. of Biodiver. and Conserv., 3 (3), 2011, 83-

79.

91.
Moore, G., Sanford, P., Wiley, T., Perennial pastures for Western Australia, Bulletin 4690,

80.

(Department of Agriculture and food, Perth), 2006.

Murai, M., Tamayama, Y., Nishibe, S., Phenylethanoids in the herb of Plantago lanceolata and
inhibitory effect on arachidonic acid-induced mouse ear edema, Planta Medica, 61, 1995, 479

81.

480.
Naczk, M., Shahidi, F., Extraction and analysis of phenolics in food, J of Chromat. A., 1054 (1),

82.
83.

2004, 95111.
Nagata, K.M., Hawaiian medicinal plants, Economic Botany, 25, 1971, 245254.
Ness, A.R., Powles, J.W., Fruit and vegetables, and cardiovascular disease: a review, Int. J.

84.

Epidemiol, 26, 1997, 1-13.

Ozaslan, M., Karagz, K., Kalender, M.E., Kilic, I.H., Sari, I., Karagz, A., In vivo Antitumoral
effect of Plantago major L.extract on Balb/C Mouse with Ehrlich Ascites Tumor. Am. J. Chin.

85.

Med., 35 (5), 2007, 841- 851.

Pailer, V.M., Haschke-Hofmeister, E., Inhaltstoffe aus Plantago major, Planta Medica, 17, 1969,

86.

139145.
Pelozo, M.I.G., Cardoso, M.L.C., Mello, J.C.P., Spectrophotometric determination of tannins
and caffeine in preparations from Paullinia cupana var. sorbilis, Braz. Arch. Biol. Technol., 51,

87.

2008, 447451.
Peter-Boyle, B.L., World Cancer Report, IARC, Lyon, France, 2008, pp. 15.
39

88.

Pineda, A., Salucci, M., Lazaro, R., Maiani, G., Ferro-Luzzi, A., Capacidad antioxidante y
potencial de sinergismo entre los principales contituyentes antioxidantes de alugnos alimentos,

89.

Rev. Cubana Aliment, 13 (2), 1999, 104-111.

Ponce-Macotela, M., Navarro-Alegria, I., Matinez-Gordillo, M.N., Alvarez-Chacon, R., In vitro

90.

antigiardiasic activity of plant extracts, La Revista de InvestigacionClnica, 46, 1994, 343347.

Popov, S.S., Marekov, N.L., Evstatieva, L.N., Cyclopentanoidmonoterpenes from Plantago
species, Communications of the Department of Chemistry, Bulgarian Academy of Sciences, 14,

91.

1981, 175-179.
Portokal, O., Oxkaya, O., Erden, I.M., Bozan, B., Kosan, M., Sayek, I., Coenzyme Q10
concentrations and antioxidant status in tissues of breast cancer patients, Clin. Biochem., 33,

92.

2000, 279-84.
Qadry, S.M.J.S., A note on Plantago major seeds: a substitute for ispaghula, J. of Pharm and

93.

Pharmacol., 15, 1963, 552-555.

Radu, A., Andronescu, E., Fuzi, I., Botanic farmaceutic, Ed. Didactic i Pedagocic,

94.

Bucureti, 1981, pp. 11.

Ravn, H., Nishibe, S., Sasahara, M., Li, X., Phenolic compounds from Plantago

95.

asiatica.Phytochemistry, 29, 1990, 3627.

Recio, M.C., Giner, R.M., Ros, J.L., Structural considerations on the iridoids as anti-

96.

inammatory agents, Planta Medica, 60, 1994, 232234.

Ringbom, T., Segura, L., Noreen, Y., Perera, P., Bolin, L., Ursolic acid from Plantago major, a
selective inhibitor of cyclooxygenase-2 catalyzed prostaglandin biosynthesis, J. of Nat Prod., 61,

97.
98.

1998, 12121215.
Rivera, D., Obon, C., The ethnopharmacology of Madeira and Porto Santo Islands, a
review. J. of Ethnopharmacol., 46, 1995, 7393.
Rodriguez, J., Loyola, J.I., Maulen, G., Schmeda-Hirschmann, G., Hypoglycaemic activity of
Geranium core-core, Oxalis rosea and Plantago major extract in rats, Phytotherapy Research, 8,

99.
100.

1994, 372374.
Rohrer, D.C., The crystal and molecular

structure of planteose dihydrate. Acta

Crystallographica B., 28, 1972, 425433.

Rollet-Labelle, E., Grange, M.J., Elbim,C., Marquetty, C., Gougerot-Pocidalo, M.A., Pasquier,
C., Hydroxyl radicals as a potential intracellular mediator of polymorphonuclear neutrophil

101.

apoptosis, Free Rad. Biol. Med., 24, 1998, 563-572.

Saklani, A., Jain, S.K., Ethnobotanical observations on plants used in northeastern India. Intern.

102.

J. of Crude Drug Research, 27, 1989, 6573.

Salganik, R.I., The benefits and hazards of antioxidants: controlling apoptosis and other
protective mechanisms in cancer patients and human population. J. Am. Coll. Nutr., 20, 2001,
464-472.
40

103.

Samuelsen, A.B., Lund, I., Djahromi, J.M., Paulsen, B.S.,Wold, J.K., Knutsen, S.H.,. Structural
features and anti-complementary activity of some heteroxylan polysaccharide fractions from the

104.

seeds of Plantago major L., Carbohydrate Polymers, 38, 1999, 133143.

Samuelsen, A.B., The traditional uses, chemical constituents and biological activities of Plantago

105.

major L. A review. J of Ethnopharm., 71, 2000, 1 21.

Sasaki, H., Nishimura, H., Morota, T., i colab., Immuno-suppressive principles of Rehmannia

106.

glutinosa var. hueichingensis, Planta Medica, 55, 1989, 458462.

Schneider, G., Arzneidrogen, Ein Kompendium fur Pharmazeuten, Biologien und Chemiker.

107.

Wissenschaftsver- lag,Mannheim, Germany, 1990, pp. 131.

Schofield, P., Mbugua, D.M., Pell, A.N., Analysis of condensed tannins: A review. Anim. Feed

108.

Sci. Tech., 91, 2001, 2140.

Schumacker, P.T, Reactive oxygen species in living cells: Live by the sword, die by the sword,

109.
110.

Cancer Cell, 10 (3), 2006, 175176.

Schwenke, D.C., Antioxidants and atherogenesis, J. Nutr. Biochem., 9, 1998, 424-445.
Sepp, T., Sild, E., Hrak, P., Hematological condition indexes in greenfinches: effects of captivity

111.

and diurnal variation, Physiol. Biochem. Zool., 83, 2010, 276- 282.
Shoyama, Y., Matsumoto, M., Nishioka, I., Phenolic glycosides from diseased roots of

112.

Rehmannia glutinosa var.purpurea, Phytochemistry, 26, 1987, 983986.

Skari, K.P., Malterud, K.E., Haugli, T., Radical scavengers and inhibitors of enzymatic lipid
peroxidation from Plantago major, a medicinal plant. Poster 495 at 2000 Years of Natural

113.

Products Research Past, Present and Future, Amsterdam, The Netherlands, 1999.
Spring, M.A., Ethnopharmacologic analysis of medicinal plants used by Laotion Hmong refugees

114.

in Minnesota, J. of Ethnopharmacol., 26, 1989, 6591.

Sreevalsan, S., Safe, S., Reactive oxygen species and colorectal cancer, Curr. Colorectal Cancer

115.
116.
117.

Rep., 9 (4), 2013, 350357.

Steinberg, D., Antioxidant Vitamins, N. Engl. J. Med., 328, 1993, 1444-1449.
Stephens, N., Antioxidant therapy for ischaemic heart disease, Lancet, 349, 1997, 1710-1711.
Sundaram, U., Gurumoorthi, P., Validation of HPTLC method for quantitative estimation of L-

119.

Dopa from Mucuna pruriens. Int. Res. J. Pharm., 3, 2012, 300-304.

Tabata, M., Sezik, E., Honda, G., i colab., Traditional medicine in Turkey III. Folk medicine in
east Anatolia, Van and Bitlis, Intern. J. of Pharmacognosy, 32, 1994, 312.
Tsao, R., Deng, Z., Separation procedures for naturally occurring antioxidant phytochemicals, J.

120.

of Chromat. B, 812, 2004, 85-99.

Tutin, T.G., Heywood, V.H., Burges, N.A., i colab., Flora Europaea, vol. 4. Cambridge

121.
122.

University Press, Cambridge, 1976, pp. 39.

Uphof, J.C.T., Dictionary of economic plants, Second edition, Cramer, Wiirzburg, 1968.
Velasco-Lezama, R., Tapia-Aguilar, R., Romn-Ramos, R., Vega-Avila, E., Prez-Gutirrez M.S.,

118.

Effect of Plantago major on cell proliferation in vitro, J Ethnopharm., 103 (1), 2006, 36-42.

41

123.

Velioglu, Y.S., Mazza, G., Gao, L., Oomah, B.D., Antioxidant activity and total phenolics in
selected fruits, vegetables and grain products. J. of Agricult. and Food Chemestry, 46 (10), 1998,

124.

4113-4117.
Vladimir-Kneevi, S., Blaekovi, B., tefan M.B., Babac, M., Plant Polyphenols as
Antioxidants Influencing the Human Health, Phytochemicals as Nutraceuticals - Global

125.
126.

Approaches to Their Role in Nutrition and Health, Dr Venketeshwer Rao, Ed. InTech, 2012.
Wanasundara, U., i colab., J. Agric. Food Chem., 42, 1994, 1285-1290.
Wannes, W. A., Mhamdi, B., Sriti, J., Jemia, M. B., Ouchikh, O., Hamdaoui, G., Kchouk, M. E.,
Marzouk, B., Antioxidant activities of the essential oil and methanol extracts from myrtle
(Myrtus communis var. italica L.) leaf, stem and flower. Food and Chemical Toxicology, 48 (5),

127.

2010, 1362-1370.
Weniger, B., Rouzier, M., Daguilh, R., Henrys, D., Henrys, J.H., Anton, R., La medecine
pupulaire dans le plateau central dHaiti. 2 inventaire ethnopharmacologique, J. of

128.

Ethnopharmacol., 17, 1986, 1330.

WHO monographs on selected medicinal plants, World Health Organisation, Geneva, vol 1,

129.

1999, pp. 202-206.

WHO monographs on selected medicinal plants, World Health Organisation, Geneva, vol 3,

130.

2007, pp. 268-282

Xiong, Q.B., Kadota, S., Tani, T., Namba, T., Antioxdative effects of phynyletanoids from

131.

Cistanche deserticol. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 19, 1996, 15801585.

Yesilada, E., Sezik, E., Fujita, T., Tanaka, S., Tabata, M., Screening of some Turkish medicinal

132.

plants for their antiulcerogenic activities, Phytotherapy Research, 7, 1993, 263265.

Zagari, A., Medicinal Plants, Iran Book, Tehran, Teheran University Publications, 1819 (4), 1992,

133.

969.
Zhang, Y., Chen, F., Reactive oxygen species (ROS), troublemakers between nuclear factor-B

134.

(NF-B) and c-Jun NH2-terminal kinase (JNK), Cancer Res., 64, 2004, 1902-1905.
Zhou, Y.C., Zheng, R.L., 1991. Phenolic compounds and analogs as superoxide anion scavengers
and antioxidants, Biochem. Pharmacol., 42, 1991, 11771179.

42