CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION

Cromatografa lquida de alta resolucion

La Cromatografa lquida de alta eficacia o High performance liquid chromatography
(HPLC) es un tipo de cromatografa en columna utilizada frecuentemente en bioqumica
y qumica analtica. Tambin se la denomina a veces Cromatografa lquida de alta
presin o High pressure liquid chromatography (HPLC), aunque esta terminologa se
considera antigua y est en desuso. El HPLC es una tcnica utilizada para separar los
componentes de una mezcla basndose en diferentes tipos de interacciones qumicas
entre las substancias analizadas y la columna cromatogrfica.
En la HPLC isocrtica el compuesto pasa por la columna cromatogrfica a travs de la
fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeas partculas redondeadas con
ciertas caractersticas qumicas en su superficie) mediante el bombeo de lquido (fase
mvil) a alta presin a travs de la columna. La muestra a analizar es introducida en
pequeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las
interacciones qumicas o fsicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la
columna. El grado de retencin de los componentes de la muestra depende de la
naturaleza del compuesto, de la composicin de la fase estacionaria y de la fase mvil.
El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de
retencin y se considera una propiedad identificativa caracterstica de un compuesto en
una determinada fase mvil y estacionaria. La utilizacin de presin en este tipo de
cromatografas incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro la columna y
reduce as su difusin dentro de la columna mejorando la resolucin de la
cromatografa. Los disolventes ms utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo.
El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el cido trifluoroactico,
que ayudan a la separacin de los compuestos.
Una mejora introducida a la tcnica de HPLC descrita es la variacin en la composicin
de la fase mvil durante el anlisis, conocida como elucin en gradiente. Un gradiente
normal en una cromatografa de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y
progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado vara en
funcin de la hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los componentes de la
muestra como una funcin de la afinidad del compuesto por la fase mvil utilizada
respecto a la afinidad por la fase estacionaria. En el ejemplo, utilizando un gradiente
agua/acetonitrilo los compuestos ms hidroflicos eluirn a mayor concentracin de
agua, mientras que los compuestos ms hidrofbicos eluirn a concentraciones elevadas
de acetonitrilo. A menudo, hace falta realizar una serie de pruebas previas por tal de
optimizar el gradiente de forma que permita una buena separacin de los compuestos.

Tipos de HPLC
Cromatografa de fase normal
La cromatografa de fase normal o "Normal phase HPLC" (NP-HPLC) fue el primer
tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la qumica, y se caracteriza por separar
los compuestos en base a su polaridad. Esta tcnica utiliza una fase estacionaria polar y
una fase mvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de inters es bastante polar. El
compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de adsorcin
aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interaccin entre el
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compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparacin a la fase mvil) aumenta
el tiempo de retencin.
La fuerza de interaccin no slo depende de los grupos funcionales del compuesto de
inters, sino tambin en factores estericos de forma que los ismeros estructurales a
menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilizacin de disolventes ms polares
en la fase mvil disminuye el tiempo de retencin de los compuestos mientras que los
disolventes ms hidrofbicos tienden a aumentar el tiempo de retencin.
La NP-HPLC cay en desuso a los aos setenta con el desarrollo del HPLC de fase
reversa o Reversed-phase HPLC debido a la falta de reproductibilidad de los tiempos de
retencin puesto que los disolventes prticos cambiaban el estado de hidratacin de la
silica o almina de la cromatografa.

Cromatografa de fase reversa

La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase inmvil apolar y una fase
mvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias ms comunes de este tipo
de cromatografa es la silica tratada con RMe2SiCl, dnde la R es una cadena alquil tal
como C18H37 C8H17. El tiempo de retencin es mayor para las molculas de
naturaleza apolar, mientras que las molculas de carcter polar eluyen ms rpidamente.
El tiempo de retencin aumenta con la adicin de disolvente polar a la fase mvil y
disminuye con la introduccin de disolventes ms hidrofbicos. La cromatografa de
fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna
especificacin adicional. La cromatografa de fase reversa se basa en el principio de las
interacciones hidrofbicas que resultan de las fuerzas de repulsin entre un disolvente
relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar.
La fuerza conductora en la unin del compuesto a la fase estacionaria es la disminucin
del rea del segmento apolar del analito expuesto al disolvente.Este efecto hidrofbico
est dominado por la disminucin de la energa libre de la entropa asociada con la
minimizacin de la interfase compuesto-disolvente polar. El efecto hidrofbico
disminuye con la adicin de disolvente apolar a la fase mvil. Esto modifica el
coeficiente de particin de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye.
Las caractersticas del compuesto de inters juegan un papel muy importante en la
retencin. En general, un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un
tiempo de retencin mayor porque aumenta la hidrofobicidad de la molcula. Aun as,
las molculas muy grandes pueden ver reducida la interaccin entre la superficie del
compuesto y la fase estacionaria. El tiempo de retencin aumenta con el rea de
superficie hidrofbica que suele ser inversamente proporcional al tamao del
compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluir ms rpidamente que sus ismeros
lineales puesto que la superficie total se ve reducida.
Aparte de la hidrofobicidad de la fase mvil, otras modificaciones de la fase mvil
pueden afectar la retencin del compuesto; por ejemplo, la adicin de sales inorgnicas
provoca un aumento lineal en la tensin superficial, y como que la entropa de la
interfase compuesto-disolvente est controlada precisamente por la tensin superficial,
la adicin de sales tiende a aumentar el tiempo de retencin.

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Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del

compuesto. Por este motivo, la mayora de mtodos utilizan un tampn como el fosfato
de sodio por controlar el valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero tambin
neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que haya quedado
expuesta y actan como contraiones que neutralizan la carga del compuesto. El efecto
de los tampones sobre la cromatografa puede variar, pero en general mejoran la
separacin cromatogrfica.
Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas
de silica normales. Aun as, muchas columnas de fase reversa estn formadas por silica
modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con bases en medio acuoso
puesto que stas podran daar el esqueleto de silica subyacente. Las columnas se
pueden utilizar en cidos en medio acuoso pero no deberan estar expuestas demasiado
tiempo al cido porque puede corroer las partes metlicas del aparato de HPLC.

Cromatografa de exclusin molecular

La cromatografa de exclusin molecular, tambin conocida como cromatografa por
filtracin en gel, separa las partculas de la muestra en funcin de su tamao.
Generalmente se trata de una cromatografa de baja resolucin de forma que se suele
utilizar en los pasos finales del proceso de purificacin. Tambin es muy til para la
determinacin de la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de las protenas
purificadas.
La cromatografa de filtracin molecular es un mtodo de cromatografa en columna por
el cual las molculas se separan en solucin segn su peso molecular, o ms
precisamente, segn su radio de Stokes.
En esta cromatografa, la fase estacionaria consiste en largos polmeros entrecruzados
que forman una red tridimensional porosa. A los fines prcticos, la columnas se
empaquetan con pequeas partculas esferoidales formadas por esos polmeros
entrecruzados. En consecuencia, estas partculas son porosas, y el tamao de los poros
es tal que algunas molculas (las demasiado grandes) no podrn ingresar a esos poros,
en tanto que otras (las suficientemente pequeas) podrn pasar libremente. Los poros
quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina una serie de caminos a
ser recorridos por las molculas que acceden al interior de esta.

Cromatografa de intercambio inico

En la cromatografa de intercambio inico, la retencin se basa en la atraccin
electrosttica entre los iones en solucin y las cargas inmovilizadas a la fase
estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga
opuesta son retenidos por la columna. Algunos tipos de intercambiadores inicos son: i)
Resinas de poliestireno, ii) intercambiadores inicos de celulosa y dextranos (geles) y
iii) Silica porosa o vidrio de tamao de poro controlado. En general los
intercambiadores inicos favorecen la unin de iones elevada carga y radio pequeo. Un
incremento en la concentracin del contrain (respeto a los grupos funcionales de la
resina) reduce el tiempo de retencin. Un incremento en el pH reduce el tiempo de
retencin en las cromatografas de intercambio catinico mientras que una disminucin
del pH reduce el tiempo de retencin en las cromatografas de intercambio aninic. Este
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tipo de cromatografa es ampliament utilizado en las siguientes aplicaciones:

purificacin de agua, concentracin de componentes traza, Ligand-exchange
chromatography, Ion-exchange chromatography of proteins, High-pH anion-exchange
chromatography of carbohydrates and oligosaccharides, etc.

Cromatografa basada en bioafinidad

Este tipo de cromatografa se basa en la capacidad de las sustancias biolgicamente
activas de formar complejos estables, especficos y reversibles. La formacin de estos
complejos implica la participacin de fuerzas moleculares como las interacciones de
Van der Waals, interacciones electrostticas, interacciones dipolo-dipolo, interacciones
hidrofbicas y puentes de hidrgeno entre las partculas de la muestra y la fase
estacionaria.

Parmetros
Dimetro interno
El dimetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crtico que determina la
cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y tambin influye en su
sensibilidad. Las columnas de dimetro interno ms grande (>10 mm) se utilizan
normalmente en la purificacin de compuestos para su utilizacin posterior. En cambio,
las columnas de dimetro interno menor (4-5 mm) se utilizan en el anlisis cuantitativo
de las muestras, y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimizacin del
consumo de disolventes que conllevan. Estas columnas se suelen denominar columnas
de rango analtico y normalmente estn asociadas a un detector UV-VIS. Aparte, existen
otros tipos de columnas, como las de tipo capilar, con un dimetro inferior a 0.3 mm,
utilizadas principalmente en espectrometra de masas.

Medida de las partculas

La mayora de HPLC tradicionales se realizan con una fase estacionaria unida al
exterior de partculas esfricas de silica. Estas partculas pueden tener diferentes
medidas, siendo las de 5\mum de dimetro las ms utilizadas. Partculas ms pequeas
ofrecen una mayor superficie y una mejor separacin, pero la presin que se requiere
por obtener una velocidad lineal ptima aumenta de forma inversamente proporcional al
cubo del dimetro de la partcula. Esto significa que disminuir la medida de las
partculas a la mitad, aumentara la resolucin de la columna, pero a la vez, aumentara
la presin necesaria en un factor de ocho.

Tamao de poro
Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor superficie. Los
poros pequeos proporcionan una mayor superficie mientras que los poros de mayor
medida proporcionan una cintica mejor, especialmente para los compuestos de tamao
ms grande; por ejemplo, una protena que sea ligeramente ms pequea que el tamao
de los poros puede entrar, pero difcilmente saldr con facilidad.

Presin de la bomba
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La presin de las bombas es variable segn el modelo y fabricante, pero su rendimiento

se mide en su habilidad para generar un flujo constante y reproducible. La presin
puede lograr valores de hasta 40 MPa (o unas 400 atmsferas). Los aparatos ms
modernos de HPLC incorporan mejoras para poder trabajar a presiones ms altas y, por
lo tanto, poder utilizar partculas de tamao ms pequeo en las columnas (< 2
micrometros). Estos nuevos aparatos, denominados Ultra Performance Liquid
Chromatography (UPLC) pueden trabajar con valores de hasta 100 MPa de presin
(unas 1000 atmsferas). (Hay que tener en cuenta que las siglas UPLC son una marca
registrada de Waters Corporation aunque a veces se utilizan de forma general para
designar este tipo de aparatos.)

Fabricantes de aparatos de HPLC

Agilent Technologies (antiguamente Hewlett-Packard)

Beckman Coulter, Inc.

Dionex Corporation

Eksigent Technologies

Gilson, Inc.

Micro-Tech Scientific

PerkinElmer, Inc.

Proxeon Biosystems A S/

Shimadzu Scientific Instrumentos

Thermo Electron Corporation

Varian, Inc.

Waters Corporation

Knauer

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JASCO

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