UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA

INFORME N 1
CURSO: Laboratorio de Microbiologa General
TTULO: Tincin simple con colorantes bsicos
INTEGRANTES:

20130318
20150092
20131314
20100080

Capistrano Feliciano Elvis

Ccoyllo Terrones Edwin Farit
Lopez Sanchez Moreno Carlos
Baca Espinoza Cynthia

LA MOLINA
2016

INTRODUCCIN
El microscopio de campo claro es el ms til para la observacin de
especmenes teidos. Los colorantes son compuestos qumicos utilizados
para aumentar el contraste. Existen algunos, llamados colorantes vitales,
que pueden aadirse directamente a una preparacin en fresco; por tanto,
colorean clulas vivas. No obstante, la mayora de los colorantes son
solamente efectivos despus de que los microorganismos hayan sido
fijados, es decir, se encuentren muertos y adheridos al portaobjetos. Para la
fijacin por calor, se realiza una fina extensin de una gota de muestra
lquida sobre un portaobjetos y se deja secar al aire; a continuacin, se pasa
la preparacin de Forma rpida sobre la llama de un mechero. El calor de la
llama mata las clulas microbianas por desnaturalizacin de sus protenas.
Las protenas coaguladas unen las clulas a la lmina. Cuando se desea fijar
especmenes delicados se utiliza la fijacin qumica, ya que es menos lesiva
que el calor. Para ello se aade una gota del fijador, por ejemplo, cido
smico, formaldehdo, o glutaraldehdo, sobre la muestra lquida con los
microorganismos.
La fijacin posee algunos inconvenientes. Por ejemplo, a menudo distorsiona
la apariencia real de las clulas, lo cual dificulta la identificacin; adems,
no permite la observacin del movimiento de los microorganismos. Despus
de la fijacin, se aade el colorante, que debe permanecer el tiempo
suficiente en contacto con el espcimen, para que pueda ser absorbido. A
continuacin, se retira el exceso de colorante, normalmente lavando con
agua.
Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones
cargados. Los colorantes bsicos son aquellos en los cuales el agente que
tie es el ion cargado positivamente, mientras que en los cidos, el
colorante es el ion cargado negativamente. Los colorantes ms utilizados
son los de tipo bsico, ya que la mayor parte de las clulas microbianas
Poseen cargas dbilmente negativas en su superficie, lo cual facilita su
unin. Entre los colorantes bsicos ms comunes se encuentran la
safranina, la fucsina bsica, el cristal violeta y el azul de metileno. Los
colorantes cidos se unen a las partes de las clulas cargadas
positivamente. Se utilizan para teir tejidos animales infectados con
microorganismos. Entre los ms frecuentes estn la eosina, la fucsina cida
y el rojo Congo.

I-Objetivos:

Realizar las tcnicas de preparacin de frotis, fijacin y tincin

ms utilizadas en el estudio de microorganismos de cultivo bacteriano
empleando tres tipos de colorantes (azul de metileno, cristal violeta,
carbolfucsina).
Observar la morfologa bacteriana y aprender a distinguir los
diferentes tipos de agrupaciones y la importancia de las tinciones
simples en la caracterizacin morfolgica de los microorganismos.
Practicar la observacin con el microscopio al mximo aumento y
familiarizarse con el correcto empleo del aceite de inmersin.

II-Marco terico:
La mayor parte de las bacterias son transparentes, por lo que suele ser
necesario recurrir al uso de tinciones si se desea observar a estos seres
vivos con un microscopio ptico convencional de campo claro. Las tinciones
aumentan artificialmente el contraste entre las clulas bacterianas y el
medio circundante. A continuacin, se da a conocer los tipos de colorantes:
1. Tipos de Colorantes:
1.1 Colorantes segn su origen:
a) Colorantes Naturales: Son extrados principalmente de plantas, pero
tambin de animales. Ejemplo:
La Hematoxilina: extrada de la leguminosa

Haematoxylum

campechianum.
El Azul de ndigo: extrada de la planta Indigofera spp.
El Carmn: extrada de la cochinilla americana Dactylopius coccus.

b) Colorantes Artificiales: Son preparados artificiales, obtenidos en su

mayora del carbn del alquitrn de la hulla. Son colorantes de Anilina.
Pueden ser cidos y bsicos, que pueden presentarse formando Sales,
as como Colorantes Neutros. Ejemplo:

Cristal Violeta
Azul de Metileno
Ac. Pcrico
Fucsina bsica
Oxalato verde de malaquita
Purpura de Metacresol
Safranina

1.2 Colorantes segn su comportamiento Qumico:

En general un colorante dependiendo de su estructura fisicoqumica, se
unir de una forma ms estable a la estructura que tia. Este tipo de
colorantes estn constituidos fundamentalmente por un anillo bencnico al
que se unen distintos Radicales, de los cuales uno ser coloreado y
corresponde al Radical Cromforo. A mayor nmero de Radicales Cromforo
mayor ser el poder del colorante de la solucin. Si al anillo bencnico se le
une unos radicales No Coloreados o Auxcromos, estos no poseern
capacidad tintorial, pero proporcionara estabilidad, posibilitando que se
tian los radicales coloreados.
a) C. cidos o Aninicos: Son aquellos donde la carga del radical colorante
es (-), corresponde principalmente a colorantes Citoplasmticos, ya que
los citoplasmas son bsicos y captan muy bien los colorantes cidos.
Ejemplo: Eosinas, Auraminas, etc.
b) C. Bsicos o Catinicos: Aqu la carga del ion Cromforo es (+),
correspondern a colorantes que tien estructuras de carcter Nuclear o
similar que son cidos, es decir cargados negativamente. Ejemplo:
Fucsina bsica, Cristal violeta (v. De Genciana), etc.
c) C. Neutros: Es una sal compuesta de un colorante cido y colorante
bsico. Ejemplo: Eosinato azul de Metileno, etc.
d) C. Indiferentes: son Insolubles en agua, pero solubles en alcohol. No
predomina ninguna carga, pero tampoco tiene carcter neutro. Son los
colorantes de los lpidos. Ejemplo: Sudan III, Negro Sudan, etc.

2. Tcnica de Tincin:
El proceso de Tincin supone una reaccin de intercambio de Iones entre el
colorante y los sitios activos de la superficie o del interior de la clula
bacteriana, de tal manera que los iones teidos del colorante remplazan
iones celulares. Permitiendo contrastar el microorganismo con el medio que
lo rodea.
2.1 Ventajas de la Tcnica de la Tincin:
Observar ms adecuadamente la morfologa de los microorganismos.
Permite diferenciar distintos tipos morfolgicos.
Informacin sobre estructuras internas y/o externas, que al realizarse por

examen fresco no son visibles.

Permite diferenciar grupos de microorganismos y ordenarlos por algunas
caractersticas presentadas.
2.2 Tipos de Tinciones Bacterianas:
a) Tincin Simple: Se caracteriza por:

Necesita fijacin de las bacterias.

Utiliza un solo colorante.

Permite observar la morfologa bacteriana.

Se dividen a su vez en:

Tinciones Simples con colorantes bsicos.
Tinciones Simples con colorantes cidos.
Tinciones Simples con colorantes neutros.
b) Tincin Negativa: Es un tipo de Tincin simple, pero adems de observar
su morfologa se aprecia caractersticas estructurales. Se caracteriza por:

No necesita fijacin.

Utiliza un solo colorante.

Permite observar sobre un fondo oscuro, la forma de la bacteria y

algunas caractersticas estructurales (presencia de cpsula).

c) Tinciones Diferenciales: Se caracterizan por:

Necesita fijacin previa por calor.

Utilizan dos colorantes (l ltimo es el colorante de contraste).

Se puede observar la morfologa y otras caractersticas, como

composicin de la pared bacteriana, como sucede en la Tincin de
Gram.

d) Tinciones Estructurales: Presentan las siguientes caractersticas:

Requiere fijacin previa por calor.

Utiliza al menos dos colorantes.

Se observa la morfologa bacteriana.

Permite visualizar caractersticas.

Estas se clasifican a su vez en:
Tincin de cpsulas.
Tincin de esporas.
Tincin de flagelos, etc.

2.3 Factores que determinan una buena Tincin:

Para llevar a cabo una buena Tincin, se debe tener en cuenta algunos
factores que pueden alterar los resultados finales, estos son:

Pureza del colorante, el colorante debe estar limpio de pureza,

para que no modifique la morfologa del microorganismo.

Concentracin del colorante, existe un rango de 0.2 a 2%, a una

mayor o menor concentracin se obtendr malos resultados.

PH del colorante, factor principal, este determina la fijacin o no del

colorante a las estructuras.

Conservacin del colorante, colocados en lugares frescos, secos,

oscuros, que estn bien envasados y etiquetados.

Elaboracin, algunos colorantes necesitan estar en soluciones

acuosas o hidroalcoholicas, por lo que debern pasar primero por un
proceso de preparacin.

Tcnica empleada, realizar todo meticulosamente, no olvidando

ningn paso y teniendo muy en cuenta la limpieza.

Temperatura, cada tcnica usa un determinado colorante, por lo que

la temperatura optima vara en cada caso.

Cantidad de muestra, es fundamental que la muestra tomada sea

representativa y homognea, de tamao ni muy grande ni muy
pequea.

Realizar correctamente la fijacin, ser muy importante a la hora

de realizar una Tincin, ya que al agregar el colorante, cabe el riesgo
de que el microorganismo sea arrastrado con los colorantes.

Soluciones mordientes, estas soluciones fijan los colorantes a las

estructuras bacterianas, se usan en la tinciones diferenciales.

Tiempo de Tincin, es vital el tiempo en que va estar expuesto el

microorganismo con el colorante, el tiempo se encuentra entre 1 a 10
minutos.

3. Fijacin del Microorganismo:

La fijacin de un microorganismo juega un rol muy importante, debido a que
si no se hubiese fijado correctamente este correra el peligro de ser retirado
al momento de enjuagar con el decolorante por ello se deben seguir los
siguientes pasos:
a) Si es Lquido, se coloca un portaobjeto previamente esterilizado, usando
el Asa de Kolle, se extiende la muestra sobre el portaobjeto, de tal forma
que quede una capa fina y homognea, si fuera espesa, se agrega agua
destilada.
b) Si es Slido, se deposita sobre el porta objeto esterilizado, una pequea
gota de agua, en ella se agrega una cantidad pequea de cultivo, al igual
que en l liquido se extiende para obtener una pelcula fina y
homognea de la muestra, para ello usando el Asa de Kolle, que tambin
debe estar esterilizado.

Para ambos casos, una vez esparcido el inoculo, la muestra se fija mediante
flameado de la preparacin con calor, as las protenas se coagulan
rpidamente quedando adheridas al porta objetos.

III-Materiales:

Asa de Kolle

Muestra de
cultivo de

Laminas
portaobjetos

Mechero de
alcohol

Piseta con agua

Papel Secante

Soporte para
Tincin

Aceite de Inmersin

Colorantes Bsicos:
Azul de Metileno
Cristal Violeta
Carbolfucsina

IV- Parte Experimental:

1. PREPARACIN DE UNA MUESTRA FIJA DE BACTERIAS PARA
TINCIN
Materiales:

Asa de Kolle
Tres lminas portaobjetos
Mechero de alcohol
Cultivo de bacterias en medio solido: Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Bacillus cereus.

Procedimiento:
-

Se realiz una limpieza previa al portaobjeto, para limpiar la grasa y

otras impurezas que tiene, con algodn y alcohol.
Una vez limpio se coloc una gota de agua sobre el portaobjeto.
Se eligi el cultivo de S. aureus para este ejercicio.
Para empezar la fijacin de la muestra se enciende el mechero ya que
este esteriliza la zona de trabajo antes de abrir el tubo de ensayo que
contiene el agar en cultivo de la bacteria.
Se esteriliza el asa de Kolle introducindolo en la llama hasta el rojo
vivo.

papel secante

Luego se procedi a abrir el tubo de ensayo de la forma indicada y

bajo la proteccin de la flama del mechero y se realiza un raspado
cuidadoso para no daar el agar.
Despus se esparci en el portaobjeto hasta formar una pelcula
uniforme.
Una vez usado el asa de Kolle se volvi a esterilizar para un posterior
uso.
Mientras se deja secar la lmina al aire o se puede pasar la lmina a
travs de la llama del mechero de forma repetida y con intervalos de
tiempo de 3 segundos, cuidando siempre que no se recaliente ya que
se puede alterar la forma y la estructura del microorganismo.
Se realiz el mismo procedimiento con todas las lminas.

2. TINCIN SIMPLE CON COLORANTES BSICOS

Materiales:

Lminas fijadas de microorganismos

Aceite de inmersin
Colorantes bsicos (Azul de metileno, Cristal violeta, Carbolfucsina)
Papel secante
Piseta de agua
Soporte de tincin

Procedimiento:

Se colocaron las lminas fijadas de microorganismos sobre soporte

para tincin, luego se le agregaron de 4 a 5 gotas de colorante (un
colorante por lmina) dejando que acte el tiempo que necesita para
teir la muestra (TABLA 1).
Una vez cumplido el tiempo se procedi a lavar cada lmina
cuidadosamente con agua destilada evitando desprender la muestra
fijada y se sec dando toque suaves con papel secante.
Para terminar con el lavado se froto con un algodn humedecido el
reverso de la lmina que estuvo en contacto con la flama para retirar
los restos de holln que pueden influir en la correcta visualizacin con
el microscopio.
Finalmente se le agreg dos gotas de aceite de cedro o inmersin y se
llev a observar al microscopio con un aumento de 1000X (lente
objetivo de 100X).

TABLA 1: Colorantes usados en la tincin.

Colorante

Tiempo que necesita

para teir la muestra

Azul de metileno

Cristal Violeta

20 segundo

Carbolfucsina

10 segundos

120 segundos

VI-Discusiones:

La mayora de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son

colorantes derivados de las anilinas, sales orgnicas intensamente
pigmentadas que proceden del alquitrn. Se denominan colorantes
bsicos si el Cromforo (porcin coloreada) de la molcula est
cargada positivamente, por ejemplo, cristal violeta y azul de metileno
son colorantes bsicos.

Otros colorantes de esta categora utilizados con frecuencia en

bacteriologa son safranina, fuchina bsica y verde malaquita. Bajo
condiciones normales de crecimiento, la mayor parte de los
procariotas tienen un pH interno prximo a la neutralidad (pH 7.0) y
una superficie celular cargada negativamente, as los colorantes
bsicos son los ms eficaces.

El azul de metileno tiene naturaleza catinica, ya que es una

sustancia que tienen carga positiva, penetra en el interior de las
clulas y tie microorganismos procariticos vivos o muertos (en
cambio los eucariticos slo se tien si estn muertos). Algunas
estructuras, como los corpsculos metacromticos, se tien ms
intensamente con este colorante que el resto de la clula.

Staphylococcus Aureus es un microorganismo Grampositivo pero las

clulas viejas y los microorganismos fagocitados se tien
como Gramnegativos, generalmente toma 60 segundos en teir una
preparacin microbiana con azul de Metileno, 10 segundos con Cristal
Violeta y 5 segundos con Fucsina, sin embargo en la prctica se dej
el doble de tiempo para una tincin ms eficiente.

Segn Rodrguez (2005) los colorantes cristal violeta, fucsina y azul

de metileno poseen una reactividad mucho mayor que otros
colorantes de su naturaleza por lo que si un frotis se queda por un
periodo prolongado de tiempo con uno estos colorantes se tiende a
sobreteir la muestra especialmente en preparaciones que tienen
grandes cantidades de materia orgnica y detritos.

S. aureus se reconocera mejor en una tincin de Gram que es un

sistema de dos tinciones simples sucesivas, separadas por una fase
de decoloracin selectiva que permite diferenciar las bacterias que
retienen el primer color (Gram-positivas) de las que no lo retienen
(Gram-negativas). Esta diferencia en comportamiento refleja
diferencias estructurales y fisiolgicas entre ambos grupos de
bacterias

El azul de metileno es ms utilizado para la observacin de levaduras

y protozoos intestinales, por lo que para una mejor diferencia
morfolgica y un mejor reconocimiento es preferible utilizar Cristal
Violeta.

Las tcnicas de tincin simple y de Gram son utilizadas en

laboratorios clnicos, esto debido a que S. aureus es un patgeno
humano (el ms importante de los Staphylococcus) localizado en la
nariz (fosas nasales) y a veces en la piel, sobretodo del personal
hospitalario y pacientes en ambientes muy contaminados y en
personas con sistema inmunolgico deficiente.

S. aureus recibe el nombre aureus debido a la pigmentacin

amarilla que presentan sus colonias. Los miembros de esta especie
son aerobios y anaerobios facultativos.

Segn Tortora (1993) S. aureus es una bacteria que puede sobrevivir

y crecer bajo elevadas presiones osmticas debido a la morfologa
esfrica combinada con la resistencia de la pared celular
Grampositiva. Esta capacidad explicara porque pueden sobrevivir y
crecer en secreciones nasales y sobre la piel, tambin porque pueden
multiplicarse en alimentos con elevada presin osmtica (jamn y
carnes crudas) o en alimentos con poca humedad (factor que tiende
a inhibir el crecimiento de otros microrganismos). Adems la
pigmentacin amarilla le confiere proteccin contra los efectos
antimicrobianos de la luz solar.

VII-Conclusiones:

Se demostr que el Cristal Violeta produce una mejor tincin que los
colorantes Azul de Metileno y Fucsina para la bacteria S. aureus y otras
bacterias Grampositivas en general.
El Azul de Metileno es el colorante ms dbil de los tres, razn por la
cual se usa ms concentrado y se deja actuar durante ms tiempo.
Tambin a la solucin de azul de metileno de uso se le agrega un lcali
(KOH) como intensificador de color, que acta haciendo ms rpida e
intensa la reaccin de coloracin.
El lavado del frotis con colorante se debe realizar con el mximo cuidado
posible evitando que el agua caiga directamente sobre la muestra y lo
suficiente para evitar la formacin de artefactos.
Se demostr que la tcnica de fijacin de la muestra por calor se realiza
en un tiempo mucho menor que la que requiere alcohol.

VIII-Bibliografa:

-Madigan, Michael T; Martinko, John M; Dunlap, Paul V; Clark,

David P. Brock, Biologa de los Microorganismos. 12da Ed.
(2009). Pearson Education Inc.(pp. 30-31)
-Gamazo, Carlos; Lpez-Goi, Ignacio; Daz, Ramn. Manual
prctico de MICROBIOLOGIA. 3ra Ed. Masson(2005). pp.24-25

-Robertson J, Gomersall M, Gill P. (1975). Mycoplasma hominis:

growth, reproduction, and isolation of small viable cells. J
Bacteriol. 124 (2): pp. 10071018.

-MICROBIOLOGIA, SEGUNDO CURSO GUIN DE PRCTICAS

Curso 2007-2008.

-Morfologa y estructura bacteriana. M. Prez, M. Mota

http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2000024/leccione
s/cap01/01_03_05.htm

-M.C. Evangelina Olive E. Manual de laboratorio de

microbiologa bsica. Universidad autnoma de ciudad de
Jurez. Primera edicin. 2001.

-Rodrguez E. Gamboa M. Hernndez F. Garca J. Bacteriologa

general. Principios y prcticas de laboratorio.

-Tortora, Gerald; Funke, Berdell; Case, Christine. (1993).

Introduccin a la Microbiologa 3. Ed. Zaragoza: Editorial
ACRIBIA, S.A.

-Levinson, Warren; Jawetz, Ernest. (1999). Microbiologa e

Inmunologa: Autoevaluacin y Repaso. Mxico, D.F. :Editorial El
Manual Moderno.

IX-Anexos:

Colorantes utilizados, asa de

Kolle y piceta

Cepa de Staphylococcus sp.

Extraccin de la muestra de
bacterias

Fijacin de la muestra

Agregando el colorante

Secando la muestra

Observando la muestra de
Staphylococcus sp.

Lavando la muestra

Agregando una gota de

aceite de inmersin

Staphylococcus sp. Visto al

microscopio (1000X)